CN103585635A - 一种可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球及其制备方法，该微球包括蛋白或多肽类药物5～30份，聚乳酸类生物降解材料30～90份，纳米生物活性玻璃5～50份。所述缓释微球采用静电纺丝技术制备，主要由聚乳酸类生物降解材料（PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）或PLA（聚乳酸）)、生物玻璃和主药组成。本发明利用可以极大促进蛋白多肽类药物在制备过程中的活性保持能提高蛋白、多肽类药物在微球储存和释放过程中的稳定性。

Description

一种可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球及其制备方法

技术领域

本发明是一种可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球及其制备方法主要涉及医药领域。 

背景技术

随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现。目前已有35种重要治疗药物上市，生物技术与生物制药企业的发展也日益全球化。生物技术药物研究的重点是应用DNA重组技术开发可应用于临床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。但这些药物在胃肠道内稳定性差，易变性，易被消化酶降解，不易吸收，这些局限性影响了它们口服给药的生物利用度。目前蛋白质类药物大多采用注射方式给药，因此如何减少注射次数/提高药效成为蛋白、多肽类药物注射给药面临的一个主要问题。 

目前多肽、蛋白质类药物常用的剂型是注射用溶液剂或冻干粉针剂，它们在血液中的半衰期一般很短，静脉注射后很快就被清除或降解，因此需要经常给药，给病人带来较多不便。因此，开展多肽、蛋白质类生物大分子药物缓释或控释制剂的研究已成为该类药物制剂研究的热点。 

目前生物大分子药物缓控释制剂研究涉及最多的是微粒递释系统，即采用生物可降解聚合物为囊材包裹多肽、蛋白质药物制成微球制剂，使其在体内达到缓择或控程目的。 

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种具有良好的生物相容性及生物降解性的高聚物，已被美国FDA批准为药用高分子材料。现已有数个多肽类药物长效注射微球产品批准上市，如曲普瑞林、丙氨瑞林、醋酸戈舍瑞林、奥曲肽此类微球制剂能使药物延长释放达1个月，甚至3个月。因此，以生物可降解聚合物为囊材的微囊化技术是开发研制多肽缓、控释剂型的有效途径，颇具发展前景。 

采用生物降解型材料，尤其是聚乳酸类材料制成药物微球可实现药物的控释或缓释。目前国内、外将中药蛋白药物制成缓释微球的研究报道较多，制备工艺主要有溶剂挥发法、相分离法、喷雾干燥法、沉淀析出法和凝聚法等。但多肽，蛋白类药物缓释微球制备、储存和释放过程中蛋白活性的损失又成为其广泛应用的制约因素，究其原因主要有两方面，一是在制备过程中，一些剧烈的机械力作用（如搅拌、超声）及有机溶剂和乳化剂的接触，导致蛋白聚集，变性，失活；二是在贮存和缓慢释放时，聚合物降解产物使蛋白质周围微环境的pH值下降，这种酸性环境易使蛋白质发生降解、聚合而变性。 

目前国内外的科研工作者已通过改进微球制备方法与优选添加剂等方法来提高蛋白稳 定性，并取得了一定的进展。（田瑞,王连艳,吴颉,张洁,曾烨婧,马光辉.快速膜乳化法制备粒径均一的PLGA微球和微囊[J].过程工程学报,2009,9(4):754-762；Rafi M.D,Singh S.M,Kanchan V,Anish C.K,Panda A.K.Controlled release of bioactive recombinant human growth hormone from PLGA microparticles[J].Journal of Microencapsulation.2010,27(6):552-560；樊莉.无水法制备干扰素-α-2b PLGA缓释微球的研究[D].第二军医大学,2006）。但目前能够成功同时保持多肽，蛋白类药物在微球制备、储存与体内外释放过程中的生物学活性的报道仍然很少，极大限制了临床应用。目前唯一上市的蛋白类缓释注射微球是美国Genentech,Inc公司采用低温喷雾提取法开发的重组人生长激素PLGA微球（Nutropin Depot^TM）。然而使用这种方法需要相应的设备，样品需要量大，成本高,难于推广，并且这种方法只能改善保持蛋白在缓释微球制备过程中活性的保持，还不能实现长期释放过程的蛋白的活性保持，美国Genentech,Inc公司已经于2004年停止该产品的生产和销售。 

