CN103409809A - 一种小分子药物筛选芯片、其构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子药物筛选芯片、其构建方法及应用，该小分子药物筛选芯片包括基底层，对所述基底层进行表面改性生成的表面修饰层，以及非选择性吸附于所述表面修饰层上的小分子。其构建方法包括对芯片的基底层进行表面改性生成表面修饰层以使小分子非选择性吸附于所述表面修饰层上的步骤。该方法可以实现大部分小分子非选择性的有效固定，并尽量不破坏小分子的固有结构，且能够实现小分子固定量较大、活性较高等特性。该小分子药物筛选芯片可用于检测小分子与靶标蛋白的相互作用中。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种小分子药物筛选芯片、其构建方法及应用。
背景技术
生物芯片是最近二十年由DNA微阵列发展而来的新方法、新技术，具有高通量、低成本和平行实验等特点，为DNA测序、生化检测、环境监控以及药物筛选等多方面提供了有效的研究手段。随着这项技术的发展，其检测手段不仅可以通过荧光或放射性等物质标记进行筛选，而且已经和石英晶体微天平、椭偏成像和表面等离子共振成像等无标签表征手段相结合，为生物分子之间的相互作用提供了更多丰富的动力学信息。小分子药物筛选芯片作为生物芯片大家族的一名成员，最近在药物筛选方面有了很大的发展。这种技术将小分子药物通过固定在基底表面上，为天然化合产物和人工设计合成的小分子提供高通量的靶标分子筛选平台。
小分子药物筛选芯片目前可以按照小分子的固定方式分为非共价固定和共价固定。非共价固定是在小分子的非活性的侧链上修饰一个标签分子，该标签分子可以通过基底表面识别该标签的物质进行选择性的非共价结合，从而构建小分子芯片。这种方法不仅改变了小分子的结构，而且大大增加了小分子与标签合成的工作量。共价固定是通过小分子的氨基、羧基、巯基等活性基团，与基底表面的活化羧基、活化氨基、马来酰亚胺基团等形成共价连接完成共价固定。这种方法局限于很多氨基、羧基、巯基正是小分子的活性中心，实验容易出现假阴性的结果，而且由于小分子的多样性，一张芯片很难满足多种小分子的筛选。日本理化学研究所的长田裕之课题组报道了光交联小分子阵列的方法，它使用卡宾基团在紫外线刺激下，可以和小分子任意一个C-H或N-H基团发生反应，从而非选择性地普适性地完成小分子的固定。这种方法虽然解决了普适性小分子的固定问题，但是破坏了小分子固有的结构，且一些紫外耐受能力差的小分子容易丧失活性。
因此，亟需一种构建小分子药物筛选芯片的新方法，以实现大部分小分子非选择性地有效固定，并尽量不破坏小分子的固有结构，且能够实现小分子固定量较大、活性较高等特性。
发明内容
本发明人经过大量实验和创造性劳动，构建了一种小分子药物筛选芯片，该小分子药物筛选芯片可以实现大部分小分子非选择性地有效固定，且具备不破坏小分子的固有结构、小分子固定量大、小分子活性高等优异特性。
本发明提供以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种小分子药物筛选芯片，包括基底层，对所述基底层进行表面改性生成的表面修饰层，以及非选择性吸附于所述表面修饰层上的小分子。
优选地，所述表面改性的方式包括非选择性吸附、共价连接、引发聚合和自组装等。
进一步优选，所述自组装包括玻璃表面的硅烷硫醇自组装、硅表面的硅烷硫醇自组装和金属表面的硫醇自组装等，所述引发聚合包括金属表面的引发聚合等。
优选地，所述表面修饰层具有表面结构和/或末端基团，以实现所述小分子的非选择性吸附。
进一步优选，所述表面结构包括二维结构和三维结构，所述末端基团包括羟基、氨基、羧基、马来酰亚胺基、环氧基和羰基；所述羟基末端基团优选为聚乙二醇羟基末端；所述氨基末端基团优选为聚乙二醇氨基末端。
在本发明一个实施方案中，提供一种在金基底构建表面引发聚合三维表面结构的非选择性吸附小分子药物筛选芯片。
优选地，所述基底层的材料为玻璃、硅、二氧化硅、石英、金属和聚合物等中任意一种或至少两种组成的复合材料。
在本发明一个实施方案中，提供一种以二氧化硅为基底层材料的小分子药物筛选芯片，其表面为硅烷氨基表面，作为与小分子非选择性吸附的场所。
在第二方面，本发明提供一种在第一方面所述的小分子药物筛选芯片的构建方法，所述方法包括对芯片的基底层进行表面改性生成表面修饰层以使小分子非选择性吸附于所述表面修饰层上的步骤。
优选地，所述方法还包括小分子点样、真空干燥、低温保存、孵育及迅速干燥的步骤。
