CN103476411B - 标靶人类胸腺核苷酸激酶诱导恶性肿瘤中的dna修复毒性 - Google Patents

Abstract

本发明是关于新颖的TMPK抑制剂组成物，及其使用方法。尤其，本发明是关于新颖的TMPK抑制剂组成物，及其造成肿瘤细胞中dUTP-介导的DNA修复，且做为一种新颖化疗增敏剂的治疗制剂，它们可用于治疗或预防癌症的方法。

Description

标靶人类胸腺核苷酸激酶诱导恶性肿瘤中的DNA修复毒性

相关申请的交叉引用

本申请依据2010年11月29日美国第61/417,648号申请案，其相关内容已纳入供参考。

本发明是由中国台湾卫生研究院NHRI-EX-100-10005NI计划案、NSC96-2628-B-002-079-MY2计划案所补助，以及由中国台湾教育部资助阳明大学的顶尖大学计划所补助。

发明所属的技术领域

本发明是关于新颖的TMPK抑制剂组成物，及其使用方法。尤其，本发明是关于新颖的TMPK抑制剂组成物，合成方法，及其伴随核醣核苷酸还原酶活性增高而造成恶性肿瘤细胞中dUTP-介导的DNA修复的治疗制剂。此类新颖的TMPK抑制剂组成物及治疗制剂，可作用做为一种新颖的化疗增敏剂，可用于治疗或预防癌症的方法中。

有关癌症化疗的主要问题在于，正常组织中肿瘤细胞与快速分裂细胞之间欠缺差异化。此会造成实质上的副作用，而可能在长期治疗下导致由该项治疗所诱发的继发性癌症。化学治疗剂常会造成一般性细胞毒性，且由于有数种DNA修复途径的存在，能使肿瘤细胞藉由移除损伤而得以存活(Helleday等人,2008)。

背景技术

已鉴定出针对检查点途径或DNA修复机制的小分子抑制剂，且已使用于临床试验做为细胞的放射治疗-或化学治疗的增敏作用化合物(Bolderson等人,2009)。基于在肿瘤生成期间检查点与DNA修复变化之间的差异，可发现这些策略会随着肿瘤的检查点脉络种类不同(Jackson与Bartek,2009；Jiang等人,2009)，而使得治疗效果不同。

再者，DNA损坏反应的乱序排列会在治疗期间造成DNA错误不断累积，而可能诱发继发性肿瘤发展(Mimeault等人,2008)。于是，研发一种不会中断检查点网络，而能以低副作用专一性诱导癌症细胞死亡的化疗增敏疗程，是重要的。

于DNA修复过程中的一项重要程序为，供给平衡且足够量的四种dNTPs(Niida等人,2010b)。由核醣核苷酸还原酶(RNR)-介导的还原作用，不仅可直接从对应的NDPs产生dADP、dGDP与dCDP，亦会产生dUDP(Nordlund与Reichard,2006)。RNR是由R1与R2次单位所组成，其中R2的量是受细胞周期调控(Bjorklund等人,1992；Engstrom等人,1985)，且往往在肿瘤细胞中被增高(Jensen等人,1994；Zhang等人,2009)。已有报导指出，R2过量表现会产生致癌可能性(Fan等人,1998)。有一种R2类似物(p53R2)可取代R2来形成RNR酵素，且其功能对于静止态细胞的DNA修复是很重要的(Hakansson等人,2006；Pontarin等人,2011)。核苷酸二磷酸激酶会将所有这些dNDPs转化成dNTPs，包括dUTP(Mathews,2006；Reichard,1988)。由dUTPase进行的dUTP的焦磷酸分解作用，或dCMP的脱胺作用会形成dUMP，其再由胸腺核苷酸合成酶(TS)转化成dTMP(Mathews,2006;Reichard,1988)。胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的作用也会从胸腺嘧啶核苷产生dTMP(Arner与Eriksson,1995)。胸腺核苷酸激酶(TMPK)接着催化dTDP的形成(Ostermann等人,2000；Reichard,1988)。因此，dTDP是唯一的dNDP，其形成不能直接从RNR反应衍生出来。

熟知的抗癌疗法常会直接诱发基因毒性(Garg等人,2010)。举例而言，胸腺核苷酸合成酶(TS)抑制剂(5-FU或5-FdUrd)会阻断dUMP转化成dTMP，而造成dUTP累积以及5-FdUTP形成(Longley等人,2003)。因为DNA聚合酶无法辨别dUTP和dTTP(Bessman等人,1958；Mosbaugh,1988)，所以过量的dUTP与5FdUTP会被错误嵌入DNA中，而引发因DNA损坏所诱导的细胞死亡(Ahmad等人,1998)。结果，此类抗-代谢物会由于错误的核苷酸嵌入，而产生过度的DNA损坏并造成癌细胞死亡，然而同时对正在生长的正常细胞而言，亦具有高毒性(Ahmad等人,1998)。

已知，增生细胞中的双股断裂(DSBs)主要是经由同源重组作用(HR)进行修复，其中单一DSB就需要1万个以上新的dNTPs嵌入(Robert等人,2011；SanFilippo等人,2008)。因此，在供给dNTPs方面的功能对于HR修复是必要的(Burkhalter等人,2009)。报告指出，独立地阻断RNR会诱导产生DNA损坏讯号及复制逆境(Helleday等人,2008)。因为dTDP形成特别需要TMPK功能，故我们推测阻断TMPK可能会减少DSBs修复的效能，而使肿瘤细胞对基因毒性损伤敏感。

于是，有需要研发出能诱导癌细胞死亡的治疗制剂，当单独或与其他抗癌疗法组合使用时，亦能同时减低由此类治疗所造成的毒性作用。

发明内容

本发明提供新颖的组成物，其合成方法及其使用方法。更特别地，本发明已鉴定得到包含TMPK抑制剂的新颖组成物与治疗制剂，及其用于治疗或预防癌症的方法。

本发明提供一种用于抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)的组成物，其包含一治疗上有效量的式(I)化合物：

其中

X＝CH或N；

Y＝S、O、C＝O或NR⁵，其中R⁵为选自氢、一直链、支链或环状烷基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳烯基、芳基、杂芳基的取代基，视需要经一或多个诸如卤素、烷基、羟基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基的取代基取代；

R¹、R²、R³及R⁴为独立地选自氢、一直链、支链或环状烷基、一直链、支链或环状烯基、一直链、支链或环状烷氧基、氟化烷基、过氟化烷基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基、芳基、杂芳基的取代基，视需要经一或多个诸如卤素、烷基、羟基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基的取代基取代；

或其医药上可接受的盐类、水合物或溶剂合物。

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于有些具体实施例，本发明的组成物能够抑制TMPK活性。于其他具体实施例，本发明的组成物能够抑制细胞中的dTTP含量。于有些具体实施例，本发明的组成物能够抑制肿瘤生长、DNA损坏检查点、DNA错配修复、核苷酸切割修复、双股断裂修复、DNA解螺旋酶功能、讯号传递、细胞周期调控或细胞凋亡。

于有些具体实施例，该双股断裂修复可能与放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法关连。于有些具体实施例，该化学疗法包含以亚德里亚霉素进行的治疗。

于有些具体实施例，本发明的组成物选择性地将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞。

于有些具体实施例，本发明的组成物能够使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法敏感。于有些具体实施例，该化学疗法包含以亚德里亚霉素进行的治疗。

于有些具体实施例，本发明的组成物不会导致基因毒性副作用。

于有些具体实施例，本发明的组成物具有IC₅₀值为约10μM或以下。于有些具体实施例，其具有IC₅₀值为约5μM或以下。于有些具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约1μM或以下。于有些具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约0.5μM或以下。又于其他具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约0.25μM或以下。于其他具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约0.1μM或以下。

于有些具体实施例，本发明的组成物每日投药一次，连续投药3天。于有些具体实施例，本发明的组成物每日投药一至二次。于有些具体实施例，本发明的组成物以约5mg/kg至约30mg/kg的剂量投药。

本发明进一步提供一种包含本发明所述组成物与医药上可接受的载体的医药组成物。

本发明进一步提供一种制造本发明所述组成物的方法，其包含如图1所示的步骤a-u。

本发明进一步提供一种使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法增敏的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的本发明组成物。

本发明亦提供一种使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法增敏的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的抑制TMPK活性的药剂。于有些具体实施例，该药剂为本发明的组成物。

本发明进一步提供一种防止癌细胞进行双股断裂修复的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的本发明组成物。

本发明亦提供一种选择性地将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的本发明组成物。

于有些具体实施例，该癌细胞选自乳癌细胞、肝肿瘤细胞、大肠癌细胞、胰脏癌细胞、食道癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、直肠癌细胞、肾脏癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌细胞及子宫内膜癌细胞。

于有些具体实施例，该方法进一步包含将该癌细胞曝露于至少一种选自抗癌剂、抗病毒剂、消炎药及免疫抑制剂的额外治疗剂。

本发明亦提供一种于有需要的个体中治疗或预防癌症的方法，其包含将一治疗上有效量的本发明组成物投药予该个体。

于有些具体实施例，该组成物经由吸入、鼻液剂、气溶胶喷雾、口服、静脉内、腹膜内、皮下，经由持续释放系统或其组合形式进行投药。

于有些具体实施例，该方法进一步包含施予至少一种选自放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法的额外抗癌治疗法。

于有些具体实施例，该抗癌治疗法于投药该组成物之前进行。于有些具体实施例，该抗癌治疗法与该组成物的投药同时进行。

于有些具体实施例，该癌症选自乳癌、肝肿瘤、大肠癌、胰脏癌、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、直肠癌、肾脏癌、甲状腺癌、脑癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌及子宫内膜癌。

于有些具体实施例，该个体为哺乳动物。

参考以下描述的详细说明、实施例及从属的权利要求，将可更加了解本发明的其他特征、目的与优点。

附图说明

图1.本发明的TMPK抑制剂衍生物化合物的合成流程。

图2.抑制TMPK表现会造成具有dUTP嵌入的DSB修复。(A)在以siRNA进行TMPK缄默达24小时后，将U2OS-DR-GFP细胞以pCBA-I-SceI质体转感染。经过48小时后，藉由流动式细胞计数分析测量GFP+频数。数据是以平均值±s.d.表示，n=3。收取一部分细胞进行分析。(B-D)将无及具有TMPKshRNA稳定表现的MDA-MB231细胞暴露至亚德里亚霉素(0.1μM)处理4小时，并藉由以新鲜培养基冲洗而使其复原，以供进行(B)γH2AXfoci染色(图中尺标为5μm)。(C)Rad51foci染色(图中尺标为20μm)。(D)XRCC1foci染色(图中尺标为5μm)。对每一实验，计数超过100个细胞(n=3)。由西方墨点分析结果显示TMPK的表现量。(E)将细胞以慢病毒LacZ或UNGshRNA感染8hr小时。经过24小时后，使细胞从亚德里亚霉素处理后复原，将其固定后进行XRCC1foci染色(图中尺标为5μm)。插图显示以RT-PCR表示UNG与TMPKRNA转录产物的量。对每一实验，计数超过100个细胞(n=3)。(F)将细胞依照指示以pEGFP-C1、野生型pEGFP-dUTPase(wt)及催化-失效的pEGFP-dUTPase(KD)转感染，随后以亚德里亚霉素处理24小时并使其复原。将细胞经由XRCC1foci染色(图中尺标为10μm)分析。对于每一实验，计数70～100个GFP-阳性细胞(n=3)。插图显示以西方墨点法表示TMPK的量。

图3.抑制TMPK表现对于DNA损坏反应中存活率的影响。(A)将亲本MDA-MB231及表现TMPKshRNA的稳定选殖纯系，以每孔1,000个细胞的密度植入96孔平盘中，以藉由MTS分析进行细胞生长分析。(B)将这两种细胞的隔夜培养物暴露至亚德里亚霉素(0.1μM)处理达4小时，之后藉由以新鲜培养基冲洗将药物去除，经过48小时后，藉由MTS分析测定细胞存活率。数据是以4次实验的平均值±s.d.表示。

图4.重组人类dUTPase活性的测量。(A)重组人类GST-dUTPase融合蛋白是通过亲和性层析术后，使用麸胱甘肽将其从麸胱甘肽-sepharose溶析出。将蛋白质于10%SDSPAGE上进行分离，并以考玛斯蓝染色。(B)经由测量于各别含有0.25μgdUTPase的反应中的PPi浓度，计算出酵素比活性(数据以平均值±s.d.表示，n=3)。

图5.野生型dUTPase的过量表现会减低XRCC1foci形成并复原持续的损坏讯号。将亲本MDA-MB231及稳定表现TMPKshRNA的选殖细胞，以所指示的质体进行转感染。经隔夜培养后，将细胞暴露至亚德里亚霉素(0.1μM)处理达4小时并使其复原。经过24小时复原后，将细胞以XRCC1及H2AXfoci染色进行分析。以XRCC1foci>5、γH2AXfoci>10对于GFP-阳性细胞数目的定量结果，显示于上图。代表的影像显示于下图。数据以平均值±s.d.表示，n=3；***，P<0.001基于双尾Student’s的t-测试。对于每一实验，计数70～100个GFP细胞。图中尺标为10μm。

图6.TMPK与RNR于DNA损坏处对于修复作用的功能协调。(A)将MDA-MB231细胞以pEGFP-TMPK(WTorD15R)转感染，随后暴露至亚德里亚霉素处理，并依照图2B的说明使其复原。将细胞固定以进行γH2AXfoci染色。图中尺标为20μm。对每一实验，计数超过100个GFP-阳性细胞(n=3)。(B)将无及具有TMPKshRNA稳定表现的MDA-MB231细胞以pCMV2-YFP-Nuc(载体)或pCMV2-YFP-Nuc-R1C(R1C)质体进行转感染。(C)依照指示将MDA-MB231细胞以pEGFP-TMPK(D15R)与pCMV2-YFP-Nuc-R1C(R1C)质体组合进行转感染。将细胞暴露至亚德里亚霉素处理并使其复原24小时之后，藉由γH2AXfoci染色进行分析(图中尺标为5μm(B)，而于(C)为10μm)。对于每一实验，计数超过100个YFP或GFP阳性细胞(n=3)。(D)将HEK293T细胞以pEGFP-C1或pEGFP-I-PpoI进行转感染。经过18小时后，收集细胞并用于以所指定的抗体，使用邻接于单一染色体1上I-PpoI裂解部位(280bp5’至I-PpoI切位)的引子对进行qChIP分析。GAPDH是做为基因DNA组对照组，因为其不含I-PpoI切位。数据以IgG对照组正常化。数据以平均值±s.d.表示，n=3。(E)将细胞平布于类玻璃培养盘进行微波照射。待复原5分钟后，将细胞固定以进行γH2AX、TMPK及R2染色，并以FluoView1000共聚焦显微镜(Olympus)观察。图中尺标为10μm。

图7.抑制TMPK的表现对于细胞的dTTP含量及细胞生长的影响。(A)将稳定表现TMPKshRNA的HCT-116p53^-/-进行萃取供测定dTTP含量。(B)取一定比例的细胞植入96-孔平盘中。以MTS分析测量于指定时间的细胞生长，数据是以相对于第0天的数值(任意设定为1)表示(平均值±s.d.表示，n=3；每项分析进行四重复)。插图表示以WB分析所得的TMPK含量。

图8.已纯化的hTMPK活性分析。使用熟知的分析测定GST-TMPK(WT)及GST-TMPK(D15R)突变型蛋白质的活性。

图9.GFP-TMPK的催化性失效对于细胞的dTTP含量的影响。于以GFP或GFP-TMPK(D15R)转感染72小时后，收取细胞进行WB分析(A)及dTTP含量测定(B)(数据以平均值±s.d.表示，n=3)。

图10.细胞的R2含量与DNA修复时的TMPK需求成正比。(A)将MCF-7、H184B5F5/M10及MCF-10A细胞以TMPKsiRNA转感染，并依照图2B的说明暴露至亚德里亚霉素处理，及使其复原以进行γH2AXfoci染色(图中尺标为20μm)。对于每一实验，计数超过100个细胞(n=3)。(B-C)依上述将MDA-MB231、MCF-7、H184B5F5/M10及MCF-10A细胞暴露至亚德里亚霉素处理并使其复原。于指定的时间点收取细胞，进行西方墨点分析(B)及流动式细胞计数分析(C)。(D)将细胞以每孔1,000个细胞的密度植入96孔平盘中，以MTS分析细胞生长。于TMPKsiRNA转感染36小时后，将H184B5F5/M10细胞以500ng/ml诺考达唑处理过夜，以增加S/G2细胞。收取一定比例的细胞进行西方墨点及FACS分析(E)。将细胞暴露至亚德里亚霉素(0.2μM)处理2小时，并藉由补满新鲜培养基而使其复原。于指定的时间点将细胞固定，以进行γH2AXfoci染色及FACS分析(F)。对于每一实验，计数超过200个细胞(n=3)。

图11.R2表现量对于因抑制TMPK表现所诱导的DNA修复伤害的帮助。将MCF-7细胞以TMPK、R2或TMPK/R2的siRNA进行转感染。于转感染后36小时，收取一定比例的细胞进行(A)西方墨点法及(B)FACS分析。(C)将剩余细胞暴露至亚德里亚霉素(0.1μM)处理4小时。于指定的时间点，将细胞以γH2AXfoci染色进行分析(图中尺标为20μm)。(D)对于每一实验，计数超过200个细胞(n=3)。(E)将经由慢病毒感染稳定表现mCherry或mCherry-R2的MCF-10A细胞以TMPKsiRNA转感染，接着进行亚德里亚霉素处理并使其复原。经过24小时复原后，将细胞固定以进行γH2AXfoci染色(图中尺标为20μm)，并收取细胞进行西方墨点及FACS分析。对于每一实验，计数超过150个细胞(n=3)。

图12.新颖hTMPK抑制剂的鉴定。(A)藉由结合荧光素酶的分析筛选TMPK抑制剂。(B)YMU1(化合物21)及相关分子的化学结构。(C)YMU1与衍生物化合物对于hTMPK的抑制作用，使用纯化的hTMPK蛋白(0.5μg)于反应前先经10分钟前培养，利用结合荧光素酶的TMPK分析进行测定。(D)YMU1对于纯化TMPK(0.5μg)及GST-hTK1蛋白(5μg)的活性的影响，于反应前先经10分钟前培养。数据以平均值±s.d.表示(n=4)。(E)TMPK-YMU1复合体的分子模型。左图组：TMPK/ATP/Mg⁺²；右图组：TMPK/YMU1。TMPK以表面静电位(上图)及结构彩带(下图)呈现。ATP与YMU1分别以带有彩色原子(O，红色；S，黄色；P，橙色)的绿色及蓝色棒表示。TMP以白色骨架而Mg⁺²以紫色显示。箭号表示Asp15的位置。

图13.YMU1对于细胞dTTP含量的影响。将HCT-116p53-/-细胞有或无以TMPKsiRNA转感染2天，并以载体或YMU1处理。经过小时后，收取细胞进行西方墨点分析及含量测定(平均值±s.d.，n=3；**，P<0.01基于双尾Student’st-测试)。