静电纺丝技术的基本原理是将聚合物溶液带上高压静电，带电的聚合物液滴在电场力的作用下在毛细管的Taylor锥顶点被加速，当电场力足够大时，聚合物液滴克服表面张力形成喷射细流。细流在喷射过程中溶剂蒸发，最终落在接收装置上，形成类似非织造布的纤维毡。 

目前静电纺丝技术已广泛应用于复合材料、结构增强体、电化学传感材料、骨架和组织工程材料的制造。在生物医学领域，主要应用于组织工程的细胞生长支架的建立，并复合各种蛋白类生长因子促进细胞增殖分化。 

目前，静电纺丝技术在药物微球控释领域的发展刚刚起步，有关的文献报道也仅限于可溶性药物包裹于海藻酸、壳聚糖等水溶性囊材中，药物包封率较低、粒径分布宽、药物体外达不到长期释放的目的。（陆丽芳,魏刚,高建成,陆伟跃.高电压静电成囊技术制备牛血清白蛋白微囊的探索[J].中国医药工业杂志,2004,35(6):341-344；Zhou X.F,Liu B,Yu X.H,et al.Controlled release of PEI/DNA complexes from mannose-bearing chitosan microspheres as a potent delivery system to enhance immune response to HBV DNA vaccine[J].J Controlled Release,2007,121(3):200-207；Ma L,Liu C.Preparation of chitosan microspheres by ionotropic gelation under a high voltage electrostatic field for protein delivery.Colloids Surf B Biointerfaces.2010,75(2):448-53）。 

专利申请人课题组在前期研究中发现通过控制静电纺丝技术中关键参数的指标，可制备粒径分布窄，包封率高的PLGA长效蛋白微球。并且由于静电纺丝工艺在微球制备过程中在无水、低温条件下作业，也没有添加表面活性剂和乳化剂，有望极大促进蛋白类药物在制备过程中的活性保持。 

但单纯依靠静电纺丝技术还是只能提高微球制备过程中的蛋白稳定性，不能改善药物释 放过程中PLGA降解产物导致的蛋白质周围微环境的低pH值，长期储存、释放过程的蛋白的活性仍然不能得到足够保持。这就需要对静电纺丝技术制备的蛋白微球作进一步的工艺和处方改进。目前国内、外也有向聚乳酸类生物降解微球中加上Mg(OH)₂等碱性颗粒的研究。有研究发现在聚乳酸类生物降解微球中加上Mg(OH)₂等碱性颗粒.模型药物BSA的聚集情况得到改善，蛋白失活情况得到了改善（Zhu G et al，Pharm Res.2000Mar;17(3):351-357；Kang J et al，Biomaterials.2002Jan;23(1):239-45）。但在常规向PLGA生物降解微球中加入Mg(OH)₂颗粒的制备方法中Mg(OH)₂不能全程中和PLGA的降解产物乳酸，只能在微球释放前期起到维持蛋白类药物稳定的作用，在微球释放的中后期，蛋白类药物还是会由于处在低pH值的环境中而易于降解、失活。并且由于不同型号的聚乳酸类生物材料具有不同的降解速度，常规加入Mg(OH)₂颗粒的方法，不能同步中和不同型号的聚乳酸类生物材料的降解所产生的低pH微观环境。这样常规向PLGA生物降解微球中加入Mg(OH)₂颗粒的制备方法还是难于保持蛋白、多肽类药物在储存和释放过程中的稳定性。 

生物活性玻璃（Bioglass）是20世纪60年代由Larry Hench教授发明的基于Na₂O-CaO-SiO₂为主体的透明生物活性材料,在其植入体内后，接触体液后，可以在材料界面诱发特殊的生理响应，缓慢形成具有碱性基团的碳酸羟基磷灰石（速率受Na₂O-CaO-SiO₂比例影响），可引起组织间特殊生物反应从而导致移植材料与骨组织之间的成骨，能够帮助骨组织以更快的速度再生和修复。经过20多年的前期基础及性能的完善，在90年代经美国食品及药品监督管理局（FDA）正式批准应用于骨、齿科临床，用于修复因各种原因导致的骨缺损，并取得良好的治疗效果。目前国内、外生物活性玻璃作为一种重要的医学材料已经广泛应用于生物医学等领域。但目前尚未有将生物活性玻璃应用于蛋白类缓释注射微球制备的研究。本专利申请中原创性的在采用静电纺丝技术进行蛋白微球制备过程中，复合纳米生物活性玻璃，通过调整生物活性玻璃的Na₂O-CaO-SiO₂-P₂O₅的比例，以期达到与PLGA近似于同步的降解速率，通过碱性碳酸羟基磷灰石的缓慢形成来中和PLGA缓慢降解过程中产生的低pH，从而同步提高蛋白类药物在微球储存和释放过程中的稳定性。 