优选地，所述低温保存为低于室温的环境保存；在本发明一个实施方案中，在-20℃的冰箱中保存过夜。所述孵育为小分子芯片表面由冷即热过程中凝集一定的水层于表面。迅速干燥为小分子芯片表面的水层迅速干燥，通常可采用鼓风干燥箱、白炽灯和紫外光照射等方式，但不限于此。
在第三方面，本发明提供一种在第一方面所述的小分子药物筛选芯片在检测小分子与靶标蛋白的相互作用中的应用。
优选地，所述应用具体是指：所述小分子药物筛选芯片结合荧光标记扫描、表面等离子共振、放射性元素标记扫描、酶联免疫标记、石英晶体微天平或椭偏成像技术在检测小分子与靶标蛋白的相互作用中的应用。
本发明的有益效果为：本发明通过芯片上的表面修饰层对小分子药物的非选择性吸附实现大部分小分子非选择性的有效固定，且具备不破坏小分子的固有结构。实验证明：本发明小分子药物筛选芯片具有小分子固定量大、小分子活性高等优异特性。
附图说明
图1为本发明实施例1所用氨基玻璃芯片表面化学结构示意图。
图2为本发明实施例1的基于荧光标记扫描的小分子在不同清洗条件下的非选择性吸附量变化荧光图。
图3为本发明实施例1的基于荧光标记扫描的小分子（1mM罗丹明B，溶剂：二甲基亚砜DMSO）在不同清洗条件下的非选择性吸附量变化曲线图。
图4为本发明实施例1的基于荧光标记扫描的小分子（1mM罗丹明B，溶剂：水）在不同清洗条件下的非选择性吸附量变化曲线图。
图5为本发明实施例1的基于荧光标记扫描的小分子（1mM Cy3，0.1mMCy5，溶剂：水）在不同清洗条件下的非选择性吸附量变化曲线图。
图6为本发明实施例2的FKBP12质粒图谱。
图7为本发明实施例2的基于荧光标记扫描的非选择性吸附小分子阵列的点样顺序和检测结果荧光图，其中A、B、C、D、E和F分别为生物素（Biotin）、FK506、HIS多肽（HIS peptide）、FLAG多肽（FLAG peptide）、环孢素A（Cyclosporine A）和地高辛（Digoxin）的检测结果。
图8为本发明实施例3的金基底构建表面引发聚合三维表面结构示意图。
图9为本发明实施例3的基于表面等离子共振成像的非选择性吸附小分子阵列检测生物素（Biotin）的结果曲线图。
图10为本发明实施例3的基于表面等离子共振成像的非选择性吸附小分子阵列检测FK506和雷帕霉素（Rapamycin）的结果曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：基于荧光标记扫描的小分子在不同清洗条件下的非选择性吸附量变化
本实施例提供通过非选择性吸附方法构建的小分子药物筛选芯片的小分子吸附量随清洗条件的变化。将两种常用的染料小分子，即罗丹明B（RhodamineB）和Cy3-Cy5点样到如图1所示的氨基玻璃芯片表面。具体做法是：将氨基玻璃芯片在水溶液下超声清洗10分钟，进行点样，具体点样信息如下：罗丹明B（1mM溶剂：DMSO）、罗丹明B（1mM溶剂：水）和cy3-cy5（Cy3:1mM,Cy5:0.1mM溶剂：水）使用TOYOBO芯片打印仪200μm直径的针头打印。打印后，在真空干燥器皿中静置20分钟，密封并于-20℃冰箱中保存过夜；次日，取出开封至室温后，在50℃的鼓风干燥箱中充分干燥。然后进行下述清洗实验：
1）室温条件下，Milli Q（水）溶液中超声清洗5分钟，离心干燥，在Genepix635nm和532nm波长下检测，此过程重复并记录5次；
2）室温条件下，乙醇溶液中超声清洗5分钟，离心干燥，在Genepix635nm和532nm波长下检测，此过程重复并记录5次；
3）室温条件下，二甲基亚砜溶液中超声清洗5分钟，离心干燥，在Genepix635nm和532nm波长下检测，此过程重复并记录5次；
4）室温条件下，二甲基亚砜溶液中震荡过夜（18小时），离心干燥，在Genepix635nm和532nm波长下检测。
实验结果：罗丹明B和Cy3-Cy5小分子通过非选择性吸附在芯片表面的吸附量变化如图2至图5所示。结果显示：本实施例中罗丹明B和Cy3-Cy5在氨基玻璃芯片表面的吸附量较大，并且吸附力强；虽然经过Milli Q溶液、乙醇溶液和二甲基亚砜溶液分别5次（每次5分钟）清洗，并且经过二甲基亚砜溶液中震荡过夜处理，仍有较多的小分子吸附在芯片表面上，并且渐趋稳定状态，尤其是图3所示的罗丹明B（1mM溶剂：DMSO）点样的情况下，小分子的吸附量更大、稳定程度更高。
实施例2：基于荧光标记扫描方法鉴定通过非选择性吸附固定的小分子