图14.YMU1对于基因组毒性及DNA修复的影响。(A)将HCT-116p53-/-细胞以TMPK或TS的慢病毒shRNA感染。平行地，将细胞以YMU1(2μM)处理2天，或是以5-氟-2’脱氧尿核苷(FdUrd,2μM)处理1天。将这些细胞固定，以进行γH2AXfoci染色及西方墨点分析。(B)将H184B5F5/M10细胞以5,000细胞/盘的密度接种于100mm-培养盘上。将MCF-10A、MCF-7及HCT-116p53^-/-细胞以600细胞/孔的密度接种于6孔平盘中。于隔夜培养后，将细胞以各种浓度的YMU1或FdUrd处理，每周三次。经过14天后，将细胞群落固定，以结晶紫染色。(C)将细胞以载体或YMU1(2μM)前处理72小时，之后以亚德里亚霉素(0.1μM)处理。从亚德里亚霉素处理解放后，于指定的时间点将细胞固定，以进行γH2AXfoci染色。对于每一实验，计数超过100个细胞(n=3)。(D)MDA-MB231细胞于载体或YMU1(2μM)处理48小时后，以pEGFP-N1或pEGFP-TMPK质体进行转感染。经过夜培养后，将细胞暴露至亚德里亚霉素处理并使其复原。于24小时，将细胞以γH2AXfoci染色进行分析。对于每一实验，计数70～100个GFP阳性细胞(n=3)。(E-F)将以载体或YMU1(2μM)前处理72小时的MDA-MB231细胞暴露至亚德里亚霉素处理并使其复原，以供进行(E)Rad51foci(F)XRCC1foci染色。对于每一实验，计数超过100个细胞(n=3)。(G)将细胞以慢病毒的LacZ或UNGshRNA感染8小时。经过暴露至亚德里亚霉素处理，并使其复原24小时后，将细胞固定以进行XRCC1foci染色。插图显示经由RT-PCR所测得的UNGRNA转译产物含量。对于每一实验，计数超过100个细胞(n=3)。(H-I)将以YMU1(2μM)前处理48小时的MDA-MB231细胞，以所指定的质体或shRNA进行转感染。经过夜培养后，将细胞暴露至亚德里亚霉素处理并使其复原。经过24小时后，将细胞以γH2AXfoci染色进行分析。对于每一实验，计数70～100个GFP或YFP阳性细胞(n=3)。

图15.于MDA-MB231细胞中因YMU1处理造成的DNA修复效率受减损。于移除亚德里亚霉素(0.1μM)后，在所指定的时间藉由彗星分析(cometassay)测量MDA-MB231细胞内的DNA修复效率。藉由使用用于测定尾面力矩的接穗(scion)影像软件，获取DNA彗星的影像。数据以平均值±s.d.表示，其是藉由在3次独立实验中，于每一样本计数至少70个彗星而得。**，P<0.01基于双尾Student’st-测试。

图16.YMU1对于亚德里亚霉素增敏作用的活体外及活体内功效。(A)将一组平行进行的细胞株以载体、YMU1(化合物)、D6(4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-羧酸乙酯)或D7(化合物28)前处理3天，并暴露至不同浓度的亚德里亚霉素处理达4小时。从亚德里亚霉素处理复原48小时后，将细胞以新鲜培养基清洗供进行MTS分析，并测定亚德里亚霉素的IC₅₀值。计算出于各细胞株中亚德里亚霉素敏感度的增强(倍数)。数据以平均值±s.d.表示，n=3；每一项实验进行四重复。插图显示亚德里亚霉素于各种细胞株的IC₅₀值。(B)以载体或YMU1处理72小时后，将细胞暴露至0.1μM亚德里亚霉素处理4小时，然后以5,000细胞/盘的密度，接种于100mm-培养盘上。经过夜培养后，将细胞以生长培养基再生。培养天14后，将细胞群落固定，以结晶紫染色并计算群落数目。(C)将HCT-116p53^-/-细胞经皮下植入Balb/c裸鼠的右腹胁部(每一实验组n=8)。箭号指示终止药物处理的时间。依本发明说明中方法段落中所述估计肿瘤体积。(D)从该处理复原2星期后，将小鼠牺牲以测量肿瘤重量。数据以平均值±s.e.m表示；**，P<0.01基于双尾Student’st-测试。(E)左图组显示肿瘤的K_i67增生标记染色结果。图中尺标为50μm。(F)于恶性癌细胞中由YMU1引起的亚德里亚霉素增敏作用的模式。R2/R1与TMPK皆被补充到诱导的双股断裂部位，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP在特定位置被合成。抑制TMPK会减低于DNA损坏部位的dTTP形成，而造成因dUTP嵌入所致的无效DNA修复。

图17.由YMU1引起的亚德里亚霉素增敏作用是透过TMPK抑制。以TMPKsiRNA转感染2天后，将MDA-MB231细胞以载体或YMU1(2μM)前处理72小时，之后以0.1μM亚德里亚霉素处理，并在与新鲜培养基培育48小时后进行细胞存活分析(平均值±s.d.，n=3；每一项实验进行四重复)。收集一部分细胞用于西方墨点法分析。

图18.经由dUTPase的过量表现而对以YMU1处理产生的亚德里亚霉素增敏作用造成逆转作用。从亚德里亚霉素处理复原48小时后，将MDA-MB231细胞以AnnexinV-PE染色以进行细胞凋亡分析。显示于AnnexinV-PE染色中呈现阳性的GFP细胞的百分比(平均值±s.d.，n=3；*，P<0.05，双尾Student’st-测试，每项实验计数>50个GFP阳性细胞)。

图19.YMU1对dUTPase活性没有影响。将0.1μg纯化的GST-dUTPase蛋白与所指定浓度的YMU1反应10分钟，然后使用dUTPase活性分析作用。

图20.抗体专一性的确认。将细胞以慢病毒TMPKshRNA、dUTPaseshRNA感染，或以R2siRNA转感染。进行感染或转感染72小时后收取细胞，使用所指定的抗体进行WB分析。

具体实施方式

在本发明所使用的特殊术语有其原本的意义，如下所用的某些特殊术语是提供熟悉该技艺者能更进一步了解本发明内容。为了方便起见一些特殊术语将会使用斜体字或引号标示出来，但这些被标示出来的部分并不会影响到特殊术语本身的范围或意义，就如同在本文中未被标示的文字一样，也就是说同样的事情会有一个以上的说法。本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。

除非另有规定，本发明所使用的科技术语具有和熟悉本发明所属技艺，具有通常知识者所共通了解的相同的定义。

为有助于了解本专利申请案及容易引述的目的，以下就本发明所使用的一些术语和缩写做出定义。

本发明所使用的术语“治疗”及“处理”意指，将一治疗剂投药或施用予个体，或是对个体进行一种治疗程序或形态，以达到能获得对某一疾病或健康状态的治疗帮助的目的。

本发明所使用的术语“防止”、“抑制”、“减低”或这些术语的任意变化，包括为达到所希望结果的任何可测量到的减少或完全抑制。例如，相较于一般正常活性或征状，可能减少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或以上，或其任何可衍生的范围。

本发明所使用的术语“投药”及“递送”是用来描述，藉其可将本发明的组成物投药或递送予个体、标靶细胞或与该标靶细胞直接并列的位置的过程。术语“被投药”与“被递送”可互相交替使用。

本发明所使用的术语“患者”、“治疗对象”与“个体”可于本文互相交替使用，且意指欲接受治疗及/或从其取得生物样本的哺乳动物(例如人类)。

本发明所使用的术语“有效的”意指，足够达成所希望、所预期或所想要的结果的。例如，“有效量”可为某一化合物足以产生治疗帮助的量。

本发明所使用的术语“治疗上有效的”或“治疗上有帮助的”意指，任何可促进或增强个体有关医药治疗或状况的好处的事物。此包括(但不限定于)减少疾病的病征或症状的发生、频数、持续时间或严重性。

本发明所使用的术语“治疗上有效量”意指，本发明的组成物可有效产生所希望的治疗帮助的量。

本发明所使用的术语“诊断的”、“诊断”及“经过诊断的”意指，鉴定出某种致病性状态的存在或特性。

本发明所使用的术语“安全且有效的量”意指，一组成物其足以产生所希望的治疗反应，且相应于本发明所使用的合理帮助/危险比例时，无不适当的有害副作用(例如，毒性、刺激性或过敏反应)的量。

特定的安全且有效的量或治疗上有效的量，将随着诸如欲受治疗的特殊病况、患者的身体状况、欲受治疗的哺乳动物或动物种类、治疗时间、目前接受(若有的话)的疗法性质与所使用的特别配方，及这些化合物或其衍生物的结构等因素而有所差异。

本发明所使用的术语“烷基”(单独或与其他术语结合)意指一饱和脂族烃基，包括具有1至20个碳原子的直键及支链基团(于本文中每逢一数值范围，例如在此所列的"1-20"，则意指该基团(在此情况为烷基)可含有1个碳原子，2个碳原子，3个碳原子，等等，至多且包括20个碳原子)。含有1至4个碳原子的烷基称做低级烷基。当所述的低级烷基不带有取代基时，将它们称做未经取代的低级烷基。更佳地，烷基为一具有1至10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、第三丁基、戊基等类。最佳地，其为一具有1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或第三丁基等类。该烷基可为经取代或未经取代的。当其为经取代，所述的取代基较佳是一或多个(更佳地一至三个，甚至更佳地一或二个)独立选自由卤基、羟基、未经取代的低级烷氧基、视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的芳基、视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的芳氧基、环内具有1至3个氮原子，环内的碳视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的6-员杂芳基、具有1至3个选自氮、氧及硫的杂原子，而该基团中的碳与氮原子是视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的5-员杂芳基、具有1至3个选自氮、氧及硫的杂原子，而该基团中的碳与氮(若存在)原子是视需要地经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的5-或6-员杂环基、巯基、(未经取代的低级烷基)硫基、视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或烷氧基的基团取代的芳基硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-胺甲酰基、N-胺甲酰基、O-硫代胺甲酰基、N-硫代胺甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、N-磺酰胺基、S-磺酰胺基、RS(O)--、RS(O)₂--、--C(O)OR、RC(O)O--、及–NR₁₃R₁₄所组成的组群的取代基，其中R₁₃及R₁₄是独立地选自由氢、未经取代的低级烷基、三卤甲基、环烷基、杂环基及视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或烷氧基的基团取代的芳基所组成的组群。

较佳地，所述的烷基是经一或二个独立选自由羟基、具有1至3个选自氮、氧及硫的杂原子，而该基团中的碳与氮(若存在)原子是视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的5-或6-员杂环基、具有1至3个选自氮、氧及硫的杂原子，而该基团中的碳与氮原子是视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的5-员杂芳基、环内具有1至3个氮原子，环内的碳是视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的6-员杂芳基、或--NR₁₃R₁₄所组成的组群的取代基取代，其中R₁₃及R₁₄独立地选自由氢及烷基。甚至更佳地，所述的烷基是经一或二个各别独立地为羟基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、二丙胺基、吡咯啶基、N-六氢吡啶基、吗啉基、六氢吡井基、4-低级烷基六氢吡井基、苯基、咪唑基、吡啶基、嗒井基、嘧啶基、恶唑基、三井基等类的取代基取代。

本发明所使用的术语“芳香族”、“芳族”或“芳基”(单独或与其他术语结合)意指，其含有6至约14个碳原子的芳香族环基，例如6员单环、10员双环或14员三环的环系。芳香族环的实例包括苯基、萘基、联苯基、茚基及蒽。

本发明所使用的术语“卤素”(单独或与其他术语结合)意指，氟取代基(“氟基”，可书写成--F)、氯取代基(“氯基”，可书写成--Cl)、溴取代基(“溴基”，可书写成--Br)、或碘取代基(“碘基”，可书写成--I)。

本发明所使用的术语“环烷基”意指一3至8员全碳的单环、全碳的5-员/6-员或6-员/6-员稠合的双环、或多环稠合的环(稠合环系意指该系统中的各环与该系统中的另一环共享一对相邻的碳原子)基团，其中一或多个环可含有一或多个双键，但各环皆不具有完全共轭的pi-电子系统。

环烷基的实例为(但不限制于)环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、金刚烷、环庚烷、环庚三烯等类。环烷基可为经取代或未经取代的。当其为经取代时，所述的取代基较佳是一或多个(更佳地一或二个)独立选自，由未经取代的低级烷基、三卤烷基、卤基、羟基、未经取代的低级烷氧基、视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的芳基、视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的芳氧基、环内具有1至3个氮原子，环内的碳视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的6-员杂芳基、具有1至3个选自氮、氧及硫的杂原子，而该基团中的碳与氮原子是视需要地经一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的5-员杂芳基、具有1至3个选自氮、氧及硫的杂原子，而该基团中的碳与氮(若存在)原子是视需要地经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或未经取代的低级烷氧基的基团取代的5-或6-员杂环基、巯基、(未经取代的低级烷基)硫基、视需要经取代一或多个(较佳地一、二或三个)各别独立为卤基、羟基、未经取代的低级烷基或烷氧基的基团取代的芳基硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-胺甲酰基、N-胺甲酰基、O-硫代胺甲酰基、N-硫代胺甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、N-磺酰胺基、S-磺酰胺基、RS(O)--、RS(O)₂--、--C(O)OR、RC(O)O--、及–NR₁₃R₁₄(其中R₁₃及R₁₄如前述所定义)所组成的组群的取代基。

本发明所使用的术语“烯基”(单独或与其他术语结合)意指，由至少两个碳原子与至少一个碳-碳双键所组成的低级烷基(如本文所定义)。代表性实例包括(但不限定于)乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等类。

本发明所使用的术语“炔基”(单独或与其他术语结合)意指，由至少两个碳原子与至少一个碳-碳参键所组成的低级烷基(如本文所定义)。代表性实例包括(但不限定于)乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等类。

本发明所使用的术语“芳基”意指，一群含5至12个具有完全共轭的pi-电子系统的碳原子的全碳单环或稠合多环(亦即，那些共享相邻的碳原子对的环)。芳基基团的实例为(但不限定于)苯基、萘基及蒽基。芳基可为经取代或未经取代的。当其为经取代时，所述的取代基较佳为一或多个(更佳地一、二或三个，甚至更佳地一或二个)独立选自，由未经取代的低级烷基、三卤烷基、卤基、羟基、未经取代的低级烷氧基、巯基、(未经取代的低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-胺甲酰基、N-胺甲酰基、O-硫代胺甲酰基、N-硫代胺甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、N-磺酰胺基、S-磺酰胺基、RS(O)--、RS(O)₂--、--C(O)OR、RC(O)O--、及–NR₁₃R₁₄(其中R₁₃及R₁₄如前述所定义)所组成的组群的取代基。较佳地，所述的芳基是视需要经一或二个独立选自卤基、未经取代的低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰胺基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰胺基的取代基取代。

本发明所使用的术语“杂芳基”意指，一群由5至12个含有一、二或三个选自N、O或S的环杂原子，而剩余的环原子为C，且又具有完全共轭的pi-电子系统的碳原子的单环或稠合多环(亦即，它们共享相邻的碳原子对的环)。未经取代的杂芳基基团的实例为(但不限定于)吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤及咔唑。杂芳基可为经取代或未经取代的。当其为经取代时，所述是取代基较佳是一或多个(更佳地一、二或三个，甚至更佳地一或二个)独立选自，由未经取代的低级烷基、三卤烷基、卤基、羟基、未经取代的低级烷氧基、巯基、(未经取代的低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-胺甲酰基、N-胺甲酰基、O-硫代胺甲酰基、N-硫代胺甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、N-磺酰胺基、S-磺酰胺基、RS(O)--、RS(O)₂--、--C(O)OR、RC(O)O--、及–NR₁₃R₁₄(其中R₁₃及R₁₄如前述所定义)所组成的组群的取代基。较佳地，所述的杂芳基是视需要经一或二个独立选自卤基、未经取代的低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰胺基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰胺基的取代基取代。

本发明所使用的术语“杂环”意指，其环中具有5至9个环原子，而其中一或二个环原子为选自N、O或S(O)n(其中n为0至2的整数)的环杂原子，而剩余的环原子为C。所述的环亦可具有一或多个双键。然而，这些环不具有完全共轭的pi-电子系统。未经取代的杂环基团的实例为(但不限定于)吡咯啶基、N-六氢吡啶基、六氢吡井基、吗啉基、硫代吗啉基、高六氢吡井基等类。杂环可为经取代或未经取代的。当其为经取代时，所述的取代基较佳是一或多个(更佳地一、二或三个，甚至更佳地一或二个)独立选自，由未经取代的低级烷基、三卤烷基、卤基、羟基、未经取代的低级烷氧基、巯基、(未经取代的低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-胺甲酰基、N-胺甲酰基、O-硫代胺甲酰基、N-硫代胺甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、硝基、N-磺酰胺基、S-磺酰胺基、RS(O)--、RS(O)₂--、--C(O)OR、RC(O)O--、及–NR₁₃R₁₄(其中R₁₃及R₁₄是如前述所定义)所组成的组群的取代基。较佳地，所述的杂环基是视需要经一或二个独立选自卤基、未经取代的低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰胺基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰胺基的取代基取代。

较佳地，所述的杂环基是视需要经一或二个独立选自卤基、未经取代的低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰胺基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰胺基的取代基取代。

本发明所使用的术语“羟基”是指--OH基团。

本发明所使用的术语“烷氧基”是指--O-(未经取代的烷基)及--O-(未经取代的环烷基)基团。代表性实例包括(但不限定于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等类。

本发明所使用的术语“芳氧基”是指--O-芳基及--O-杂芳基基团，如前述所定义。代表性实例包括(但不限定于)苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡井氧基等类，及其衍生物。

术语“杂环”、“杂环族”或“杂环基”(单独或与其他术语结合)是指，完全饱和(亦即“杂环烷基”)、非芳香族部分饱和(亦即“杂环烯基”)或杂环芳香族(亦即“杂芳基”)的环结构，代表性地具有3至约20个碳原子，更代表性地具有3至约14个碳原子。例如，所述的杂环可为4至约7员单环环系、7至约11员双环环系或10至约15员三环环系，具有至少一个杂原子位于至少一个含碳原子的环中。含有杂原子的杂环基团的每一环可含有1、2、3或4个选自氮原子、氧原子及/或硫原子的杂原子，其中该氮及硫杂原子可视需要地被氧化，且氮杂原子可视需要地被四级化。所述的杂环基团可于该环或环系中任何杂原子或碳原子处接上取代基。

杂环基可为一单环，代表性地具有3至7个环原子，更代表性地具有3至6个环原子，且甚至代表性地具有5至6个环原子。单环杂环基的实例包括呋喃基、噻吩基(亦已知称为“硫代苯基”与“硫代呋喃基”)、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、异噻唑基、噻恶唑基、恶二唑基(包括1,2,3-恶二唑基、1,2,4-恶二唑基(亦已知称为"azoximyl")、1,2,5-恶二唑基(亦已知称为“呋呫基”)及1,3,4-恶二唑基)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、恶噻唑基、恶三唑基(包括1,2,3,4-恶三唑基及1,2,3,5-恶三唑基)、吡啶基、二井基(包括嗒井基(亦已知称为“1,2-二井基”)、嘧啶基(亦已知称为“1,3-二井基”)及吡井基(亦已知称为“1,4-二井基”))、三井基(包括s-三井基(亦已知称为“1,3,5-三井基”)、as-三井基(亦已知称为“1,2,4-三井基”)及v-三井基(亦已知称为“1,2,3-三井基”)、恶噻井基(包括1,2,5-恶噻井基及1,2,6-恶噻井基)、氧呯基、硫呯基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢噻吩基(亦已知称为“二氢硫代苯基”)、四氢噻吩基(亦已知称为“四氢硫代苯基”)、异吡咯基、吡咯啉基、异咪唑基、咪唑啉基、吡唑啉基、吡唑啶基、二硫杂环己基、氧硫杂环己基、氧硫杂环戊基、恶唑啶基、异恶唑啶基、噻唑啉基、异噻唑啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、二恶唑基(包括1,2,3-二恶唑基、1,2,4-二恶唑基、1,3,2-二恶唑基及1,3,4-二恶唑基)、哌喃基(包括1,2-哌喃基及1,4-哌喃基)、二氢哌喃基、四氢哌喃基、六氢吡啶基、六氢吡井基、恶井基(包括1,2,3-恶井基、1,3,2-恶井基、1,3,6-恶井基(亦已知称为“五恶井基”)、1,2,6-恶井基及1,4-恶井基)、异恶井基(包括o-异恶井基及p-异恶井基)、恶二井基(包括1,4,2-恶二井基及1,3,5,2-恶二井基)、吗啉基、氮呯基及异氮呯基。

单环杂环基的实例包括吡咯啶基、吡咯基、吡唑基、氧杂环丁基、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑啶基、恶唑基、恶唑啶基、异恶唑啉基、异恶唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑啶基、异噻唑基、异噻唑啶基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、恶二唑基、六氢吡啶基、六氢吡井基、2-氧六氢吡井基、2-氧六氢吡啶基、2-氧吡咯啶基、2-氧氮呯基、4-六氢吡啶酮基、吡啶基、吡井基、嘧啶基、嗒井基、四氢哌喃基、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉基砜、硫吗啉基磺胺、1,3-二恶烷及四氢-1,1-二氧噻吩基、噻唑基、噻井基等类。