发明内容

本发明为了提高蛋白、多肽类药物在制备、储存和释放过程中的稳定性采用的技术方案是：采用静电纺丝技术制备蛋白多肽类聚乳酸类缓释微球体系，通过优化关键性参数如电场电压、静电纺丝距离及推进速度制备粒径分布窄、包封率高、活性高保持的长效多肽、蛋白药物缓释微球。并在静电纺丝技术的基础上，添加生物活性玻璃，通过调整生物活性玻璃的组成的比例，达到与聚乳酸类高分子近似于同步的降解速率，通过碳酸羟基磷灰石的缓慢形 成来中和聚乳酸类高分子缓慢降解过程中产生的低pH，从而同步提高蛋白、多肽类药物在微球储存和释放过程中的稳定性。 

本发明的缓释微球主要包括主药（蛋白或多肽类药物）、生物活性玻璃、聚乳酸类生物医学材料组成。其中按重量份计，蛋白或多肽类药物5～30份，聚乳酸类生物降解材料30～90份，生物活性玻璃5～50份。 

所述的蛋白、多肽类药物，包括所述蛋白或多肽类药物包括但不局限于以下药物：醋酸亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、胰岛素、骨胶原形成蛋白、血管生长因子、艾赛那肽、醋酸奥曲肽、降钙素、重组人生长激素或重组人干扰素。 

本发明所选用聚乳酸类生物医学材料作为缓释材料，包括聚乳酸（PLA）或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。 

生物活性玻璃的SiO₂:CaO:P₂O₅摩尔比可在26:70:4～70:15:15之间； 

本专利还提供制备上述蛋白、多肽类药物缓释微球的制剂的方法，包括如下步骤： 

（1）生物活性玻璃的制备 

1)取一定量的浓硝酸与乙醇混合均匀，得到溶液1； 

2)溶液1加入正硅酸乙酯，1000rmp预水解30min，得到溶液2； 

3)向溶液2中再加入P₂O₅，1000rmp搅拌30min，得到溶液3； 

4)向溶液3中加入四水硝酸钙，1000rmp搅拌1h，充分溶解形成清澈溶胶。 

5)将步骤4）中制备好的溶胶倒入烧杯，置60℃烘箱中72h，形成凝胶； 

6)将步骤5）中得到的凝胶在130℃干燥72h； 

7)将步骤6）所得凝胶球磨、筛分，并将所得的干凝胶粉在700℃煅烧得到纳米生物活性 

玻璃； 

（2）蛋白、多肽缓释微球的制备 

1)将蛋白、多肽类药物和纳米生物活性玻璃混悬于含有PLGA或者PLA的有机溶液； 

2)将步骤1）中混悬液通过静电纺丝装置制备不同粒径（1～80μm）的液球； 

3)将步骤2）中制备的液球滴入置有-196℃液氮容器中，将液球冻结固形成球，接收距离为10cm，； 

4)将步骤3）中容器至于-60摄氏度～-90℃低温环境中，用醇类萃取剂将二氯甲烷带走，使聚合物产生沉积，微球得以固化； 

5)用去离子水清洗步骤4）中固化的微球，离心后冻干保存。 

上述（2）的步骤1）中所采用的有机溶剂选自二氯甲烷，氯仿，丙酮，乙醇，六氟异丙醇，三氟乙醇中的一种或几种混合物。步骤2）中，混悬液通过静电纺丝装置制备不同粒径 的液球的工艺条件为：滴速为0.5ml/h～10ml/h，电压为3KV～30KV，针头到接收板距离为5～30cm，相对湿度为15%～50%。 

对本领域技术人员来说，在制备生物活性玻璃时，能根据原料的量来调节生物活性玻璃中SiO₂:CaO:P₂O₅的比例。 

本发明的优点是：1、静电纺丝技术在无水、低温条件下作业，不添加表面活性剂和乳化剂，与现有的微球制备方法如溶剂挥干法法相比，可以极大促进蛋白多肽类药物在制备过程中的活性保持。2、在微球制备过程中使用优化比例的复合纳米生物活性玻璃可以达到与聚乳酸类生物降解材料近似于同步的降解速率，中和聚乳酸类生物降解材料缓慢降解过程中产生的低pH，从而提高蛋白、多肽类药物在微球储存和释放过程中的稳定性。 