本实施例提供使用荧光标记扫描方法鉴定多种通过非选择性吸附固定的小分子的活性。将七种不同的小分子点样到氨基玻璃芯片（同实施例1）表面。具体做法是：将氨基玻璃芯片在水溶液下超声清洗10分钟，进行点样，具体点样信息如下：罗丹明B（1mM）、生物素（Biotin，5mM）、FK506（5mM）、HIS多肽（HIS peptide，1mM）、FLAG多肽（FLAG peptide，5mM）、环孢素A（Cycrosporine A，5mM）和地高辛（Digoxin，5mM），使用TOYOBO芯片打印仪200μm直径的针头打印。打印后，在真空干燥器皿中静置30分钟，密封并于-20℃冰箱中保存过夜；次日，取出开封至室温后，在白炽灯下充分干燥。通过1mg/mL牛奶（溶剂为TBST，含0.05%Tween20）封闭芯片1小时后，使用TBST清洗表面3次，每次5分钟。芯片标记为A（检测生物素），B（检测FK506），C（检测HIS多肽），D（检测FLAG多肽），E（检测环孢素A）和F（检测地高辛）六个芯片。
分别对A～F六个芯片进行如下所示的反应流程：
A：在芯片表面加入10μg/mL的Cy5标记的链霉亲和素50μL（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出后使用TBST清洗3次，每次5分钟。然后，使用GenePix扫描635nm波长（强度800）和532nm波长（强度500）。
B：在芯片表面加入20倍稀释的通过Cellfree Science公司麦胚表达体系表达的FKBP12（其中FKBP12质粒的结构如图6所示）细胞裂解混合液50μL（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。在芯片表面加入10μg/mL的Mouse Anti-his抗体（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。在芯片表面加入10μg/mL的633nm荧光标记的Goat Anti Mouse抗体（GE公司购买，溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。然后，使用GenePix扫描635nm波长（强度800）和532nm波长（强度500）。
C：在芯片表面加入10μg/mL的Mouse Anti-his抗体（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。在芯片表面加入10μg/mL的633nm荧光标记的Goat Anti Mouse抗体（GE公司购买，溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。然后，使用GenePix扫描635nm波长（强度800）和532nm波长（强度500）。
D：在芯片表面加入10μg/mL的Rabbit Anti-FLAG抗体（Sigma公司购买，溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。在芯片表面加入10μg/mL的633nm荧光标记的Goat Anti Rabbit抗体（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。然后，使用GenePix扫描635nm波长（强度800）和532nm波长（强度500）。
E：在芯片表面加入54μg/mL的Mouse Anti-Cycrosporine A抗体（Hytech公司购买，溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。在芯片表面加入10μg/mL的633nm荧光标记的Goat AntiMouse抗体（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。然后，使用GenePix扫描635nm波长（强度800）和532nm波长（强度500）。
F：在芯片表面加入54μg/mL的Rabbit Anti-Digoxin抗体（Sigma公司购买，溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。在芯片表面加入10μg/mL的633nm荧光标记的Goat Anti Rabbit抗体（溶剂为牛奶封闭剂），于30℃的恒温箱中反应1小时，取出使用TBST清洗3次，每次5分钟。然后，使用GenePix扫描635nm波长（强度800）和532nm波长（强度500）。