另供选择地，杂环基可为2至5(更具代表地2或3)个环稠合在一起，例如，吲井基、哌喃并吡咯基、嘌呤基、咪唑并哌井基、咪唑并嗒井基、吡啶并吡啶基(包括吡啶并[3,4-b]-吡啶基、吡啶并[3,2-b]-吡啶基、吡啶并[4,3-b]-吡啶基及奈啶基)、喋啶基、嗒井并四井基、吡井并四井基、嘧啶并四井基、吡啶基、吡唑并嘧啶基、吡唑并吡井基、吡唑并嗒井基或4H-喹井基。于有些具体实施例，所述的多环杂环为吲井基、哌喃并吡咯基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、吡啶基及4H-喹井基。

双环杂环基的实例包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧杂环戊基、苯并噻吩基、昆啶基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并哌喃基、吲井基、苯并呋喃基、色酮基、熏草基、苯并哌喃基、[口]辛喏啉基、喹喏啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(例如呋喃并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶基或呋喃并[2,3-b]吡啶基)、二氢异吲哚基、二氢喹啉基(例如3,4-二氢-4-氧-喹啉基)、四氢喹啉基等类。

三环杂环基的实例包括咔唑基、苯并吲哚基、啡啉基、吖啶基、啡啶基、[口]山基等类。

其他稠环杂环基的实例包括苯并-稠合杂环，例如苯并呋喃基(亦已知称为“熏草基”)、异苯并呋喃基、苯并恶唑基、苯并异恶唑基(亦已知称为“氧杂吲井基”)、蒽啉基、苯并噻吩基(亦已知称为“苯并硫代苯基”、“硫代萘基”与“苯并硫代呋喃基”)、异苯并噻吩基(亦已知称为“异苯并硫代苯基”、“异硫代萘基”与“异苯并硫代呋喃基”)、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、苯并恶二唑基、吲哚基、吲唑基(亦已知称为“苯并吡唑基”)、苯并咪唑基、苯并三唑基、联苯胺基(包括喹啉基(亦已知称为“1-联苯胺基”)与异喹啉基(亦已知称为“2-联苯胺基”))、呔井基、喹喏啉基、苯并二井基(包括[口]辛啉基(亦已知称为“1,2-苯并二井基”)与喹唑啉基(亦已知称为“1,3-苯并二井基”))、苯并咪唑并噻唑基、、咔唑基、吖啶基、异吲哚基、吲哚啉基(亦已知称为“伪吲哚基”)、苯并二恶唑基、克基、异克基、硫代克基、异硫代克基、克烯基、异克烯基、硫代克烯基、异硫代克烯基、苯并二氧杂环己基、四氢异喹啉基、苯并恶井基(包括1,3,2-苯并恶井基、1,4,2-苯并恶井基、2,3,1-苯并恶井基与3,1,4-苯并恶井基)、苯并异恶井基(包括1,2-苯并异恶井基与1,4-苯并异恶井基)、苯并恶二井基及[口]山基等类。于有些具体实施例，所述的苯并-稠合杂环为苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并恶唑基、苯并异恶唑基、蒽啉基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并恶二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、联苯胺基、呔井基、喹喏啉基、苯并二井基、咔唑基、吖啶基、异吲哚基、吲哚啉基、苯并二恶唑基、克基、异克基、硫代克基、苯并二氧杂环己基、四氢异喹啉基、苯并恶井基及[口]山基等类。

本发明所使用的术语“杂芳基”(单独或与其他术语结合)是指，代表性含有5至14个环原子的芳香族杂环基。杂芳基可为单环或多数(代表性地2或3个)稠合环。此部分包括(例如)5-员环如呋喃基、噻吩基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、恶二唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、氧噻唑基及氧三唑基；6-员环如吡啶基、吡井基、嘧啶基、嗒井基、三井基及氧噻井基；7-员环如氧呯基及硫呯基；6/5-员稠合环是如苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并恶唑基、苯并异恶唑基、蒽啉基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲井基、哌喃并吡咯基、苯并恶二唑基、吲哚基、异吲唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、嘌呤基、咪唑并吡井基及咪唑并嗒井基；及6/6-员稠合环系如喹啉基、异喹啉基、吡啶并吡啶基、呔井基、喹喏啉基、苯并二井基、咔唑基及吖啶基。于有些具体实施例，所述的5-员环包括呋喃基、噻吩基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、异噻唑基、恶二唑基、吡唑基及咪唑基；6-员环包括吡啶基、吡井基、嘧啶基、嗒井基及三井基；6/5-员稠合环是包括苯并恶唑基、苯并异恶唑基、蒽啉基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、及嘌呤基；且6/6-员稠合环是包括喹啉基、异喹啉基及苯并二井基。

杂芳基基团的实例包括吡咯基、吡唑基、咪唑基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、恶二唑基、吡啶基、吡井基、嘧啶基、嗒井基、三唑基、三井基等类。

本发明所使用的术语“氢”(单独或与其他术语结合)是指氢取代基，且可书写成–H。

本发明所使用的术语“羟基”(单独或与其他术语结合)是指–OH。

本发明所使用的术语“硝基”(单独或与其他术语结合)是指–NO₂。

本发明所使用的术语“取代”是指化合物具有一个包含至少一个键结到一或多个氢原子上的碳、氮、氧或硫原子的取代基。若叙述一取代基是经取代的，则有一非氢取代基取代了原位于该取代基的碳、氮、氧或硫上的氢原子。因此(例如)，经取代的烷基取代基为其中有至少一个非氢取代基，取代了位于该烷基取代基的氢原子。举例而言，单氟烷基为经一个氟基取代的烷基，而二氟烷基为经两个氟基取代的烷基。应了解，一取代基若有一个以上取代，则各别非氢取代基可为相同或相异(除非有另外指定)。

本发明所使用的术语“接触”与“暴露”当应用于细胞时，是用来描述一种藉其将本发明的化合物投药或递送至标靶细胞，或是将其置入与该标靶细胞直接并列的位置的过程。术语术语“投药”及“递送”可与“接触”及“暴露”互相交替使用。

若叙述一取代基“视需要经取代的”，则该取代基为(1)经取代的或(2)未经取代的。当一群取代基的成员一般性被叙述成视需要经取代的，此群的各成员中任何能够取代的原子可为(1)经取代的或(2)未经取代的。此特征描述预期，该群中有些成员是不可取代的。能够取代的原子包括(例如)与至少一个氢结合的碳，与至少一个氢结合的氧，与至少一个氢结合的硫，或与至少一个氢结合的氮。另一方面，单独的氢、卤素、氧基及氰基并不属于能够取代的定义中。

虽然这些与本发明所述类似或相等的方法及组成物可用于实施或测试本发明，以下仍叙述适合的方法及组成物。

应特别理解，关于本发明一项具体实施例所讨论的任何限制，可应用于本发明的任何其他具体实施例。此外，本发明的任何组成物可用于本发明的任何方法中，而本发明的任何方法可用于制造或使用本发明的任何组成物。

以下所论述的特别实施例仅为说明的目的，而无意限制本发明的范围。

TMPK及TMPK抑制剂

本发明是关于包含TMPK抑制剂的新颖组成物与治疗剂，以及其用于治疗或预防癌症的方法。特别地，本发明揭示胸腺核苷酸激酶(TMPK)对于dTDP形成很重要，而dADP、dGDP、dCDP及dUDP能直接在，由核醣核苷酸还原酶(RNR)催化的反应中产生。本发明报导TMPK与RNR会在DNA损坏部位结合，且于肿瘤细胞中干预TMPK的功能，会经由造成dUTP嵌入而影响DNA双股断裂的修复。于肿瘤细胞中，可经由破坏RNR损坏部位的补充，或减少RNR的R2次单位表现量来防止这些dUTP-介导的损伤，表示提升DNA损坏部位的RNR功能，会助长在损伤DNA的修复过程中嵌入dUTP，而造成有毒的修复。

利用RNA干扰，本发明提出抑制TMPK表现会显着增加，HCT-116结肠癌细胞对亚德里亚霉素(一种诱导DNA(DSBs)的拓扑异构酶II抑制剂)的敏感性，而与p53状态无关(Hu与Chang,2008)。比较上，因为有TK-介导dTMP的形成的补充，抑制TS表现在使p53-缺陷细胞对亚德里亚霉素增敏的功效上比较有限。重要地，本发明提出抑制TMPK表现(本身)不会活化DNA损坏反应。因此其与熟知抗癌疗法中所使用的抗代谢物(直接诱发基因毒性)，有相当不一样的执行功能方式(Garg等人,2010)。

不像阻断RNR，会随着DNA损坏反应而导致复制逆境(Helleday等人,2008)，TMPK表现受抑制的细胞仍然能增生且存活(Hu与Chang,2008)。TMPK在dTDP形成中提供基本必要的功能，因此，人类肿瘤细胞可能含有同工型的原因，造成特定TMPK已消损的细胞仍具有生长能力。然而，很难了解为何抑制TMPK表现(如同阻断RNR)，会深深地影响肿瘤细胞的DNA修复。最近一篇报告证明，经由R1次单位的C-端区域与Tip60相互反应，可使RNR转移至DNA损坏部位(Niida等人,2010a)。破坏RNR补充至DNA损坏部位，会影响细胞中的DSBs修复，这是由于在G0/G1期dNTP库的含量低，使得在这些细胞中特别需要由RNR制造dNTPs以供DNA修复(Hakansson等人,2006)。本发明例举说明，TMPK与DNA损坏部位的关联，且RNR的R2在DNA损坏部位的高度表现，若无结合TMPK的功能，则于增生的肿瘤细胞中，会因dUTP嵌入而导致有毒的修复。因此本发明提出，肿瘤细胞R2含量增加，会使TMPK成为增强亚德里亚霉素作用的标靶。

本发明提供鉴定新颖TMPK抑制剂，其可于活体外籍活体内使肿瘤细胞对亚德里亚霉素敏感，但不会在细胞或小鼠中产生基因毒性作用。因此，本发明所述的新颖抑制剂，可使温和剂量的亚德里亚霉素治疗，引发肿瘤产生反应而致死，同时在正常不断生长性细胞中有最低副作用，对于温和抗癌疗法方面提供一个新的契机。

于是，本发明提供可用于治疗或预防癌症的新颖TMPK抑制剂。

于本发明的一项具体实施例是提供一种抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)的组成物，其包含治疗上有效量的式(I)化合物：

其中

X＝CH或N；

Y＝S、O、C＝O或NR⁵，其中R⁵为选自氢、一直链、支链或环状烷基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳烯基、芳基、杂芳基的取代基，视需要经一或多个诸如卤素、烷基、羟基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基的取代基取代；

R¹、R²、R³及R⁴为独立地选自氢、一直链、支链或环状烷基、一直链、支链或环状烯基、一直链、支链或环状烷氧基、氟化烷基、过氟化烷基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基、芳基、杂芳基的取代基，视需要经一或多个诸如卤素、烷基、羟基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基的取代基取代；

或其医药上可接受的盐类、水合物或溶剂合物。

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含下列结构：

于本发明的有些具体实施例，该组成物包含至少一种下列结构：

于有些具体实施例，本发明的组成物能够抑制TMPK活性。于其他具体实施例，本发明的组成物能够抑制细胞中的dTTP含量。于有些具体实施例，本发明的组成物能够抑制肿瘤生长、DNA损坏检查点、DNA错配修复、核苷酸切割修复、双股断裂修复、DNA解螺旋酶功能、讯号传递、细胞周期调控或细胞凋亡。

于有些具体实施例，该双股断裂修复可能与放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法关连。于有些具体实施例，该化学疗法包含以亚德里亚霉素进行的治疗。

于有些具体实施例，本发明的组成物选择性地将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞。

于有些具体实施例，本发明的组成物能够使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法敏感。于有些具体实施例，该化学疗法包含以亚德里亚霉素进行的治疗。

于有些具体实施例，本发明的组成物不会导致基因毒性副作用。

于有些具体实施例，本发明的组成物具有IC₅₀值为约10μM或以下。于有些具体实施例，其具有IC₅₀值为约5μM或以下。于有些具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约1μM或以下。于有些具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约0.5μM或以下。又于其他具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约0.25μM或以下。于其他具体实施例，该组成物具有IC₅₀值为约0.1μM或以下。

本发明亦提供用于制造所述组成物的方法，特别是如图1所述的新颖TMPK抑制剂衍生物化合物，该方法包含下列步骤：

(a)将2-氯-6-甲基烟碱腈(或2-氯-4,6-二甲基烟碱腈)以硫脲处理，而得中间物2-巯基-6-甲基烟碱腈(或2-巯基-4,6-二甲基烟碱腈)；

(b)将2-巯基-6-甲基烟碱腈及2-巯基-4,6-二甲基烟碱腈置于浓H₂SO₄中于100℃下处理，而分别得化合物3(R¹=H,R²=Me)及4(R¹=R²=Me)。

(c)将六氢吡井-1-碳酸酯以4-硝基苯基氯甲酸酯及三乙胺(Et₃N)处理，而得活化的胺甲酸酯的中间化合物。

(d)将该活化的胺甲酸酯以苯并噻唑酮(化合物1)，于4-二甲基胺基吡啶(DMAP)与二异丙基乙胺(DIEA)中处理，而得化合物5；

(e)将苯并噻唑酮1(或吡啶并噻唑酮4)于DIEA及碳酸铯(Cs₂CO₃)存在下，以2-溴乙酸甲酯处理，而分别得化合物6及7；

(f)将化合物6及7置于浓盐酸中于100℃下处理，而分别得化合物8及9；

(g)将苯并噻唑酮1(或吡啶并噻唑酮4)于Et₃N与Cs₂CO₃存在下，以适当的卤化物处理，而得化合物11、12,、19、21及22；

(h)将胺甲酸第三-丁酯12及22以三氟乙酸(TFA)处理，而分别得化合物10及20；

(i)将化合物10于DIEA存在下，以氯甲酸苯甲酯处理而得化合物13；

(j)将化合物10于DMAP存在下，以4-硝基苯基氯甲酸酯处理，而得化合物14；

(k)将化合物10于DIEA存在下，以溴化丙烯基处理，而得化合物15；

(l)将4-(2-氯乙酰基)六氢吡井-1-碳酸第三-丁酯以碘化钠于丙酮中处理，而得相对应的碘基化合物，4-(2-碘乙酰基)六氢吡井-1-碳酸第三-丁酯；

(m)将糖精(化合物2)于DIEA存在下，以前述制备得的碘基化合物处理而得化合物17；

(n)将胺甲酸第三-丁酯17以TFA处理，而得化合物16；

(o)将酞酰亚胺于碘化第三丁铵(TBAI)与DIEA存在下，以4-(2-氯乙酰基)六氢吡井-1-碳酸第三-丁酯处理，而得化合物18；

(p)将化合物9于1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)羰二亚酰胺(EDCI)、DMAP与DIEA存在下，以六氢吡井-1-碳酸乙酯处理，而得化合物21(YMU1)；

(q)将苯并噻唑酮1于DIEA存在下，以4-(4-碘丁酰基)六氢吡井-1-碳酸酯处理而得化合物23；

(r)将苯并噻唑酮1于DIEA存在下，以1,1'-(六氢吡井-1,4-二基)-双(2-碘乙酮)处理而得化合物24；

(s)将吡啶并噻唑酮4于DIEA及Cs₂CO₃存在下，以2-溴乙酸甲酯处理而得N-烷基化化合物7及O-烷基化化合物25；

(t)将化合物25置于浓盐酸中于100℃下处理，而得化合物26；

将化合物26于EDCI、DMAP与DIEA存在下，以吗啉(或六氢吡井-1-碳酸乙酯)处理，而分别得化合物27及28；

如于实施例段落中所述，本发明创新探究TMPK对于肿瘤细胞DNA修复的功能上的需求。此需求特别涉及到R2表现提高及RNR补充至DNA损坏部位。本文所示的数据显示，DNA损坏部位的RNR可引起部位专一性dUTP的制造。理论上，dUTPase对dUMP形成的作用以及由TS介导将dUMP转化成dTMP的反应，会限制细胞内dUTP的量。然而，阻断TMPK功能造成在DNA修复时的dUTP嵌入，而其取决于肿瘤细胞中RNR在损坏部位的补充，表示从RNR的部位专一性制造dUTP，具有其生理复杂性。

于是，本发明提出阻断TMPK可减低DNA损坏部位的dTTP形成率，然后增加修复程序中dUTP嵌入的可能性，而导致永存的伤害。这是因在修复每一DSB时有超过10,000个dNTPs嵌入，且肿瘤细胞中RNR的功能增高会使dUTP在损坏部位占优势，造成有毒的修复。由于肿瘤细胞含有被提高的RNR功能，故阻断TMPK功能可专一性地使肿瘤细胞对亚德里亚霉素增敏。

有趣地，在MDA-MB231及MCF-7细胞中，R2和dUTPase的表现量同时被提高。推测上，此细胞状态可保护DNA修复不发生dUTP嵌入。于是，这些肿瘤细胞能够修复因低剂量亚德里亚霉素处理所引发的损伤。于此细胞状态，直到抑制TMPK的表现，才会在DNA修复时发生dUTP嵌入。RNR次单位R2及dUTPase的表现是受细胞周期调控，在S与G2/M期达到高峰(Ladner与Caradonna,1997；Nordlund与Reichard,2006)。已知恶性肿瘤细胞具有细胞周期检查点缺陷(Kastan与Bartek,2004)。因此，这些细胞在从DNA损坏恢复的期间，有较多处于S与G2/M期的族群分布。相反地，在正常具不断生长性H184B5F5/M10细胞，从DNA损坏恢复期间的S期族群减少，这可能是由于存在着完整的检查点所致。结果，这些正常具不断生长性细胞甚至表现较少量R2，其可进一步限制dUDP形成。然而，应注意正常具不断生长性细胞的p53R2次单位量增加，其仍然能够在DNA损坏部位形成具有功能的RNR。所以，为何在正常具不断生长性细胞，DNA修复不会受TMPK表现抑制影响一种合理的解释为，R2对于R1具有较p53R2高出4.7-倍的结合亲和力(Shao等人,2004)。可能p53R2对于R1次单位的低亲和力使得RNR功能较差，使正常细胞中的DNA损坏部位的dUTP形成量并不多，因此在DNA修复时，较不需TMPK的功能性配合。的确，藉由过量表现来强迫提高R2量，会促使正常具不断生长性细胞对抑制TMPK产生敏感，在暴露至低剂量亚德里亚霉素处理后，造成持续性DNA损坏，此支持本案所述经由提高RNR功能制造dUTP。已发现在许多类型的患者癌细胞中，R2与p53R2表现量受调节增加(Jensen等人,1994；Okumura等人,2005；Yanamoto等人,2003；Zhang等人,2009)。过量表现R2或p53R2的转殖基因小鼠肺中产生肿瘤(Xu等人,2008)。于DNA损坏部位RNR造成dUTP形成的副作用，是否与其致癌潜能有关仍有待研究。尽管如此，须注意p53R2预后大肠癌较佳的存活率，而R2表现度则与较差的结果有关联(Liu等人,2011)。于酵母菌表现在dATP回馈抑制作用上有缺陷的RNR突变型，造成dNTP量增高，伴随着细胞周期行进及DNA损坏检查点受抑制(Chabes与Stillman,2007)。此现象是否涉及dUTP形成亦值得研究。

本发明合理化说明，肿瘤细胞内R2表现量增加，会使TMPK成为增强亚德里亚霉素作用的标靶弱点。为达成此目的，鉴定得一种新颖的TMPK抑制剂，YMU1。本发明提出，YMU1在细胞或小鼠中不会产生基因毒性作用。5-FU及5-FdUrd(最常用的化学治疗剂)会抑制TS(其在新合成途径中将dUMP转化成dTMP)，并进一步透过将错误的核苷酸嵌入RNA及DNA中而损害细胞功能(Longley等人,2003)。虽然已有TS抑制剂及其他核苷酸代谢物阻断剂使用作为化学增敏剂(Garg等人,2010)，仍应强调这些抗癌剂对于正常的不断生长性细胞的基因DNA具有毒性。它们的治疗功效仅仅来自其可造成广泛的DNA损坏的能力，如此使其产生非专一的毒性。我们则提出本发明TMPK抑制剂超越这些熟知化合物的治疗优点，在于它们针对带有DNA损伤的恶性肿瘤细胞产生专一毒性。