附图说明

图1是根据实施例1制备的胰岛素缓释微球的体外释放曲线图。 

图2是根据实施例1制备的胰岛素缓释微球的体外释放过程中的活性保持测定图。 

图3是根据实施例2制备的重组人干扰素缓释微球的体外释放过程中样品的UVCD图谱。 

图4是根据实施例2制备的重组人干扰素缓释微球的体外释放过程中样品的FTIR图谱。 

图5是根据实施例2制备的重组人干扰素缓释微球的扫描电镜图谱。 

具体实施方式

本发明通过以下实施实例作更详细的描述，但不能将其解释为限制本发明的保护范围。 

实施例一 

1胰岛素缓释微球的制备 

1.1生物活性玻璃的制备 

取7ml浓硝酸，加入53g乙醇，所得溶液中加入10.84g正硅酸乙酯，1000rmp预水解30min，再加入P₂O₅1.14g，1000rmp搅拌30min，加入33g四水硝酸钙，1000rmp搅拌1h，充分溶解形成清澈凝胶。将制备好的溶胶倒入烧杯，置60℃烘箱中72h，形成凝胶，然后在130℃干燥72h，将凝胶球磨、筛分，并将所得的干凝胶粉在700℃煅烧2h，粉碎得纳米生物活性玻璃微粉。 

该步骤制备后生物活性玻璃的组成和成分比例为;SiO₂:CaO:P₂O₅摩尔比=26:70:4 

1.2缓释微球的制备 

精密称取100mgPLGA（分子量5KD）溶于5ml二氯甲烷中。精密称取10mg胰岛素微 粉与20mg纳米级生物活性玻璃粉混悬于PLGA二氯甲烷溶液中。采用静电纺丝工艺进行微球制备：滴液速度10ml/h，电压3kV，针头到接收板距离10cm，相对湿度30%。将液球滴入置有-196℃液氮容器中，将液球冻结固形成球后于-60℃用醇类萃取剂将二氯甲烷带走，使聚合物产生沉积，微球得以固化；去离子水清洗，离心后冻干得微球粉末。 

2胰岛素缓释微球的质量评价 

2.1包封率，含量，收率的计算与平均粒径的考察 

精密称取含药微球约10mg，加入5.0ml0.1mol/L NaOH(含有0.5％SDS),37℃水浴振荡24h，使微球完全溶解，盐酸调节pH至中性，取上清液采用BCA Kit法进行蛋白含量测定，并计算载药量和包封率。其中药物含量为1.14%(w/w)。微球产率为90.2%(w/w)。微球体积平均粒径为30μm。 

2.2溶出度的测定与溶出过程中稳定性的考察 

精密称取含药微球20mg置于5ml10mmol/L pH7.4缓冲液(含0.02％叠氮钠作为抑菌剂，0.02％F-68润湿剂)作为释放介质，置于恒温水浴摇床中，在100rpm振荡速度、37℃±0.5℃温度条件下进行微球的体外释放度测定。用BCA Kit法测定上清液中蛋白的浓度，计算累计释药百分数。并同时取上清液作为供试品溶液，采用小鼠血糖法测定上清液中胰岛素的活性。结果见附图1～2。 

实施例二 

1重组人干扰素缓释微球的制备 

1.1生物活性玻璃的制备 

取7ml浓硝酸，加入53g乙醇，所得溶液中加入29.17g正硅酸乙酯，1000rmp预水解30min，再加入P₂O₅4.26g，1000rmp搅拌30min，加入7.08g四水硝酸钙，1000rmp搅拌1h，充分溶解形成清澈凝胶。将制备好的溶胶倒入烧杯，置60℃烘箱中72h，形成凝胶，然后在130℃干燥72h，将凝胶球磨、筛分，并将所得的干凝胶粉在700℃煅烧2h，粉碎得生物活性玻璃微粉。 

该步骤制备后生物活性玻璃的组成和成分比例为SiO₂:CaO:P₂O₅摩尔比=70:15:15 

1.2缓释微球的制备 

精密称取150mgPLGA（分子量5KD）溶于6ml二氯甲烷中。精密称取8mg重组人干扰素微粉与15mg纳米级生物活性玻璃粉混悬于PLGA二氯甲烷溶液中。采用静电纺丝工艺进行微球制备：滴液速度0.5ml/h，电压30KV，针头到接收板距离5cm，相对湿度25%。将液球滴入置有-196℃液氮容器中，将液球冻结固形成球后于-80℃用醇类萃取剂将二氯甲烷带 走，使聚合物产生沉积，微球得以固化；去离子水清洗，离心后冻干得微球粉末。 