结果如图7所示，六个芯片上相应待检测小分子的结合位点呈现较强的荧光信号，说明小分子固定量较大、活性较高。此外，六个芯片上相应待检测小分子仅与相应抗体结合，说明其特异性好，能满足同一芯片检测多种小分子的需求，即该实施例证明本发明可以实现大部分小分子非选择性地有效固定。
实施例3：基于表面等离子共振成像的非选择性吸附小分子阵列
本实施例提供在通过金基底构建表面引发聚合三维表面构建的非选择性吸附小分子药物筛选芯片的方法，该表面具有很强的抗蛋白质非特异性吸附的特点。其检测对象是小分子与蛋白质（非抗体）之间的相互作用，包括生物素与链霉亲和素、FK506与FKBP12蛋白、雷帕霉素（Rapamycin）与FKBP12蛋白之间的相互作用。将结构类似的溴引发剂硫醇和PEG-3-羟基硫醇在使用SPR实验的金片表面构建分子自组装。溴引发剂硫醇和PEG-3-羟基硫醇比例为1:99（总量为1mM），常温下反应16小时。清洗后引发表面聚合反应，构建以聚乙二醇羟基作为支链的三维表面化学（其结构如图8所示）后，使用水溶液进行超声清洗。点样方法、真空干燥、低温保存以及再干燥方法与实施例2相同。最后安装至Plexera公司的SPRi检测装置上进行如下检测：
（1）鉴定生物素：
1μg/mL链霉亲和素稀释于PBST（含0.05%Tween20）中，流速为2μL/s。反应包括180s基线、200s结合过程、400s解离过程、200s的磷酸（1:200v/v MilliQWater）重生过程。实验结果如图9所示，生物素与链霉亲和素之间的相互作用有很强的信号；而链霉亲和素与FK506、HIS多肽、FLAG多肽、雷帕霉素、地高辛没有相互作用显示出的信号（在图9中表现为5条曲线处于标准响应为0的水平）。
（2）鉴定FK506和雷帕霉素：
20倍稀释表达FKBP12的无细胞表达体系混合液（溶剂为PBST（含0.05%Tween20）），流速为2μL/s。反应包括180s基线、200s结合过程、400s解离过程、200s的磷酸（1:200v/v MilliQ水）重生过程。实验结果如图10所示，FK506与FKBP12蛋白、雷帕霉素（Rapamycin）与FKBP12蛋白之间的相互作用有很强的信号；而生物素、HIS多肽、FLAG多肽和地高辛没有响应信号（在图10中表现为4条曲线处于标准响应为0的水平）。
本领域技术人员将会理解：尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种小分子药物筛选芯片，其特征在于，包括基底层，对所述基底层进行表面改性生成的表面修饰层，以及非选择性吸附于所述表面修饰层上的小分子。
2.根据权利要求1所述的小分子药物筛选芯片，其特征在于，所述表面改性的方式包括非选择性吸附、共价连接、引发聚合和自组装。
3.根据权利要求2所述的小分子药物筛选芯片，其特征在于，所述自组装包括玻璃表面的硅烷硫醇自组装、硅表面的硅烷硫醇自组装和金属表面的硫醇自组装，所述引发聚合包括金属表面的引发聚合。
4.根据权利要求1至3任一项所述的小分子药物筛选芯片，其特征在于，所述表面修饰层具有表面结构和/或末端基团，以实现所述小分子的非选择性吸附。
5.根据权利要求4所述的小分子药物筛选芯片，其特征在于，所述表面结构包括二维结构和三维结构，所述末端基团包括羟基、氨基、羧基、马来酰亚胺基、环氧基和羰基；所述羟基末端基团优选为聚乙二醇羟基末端；所述氨基末端基团优选为聚乙二醇氨基末端。
6.根据权利要求1至3任一项所述的小分子药物筛选芯片，其特征在于，所述基底层的材料为玻璃、硅、二氧化硅、石英、金属和聚合物中任意一种或至少两种组成的复合材料。
7.一种权利要求1至6任一项所述的小分子药物筛选芯片的构建方法，其特征在于，所述方法包括对芯片的基底层进行表面改性生成表面修饰层以使小分子非选择性吸附于所述表面修饰层上的步骤。
8.根据权利要求7所述的小分子药物筛选芯片的构建方法，其特征在于，所述方法还包括小分子点样、真空干燥、低温保存、孵育及迅速干燥的步骤。
9.一种权利要求1至6任一项所述的小分子药物筛选芯片在检测小分子与靶标蛋白的相互作用中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述小分子药物筛选芯片结合荧光标记扫描、表面等离子共振、放射性元素标记扫描、酶联免疫标记、石英晶体微天平或椭偏成像技术在检测小分子与靶标蛋白的相互作用中的应用。
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