治疗用途

本发明提供一种使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法增敏的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的本发明的TMPK抑制剂组成物。于有些具体实施例，该TMPK抑制剂选择性将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞。于有些具体实施例，本发明的TMPK抑制剂组成物不会造成基因毒性副作用。

本发明亦提供一种使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法增敏的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的抑制TMPK活性的药剂。于有些具体实施例，该药剂为本发明的组成物。

本发明亦提供一种防止癌细胞进行双股断裂修复的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的本发明的TMPK抑制剂组成物。

本发明亦提供一种选择性将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞的方法，其包含将该癌细胞曝露于一治疗上有效量的本发明的TMPK抑制剂组成物。

于有些具体实施例，该癌细胞选自乳癌细胞、肝肿瘤细胞、大肠癌细胞、胰脏癌细胞、食道癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、直肠癌细胞、肾脏癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌细胞及子宫内膜癌细胞。

于有些具体实施例，该方法进一步包含将该癌细胞曝露于至少一种选自抗癌剂、抗病毒剂、消炎药及免疫抑制剂的额外治疗剂。

预期用于本发明的抗癌剂包括(但不限定于)微管干扰剂、拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、胸腺核苷酸合成酶抑制剂、抗代谢物、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂、核醣核苷酸还原酶抑制剂、及激酶抑制剂。于有些具体实施例，微管干扰剂为这些会诱导微管形成混乱，破坏有丝分裂与DNA合成的药剂，且包括紫杉烷类例如红豆杉醇与多西他赛；长春花生物碱类例如长春碱、长春新碱与长春地新。于有些具体实施例，藉由打断DNA而作用的拓扑异构酶抑制剂包括两类，即拓扑异构酶I与拓扑异构酶II抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂包括(但不限定于)伊立替康(CPT-11)。拓扑异构酶II抑制剂包括(例如)多柔比星与表柔比星。其他可用于本发明的拓扑异构酶抑制剂包括(但不限定于)依托泊苷、替诺泊苷、伊达比星及柔红霉素。于有些具体实施例，藉由损坏DNA而作用的烷化剂，例如苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、替莫罗酰胺、塞替派、丝裂霉素C、白消安、卡莫司汀(BCNU)与洛莫司汀(CCNU)，已显示为有用的化疗剂。烷化剂亦包括白金例如卡铂与顺铂，它们已显示为有用的化疗剂，虽然不属于烷化剂但亦藉由与DNA共价结合而作用。于有些具体实施例，胸腺核苷酸合成酶抑制剂(其是藉由代谢成假的DNA和RNA碱基而干扰转录作用)包括(例如)5-氟尿嘧啶与卡培他滨。于有些具体实施例，抗代谢物例如叶酸拮抗剂，胺基甲基叶酸与三甲曲沙已发现可用作为化疗剂。于有些具体实施例，嘧啶拮抗剂例如氟尿嘧啶、氟脱氧尿嘧啶核苷与氮杂胞嘧啶核苷已发现可用作为化疗剂。于有些具体实施例，嘌呤拮抗剂已发现可用作为化疗剂，且包括巯基嘌呤、硫鸟嘌呤与喷司他丁。亦可用作为化疗剂的含醣类修饰类似物包括，阿糖胞苷与氟达拉滨。于有些具体实施例，核醣核苷酸还原酶抑制剂已发现可用作为化疗剂，且包括诸如羟基尿素等药剂。

本发明亦提供一种于有需要的个体中治疗或预防癌症的方法，其包含将一治疗上有效量的本发明的TMPK抑制剂衍生物投药予该个体。于有些具体实施例，本发明的TMPK抑制剂衍生物选择性将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞。于有些具体实施例，本发明的TMPK抑制剂衍生物不会造成基因毒性副作用。

于有些具体实施例，该癌症选自乳癌、肝肿瘤、大肠癌、胰脏癌、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、直肠癌、肾脏癌、甲状腺癌、脑癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌及子宫内膜癌。

投药及医药组成物

所述方法包含将本发明的TMPK抑制剂衍生物，单独或与另一治疗方法例如放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法结合投药予个体。

可使用一或多种生理上可接受的载剂，包含有助于将活性化合物加工成可被医药上使用的制剂的赋形剂与辅助剂，以熟知方法调配得根据本发明使用的医药组成物。适当的调配物是依所选择的投药途径而定。

用于注射，可将本发明的组成物调配于水溶液，较佳地调配于生理学上可兼容的缓冲液，例如汉克氏液、林格氏液或生理食盐水中。用于经黏膜投药，是将适于欲通过屏障的渗透剂用于调配物。此类渗透剂为该项技艺一般已知的渗透剂。

用于口服投药，可藉由将活性化合物与该项技艺已熟知的医药上可接受的载剂组合，而调配成组成物。此类载剂能使本发明的组成物调配呈锭剂、丸剂、菱刻锭剂、糖衣锭、胶囊、液体、胶体、糖浆、浆剂、悬浮液等类，以供或者以口服摄入。用于口服的医药制剂可使用固体赋形剂制得，视需要可将所成的混合物研磨，及在加入其他若希望的适宜辅助剂后，将颗粒混合物加工而获得锭剂或糖衣锭核心。可用的赋形剂为(特别是)填充剂例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及/或聚乙烯-吡咯啶酮(PVP)。若希望，可添加崩解剂例如交联聚乙烯吡咯啶酮、琼脂或藻酸。以可使用诸如藻酸钠的盐类。

用于藉由吸入方式投药，是方便地将根据本发明使用的组成物，以使用加压包装或喷雾器与适宜的推进剂，例如(不限定于)二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的气溶胶喷雾形式进行递送。举加压器溶胶为例，可藉由提供用于递送一预定量的阀，来调控所述的剂量单位。由明胶制成用于吸入器或吹药器的胶囊与匣筒，可经调配而含有所述组成物与适宜粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

所述组成物亦可经调配用于非经肠道投药，例如藉由团剂注射或连续灌流。用于注射的调配物可以单位剂量形式呈现，例如存放于安瓿或多次剂量容器中，有添加防腐剂。所述组成物可采用诸如溶于油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳液等形式，且可含有调配用物质例如悬浮剂、安定剂与/或分散剂。

用于非经肠道投药的医药组成物包括，所述活性化合物的水溶性形式例如(不限定于)盐类的水溶液。此外，可于亲脂性载剂中制备得活性化合物的悬浮液。适宜的亲脂性载剂包括脂肪族油类例如芝麻油，合成型脂肪酸酯例如油酸乙酯与三酸甘油酯，或诸如脂质体的材料。水性注射悬浮液可含有增加所述悬浮液黏稠度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡萄聚醣。视需要地，所述悬浮液亦可含有适宜安定剂，及/或可增加该组成物溶解度，以使能制备高浓缩溶液的试剂。

另供选择地，所述的活性成分可呈粉末形式，用以于使用前与适合的载剂例如无菌、无热源水重建该组成物。

除了前述的调配物，所述组成物亦可调配呈补给制剂。此类长作用型调配物可藉由植入(例如经皮下或肌肉内)，或藉由肌肉内注射方式投药。本发明的组成物可与适合的聚合物或厌水性物质(例如，与医药上可接受的油类形成乳液)，与离子交换树脂调配，或呈一种难溶的衍生物例如(不限定于)难溶性盐类，而用于此途径投药。

另供选择地，可利用其他用于厌水性医药组成物的递送系统。脂质体与乳液为用于厌水性药物的已熟知的递送载剂或载体实例。此外，可使用特定有机溶剂例如二甲亚砜，虽然常造成较大的毒性。

又，所述组成物可使用持续释放系统，例如由含有治疗剂的固体厌水性聚合物所成的半通透性基材进行递送。已知有各类型持续释放材料，且为习于该项技艺者所熟知。持续释放型胶囊(视其化学本质而定)可持续释出所述化合物达数星期或100天以上。视治疗剂的化学本质与生物稳定性而定，可使用额外的蛋白质稳定化策略。

本发明的医药组成物可包含适合的固体或凝胶态载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括(但不限定于)碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶及聚合物例如聚乙二醇。

适用于本发明的医药组成物包括，其中含有其量足以达到所希望目的，例如治疗癌症患者的活性成分的组成物。

更特别地，“治疗上有效量”意指化合物可有效预防、减轻或改善受治疗个体的癌症症状，或延长该个体存活的用量。

习于该项技艺者可容易地，特别是依照本发明所提供的详细揭示，决定治疗上有效的量。

对于任何用于本发明方法的化合物，最初可从细胞培养分析来估计其治疗上有效量或剂量。然后，可调配所述的剂量用于动物模式，以达到一循环浓度范围，包括于细胞培养所测得的IC₅₀值(亦即，测试化合物可达到最大TMPK抑制作用的一半的浓度)。接着可将此类信息用于更精确测定可用于人类的剂量。

可藉由于细胞培养或实验动物进行的标准制药学程序，例如藉由测定标的化合物的IC₅₀及值LD₅₀，其中LD₅₀为测试化合物可达到最大致死性抑制作用的一半的浓度，而决定本发明所述组成物的毒性与治疗功效。从这些细胞培养分析及实验研究获得的数据，可用来调配出一用于人类的剂量范围。该剂量可依所使用的剂型及所利用的投药途径而有所变化。可由个别医师参照患者的病况选择正确的配方、投药途径与剂量。

可各别调整剂量与投药间隔，以提供足以维持所希望调节功效的活体血浆浓度。这些血浆浓度称为最低有效浓度(MECs)。对于各别化合物的MEC会有所差异，但可从活体外估计得，例如可使用本文所述的分析，确认欲达到50-90%激酶抑制作用所需的浓度。欲达到MEC所需的剂量将取决于个体的特征与投药途径。分析或生物分析可用于测定血浆浓度。

使用MEC值亦可测定剂量间隔。化合物应使用可使血浆浓度在治疗时程的10-90%，较佳地30-90%，且最佳地50-90%时仍维持高于MEC的疗程进行投药。

所投药的组合物量(当然)将视欲受治疗的个体、疾病严重性、投药方式及执业医师的判断等等而定。

据此，本发明提供所述的TMPK抑制剂组成物可每日投药一次，连续投药3天。于有些具体实施例，本发明提供所述的TMPK抑制剂组成物可每日投药一至二次。于有些具体实施例，本发明提供所述的TMPK抑制剂组成物可以约5mg/kg至约30mg/kg的剂量投药。

虽然本发明已描述目前被认为最实际且最佳的实施态样，应了解本发明无需受限于所揭示的具体实施例。反之，本发明欲涵盖各种包括在所附申请专利范围的精神与范围内的修改及类似的排列，其是根据最广义概念以致包含所有此类修改与相似的结构。

本发明进一步举例下列特别的实施范例。这些实施范例仅作为辅助说明，而不应构成限制本发明的范围。

实施例

实施例1：TMPK藉由防止dUTP嵌入而在双股断裂的修复中占有重要性

为分析TMPK在DSBs修复中扮演的角色，本实验藉由干扰来耗尽表现，并于带有DR-GFP报告基因的U2OS细胞进行HR分析(Pierce等人,1999)。随着I-SceI核酸内切酶表现，发生HR修复而产生完整的GFP，可读取到荧光数值。经由流动式细胞计数分析，抑制TMPK表现会显着降低修复效率，由GFP阳性部分侦测到(图2A)。本实验亦测试，在MDA-MB231乳癌细胞中抑制TMPK表现对于修复亚德里亚霉素所诱导的DNA损伤的影响。将对照组及TMPK抑制表现细胞以低剂量(0.1μM)亚德里亚霉素处理4小时，然后以新鲜培养基充分冲洗而使其复原。起初，这些细胞的DNA损伤程度(藉由γH2AXfoci染色(Mah等人,2010)标示)很相似(图2B)。经过复原24小时后，亚德里亚霉素所诱导的DNA损伤在对照组细胞中已消除，表示细胞能够修复由低剂量亚德里亚霉素处理所诱导的DNA损伤程度。相反地，在TMPK抑制表现细胞中仍保有γH2AXfoci。结果显示，抑制TMPK表现显着减低具有亚德里亚霉素处理的细胞存活(图3)。因此，TMPK对于在低剂量亚德里亚霉素处理的反应的DNA修复是必要的。

亚德里亚霉素处理诱导DNA双股断裂，其可经由HR过程来修复(Nitiss,2009)。已知HR过程包含，其中可发生股侵入而进行修复的Rad51foci(Holthausen等人,2010)。本实验测试于经亚德里亚霉素处理的细胞中抑制TMPK表现对Rad51foci形成与消退的影响。结果显示，抑制TMPK表现起初不会影Rad51foci形成。经过24小时后，对照组细胞中的Rad51foci数量显着减少，而在TMPK抑制表现细胞中仍保持不变(图2C)。此表示抑制TMPK表现可持续这些结构重组的损伤。我们亦检测已知做为单股断裂修复(SSBR)标记的XRCC1foci(Caldecott,2008)。如预期，在亚德里亚霉素处理时，于对照组及TMPK抑制表现细胞中侦测到非常少量的XRCC1foci，证明TMPK缺陷起初并不会在亚德里亚霉素处理时诱导DNA单股断裂修复(SSBR)。于24-48小时复原期间，抑制TMPK表现可使XRCC1foci数量明显增(图2D)，暗示在HR程序中阻断TMPK会促进SSBs。

已相当了解是藉由在去掉碱基部位，以DNA糖苷酶与去嘌呤/去嘧啶核酸内切酶(APE)介导的裂解移除错误的碱基而产生SSBs(Caldecott,2008；Nazarkina等人,2007)。尿嘧啶DNA糖苷酶例如尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)可将尿嘧啶从DNA移除(Krokan等人,2002；Nilsen等人,1997)。为测试是否可由因尿嘧啶错误嵌入产生的XRCC1foci显示SSBs，遂将TMPK抑制表现细胞以慢病毒UNG的shRNA感染。待从亚德里亚霉素处理复原后，观察到XRCC1foci数量因抑制UNG表现而显着减少(图2E)。因此，阻断TMPK会在修复亚德里亚霉素所诱导的DSBs时，促进基因组中的尿嘧啶量。

接着测试基因组中尿嘧啶量增加是否为dUTP嵌入的结果。细胞中dUTP浓度主要是由dUTPase(一种负责将dUTP水解成dUMP与焦磷酸盐的酵素)进行调控(McIntosh等人,1992)。将野生型GFP-dUTPase与缺乏催化活性GFP-dUTPase的突变形式(图4)，于缺乏TMPK的MDA-MB231细胞中进行表现。待从亚德里亚霉素处理复原后，野生型GFP-dUTPase显着减少TMPK抑制表现细胞中的XRCC1foci数量，而表现不具催化活性dUTPase的细胞仍维持XRCC1foci(图2F)。一致地，γH2AXfoci可由野生型的过量表现消除，但缺乏催化活性的dUTPase则否(图5)。结论，TMPK对于防止在修复DSBs时嵌入dUTP是必要的。

实施例2：DNA损坏处的RNR需要TMPK的功能性调节以进行修复

已估计细胞中的dUTP/dTTP比例是介于0.3-3%的范围内(Traut,1994)。TMPK抑制表现细胞仍维持大于60%的dTTP库，且这些细胞持续增生(图7)。或许，细胞含有其他TMPK的功能类似物来补偿此特别耗尽。推测，这些细胞内的dTTP浓度仍较dUTP高出许多。此诉诸一个问题：为何此特定抑制TMPK表现会导致在DNA修复嵌入dUTP。

为分析TMPK在DNA修复中的功能性需求，遂将MDA-MB231乳癌细胞以pEGFP-TMPK(D15R)(一种不具催化能力的突变株)转感染(图8)。注意，TMPK(D15R)在具有高转感染效率的HeLa细胞中的过量表现，并不影响总体dTTP库(图9)。经过亚德里亚霉素处理及复原后，发现在未经转感染的细胞，或过量表现野生型GFP-TMPK的细胞中γH2AXfoci被消除，而反观在GFP-TMPK(D15R)-阳性细胞中仍保有γH2AXfoci(图6A)。已知TMPK的内源性功能不会受TMPK(D15R)表现影响，故TMPK(D15R)表现对于DNA修复的影响，似乎不是和dTTP量有关。

RNR介导的反应可制造出dUDP，其被NDP激酶转化成dUTP(Mathews,2006)。我们假设抑制TMPK表现会导致在DNA损坏部位的dTTP形成减少，而在DNA修复时嵌入dUTP。为说明此假说，遂过量表现一段YFP-融合至R1次单位的90-胺基酸C-端片段(R1C-NLS-YFP)，干扰内源性RNR与Tip60的相互作用，以此破坏RNR补给至DNA受损坏部位(Niida等人,2010a)。显然，此R1C-NLS-YFP融合片段的过量表现会消除在MDA-MB231细胞中抑制TMPK表现，对于在从亚德里亚霉素处理复原期间使γH2AXfoci数量增加的影响(图6B)。TMPK(D15R)过量表现的影响，也会被R1C-NLS-YFP的共同表现逆转(图6C)。因此，DNA损坏部位的RNR需要功能性TMPK配合，以防止dUTP-介入的永久性损害。

为了解TMPK及RNR是否为DNA损坏部位所必需的，遂将细胞表现I-PpoI，这是一个特定DNA裂解酵素，可将DSB导入染色体1上的特定序列(Flick等人,1998)。此系统可以在DNA受损区进行HR修复期间，侦测修复蛋白(例如ATM)是否补给至特定DNA损坏部位(Berkovich等人,2007)。染色丝免疫沉淀(ChIP)分析显示，随着I-PpoI表现，TMPK占据在染色体1上的I-PpoI裂解部位(而非GAPDH基因部位)，ATM与RNR的R2次单位亦是如此(图6D)。进一步分析细胞中DNA损坏部位上的TMPK与R2。使用激光显微照射破坏DNA，侦测到TMPK及R2与γH2AX共同定位在沿着受显微照射的线(图6E)。结论，TMPK与RNR在DNA损坏部位处有功能性结合以进行修复。

实施例3：在需要TMPK进行修复的肿瘤细胞中R2的高度表现是一项决定性因素

本实验进一步测试在另一乳癌细胞系(MCF-7)及非肿瘤不断生长性哺乳动物细胞系H184B5F5/M10与MCF10A中，TMPK对于DNA修复的需求性。类似于MDA-MB231细胞，抑制TMPK表现会造成由亚德里亚霉素处理诱导的γH2AXfoci永存在MCF-7细胞中。相反地，在H184B5F5/M10与MCF10A细胞中DNA修复不受影响(图10A)。本实验比较在从DNA损坏复原期间，于MDA-MB231、MCF-7、H184B5F5/M10与MCF10A细胞中，R2、p53R2、TMPK及dUTPase的表现程度(图10B)。于MDA-MB231及MCF-7细胞中RNR的R2次单位与dUTPase的表现量，较于H184B5F5/M10及MCF-10A细胞中的高出甚多。于MDA-MB231细胞中，在亚德里亚霉素处理后的12至48小时复原期间，R2与dUTPase含量相伴地增加。在MDA-MB231细胞，因为p53的功能有缺陷，以致p53R2的表现量非常低。于MCF-7、H184B5F5/M10及MCF10A细胞，p53R2的表现量在亚德里亚霉素处理后的24-48小时复原期间有增加。流动式细胞计数分析证明，在从DNA损坏复原期间，于H184B5F5/M10及MCF-10A细胞的G0/G1期细胞族群，较于MDA-MB231及MCF-7细胞中的高2-3-倍。在复原期间MDA-MB231及MCF-7细胞具有较多S与G2/M族群，表示它们对于基因组损伤的反应的检查点调控教不严苛(图10C)。亦比较此四种细胞系的细胞生长速率(图10D)。于所设定的实验条件下，H184B5F5/M10c或MCF-10A细胞的增生速率的确较MDA-MB231及MCF-7细胞快(图10D)。考虑到HR修复是发生在S与G2期，遂进一步将H184B5F5/M10细胞以诺考达唑处理过夜以阻断有丝分裂进行，并藉此增加S/G2细胞(由流动式细胞计数分析显示)(图10E)。将这些细胞暴露至亚德里亚霉素处理，并于复原后进行γH2AXfoci染色。类似于异步培养，于诺考达唑处理后其S/G2族群量增加20%的H184B5F5/M10细胞，在DNA修复方面仍然不会对抑制TMPK表现敏感(图10F)。因此，在修复时对于抑制TMPK表现的差别反应，似乎并非由细胞周期分布上的差异来决定。这些数据指出，在DNA修复时对于抑制TMPK表现的敏感性差异，与这些细胞系的增生速率无关。先前已有报导指出，R2/R1复合体的酵素活性较p53R2/R1的高出5-倍(Qiu等人,2006；Shao等人,2004)。具有低R2表现量的H184B5F5/M10细胞中的DNA修复，并不受抑制TMPK表现影响。