2重组人干扰素缓释微球的质量评价 

2.1微球的粒径分布：采用激光光散射仪(CoulterL S-230Particle Size Analyzer,Miami，USA)测定微球平均粒径及粒径分布。 

2.2微球表面形态学观察：微球的表面形态使用扫描电子显微镜进行观察。 

2.3微球的载药量和包封率的测定精密称取含药微球约10mg，加入5.0ml0.1mol/LNaOH(含有0.5%(w/v)SDS),37℃水浴振荡24h，使微球完全溶解，盐酸调节pH至中性，取上清液采用BCA Kit法进行蛋白含量测定，并计算载药量和包封率。 

2.4微球的体外药物释放：精密称取含药微球20mg置于5ml10mmol/L pH7.4缓冲液(含0.02％叠氮钠作为抑菌剂，0.02％F-68润湿剂)作为释放介质，置于恒温水浴摇床中，在100rpm振荡速度、37℃±0.5℃温度条件下进行微球的体外释放度测定。用BCA Kit法测定上清液中重组人干扰素的浓度，计算累计释药百分数。采用FTIR和UVCD考重组人干扰素的2级与3级空间立体结构的保持。结果见附图3～4。 

如上所述，本发明的包含蛋白、多肽类药物的的无机、有机物复合缓释微球可以实现蛋白、多肽类药物在储存与释放过程中的活性保持。 

虽然已经根据上述特定的实施方案叙述了本发明，但应该承认，本领域技术人员可能对本发明做出各种修饰和转变，而这些修饰和转变同样属于所附权利要求书所定义的本发明的范围内。 

Claims (6)

1. 一种可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）纳米生物活性玻璃制备：

1)取一定量的浓硝酸与乙醇混合均匀，得到溶液1；

2)溶液1加入正硅酸乙酯，1000rmp预水解30min，得到溶液2；

3)向溶液2中再加入P₂O₅，1000rmp搅拌30min，得到溶液3；

4)向溶液3中加入四水硝酸钙，1000rmp搅拌1h，充分溶解形成清澈溶胶；

5)将步骤4中制备好的溶胶倒入烧杯，置60℃烘箱中72h，形成凝胶；

6)将步骤5中得到的凝胶在130℃干燥72h；

7)将步骤6所得凝胶球磨、筛分，并将所得的干凝胶粉在700℃煅烧得到纳米生物活性玻璃；

（2）蛋白、多肽缓释微球的制备

   1) 将蛋白、多肽类药物和纳米生物活性玻璃混悬于含有PLGA或者PLA的有机溶剂；

   2) 将步骤1)中混悬液通过静电纺丝装置制备不同粒径的液球；

   3) 将步骤2)中制备的液球滴入置有-196℃液氮容器中，将液球冻结固形成球；

   4 )将步骤3)中容器至于-60℃~-90℃低温环境中，用醇类萃取剂将有机溶剂带走，使聚合物产生沉积，微球得以固化；

   5) 用去离子水清洗步骤4）中固化的微球，离心后冻干保存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在所述（2）的步骤1）中所采用的有机溶剂选自二氯甲烷，氯仿，丙酮，乙醇，六氟异丙醇，三氟乙醇中的一种或几种混合物。

3.根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于：在所述（2）的步骤2）中，混悬液通过静电纺丝装置制备不同粒径的液球的工艺条件为：滴速为0.5 ml/h~10 ml/h，电压为3kV~30 kV，针头到接收板距离为5~30cm，相对湿度为15%~50%。

4.一种可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球，其特征在于，按重量份计，包括蛋白或多肽类药物5～30份 ，聚乳酸类生物降解材料30～90份，纳米生物活性玻璃5～50份。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白或多肽类药物是醋酸亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、胰岛素、骨胶原形成蛋白、血管生长因子、艾赛那肽、醋酸奥曲肽、降钙素、重组人生长激素或重组人干扰素。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述生物活性玻璃的组成成分组成比例：SiO_2, CaO和P2O₅；SiO₂: CaO: P2O₅ 摩尔比在26:70:4～70:15:15。

Images