考虑到于带有TMPK抑制表现的MDA-MB231细胞中，DNA损坏处的RNR会引起dUTP嵌入，遂接着测试肿瘤细胞中R2含量增高，是否为决定TMPK对于DNA修复的需求的主要因素。MCF-7细胞表现大量R2，而其p53R2表现量与H184B5F5/M10细胞所观察到的类似。于是藉由siRNA转感染来降低MCF-7细胞的R2表现量，以测试的R2贡献(图11A)。流动式细胞计数分析显示，藉由siRNA转感染减少R2表现量，或结合抑制TMPK表现并不会增加族群(图11B)。于复原后24小时，经单独R2siRNA或R2/TMPKsiRNA转感染的细胞中有侦测到γH2AXfoci。然而，于复原后36小时，发现减少R2表现可补救因抑制TMPK表现的MCF-7细胞的DNA修复(图11C,D)。因此，似乎并非由细胞周期的分布决定DNA修复对于抑制TMPK表现的反应。而R2的量才是关键因素。

本实验进一步藉由慢病毒感染，来提高MCF-10A细胞中R2的量，并测定DNA修复对于抑制TMPK表现的反应。结果显示，强迫R2表现会在TMPK表现受抑制的细胞造成永存的γH2AX染色，而对于细胞周期分布仅有少量影响(图11E)。因此，提高R2表现会使MCF10A的DNA修复转向对抑制TMPK表现敏感。总而言之，本实验的证据证明增加R2的表现量以及将RNR补给到DNA损坏处，是使TMPK成为肿瘤细胞DNA修复的决定性组成的关键要素。

实施例4：筛选及鉴定YMU1为人类TMPK抑制剂

基于肿瘤细胞R2表现量很高，在DNA受损后的修复上于TMPK的功能上需求，本实验探究hTMPK抑制剂可否用于使肿瘤细胞选择性对亚德里亚霉素增敏的可能性。藉由使用结合荧光素酶的TMPK分析(Hu与Chang,2010)，其中TMPK的抑制可使更多ATP用于由荧光素酶产生冷光(图12A)，对21,120个小分子的集库进行筛选，鉴定出一个高度有效的化合物YMU1，其结构列示于图12B。YMU1(化合物21)的合成方法及结构说明，叙述于发明说明的方法段落中。

酵素分析确定YMU1为hTMPK抑制剂，具有IC₅₀为0.61±0.02μM(图12C)，而对纯化的胸腺嘧啶核苷激酶1(TK1)活性无抑制作用(图12D)。为研究结构与活性关系，遂合成两种片段化合物(D3(化合物4)与D6(4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-羧酸乙酯))，一种O-烷基化异构物D7(化合物28)与苯异噻唑酮衍生物D8(化合物10)(图12B)。D6(做为YMU1的六氢吡嗪片段)或D7(做为YMU1的O-烷基化异构物)皆未显示对hTMPK的抑制作用，而D3(做为YMU1的吡啶并异噻唑酮片段)呈现弱的抑制活性。有趣地，苯异噻唑酮衍生物D8亦呈现相当的抑制功能。

藉由将不同浓度的YMU1与纯化的hTMPK蛋白进行预反应，并使用熟知TMPK分析测量初速度而测定YMU1的抑制方式。使用非线性回归分析测定K_m与V_max值，列示于表1。

表1.YMU1对于纯化的人类胸腺嘧啶核苷激酶动力学参数的影响

对于K_i值的测定，是将所指定浓度的YMU1与0.5μg纯化的hTMPK蛋白进行预反应10分钟，并于ATP(1mM)与不同浓度的TMP(2～200μM)存在下，或于TMP(200μM)与不同浓度的ATP(5～1000μM)存在下，使用结合NADH的TMPK分析(如发明说明的方法段落中所述)测量TMPK反应的初速度。数据以平均值±s.d.表示，n=4。计算得自非线性回归分析的数据用于测定K_m与V_max值。从方程式:K_i=[I]/(V_max/V_max’-1)计算得YMU1化合物对于hTMPK的K_i值，其中[I]与V_max’分别是，YMU1化合物浓度及有YMU1存在下的最大速率。K_i值代表从三种不同YMU1浓度获得的平均。

与YMU1进行预反应会减低hTMPK的Vmax(以浓度-依赖性的方式)，且会增加对于ATP的Km而不影响对于TMP的K_m。抑制常数(K_i)经由动力学分析测定为0.22±0.03μM(表1)。

进行分子对接研究以分析TMPK受YMU1抑制的机制。动力学研究暗示，YMU1可能作用在TMPK的ATP结合凹穴。利用TMPK与ATP和Mg⁺²的共结晶结构，将YMU1对接入ATP凹穴中。以此对接状态，YMU1阻止一个Mg⁺²离子与催化功能域中的Asp15残基反应(图12E)。因为将Asp15突变成Arg会促使TMPK的催化功能丧失，故有可能TMPK与YMU1的预反应会阻碍指向ATP凹穴中Asp15的催化功能的Mg⁺²结合，而藉此减低催化效率。将D3(化合物4)、D6(4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-羧酸乙酯)及D7(化合物28)对接入这些部位，并不能阻断Asp15与Mg⁺²结合，因此，它们不会抑制TMPK。

进行其他实验以测定YMU1处理对于细胞内dTTP浓度的影响。细胞经YMU1处理3天后，其中的dTTP库减少约30-40%(图13)。将这些细胞以siRNA转感染而抑制TMPK表现，会使dTTP库的大小减少相似的幅度。YMU1处理在这些TMPK抑制表现的细胞并不会造成进一步的减少(图13)，表示YMU1降低dTTP含量的能力取决于细胞中是否存在TMPK。

实施例5：YMU1不具基因组毒性且类似TMPK缄默会损害DSBs修复.

TMPK与TS为dTTP合成中的关键酵素，且TS已知为一种主要的化疗标靶(Garg等人,2010)。由FdUrd对TS的抑制作用会造成基因组毒性(Longley等人,2003)。已知TMPK与TS在dTTP合成中扮演相同角色，本实验接着比较，藉由shRNA干扰或抑制剂处理来阻断TMPK及TS，对于诱导DNA损坏的影响。如γH2AX染色的结果所示(Mah等人,2010)，干扰TS表现或FdUrd处理会诱导严重的DNA损坏，而TMPK缄默与YMU1处理则不会(图14A)。

本实验亦比较YMU1及FdUrd对于非肿瘤哺乳动物循环细胞H184B5F5/M10与MCF-10A，及肿瘤细胞系MCF-7与HCT-116p53^-/-细胞的存活率的影响。由群落与分析指出，FdUrd会引起这些细胞死亡而YMU1不会(图14B)。因此，不像阻断TS，标靶TMPK(本身)不会对正常不断生长细胞造成基因组毒性或细胞毒性。接着检测对于MDA-MB231与H184B5F5/M10细胞中在从低剂量亚德里亚霉素处理复原后，修复由亚德里亚霉素所诱导的DNA损伤的影响。

应注意，YMU1处理并不影响DNA损伤形成的数量，此由γH2AX焦点染色进行测定。类似抑制TMPK表现，以YMU1前处理会促使70%以上的MDA-MB231细胞，在从亚德里亚霉素处理复原48小时后仍为γH2AX-阳性(图14C)，且在复原期间不影响细胞周期进行(数据未示)。

彗星分析进一步确认YMU1处理会在受亚德里亚霉素处理的细胞中，导致DNA修复被破坏(图15)。GFP-TMPK的过量表现会使MDA-MB231细胞对YMU1造成的持续DNA损伤产生抗性，此支持YMU1是藉由标靶TMPK而作用(图14D)。类似于以siRNA抑制表现，YMU1亦造成永久性Rad51foci及增加XRCC1foci形成(其可藉由干扰UNG表现而消除)(图14E-G)。可藉由过量表现dUTPase或R1次单位的C-端90个胺基酸，逆转YMU1对于破坏DNA修复的影响(图14H-I)，确认YMU1不影响修复过程。

实施例6：于活体外及活体内YMU1使恶性肿瘤细胞对亚德里亚霉素增敏

接着，将各种不同细胞系以YMU1、D6或D7处理72小时，以测试TMPK抑制剂用于增敏作用的可能性。待暴露至不同浓度的亚德里亚霉素处理4小时后，细胞在正常生长培养液中培养两天之后进行存活分析，并测定各细胞系对于亚德里亚霉素的IC₅₀值(图16A及表2)。

表2.亚德里亚霉素处理的IC₅₀值(μM)

在HT-29、U2OS、CL-1-0、HCT-116p53+/+、HCT-116p53-/-、H1299、MDA-MB468、MDA-MB231及SaoS2恶性肿瘤细胞中，YMU1处理增加的敏感度范围从3-至35-倍。YMU1使非肿瘤乳房不断生长性H184B5F5/M10、MCF10A细胞、初生人类乳房上皮细胞(HMEC)与初生肾上皮细胞(HREC)及IMR-90胚胎肺成纤维细胞对亚德里亚霉素增敏的能力较弱许多。两株在同源重组修复上有缺陷的BRCA1/2缺陷型肿瘤细胞，在亚德里亚霉素增敏方面对YMU1没有反应。不活化的D6(4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-羧酸乙酯)及D7(化合物28)在这些细胞中不具有亚德里亚霉素增敏功效。

群落分析进一步显示，YMU1在不同癌细胞系中显着增强亚德里亚霉素(0.1μM)的致死效用(图16B)。抑制TMPK表现不能再进一步使经YMU1处理的MDA-MB231细胞对亚德里亚霉素增敏(图17)，表示YMU1在亚德里亚霉素增敏作用的专一性是藉由标靶TMPK。过量表现野生型dUTPase能够防止YMU1/亚德里亚霉素诱发的细胞凋亡，由AnnexinV的染色减少所呈现(图18)。而且，YMU1能抑制dUTPase(图19)。

亦使用活体内异种移植模式来检测，做为佐剂对低剂量亚德里亚霉素处理增敏的功效。将HCT-116p53^-/-细胞接种入裸鼠中。经四天后，使小鼠开始接受每周分别三次及两次YMU1与亚德里亚霉素的i.p.注射。以YMU1与亚德里亚霉素的处理持续进行4星期。于经单独亚德里亚霉素或YMU1处理的小鼠中的肿瘤成长速率，与对照组中的类似。反之，在以YMU1/亚德里亚霉素双重处理的小鼠中的肿瘤成长显得缓慢许多(图16C)。在施予最后一次注射后两星期，将小鼠牺牲并测量肿瘤重量。在经YMU1/亚德里亚霉素双重处理的小鼠中，观察到良好的肿瘤抑制效果，其平均肿瘤大小为对照组小鼠的25%(图16D)。于这些实验条件下，以单独亚德里亚霉素或YMU1处理的小鼠中的肿瘤大小很类似。符合肿瘤成长的数据，在以YMU1与亚德里亚霉素组合处理的裸鼠中，肿瘤增生指数(藉由测量K_i67免疫染色指示)有明显降低(图16E)。

为分析YMU1的活体内毒性，遂将Balb/c小鼠以YMU1处理4周，于肿瘤异种移植研究中使用2-倍较高的剂量疗程。历经4周时程，YMU1处理不会改变小鼠体重。此外，在对照组与处理小鼠的不同器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏与肾脏)重量，及血液学分析结果很相似(表3)。总和上述，YMU1(本身)不会对正常小鼠产生毒性作用。结合低剂量亚德里亚霉素，YMU1可抑制小鼠的肿瘤生长。

表3.YMU1对于动物毒性的作用

*,P<0.05

实施例7：TMPK抑制剂衍生物的活体外及活体内活性

以下列示用于测试活体外TMPK抑制活性，及活体内(于MDA-MB231细胞)亚德里亚霉素增敏活性的不同TMPK抑制剂衍生物的化学结构。

于一项具体实例，指定化合物21(YMU1)为标准物，于2μM的浓度下具有100%抑制效益。据此，其他TMPK抑制剂衍生物化合物的抑制效益经正常化如下(n=3或6)：化合物1(74.0%)，化合物2(7.0%)，化合物3(76.5%)，化合物4(28.0%)，化合物5(92.9%)，化合物6(96.0%)，化合物7(98.3%)，化合物8(29.1%)，化合物9(47.0%)，化合物10(96.8%)，化合物11(100.4%)，化合物12(124.5%)，化合物13(127.2%)，化合物14(129.4%)，化合物15(102.3%)，化合物16(11.8%)，化合物17(10.1%)，化合物18(51.4%)，化合物19(100.5%)，化合物20(99.5%)，化合物21(YMU1,100%)，化合物22(111.6%)，化合物23(0%)，化合物24(117.7%)，化合物25(7.8%)，化合物26(16.4%)，化合物27(16.0%)及化合物28(14.7%)。于MAD-MB231细胞处理中，化合物10及19在2μM的浓度下时，对于亚德里亚霉素增敏作用并没有影响；然化合物12及21在2μM的浓度下时，对于亚德里亚霉素增敏作用可增强30倍。

基于这些结果，该双环核心结构似乎对于TMPK抑制剂的活性是重要的。如以YMU1(化合物21)及相关化合物所例举说明的，位于噻唑酮环上的N-烷基化结构，似乎为所观察到的活性所必需，-而六氢吡嗪环的C-端部分是活体内亚德里亚霉素增敏作用所必需的。

本发明的方法

抗体

抗-hTMPK与抗-hTK1多株抗体是如先前技艺所述制备(Chang等人,1994；Ke等人,2005)。抗-R2(sc-10844)、抗-p53R2及抗-ATM(sc-23921)抗体是购自SantaCruz。藉由以纯化的GST-hdUTPase(不透明形式)蛋白免疫兔子，而制造并收集对抗hdUTPase的抗血清，之后再以亲和性纯化得多株抗体。经由RNAi实验确定hTMPK、R2及hdUTPase抗体的专一性(图20)。抗-GFP抗体(632375)购自BD生物科学公司(BDBiosciences)。抗-hTS抗体(纯株4H4B1)购自ZymedLaboratoriesinc.。抗-Rad-51抗体(PC130)购自Calbiochem。抗-γH2AX(Ser139)及抗-XRCC1(纯株33-2-5)抗体分别购自Upstate与ThermoFisherScientificInc.。抗-β-微管蛋白、抗-β-肌动蛋白、抗兔子IgG-FITC、抗小鼠IgG-FITC及抗小鼠IgG-TRITC抗体购自Sigma。

试剂

G418与转感染试剂nanofectin分别购自Invitrogen及PAAlaboratoriesInc.。ATP、TMP、NADH、磷酸烯醇丙酮酸、5,5’-二硫-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、荧光素、萤火虫(Photinuspyralis)荧光素酶、人类凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)、亚德里亚霉素及H33342购自Sigma。乳酸脱氢酶与丙酮酸激酶购自Roche。麸胱甘肽4B珠粒购自AmershamPharmacia，而AnnexinV-PE细胞凋亡套组(CBA-060)与MTS试剂分别购自Calbiochem及Promega。hTMPKsiRNA得自DharmaconsiGenomeSMART库(MQ-006720)，R2siRNA的合成及Lipofectamin2000则来自Invitrogen。已透析血清购自GIBCOTM，pLKO-UNGshRNA与pLKO-dUTPaseshRNA是购自中国台湾RNAi核心机构。

细胞培养及稳定细胞系的建立

HCT-116p53+/+与p53-/-细胞是由约翰霍普金大学医学系的BertVogelstein慷慨提供(Bunz等人,1998)。U2OS-DR-GFP细胞是由Sheau-YenShieh(Sinica学院)提供。已补充10%FBS的生长培养基使用如下：McCoy’s5A用于HCT-116及U2OS，RPMI用于HT-29，DMEM用于MDA-MB231、MDA-MB468、HeLa及HEK-293T，MEM-α用于得自生物资源收藏与研究中心(新竹，中国台湾)的H184B5F5/M10细胞(杨等人,1996)。对于稳定表现TMPKshRNA的MDA-MB231细胞及稳定表现TMPKshRNA的HCT-116p53-/-细胞的建立，是将细胞以慢病毒TMPKshRNA感染，之后将细胞以2μg/ml杀稻瘟素(blasticidine)进行拣选。

用于化合物化学合成的一般材料

所有试剂与溶剂皆为试剂等级且无经进一步纯化，除非另外特别指示。所有试剂为无水等，除非另外特别指示。二氯甲烷(CH₂Cl₂)经CaH₂蒸馏得。所有空气或湿度敏感实验皆于氮气下进行。反应是藉由薄层色层分析术(TLC)，于E.Merck0.25mm硅胶60F₂₅₄玻璃板上进行侦测。化合物由UV呈像，或使用对甲氧苯甲醛、宁海得林（Ninhydrin）及磷钼酸(PMA)做为显影剂。E.Merck硅胶60(粒径0.040-0.063mm)用于急骤层析术。

仪器操作

于Yanaco微设备记录熔点。以PerkinElmerLamda35UV–Vis分光亮度计测量吸收光谱。核磁共振(NMR)光谱于VarianUnityPlus-400(400MHz)取得，并相对于CHCl₃/CDCl₃的δ_H7.24/δ_C77.0(三峰的中央线)、CH₃OH/CD₃OD的δ_H3.31/δ_C49.0及(CH₃)₂SO/(CD₃)₂SO的δ_H2.50(m)/δ_C39.5(m)，记录化学位移(δ)，以每百万分之一(ppm)为单位。分裂型式记录为s(单峰)、d(双峰)、t(三峰)、q(四峰)、m(多峰)及br(分散)。偶合常数(J)单位为Hz。于BrukerDaltonicsBioTOFIII高解析质谱仪进行ESI-MS实验。高效能液态层析术(HPLC)是于装备有除气机(Quat帮浦)与UV侦测器的Agilent1100系列仪器上进行。

化合物纯度测定

经由HPLC，于流速为1mL/min的HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)，以20–90%、30–90%或40–90%CH₃CN水溶液梯度溶析15或20分钟而测定化合物的纯度。

6-甲基异噻唑并[5,4-b]吡啶-3(2H)-酮(化合物3)。将2-氯-6-甲基烟碱腈(220mg，1.45mmol)与硫脲(348mg，4.57mmol)置于n-丁醇中于回流(118℃)下加热4小时。冷却至室温后，该黄色溶液转变成含有黄色固体的悬浮液。藉由过滤将固体收集，以n-丁醇清洗并于真空中干燥而得2-巯基-6-甲基烟碱腈(218mg，产率100%)。C₇H₆N₂S；黄色粉末，¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(1H,dt,J=8,0.8Hz),7.79(1H,dt,J=8,0.8Hz),7.70(1H,td,J=8,1.2Hz),7.46(1H,td,J=8,1.2Hz),4.64(2H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ177.39,154.77,144.83,117.1,113.3,112.7,19.2；ESI-HRMS(负电模式)C₇H₅N₂S的计算值：149.0173，实验值：m/z149.0172[M-H]^-。

将上述制备得的化合物(120mg，0.80mmol)加至浓H₂SO₄(1mL)中。将混合物浸泡于预热的100℃油浴中4小时。然后将混合物冷却，并藉由添加饱和NaHCO₃调整到pH5–6，产生内含不溶物质的悬浮液。藉由过滤将固体收集，并于真空中干燥而得所述的标题化合物(86mg，产率65%%)。C₇H₆N₂S；黄色粉末；mp187-190℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.16(1H,d,J=7.8Hz),7.21(1H,d,J=7.8Hz),2.70(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ167.0,165.5,164.1,134.1,120.2,116.1,24.1；ESI-HRMS(负电模式)C₇H₅N₂OS的计算值：150.9966，实验值：m/z150.9965[M-H]^-。

4,6-二甲基异噻唑并[5,4-b]吡啶-3(2H)-酮(4)。将2-氯-4,6-二甲基烟碱腈(800mg，4.83mmol)与硫脲(1.2kg，15.76mmol)置于n-丁醇中于回流(118℃)下加热4小时。冷却至室温后，该黄色溶液转变成含有黄色固体的悬浮液。藉由过滤将固体收集，以n-丁醇清洗并于真空中干燥而得2-巯基-4,6-二甲基烟碱腈(778mg，产率98%)。C₈H₈N₂S；浅黄色粉末；mp219-221℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.40(1H,s),2.45(3H,s),2.43(3H,s)；ESI-HRMS(负电模式)C₈H₇N₂S的计算值：163.0330，实验值：m/z163.0332[M-H]^-。

将上述制备得的化合物(750mg，4.57mmol)加至浓H₂SO₄(5mL)中。将混合物浸泡于预热的100℃油浴中4小时。然后将混合物冷却，并藉由添加饱和NaHCO₃调整到pH5–6，产生内含不溶物质的悬浮液。藉由过滤将固体收集，并于真空中干燥而得所述的标题化合物(743mg，产率84%)。C₇H₆N₂S；黄色粉末；mp190-193℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.93(1H,s),2.74(3H,s),2.60(3H,s);¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ167.5,165.8,162.6,149.2,122.0,114.5,25.0,18.2；ESI-HRMS(负电模式)C₈H₇N₂OS的计算值：179.0279，实验值：m/z179.0281[M-H]^-。

4-(1-氧异吲哚啉-2-羰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(5)。将六氢吡嗪-1-碳酸酯(300mg，1.90mmol)、4-硝基苯基氯甲酸酯(460mg，2.28mmol)与Et₃N(576mg，5.69mmol)溶于无水CH₂Cl₂(7mL)的混合物于室温下搅拌24小时，然后该反应混合物转为黄色溶液。以NaHCO_3(aq.)萃取直到有机层转为透明溶液。然后将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及藉由于使用EtOAc/己烷(1:1.5)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，得到4-(4-硝基苯基)六氢吡嗪-1,4-二碳酸1-乙酯(172mg，产率45%)。C₁₄H₁₇N₃O₆；淡黄色固体；mp125-128℃；IRν_max(neat)3512,3082,2983,2930,2867,1730,1701,1594,1523,1459,1425,1348,1288,1209,1163,1085,1055,996,957cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(1H,d,J=8.8Hz),7.28(1H,t,J=8.8Hz),4.17(2H,q,J=6.8Hz),3.66(2H,brs),3.56(6H,brs),1.28(3H,t,J=7.2Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ155.7,155.1,151.9,144.7,124.9(2×),122.1(2×),61.8,44.5,43.8,43.4(2×),14.8。

将上述制备得的p-硝基苯基胺甲酸酯(100mg，0.31mmol)、苯并噻唑酮(化合物1，56mg，0.37mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP，113mg，0.92mmol)与二异丙基乙胺(DIEA，120mg，0.93mmol)，溶于CH₂Cl₂(3mL)的混合物于室温下搅拌。将混合物搅拌48小时，接着依序以1MHCl_(aq)及饱和NaHCO_3(aq.)萃洗。将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及于使用CH₂Cl₂/MeOH(9:1)做为延展溶液的薄层硅胶平板(20cm×20cm×2mm)上进行纯化，而得标题化合物。C₁₅H₁₇N₃O₄S；白色油体；IRν_max(neat)2923,2853,1689,1423,1259,1229,995,749cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.96(1H,d,J=8.0Hz),7.66(1H,d,J=8.0Hz),7.52(1H,d,J=8.0Hz),7.40(1H,d,J=8.0Hz),4.16(2H,q,J=8.0Hz),3.63(8H,m),1.28(3H,t,J=6.8Hz)；ESI-HRMSC₁₅H₁₇N₃O₄NaS的计算值：358.0837，实验值：m/z358.0827[M+Na]⁺。

2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酸甲酯(6)。将苯并噻唑酮1(500mg，3.31mmol)悬浮于含有DIEA(1.28kg，9.93mmol)及Cs₂CO₃(1.75kg，3.30mmol)的CH₂Cl₂(25mL)中。然后于室温下将2-溴乙酸甲酯(800mg，5.26mmol)加入。将混合物搅拌5小时，于减压下浓缩，及藉由于使用EtOAc/己烷(1:2)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(495mg，产率67%)。C₁₀H₉NO₃S；白色固体；mp89-91℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.15(1H,dt,J=8,0.8Hz),7.59(1H,td,J=7.2,1.2Hz)7.52(1H,dt,J=8,0.8Hz)7.37(1H,td,J=7.2,1.2Hz),4.59(2H,s),3.76(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ167.8,165.4,140.6,132.0,126.7,125.4,123.2,120.2,52.6,44.5；ESI-HRMSC₁₀H₉NO₃S的计算值：224.0381，实验值：m/z224.0390[M+H]⁺。

2-(4,6-二甲基-3-氧异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-基)乙酸甲酯(7)。为增加N-烷基化超越O-烷基化的选择性，将吡啶并噻唑酮4(500mg，2.77mmol)悬浮于含有二异丙基乙胺(DIEA，1.5mL，8.61mmol)及Cs₂CO₃(700mg，3.07mmol)的CH₂Cl₂(20mL)中。然后于室温下将2-溴乙酸甲酯(900mg，5.88mmol)加入。将混合物搅拌5小时，于减压下浓缩，及藉由于使用EtOAc/己烷(1:4)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物7(360mg，产率55%)，伴随有O-烷基化副产物产生(7%)。化合物7：C₁₁H₁₂N₂O₃S；白色固体；mp89-91℃；IRν_max(neat)2928,1766,1728,1664,1561,1523,1435,1375,1324,1210cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.92(1H,s),4.54(2H,s),3.76(3H,s),2.70(3H,s),2.57(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ167.4,164.3,162.6,162.3,149.6,122.4,113.8,52.8,44.2,24.9,17.8；ESI-HRMSC₁₁H₁₃N₂O₃S的计算值:253.0647，实验值m/z253.0657[M+H]⁺。

2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酸(8)。将酯6(500mg，2.24mmol)悬浮于浓HCl(8mL)中，并伴随搅拌于100℃下加热6小时直到水解完成。将混合物冷却至室温，以水(500mL)稀释，并收集沉淀而得标题化合物(460mg，产率98%)。C₉H₇NO₃S；白色固体；mp241-243℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(1H,dt,J=8,0.8Hz),7.79(1H,dt,J=8,0.8Hz),7.70(1H,td,J=8,1.2Hz),7.46(1H,td,J=8,1.2Hz),4.64(2H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ169.4,166.4,141.8,132.3,125.8,125.5,123.4,121.0,44.4；ESI-HRMS(负电模式)C₉H₇NO₃S的计算值:208.0068，实验值:m/z208.0064[M-H]^-。

2-(4,6-二甲基-3-氧异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-基)乙酸(9)。将酯7(160mg，0.63mmol)悬浮于浓HCl(4mL)中，并伴随搅拌于100℃下加热6小时直到水解完成。将混合物冷却至室温，以水(500mL)稀释，并收集沉淀而得标题化合物(151mg，产率100%)。C₁₀H₁₀N₂O₃S；白色固体；mp355℃(分解)；¹HNMR(400MHz,CD₃OD)δ7.13(1H,s),4.60(2H,s),2.71(3H,s),2.59(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ170.2,165.7,164.2,163.3,151.3,123.3,115.1,45.2,24.7,17.9；ESI-HRMS(负电模式)。C₁₀H₉N₂O₃S的计算值:237.0334，实验值:m/z237.0329[M–H]^-。

2-(2-氧-2-(六氢吡嗪-1-基)乙基)苯并[d]异噻唑-2(3H)-酮(10)。将胺甲酸第三-丁酯12(50mg，0.13mmol)与三氟乙酸(TFA，2mL，26.1mmol)溶解于无水CH₂Cl₂(15mL)中，然后于27℃下搅拌2小时。将TFA于减压下移除；将残余物以胺溶液(35%)及CH₂Cl₂萃取。将有机层通过MgSO₄干燥、过滤、及浓缩，而得标题化合物(32mg，产率87%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=7.52min(15分钟内的梯度为20-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示化合物纯度为98.4%。C₁₃H₁₅N₃O₂S；泡沫；IRν_max(neat)3449,2924,2852,1639,1448,1356,1243,1202,1134,1031,929,744cm^–1；¹HNMR(400MHz,CD₃OD)δ7.97(1H,dt,J=8.0,0.8Hz),7.79(1H,dt,J=8.0,0.8Hz),7.70(1H,m),7.38(1H,m),4.82(2H,s),3.58(4H,m),2.90(2H,t,J=5.2Hz),2.84(2H,t,J=5.2Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.5,164.7,141.3,131.9,126.6,125.3,123.3,120.2,46.5,46.2,45.7,44.8,43.3；ESI-HRMSC₁₃H₁₆N₃O₂S的计算值:278.0963，实验值:m/z278.0962[M+H]⁺。

4-(2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(11)。于室温下将4-(2-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(200mg，0.61mmol)加入含苯并噻唑酮1(102mg，0.67mmol)、Et₃N(233mg，1.83mmol)及Cs₂CO₃(198mg，0.61mmol)悬浮于CH₂Cl₂(8mL)的悬浮液中。将混合物搅26小时，并以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，及藉由于使用EtOAc/己烷(1:2)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(134mg，产率63%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=11.87min(20分钟内的梯度为20-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示化合物纯度为99.3%。C₁₆H₁₉N₃O₄S；白色固体；mp158-160℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.09(1H,dd,J=7.2Hz,0.8Hz),7.59(1H,m),7.53(1H,dd,J=7.2,0.8Hz),7.38(1H,m),4.69(2H,s),4.13(2H,q,J=7.2Hz),3.60(2H,m),3.55(2H,m),3.48(4H,m),1.25(3H,t,J=7.2Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.6,154.6,140.8,131.8,130.0,126.4,125.1,122.9,120.0,61.9,45.3,45.0,43.5(2×),42.2,15.0；ESI-HRMSC₁₆H₁₉N₃O₄S的计算值:372.0994，实验值:m/z372.0992[M+H]⁺。

4-(2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(12)。将六氢吡嗪(1.10g，12.8mmol)与DIEA(1.65g，12.8mmol)混合于无水CH₂Cl₂(60mL)的混合物于27℃下搅拌，并将二碳酸二第三丁酯(1.39g，6.39mmol)溶于无水CH₂Cl₂(80mL)的溶液缓慢地经由分液漏斗加入，历时20小时。将混合物以水分层；将有机相分离，通过MgSO₄干燥、过滤及浓缩，而得六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(2.01g，产率85%)。C₉H₁₈N₂O₂；白色固体；mp45-46℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ3.38(4H,t,J=4.8Hz),2.80(4H,t,J=4.8Hz),1.73(1H,s),1.45(9H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ154.1,79.5,45.9(2×),44.8(2×),28.7(3×)；ESI-HRMSC₉H₁₉N₂O₂的计算值:187.1447，实验值:m/z187.1451[M+H]⁺。

将上述制备得的六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(500mg，2.68mmol)，于DIEA(1.04g，8.05mmol)存在下以氯化氯乙酰基(360mg，2.95mmol)处理，经由于硅胶管柱(EtOAc/己烷=1:2)上进行的急骤层析术纯化，而得4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(571mg，产率81%)。C₁₁H₁₉ClN₂O₃；白色固体；mp68-70℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.06(2H,s),3.58(2H,m),3.49(4H,s),3.44(2H,m)1.47(9H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.5,153.7,80.2,46.2,43.3(2×),42.1,40.9,28.5；ESI-HRMSC₁₁H₂₀ClN₂O₃的计算值:285.0982，实验值:m/z285.0985[M+H]⁺。

于室温下，将上述制备得的含氯基化合物(52mg，0.34mmol)加入含苯并噻唑酮1(90mg，0.34mmol)、Et₃N(175mg，1.73mmol)及Cs₂CO₃(167mg，0.51mmol)悬浮于无水CH₂Cl₂(20mL)的悬浮液中。将混合物搅22小时，并于减压下浓缩。将残余物以CH₂Cl₂及H₂O萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，及藉由于以EtOAc/己烷(3:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(87mg，产率67%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=16.6min(20分钟内的梯度为20-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示化合物纯度为96.9%。C₁₈H₂₃N₃O₄S；白色固体；mp120-122℃；IRν_max(neat)2974,2925,1655,1460,1418,1364,1339,1285,1171,1128,1068,1028740cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(1H,d,J=8.0Hz),7.58(1H,td,J=8.0,0.8Hz),7.52(1H,d,J=8.0Hz),7.38(1H,td,J=8.0,0.8Hz),4.68(2H,s),3.59(2H,m),3.53(2H,m),3.41(4H,m),1.44(9H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.0,164.6,153.8,140.8,131.8,126.4,125.1,122.9,120.0,80.4,45.3,45.0,43.4(2×),42.2,28.7(3×)；ESI-HRMSC₁₈H₂₄N₃O₄S的计算值:400.1307，实验值:m/z400.1301[M+H]⁺。

4-(2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸苯甲酯(13)。于室温下，将化合物10(100mg，0.36mmol)与氯甲酸苯甲酯(75mg，0.44mmol)及DIEA(140mg，1.10mmol)，于无水CH₂Cl₂(5mL)与DMF(1mL)中反应4小时。将CH₂Cl₂及DMF于减压下去除。将混合物依序以1MHCl_(aq)及饱和NaHCO_3(aq.)萃洗。将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及于使用CH₂Cl₂/MeOH(9:1)做为延展溶液的薄层硅胶平板(20cm×20cm×2mm)上进行纯化，而得标题化合物。C₂₁H₂₁N₃O₄S；白色固体；mp138-142℃；IRν_max(neat)2923,2854,1700,1655,1428,1354,1286,1227,1125,1075,1027,984,861,741cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.01(1H,d,J=8.0Hz),7.60(1H,t,J=7.2Hz),7.53(1H,d,J=8.0Hz),7.36(6H,m),5.12(2H,s),4.69(2H,s),3.62(8H,m)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.1,154.8,141.1,136.1,132.1,128.5,128.1,127.9,126.7(2×),126.3(2×),125.4,123.2,120.2,67.6,45.2,44.9,43.6(2×),42.0；ESI-HRMSC₂₁H₂₁N₃O₄NaS的计算值:434.1150，实验值:m/z434.1149[M+H]⁺。

4-硝基苯基4-(2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸酯(14)。于室温下，将化合物10(81.5mg，0.29mmol)与4-硝基苯基氯甲酸酯(213mg，1.06mmol)及DMAP(108mg，0.88mmol)，于无水CH₂Cl₂(4mL)中反应16小时。将混合物依序以饱和NaHCO_3(aq.)及1MHCl_(aq)萃洗，直到溶液变为透明。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，及经由于以CH₂Cl₂/MeOH(100:0.5至9:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(70mg，产率56%)。C₂₀H₁₈N₄O₆S；淡黄色固体；mp114-118℃；IRν_max(neat)2923,2854,1725,1655,1520,1346,1259,1163,1111,1056,1024,862,748cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.22(2H,d,J=10.2Hz),8.02(1H,d,J=8.0Hz),7.62(2H,t,J=8.0Hz),7.55(1H,d,J=8.0Hz),7.40(1H,t,J=8.0Hz),7.27(1H,d,J=10.2Hz),4.73(2H,s),3.70(6H,brs),3.62(2H,brs)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.4,165.1,155.5,151.7,144.7,141.0,132.1,126.5,125.4,124.9(2×),123.0,122.0(2×),120.2,44.7,44.5,44.2,43.8,43.6；ESI-HRMSC₂₀H₁₉N₄O₆S的计算值:443.1025，实验值:m/z443.1042[M+H]⁺。

2-(2-(4-丙烯基六氢吡嗪-1-)-2-氧乙基)苯并[d]异噻唑-2(3H)-酮(15)。于室温下，将化合物10(30mg，0.11mmol)与溴化丙烯基(16mg，0.13mmol)及DIEA(40mg，0.31mmol)，于无水CH₂Cl₂(2mL)中反应6小时。然后藉由减压将溴化丙烯基去除，并将残余物以H₂O清洗，在于使用CH₂Cl₂/MeOH(9:1)做为延展溶液的薄层硅胶平板(20cm×20cm×2mm)上进行纯化后，得到标题化合物。C₁₆H₁₉N₃O₂S；白色固体；mp119-120℃；IRν_max(neat)3072,2920,2857,2801,1717,1653,1448,1339,1262,1234,1136,1038,1000,924,748cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.02(1H,d,J=8.0Hz),7.58(1H,t,J=7.6Hz),7.53(1H,d,J=8.0Hz),7.37(1H,t,J=7.6Hz),5.80(1H,m),5.16(2H,m),4.69(2H,s),3.65(2H,t,J=5.2Hz),3.57(2H,t,J=5.2Hz),2.99(2H,d,J=6.8Hz),2.45(4H,m)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.5,164.7,134.1,132.0,126.7,125.3,120.2,118.5,61.5,52.9,52.5,45.3,44.8(2×),42.2,29.8；ESI-HRMSC₁₆H₂₀N₃O₂S的计算值:318.1274，实验值:m/z318.1274[M+H]⁺。

2-(2-氧-2-(六氢吡嗪-1-基)-乙基)苯并[d]异噻唑-2(3H)-酮1,1-二氧化物(16)。将化合物17(39mg，0.10mmol)与三氟乙酸(TFA，1mL，13.2mmol)溶解于无水CH₂Cl₂(2mL)中，然后于27℃下搅拌2小时。将TFA于减压下去除，并将残余物以乙基醚清洗，而得产物37(45.3mg，产率100%)。C₁₃H₁₅N₃O₄S；白色油体；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.10(2H,m),8.01(1H,td,J=7.6,1.2Hz),7.96(1H,td,J=7.6,1.2Hz),4.78(2H,s),3.91(2H,brs),3.84(2H,brs),3.36(2H,brs),3.27(2H,brs)；¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ165.7,160.6,139.2,136.6,136.0,128.2,126.2,122.3,67.0,44.4,43.2(2×),40.5；ESI-HRMSC₁₃H₁₆N₃O₄S的计算值:310.0862，实验值:m/z310.0865[M+H]⁺。

4-(2-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯1,1-二氧化物(17)。于室温下，将糖精(化合物2，200mg，1.09mmol)加入4-(2-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三-丁酯(343mg，0.97mmol)、DIEA(382mg，2.98mmol)于无水CH₂Cl₂(5mL)的悬浮液中。将混合物搅拌23小时，并依序以1MHCl_(aq)及饱和NaHCO_3(aq.)萃洗。将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及于以EtOAc/己烷(1:1.5)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(159mg，产率40%)。C₁₈H₂₃N₃O₆S；白色固体；mp178-181℃；TLC(EtOAc/己烷=1:1.5)R_f=0.2；IRν_max(neat)3193,2974,2929,2851,1743,1689,1663,1459,1428,1330,1238,1181,1126,1057,999,973,877cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(1H,d,J=7.6Hz),7.91(1H,d,J=8.0Hz),7.83(2H,m),4.51(2H,s),3.58(2H,m),3.51(2H,s),3.49(2H,s)3.44(2H,m),2.24(2H,m),1.54(9H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ162.5,159.0,154.2,137.6,134.8,134.2,127.1,125.3,121.0,80.4,44.8(2×),42.2(2×),39.8,28.4(3×)；ESI-HRMSC₁₈H₂₄N₃O₆S的计算值:410.1386，实验值:m/z410.1396[M+H]⁺。

4-[2-(1,3-二氧-1,3-二氢-吲哚-2-基)-乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯1,1-二氧化物(18)。于40℃下，将酞酰亚胺(33mg，0.23mmol)以4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三-丁酯(80.5mg，0.32mmol)、碘化四丁铵(TBAI，84mg，2.3mmol)、二异丙基乙胺(DIEA，0.20mg，1.14mmol)于无水CH₂Cl₂(10mL)中处理24小时。将混合物置于CH₂Cl₂与水之间分配。将有机相分离，通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及于以EtOAc/己烷(1:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(57.1mg，产率67%)。C₁₉H₂₃N₃O₅；白色固体；TLC(EtOAc/己烷=1:1)R_f=0.2；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.85–7.87(2H,m),7.70–7.72(2H,m),4.49(2H,s),3.51–3.57(6H,m),3.44(2H,d,J=5.2Hz),1.46(9H,d,J=4.8Hz)。

4,6-二甲基-2-(2-吗啉基-2-氧乙基)异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-酮(19)。于0℃下，将氯化氯乙酰基(840mg，6.89mmol)加入吗福啉(500mg，5.74mmol)溶于含有Et₃N(1.74g，17.22mmol)的无水CH₂Cl₂(25mL)的溶液中。将该混合物搅拌并加温至27℃达2小时。将混合物以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥并于减压下浓缩，而得2-氯-1-吗啉基乙酮(1.13g，产率100%)。C₆H₁₁ClNO₂；棕色油体；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.05(2H,s),3.69(4H,m),3.62(2H,m),3.52(4H,m)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.4,66.5,66.4,46.8,42.5,40.8；ESI-HRMSC₆H₁₂ClNO₂的计算值:164.0478，实验值:m/z164.0478[M+H]⁺。

将上述制备得的含氯基化合物(225mg，0.34mmol)加入含吡啶并噻唑酮4(200mg，1.22mmol)、Et₃N(370mg，3.66mmol)悬浮于无水CH₂Cl₂(25mL)加热至回流(40℃)的悬浮液中。将该混合物搅拌24小时，并以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及于以EtOAc/己烷(1:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得到标题化合物(211mg，产率55%)。伴随有O-烷基化副产物产生(9%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=11.9min(20分钟内的梯度为20-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示产物19的纯度为97.3%。C₁₄H₁₇N₃O₃S；白色固体；mp200-203℃；IRν_max(neat)3490,2921,2851,1704,1651,1467,1275,1111,1036,750cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.91(1H,s),4.62(2H,s),3.67(4H,m),3.62(2H,m),3.54(2H,m),2.70(3H,s),2.58(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.8,164.8,163.2,162.9,149.8,122.5,114.0,66.7,66.4,45.5,44.1,42.5,25.0,17.6；ESI-HRMSC₁₄H₁₈N₃O₃S的计算值:308.1069，实验值:m/z308.1071[M+H]⁺。

4,6-二甲基-2-(2-氧-2-(六氢吡嗪-1-基)乙基)异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-酮(20)。将化合物22(20mg，0.05mmol)与TFA(4mL，52.6mmol)溶解于无水CH₂Cl₂(15mL)中，然后于27℃下搅拌0.5小时。将TFA于减压下移除，并将残余物以胺溶液(35%)及CH₂Cl₂萃取。将有机层通过MgSO₄干燥、过滤、及浓缩，而得标题化合物(16mg，产率100%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=16.6min(20分钟内的梯度为20-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示化合物纯度为95.2%。C₁₄H₁₈N₄O₂S；白色固体；mp175-177℃；IRν_max(neat)3475,3310,2925,1652,1565,1443,1337,1275,1033,750cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.92(1H,S),4.64(2H,s),3.62(2H,m),3.53(2H,m),2.88(4H,m),2.72(3H,s),2.59(3H,s),2.04(1H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.4,164.1,162.9,162.4,149.4,122.6,113.9,46.5,46.3,45.9,44.4,43.5,24.9,17.9；ESI-HRMSC₁₄H₁₉N₄O₂S的计算值:307.1229，实验值:m/z307.1227[M+H]⁺。

4-(2-(4,6-二甲基-3-氧-异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(21,YMU1)。将含酸9(420mg，1.76mmol)与六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(279mg，1.76mmol)的混合物以1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)羰二亚酰胺(EDCI，370mg，1.1mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP，催化量)与二异丙基乙胺(DIEA，186mg，5.28mmol)，于无水CH₂Cl₂(50mL)中处理。将混合物于氮大气下，于27℃下搅拌16小时。将混合物置于H₂O与1MHCl_(aq)之间分配。将有机相通过MgSO₄干燥，过滤并于减压下浓缩。将残余物经急骤层析术(溶析：EtOAc/己烷=1.5:1)，而得到430mg(产率65%)的标题化合物(YMU1)，将其从EtOAc再结晶。经由于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=9.35min(40分钟内的梯度为30-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示产物的纯度为95.7%。

或者，于室温下将吡啶并噻唑酮4(300mg，1.66mmol)以4-(2-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(541mg，1.66mmol)、Et₃N(840mg，8.30mmol)及Cs₂CO₃(500mg，1.54mmol)于无水CH₂Cl₂(25mL)中处理24小时，然后以H₂O萃洗。将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩，及以于硅胶管柱上进行的急骤层析术(EtOAc/己烷(1:1))纯化，而得到标题化合物(产率60%)。伴随有O-烷基化副产物28产生(11%)。

化合物21：C₁₇H₂₂N₄O₄S；白色粉末；TLC(EtOAc/己烷=3:1)R_f=0.45；¹HNMR(400MHz,CD₃OD)δ6.93(1H,s),4.65(2H,s),4.15(2H,q,J=6.8Hz),3.61(2H,m),3.52(4H,s),3.49(2H,m),2.72(3H,s),2.59(3H,s),1.26(3H,t,J=7.6Hz)；¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ164.41,164.31,162.73,162.49,154.61,149.43,122.23,113.74,61.85,45.13,44.45,43.56(2×),42.15,24.90,17.85,14.90；ESI-HRMSC₁₇H₂₃N₄O₄S的计算值:279.1440，实验值:m/z279.1446[M+H]⁺。

4-(2-(4,6-二甲基-3-氧-异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(22)。将4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(150mg，0.57mmol)与碘化钠(260mg，1.73mmol)混于丙酮(6mL)的混合物于室温下搅拌21小时，然后反应混合物转变成含有白色固体的悬浮液。藉由过滤将固体清除，并将滤液干燥至真空，并以CH₂Cl₂与H₂O清洗。然后将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤、浓缩而得4-(2-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸第三丁酯(164.4mg，产率84.4%)。C₁₁H₁₉IN₂O₃；棕色固体；mp69-71℃；IRν_max(neat)2976,2926,2861,1696,1650,1459,1419,1366,1258,1168,1028,996,750cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ3.76(2H,s),3.57(2H,m),3.51(2H,m),3.41(4H,m)1.47(9H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ166.5,154.2,80.4,47.0,43.0(2×),41.9(2×),28.4(3×)。

于室温下，将吡啶并噻唑酮4(300mg，1.66mmol)加入上述制备得的含碘基化合物(578mg，1.66mmol)、Et₃N(840mg，8.30mmol)与Cs₂CO₃(500mg，1.54mmol)悬浮于无水CH₂Cl₂(25mL)的悬浮液中。将混合物搅拌24小时，并于减压下浓缩。将残余物以CH₂Cl₂及H₂O萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，及于以EtOAc/己烷(1:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得标题化合物(400mg，产率59%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=8.1min(15分钟内的梯度为40-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示产物的纯度为98.4%。C₁₉H₂₆N₄O₄S；白色固体；mp204-207℃；IRν_max(neat)3473,2974,2924,1655,1588,1564,1460,1419,1365,1286,1238,1169,1127,1033,997,765cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.89(1H,s),4.62(2H,s),3.56(2H,m),3.47(2H,m),3.41(4H,m),2.67(3H,s),2.55(3H,s),1.42(9H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.8,164.7,163.1,162.9,154.1,149.7,122.4,113.9,80.35,45.0,44.3,43.1(2×),42.0,28.4(3×),24.6,17.5；ESI-HRMSC₁₉H₂₆N₄O₄S的计算值:407.1753，实验值:m/z407.1756[M+H]⁺。

4-(4-(3-氧苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)丁酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(23)。于20℃下，将六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(800mg，5.06mmol)以氯化4-氯丁酰基(856mg，6.075mmol)，于含有Et₃N(1.54g，15.17mmol)的无水CH₂Cl₂(25mL)中处理2小时，然后以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥，并于减压下浓缩，而得4-(4-氯丁酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(1.315kg，产率99%)。C₁₁H₁₉ClN₂O₃；淡黄色油体；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.13(2H,q,J=7.2Hz),3.62(2H,t,J=5.6Hz),3.58(2H,m),3.46(6H,m)2.49(2H,t,J=6.8Hz),2.11(2H,m),1.25(3H,t,J=7.2Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ170.1,155.1,61.7,45.2,44.8,43.7(2×),41.4,29.8,27.8,14.7；ESI-HRMSC₁₁H₂₀ClN₂O₃的计算值:263.1162，实验值:m/z263.1175[M+H]⁺。

将上述制备得的含氯基化合物(664mg，2.53mmol)以碘化钠(1.14kg，7.59mmol)于丙酮(8mL)中处理。将混合物于室温下搅拌21小时，得到含有白色固体的悬浮液。将固体藉由过滤清除，并将滤液于真空中干燥。将残余物置于CH₂Cl₂与H₂O之间进行分配。将有机层通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩而得4-(4-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸丁酯(654.5mg，产率73%)。C₁₁H₁₉IN₂O₃；黄色油体；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.14(2H,q,J=7.2Hz),3.61(2H,t,J=5.2Hz),3.59(2H,m),3.45(6H,m)2.51(2H,t,J=7.0Hz),2.11(2H,m),1.26(3H,t,J=6.8Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ170.1,155.1,61.7,45.2,44.8,43.6(2×),41.4,29.8,27.8,14.7。

于室温下，将苯并噻唑酮1(291mg，1.92mmol)以上述制备得的含碘基化合物(650mg，1.83mmol)与DIEA(712mg，5.51mmol)于无水CH₂Cl₂(25mL)中处理。将混合物搅17小时，并依序以1MHCl_(aq)及饱和NaHCO_3(aq.)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，并于以EtOAc/己烷(1:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得标题化合物(350mg，产率50%)。C₁₈H₂₃N₃O₄S；油体；TLC(EtOAc/己烷=2:1)R_f=0.6；IRν_max(neat)2987,2923,1698,1645,1509,1464,1428,1346,1260,1233,1021,750cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.85(2H,d,J=8.0Hz),7.73(2H,d,J=8.0Hz),7.48(2H,t,J=7.2Hz),7.35(2H,t,J=7.2Hz),4.58(2H,d,J=5.6Hz),4.13(2H,q,J=3.6Hz),3.61(2H,m),3.44(6H,m)2.54(2H,t,J=7.6Hz),2.24(2H,m),1.50(3H,t,J=6.4Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ170.5,162.7,155.1,151.4,128.5,125.1,124.2,122.7,120.0,67.9,61.7,45.2,43.6(2×),41.4,29.7,24.8,14.7；ESI-HRMSC₁₈H₂₄N₃O₄S的计算值:378.1488，实验值:m/z378.1493[M+H]⁺。

2,2'-(2,2'-(六氢吡嗪-1,4-二基)双(2-氧乙烷-2,1-二基))二苯并[d]异噻唑-2(3H)-酮(24)。于0℃下，将氯化氯乙酰基(892mg，7.31mmol)加入六氢吡嗪(300mg，3.48mmol)溶于含有Et₃N(1.41kg，13.93mmol)的无水CH₂Cl₂(12mL)的溶液中。将该混合物搅拌并加温至27℃达1小时。将混合物以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥并于减压下浓缩，而得1,1'-(六氢吡嗪-1,4-二基)-双(2-氯乙酮)(750mg，产率90%)。C₈H₁₂Cl₂N₂O₂；白色固体；mp104-107℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.08(4H,s),3.69(2H,m),3.62(4H,d,J=8.0Hz),3.55(2H,m)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.2(2×),46.2,45.8,42.1,41.7,40.7(2×)。

将上述制备得的1,1'-(六氢吡嗪-1,4-二基)-双(2-氯乙酮)(750mg，3.14mmol)与碘化钠(1.88kg，12.54mmol)混于丙酮(10mL)中的混合物于室温下搅拌16小时，得到含有白色固体的悬浮液。将固体藉由过滤清除，并将滤液于真空中干燥。将残余物置于CH₂Cl₂与H₂O之间进行分配。将有机层通过MgSO₄干燥、过滤及浓缩，而得1,1'-(六氢吡嗪-1,4-二基)-双(2-碘乙酮)(210mg，产率16%)。C₈H₁₂I₂N₂O₂；暗褐色固体；mp105-109℃；IRν_max(neat)3003,2922,2853,1708,1637,1439,1258,1225,1161,1092,1023,983,737cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ3.76(4H,s),3.73(2H,m),3.62(2H,s),3.57(2H,s),3.46(2H,m)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ166.6,166.4,46.5,46.3,41.5,41.4,29.7(2×)。

于室温下，将苯并噻唑酮1(160mg，1.06mmol)以上述制备得的含碘基化合物(200mg，0.47mmol)与DIEA(368mg，2.85mmol)于无水CH₂Cl₂(5mL)中处理。将混合物搅26小时，并依序以1MHCl_(aq)及饱和NaHCO_3(aq.)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，并于以CH₂Cl₂/MeOH(100:2.5)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得标题化合物(225mg，产率48%)。C₂₂H₂₀N₄O₄S₂；白色固体；mp269-271℃(已分解)；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.95(2H,d,J=8.0Hz),7.87(2H,d,J=8.0Hz),7.69(2H,t,J=8.0Hz),7.43(2H,t,J=8.0Hz),4.81(2H,s),4.79(2H,s),3.62(2H,brs),3.55(4H,brs)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ165.2(2×),165.1(2×),141.5(2×),132.1(2×),125.7(2×),125.5(2×),123.5(2×),121.8(2×),44.5(2×),43.8(2×),41.2(2×)；ESI-HRMSC₂₂H₂₁N₂O₄S₂的计算值:469.1004，实验值:m/z469.1004[M+H]⁺。

2-(4,6-二甲基异噻唑并[5,4-b]吡啶-3-基氧基)乙酸甲酯(25)。将吡啶并噻唑酮4(500mg，2.77mmol)、溴乙酸甲酯(900mg，5.88mmol)、Cs₂CO₃(700mg，3.07mmol)与DIEA(1.5mL，8.61mmol)于无水CH₂Cl₂(25mL)的混合物于室温下搅拌24小时，并于减压下浓缩。除了主要的N-烷基化产物7(55%)以外，经以于硅胶管柱上进行的急骤层析术(EtOAc/己烷(1:4))纯化后，得到标题化合物(50mg，产率7%)。C₁₁H₁₂N₂O₃S；白色固体；mp89-91℃；IRν_max(neat)3053,2958,2929,2851,1767,1592,1562,1504,1445,1398,1334,1228,1128,1039,961cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.91(1H,s),5.05(2H,s),3.78(3H,s),2.89(3H,s),2.61(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ172.3,168.4,160.7,160.2,145.6,121.4,115.7,64.2,52.3,24.6,19.1；ESI-HRMSC₁₁H₁₃N₂O₃S的计算值:253.0647，实验值:m/z253.0647[M+H]⁺。

2-(4,6-二甲基异噻唑并[5,4-b]吡啶-3-基氧基)乙酸(26)。将酯25(150mg，0.59mmol)悬浮于浓HCl(3mL)中，并伴随搅拌于100℃下加热5小时直到水解完成。将混合物冷却至室温，以水(350mL)稀释，并收集沉淀而得标题化合物(138mg，产率98%)。C₁₀H₁₀N₂O₃S；白色固体；mp270℃(已分解)；IRν_max(neat)3423,2928,1716,1591,1504,1440,1392,1363,1308,1204,1125,1038,985,862cm^–1；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.20(1H,s),5.03(2H,s),2.66(3H,s),2.58(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.0,169.0,160.9,160.6,145.3,121.7,115.1,64.4,24.1,14.4；ESI-HRMS(负电模式)C₁₀H₉N₂O₃S的计算值:237.0334，实验值:m/z237.0332[M–H]^-。

2-(4,6-二甲基异噻唑并[5,4-b]吡啶-3-基氧基)-1-吗福啉乙酮(27)。将吡啶并噻唑酮4(200mg，1.22mmol)以2-氯-1-吗福啉乙酮(225mg，1.25mmol)与Et₃N(370mg，3.66mmol)于无水CH₂Cl₂(25mL)中，于回流(40℃)下处理24小时，然后以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥、过滤、浓缩，并于以EtOAc/己烷(1:1)溶析的硅胶管柱上进行的急骤层析术纯化，而得标题化合物(35mg，产率9%)，外加主要的N-烷基化产物19(55%)。

或者，将酸26与吗福啉在EDCI、DMAP及DIEA存在下，经由类似于化合物21(YMU1)的制程进行偶合反应，而得到化合物27(产率82%)。

化合物27：C₁₄H₁₇N₃O₃S；白色固体；mp153-155℃；IRν_max(neat)3488,2923,2853,1665,1591,1498,1443,1378,1333,1273,1239,1115,1018cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.93(1H,S),5.16(2H,s),3.90(6H,m),3.51(2H,3),2.71(3H,s),2.61(3H,s)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ172.3,165.4,160.7,160.5,145.7,121.5,115.8,66.8,66.4,64.9,45.3,42.2,24.6,19.1；ESI-HRMSC₁₄H₁₈N₃O₃S的计算值:308.1069，实验值:m/z308.1070[M+H]⁺。

4-(2-(4,6-二甲基异噻唑并[5,4-b]吡啶-3-基氧基)乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(28)。于0℃下，将六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(200mg，1.26mmol)以氯化氯乙酰基(186mg，1.65mmol)于含有DIEA(490mg，3.80mmol)的无水CH₂Cl₂(10mL)的溶液中处理。将该混合物搅拌并加温至27℃达4小时。将混合物以1MHCl_(aq)萃洗。将有机相通过MgSO₄干燥，并于减压下浓缩，而得4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(275mg，产率93%)。C₉H₁₅ClN₂O₃；透明油体；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.15(2H,q,J=7.2Hz)4.06(2H,s),3.60(2H,m),3.54(2H,m),3.49(4H,m),1.27(3H,t,J=7.2Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ164.3,154.3,61.4,45.8,43.5,43.1,41.8,40.8,14.7；ESI-HRMSC₉H₁₆ClN₂O₃的计算值:235.0849，实验值:m/z235.0852[M+H]⁺。

将4-(2-氯乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(2.36g，10.06mmol)与碘化钠(3g，20.11mmol)混于丙酮(45mL)的混合物，于室温下搅拌24小时，而得含有白色固体的悬浮液。藉由过滤将固体清除，并将滤液于减压下浓缩。将残余物以CH₂Cl₂与H₂O萃取。然后将有机层通过MgSO₄干燥，经过滤及浓缩而得4-(2-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(2.47g，产率75%)。C₉H₁₅IN₂O₃；棕色油体；IRν_max(neat)2981,2927,2864,1697,1642,1464,1434,1385,1286,1232,1133,1073,1030,989,767cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.14(2H,q,J=7.0Hz),3.75(2H,s),3.58(4H,m),3.43(4H,m),1.26(3H,t,J=7.0Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ166.6,155.1,61.8,47.0,43.1(2×),42.0(2×),14.7；ESI-HRMSC₉H₁₆IN₂O₃的计算值:327.0206，实验值:m/z327.0215[M+H]⁺。

于室温下，将吡啶并噻唑酮4(300mg，1.66mmol)以4-(2-碘乙酰基)六氢吡嗪-1-碳酸乙酯(541mg，1.66mmol)、Et₃N(840mg，8.30mmol)与Cs₂CO₃(500mg，1.54mmol)于无水CH₂Cl₂(25mL)中处理24小时，然后以H₂O萃洗。将有机层通过MgSO₄干燥，过滤、浓缩，并藉由于硅胶管柱上(EtOAc/己烷(1:1))的急骤层析术纯化，而得标题化合物(68mg，产率11%)，外加主要的N-烷基化产物21(YMU1,60%)。以于HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5μM)上，t_R=4.9min(15分钟内的梯度为40-90%CH₃CN水溶液)进行的HPLC显示化合物纯度为99.5%。

化合物28：C₁₉H₂₆N₄O₄S；白色固体；mp88-90℃；IRν_max(neat)2981,2926,2868,1674,1591,1566,1498,1466,1431,1381,1286,1231,1200,1174,1127,1007cm^–1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.93(1H,s),5.18(2H,s)4.15(2H,q,J=7.2Hz),3.62(2H,m),3.51(4H,m),2.71(3H,s),2.62(3H,s),1.26(3H,t,J=7.2Hz)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ171.84,165.01,160.36,160.23,154.70,145.33,121.27,115.56,65.06,61.92,44.91,43.67(2×),41.98,24.88,19.46,15.06；ESI-HRMSC₁₇H₂₂N₄O₄S的计算值:401.1259，实验值:m/z401.1260[M+H]⁺。

慢病毒载体的构筑

使用BLOCK-iT^TMLentiviralRNAi表现系统(Invitrogen)构筑慢病毒为主的小发夹RNA(shRNA)。选择hTMPK开放读框的核苷酸509至527，及hTS基因的3’UTR中的核苷酸1017至1036做为标靶序列。本发明合成一股含有该标靶序列，随后接着一个7-核苷酸短环，及最初标靶序列的反向互补序列的寡核苷酸。将成对的寡核苷酸黏合，并插入pENTRTM/U6RNAi卡匣中而产生一进入构体。亦选殖该套组所提供的LacZ双股对照组，做为非缄默性(阴性)对照组siRNA。然后藉由将U6RNAi卡匣重组入pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体中，而各别选殖得慢病毒构体。

制造用于感染的慢病毒shRNA

将293FT生产者细胞(6×10⁶个细胞)以9μg的ViraPower^TM包装Mix(含有pLP1、pLP2与pLP/VSVG质体的混合物)，及3μg的pLenti6LacZ^shRNA、TMPK^shRNA、TS^shRNA、pLKO-UNG^shRNA或pLKO-dUTPase^shRNA质体，藉由lipofectamine2000(Invitrogene)进行共-转感染。于转感染后72小时，收集10ml含有慢病毒的上清液，并以Millipore浓缩管柱浓缩至最终体积为5ml。使用存在1ml含有8μg/ml聚溴化季铵阳离子(polybrene)的培养基中的慢病毒LacZ^shRNA、TMPK^shRNA、TS^shRNA、UNG^shRNA及dUTPase^shRNA储存液来感染2.5×10⁵个细胞，经隔夜培养后将上清液替换成用于后续分析的完全培养基。

结合荧光素酶的TMPK分析

于25℃下将溶于50μlTMPK分析缓冲液(100mMTris-HCl,pH7.5,100mMKCl,10mMMgCl2,50μMATP与100μMdTMP)中的纯化的hTMPK加入96孔平盘中开始进行TMPK反应10分钟，并藉由加入200μlofDTNB(100μM)而终止反应，随后将10μl反应溶液转移至含有90μl荧光素酶分析缓冲液(50mMGlycine,0.5mMEDTA与5mMEDTA,pH7.0,0.1μg荧光素酶,50μM荧光素与0.1%BSA)的白色96-孔平盘。以冷光计数器(Packard)测量冷光。

结合荧光素酶的TK分析

于25℃下将溶于50μlTK分析缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.5,1mMCHAPS,3mg/mlBSA,2.5mMMgCl2,50μMATP与100μM胸腺核苷)中的纯化的hTMPK加入96孔平盘中开始进行TMPK反应10分钟，并藉由加入200μlof胸腺核苷(1.25mM)而终止反应，随后将10μl反应溶液转移至含有90μl荧光素酶分析缓冲液(50mMGlycine,0.5mMEDTA与5mMEDTA,pH7.0,0.1μgof荧光素酶,50μM荧光素与0.1%BSA)的白色96-孔平盘。以冷光计数器(Packard)测量冷光。

结合NADH的TMPK分析

所有反应皆于96-孔平盘中进行，分析体积为100μl。hTMPK的活性是于25℃下，使用经修改的已知结合NADH的比色分析进行测量(Agarwal等人,1978；Miyata等人,2003；Ostermann等人,2003)，其中是将纯化的hTMPK加入含有100mMTris-HCl,pH7.5、100mMKCl、10mMMgCl₂、0.5mM磷酸烯醇丙酮酸、0.25mMNADH、5单位乳酸脱氢酶、4单位丙酮酸激酶、1mMATP与200μMdTMP的缓冲液中。经由读取340nm下的吸光值来测量NADH的变化量。一单位TMPK活性定义为每分钟将1μmoleTMP转变成TDP。

酵素的表现及纯化

将pGEX-2T-hTMPK(Ke等人,2005)、pGEX-2T-hTMPKD15R、pGEX-2T-dUTPase(WT)、pGEX-2T-dUTPase(KD-突变型)或pGEX-3X-hTK1(Chang等人,1998)转形至大肠杆菌JM109株中，藉由于37℃下以0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖呱喃醣苷(IPTG)进行诱导4小时，来制造GST-hTMPK及GST-dUTPase融合蛋白。将细菌经由超音波震荡溶解，并将已澄清的上清液与麸胱甘肽4B珠粒(AmershamPharmacia)反应。经过以磷酸盐缓冲食盐水(PBS)充分清洗后，藉由于4℃下进行凝血酶(Sigma)分解过夜，将hTMPK蛋白从结合在麸胱甘肽珠粒的GST-融合蛋白分解出。纯化的GST-dUTPase(WT)及GST-dUTPase(KD-突变型)融合蛋白是于亲和层析术后，使用将其从麸胱甘肽-sepharose溶析出。

dUTPase活性分析

为侦测dUTPase活性，使用EnzChek磷酸盐分析套组(Invitrogen)，依照制造商的指示来测量dUTPase活性。简述之，将0.25μgGST-dUTPase(WT)或GST-dUTPase(KD-突变型)蛋白加入200μl含有0.3mMdUTP的反应缓冲液[34mMTris-HClpH8.3,10mMMgCl₂,0.5mMEDTA,0.25mg/ml牛血清白蛋白(BSA,Sigma)]中。将反应混合物静置于37℃下3分钟。将样本(各15μl)加入反应混合物[715μldH2O,50μl20X反应缓冲液,200μlMESG受质,1U嘌呤核苷磷酸化酶,0.03U无机焦磷酸水解酶]中，并于22℃下反应45分钟。使用ELISA平盘计读机测量360nm下的吸光值。

彗星分析

使用Trevigen’s彗星分析套组(4250-050-k)，依照制造商的指示进行碱性彗星分析。将DNA以SYBRGreen染色，并将玻片数字照相(OlympusBX51显微镜与Olympus相机)。使用ScoinImage软件分析尾部力矩。

整体细胞dTTP萃取及定量

将10⁶个细胞以1ml冰冻的60%甲醇于-20℃下萃取过夜，随后于16,000xg离心30分钟。将上清液浸于100℃干浴中3分钟，并于真空下干燥。将干燥的残余物溶解于80μl不含核酸酶的水中，并根据Ferraro等人所述的方法(Ferraro等人,2010)，将其用于测量细胞的dNTP。

蛋白质萃取及西方墨点分析

如先前技艺所述制备细胞萃取物(Chang等人,1998)。将等量蛋白质于SDS-PAGE(11%(w/v)凝胶)上进行解析，随后以电泳术转移至PVDF膜(Millipore)。经过5%(w/v)脱脂奶粉封阻后，将该膜与不同的抗体于4℃下反应过夜，再以辣根过氧化酶共轭的山羊抗-兔子IgG、山羊抗-小鼠及驴子抗-山羊抗体(SantaCruz)处理。依照制造商的指示(PerkinElmer生命科学)，进行对于辣根过氧化酶反应的ECL侦测。藉由UVPBioSpectrum500显像系统测定蛋白质讯号。以GEL-PRO软件决定蛋白表现程度。

RNA分离及RT-PCR

于指定时间点，藉由使用TRIzol试剂(Invitrogene)而从细胞分离出总体RNA。使用ImProm-II反转录酶(Promega)合成cDNA。以RT-PCR评估UNG、TMPK及GAPDH的mRNA含量。使用GAPDH基因做为内在对照组基因。引子是基于如表4所列示的人类UNG、hTMPK及GAPDH的核苷酸序列设计。PCR混合物含有1μl的cDNA样本(50ng)、1μM前向与反向引子、及12.5μl的GoTaqGreenMasterMix,2x(Promega)，总体积为25μl。PCR的进行模式：于95℃下5分钟，及25次包含95℃下30秒、55℃下30秒与72℃下30秒的扩增循环，接着于72℃下5分钟及于4℃下10分钟。将产物于2%琼脂糖凝胶上分析，并经由溴化乙锭染色呈像。

表4.shRNA及siRNA标靶序列

	标靶序列
			LacZ shRNA	CTACACAAATCAGCGATTT	SEQ ID NO:1
TMPK shRNA	ACACGACTTTGAACTGGAA	SEQ ID NO:2
			TS shRNA	GGATATTGTCAGTCTTTAGG	SEQ ID NO:3
UNG shRNA	GTCTACAGACATAGAGGATTT	SEQ ID NO:4
			dUTPase shRNA	GCGCTCCCTTCTGGGTGTTAT	SEQ ID NO:5
R2siRNA	ACCGGAAAAGAAAATGCT	SEQ ID NO:6

实时PCR与RT-PCR引子

表现质体的构筑及定点突变

将hTMPKcDNA插入pEGFP-N1(Clontect)的HindIII切位而构筑得pEGFP-hTMPK。使用QuickChangeXL定点突变套组(Stratagene)来产生pEGFP-hTMPK(D15R)突变株。mCherry-R2的表现载体是藉由将R2的cDNA插入mCherry质体的BglII切位中而产生。将呈核形式的dUTPasecDNA以符合读框的方式，插入pEGFP-C1(Clontech)的EcoRI-BamHI切位而产生pEGFP-dUTPase(WT)。pEGFP-dUTPase的催化致死(KD)突变型是藉由导入D102N突变(Harris等人,1999)而产生。将涵盖的R1次单位的C-端701-792胺基酸的cDNA，插入质体pCMV2-YFP-Nuc的BamHI切位，而构筑得pCMV2-YFP-Nuc-R1C。将mCherry或mChery-R2的cDNA插入pLKOAS3w质体的NheI切位，而产生mChery与mCherryR2的慢病毒表现载体。

同源重组分析

将带有整合入的同源重组报告子DR-GFP(Pierce等人,1999)的U2OSDR-GFP细胞以TMPKsiRNA转感染，随后进行I-SceI表现载体(pCBA-I-SceI)表现达48小时。以流动式细胞计数分析测量GFP+频率来检测重组效率。

免疫荧光染色分析

对于γH2AX、Rad51及XRCC1染色，是将细胞以4%三聚甲醛于室温下固定30分钟，并与TBS(50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl)加0.3%TritonX-100反应5分钟。将盖玻片以MAXblock^TM(ActiveMotif)于37℃下进行封阻1小时，随后以下列一次抗体：抗-γH2AX单株抗体(1:1000)、抗-Rad51多株抗体(1:500)或抗-XRCC1单株抗体(1:500)，于4℃下染色过夜。经充分清洗后，将细胞以二次抗体及Hoechst33342于室温下染色1小时。于包埋后，将细胞以装备有AxioCam数字相机与AxioVisionRel.4.8成像软件的CarlZeiss荧光显微镜进行分析及照相。

定量型染色丝免疫沉淀分析

将HEK293T细胞(1x10⁷)以pEGFP-I-PpoI表现载体转感染。经转感染18小时后，于室温下将细胞与终浓度为1%的甲醛进行交联10分钟，并如先前技艺所述进行ChIP(Berkovich等人,2007)。将沉淀的DNA再悬浮于50μlTE缓冲液中，并藉由以ABIStepOne系统，使用FastSYBRGreenPCRMasterMix(应用生物系统)的定量型实时PCR进行分析。于染色体I中接近I-PpoI部位及GAPDH的引子序列，经列示于表4中。

DNA损坏部位的激光显微照射及蛋白质定位

将细胞以适当密度接种于玻璃底的培养盘上。细胞以2μg/mlHochest33342染色10分钟。使用FluoView1000共聚焦显微镜(Olympus)及405nm雷射二极管(快速模式，SIM扫描仪，250msec)完成激光显微照射。对于γH2AX、内源性TMPK与R2共染色，是将细胞以含有0.1%ofTritonX-100的CSK缓冲液(100mMNaCl,300mM蔗糖,10mMPIPESpH7.0,3mMMgCl₂)清洗5分钟，然后以2%三聚甲醛于室温下固定15分钟。

TMPK抑制剂筛检

修改结合荧光素酶的TMPK分析(Hu与Chang,2010)，并用于从ChemDiv集库(SanDeigo,USA)选出的21,120个结构上不同的化合物进行筛检。将这些化合物溶解于DMSO中，并各别取10μM转移到含有0.25μg最终体积为4μl的纯化的hTMPK蛋白的1536-孔平盘。使用终浓度为10μM的5,5-二硫-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)做为TMPK抑制作用的阳性对照组(黄等人,1994)。经预先培养30分钟后，藉由将含有100mMTris-HCl,pH7.5、100mMKCl、10mMMgCl₂、5μMATP与20μMdTMP的TMPK反应缓冲液加至各孔，而开始进行TMPK反应10分钟，随后加入4μl含有50mM甘胺酸与0.5mMEDTA,pH7.0、0.1μg荧光素酶及25μM荧光素与0.1%BSA的荧光素酶分析缓冲液。由ViewLux侦测器(PerkinElmer)取得荧光值，并藉由与所述的阳性对照组比较，而判读出TMPK抑制活性。

分子对接

从PDB1E2D取得TMPK的原始结构并进行能量最小化。建构YMU1并使用Gaussian03包装组订出电荷。使用AutoDock程序鉴定结合位置，并研究YMU1与TMPK的相互作用。在此，藉由NAMD程序与CHARMM27力场进行MD模拟。最后，接着将该系统进行MD仿真以分析结合亲和力。评估TMPK与YMU1之间的非结合作用，以搜寻出最适化的位置。

活体内化学疗法

使用6–8周龄的雌性BALB/cAnN.Cg-Foxnl^nu/CrlNurl小鼠(实验室动物中心，中国台湾)为肿瘤异种移植模式。将HCT-116p53-/-细胞(1×10⁶)经皮下植入每只小鼠的的右腹胁部。待肿瘤直径达约0.5～1mm时开始进行治疗。将小鼠(n=32)随机分成四组：载剂，15%TEG；亚德里亚霉素(1.25mg/kg一周两次)；YMU1(15mg/kg一周三次)；YMU1(15mg/kg一周三次)结合亚德里亚霉素(1.25mg/kg一周两次)。小鼠以所指定的治疗，经由腹膜内进行投药4周，之后再使小鼠生长于无药剂的条件下2星期。于最初药物治疗之后，每天以电子测径规测量肿瘤大小。使用下列方程式估算肿瘤体积：肿瘤体积=长度(mm)×宽度²(mm²)/2。

细胞毒性、细胞凋亡分析及细胞周期分析

将植入孔平盘的细胞(10³细胞/孔)处理，并藉由MTS分析(Promega)测量细胞存活率(Cory等人,1991)。使用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯(FITC)细胞凋亡套组(Calbiochem)来侦测细胞凋亡。将细胞以碘化丙啶(PI)染色，用于以CellQuest软件进行荧光活化细胞选别(FACS)分析，而完成细胞周期分析。

免疫组织化学分析

单株K_i67抗体(B56)从BDPharMingen购得。将经石蜡包埋的肿瘤切片与一次抗体反应，以LSABTM套组(DakoCytomation)根据制造商的指示侦测，并使用苏木素进行对比染色。

群落形成分析

将细胞以每盘5,000个细胞的密度植入100mm-培养皿。于天后，将细胞群落固定并以结晶紫染色及计算群落数。

统计分析

进行双尾Student’st-测试来定量同源重组效率，每颗细胞具有γH2AXfoci>10、Rad51foci>20或XRCC1foci>5的细胞百分比值(%)，qChIP分析，肿瘤大小与肿瘤重量；*指示p<0.05，而**指示p<0.01。数据以平均值±s.d.表示。

除非于本文中指示，或由内文另行清楚地指示，上述组件以其所有可能的变化的任何组合方式皆包含于本发明。

术语“一”与“该”及类似的指示词，用于描述本发明的内文中是包括单数与复数，除非于本文中有指定，或由内文另行清楚地指示。

于本文中所使用的任何及所有实例，或例举性语言(像是“例如”)仅为更佳说明本发明，而无意设限本发明的范围，除非有另行指定。本说明书的用词不应受限为指定任一组件是实施本发明所必要的，除非有很清楚地指定。

除非于本文中有指定，或由内文另行清楚地指示，在叙述本发明的任何方面或具体实施例时，使用诸如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”等术语来引述某(些)组件，是欲支持本发明“由...组成”、“本质上由...组成”或“实质上包含”该(等)特别组件的类似方面或具体实施例，例如，一组成物于本文中所述为包含某特定组件，应了解其亦描述一由该组件组成的组成物，除非另有指定或由内文清楚地指示。

本发明包括于本文所示的各方面或权利要求中列举的标的物的所有改变与同等物，至现行法律所能允许的最大程度。

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Claims (27)

1.一种用于抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)的组成物，其包含一治疗上有效量的式(I)：

其中该式(I)选自至少下列一者：

或其医药上可接受的盐类。

2.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物能够抑制TMPK活性。

3.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物能够抑制细胞中的dTTP含量。

4.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物能够抑制肿瘤生长、DNA错配修复、核苷酸切割修复、双股断裂修复、DNA解螺旋酶功能、讯号传递或细胞周期调控。

5.如权利要求4所述的组成物，其中该双股断裂修复与放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法关连。

6.如权利要求5所述的组成物，其中该化学疗法包含以亚德里亚霉素进行的治疗。

7.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物选择性地将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞。

8.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物能够使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法敏感。

9.如权利要求8所述的组成物，其中该化学疗法包含以亚德里亚霉素进行的治疗。

10.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物不会导致基因毒性副作用。

11.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物呈现一IC₅₀值为10μM或以下。

12.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物呈现一IC₅₀值为5μM或以下。

13.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物呈现一IC₅₀值为1μM或以下。

14.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物呈现一IC₅₀值为0.5μM或以下。

15.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物呈现一IC₅₀值为0.25μM或以下。

16.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物呈现一IC₅₀值为0.1μM或以下。

17.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物每日投药一次，连续投药3天。

18.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物每日投药一至二次。

19.如权利要求1所述的组成物，其中该组成物以5mg/kg至30mg/kg的剂量投药。

20.一种医药组成物，其包含如权利要求1所述的组成物与医药上可接受的载体。

21.一种制造如权利要求1所述的组成物的方法，其包含步骤：

(a)将苯并噻唑酮于Et₃N与Cs₂CO₃存在下，以适当的卤化物处理，而得化合物化合物或

(b)将所述化合物12以三氟乙酸(TFA)处理，而分别得化合物或

(c)将所述化合物10于DIEA存在下，以氯甲酸苯甲酯处理而得化合物或

(d)将所述化合物10于DMAP存在下，以4-硝基苯基氯甲酸酯处理，而得化合物或

(e)将所述化合物10于DIEA存在下，以溴化丙烯基处理，而得化合物或

(f)将苯并噻唑酮于DIEA存在下，以1,1'-(六氢吡嗪-1,4-二基)-双(2-碘乙酮)处理而得化合物

22.一种如权利要求1所述的组成物在制备用于使癌细胞对放射疗法、化学疗法或免疫调制疗法增敏的医药组成物中的用途。

23.如权利要求22所述的用途，其中该组成物选择性地将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞。

24.如权利要求22所述的用途，其中该组成物不会导致基因毒性副作用。

25.一种如权利要求1所述的组成物在制备用于防止癌细胞进行双股断裂修复的医药组成物中的用途。

26.一种如权利要求1所述的组成物在制备用于选择性地将毒性标靶至带有DNA损伤的癌细胞的医药组成物中的用途。

27.如权利要求22-26中任一项所述的用途，其中该癌细胞选自乳癌细胞、大肠癌细胞、胰脏癌细胞、食道癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、直肠癌细胞、肾脏癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌细胞及子宫内膜癌细胞。