CN103409451A

CN103409451A - 一种向树突状细胞dc靶向加载肿瘤抗原肽的方法

Info

Publication number: CN103409451A
Application number: CN2013102675632A
Authority: CN
Inventors: 胡伟明; 夏冰
Original assignee: YANGZHOU VAX BIOSCIENCES Ltd
Current assignee: YANGZHOU VAX BIOSCIENCES Ltd
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2013-11-27

Abstract

一种向树突状细胞DC靶向加载肿瘤抗原肽的方法，属于医疗技术领域，本发明采用具有抗体活性的融合蛋白与DC细胞表面受体分子DEC-205紧密结合，向DC细胞靶向加载肿瘤抗原肽MUC1,能极大提高DC细胞递呈肿瘤抗原肽MUC1的能力。

Description

一种向树突状细胞DC靶向加载肿瘤抗原肽的方法

技术领域

本发明属于医疗技术领域，特别是肿瘤生物技术中用于治疗肿瘤抗原靶向加载的方法。

背景技术

肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类癌症治疗方法，系利用机体激发的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。与传统的治疗方法不同，肿瘤生物治疗是以现代分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等前沿科学为基础，利用机体对肿瘤的免疫应答，通过生物手段改变肿瘤和机体之间的相互作用，调动机体对肿瘤的防御机制，达到控制肿瘤生长，延长患者生存期，提高患者生活质量的目的，其已成为肿瘤综合治疗中的重要治疗方法。

免疫系统是人体的防御体系，一方面清除细菌、病毒等外来异物，另一方面清除体内衰老的无功能细胞以及发生突变的细胞。突变细胞进一步变为肿瘤细胞，人体免疫系统可及时识别这些肿瘤细胞，并予以清除。机体免疫系统实现这种清除功能需有两个重要的环节，一是识别(肿瘤抗原识别)，二是杀伤（清除肿瘤细胞）。识别环节主要依赖于具有抗原递呈功能的树突状细胞（DC）等细胞，杀伤环节依赖多种具有清除功能的免疫淋巴细胞。DC细胞获取肿瘤抗原是免疫系统特异性识别肿瘤细胞的关键。

经过近二十年的研究和完善，DC细胞的体外分化和激活方法已趋于成熟。但DC的肿瘤抗原加载技术还远未达成共识。因此，不同DC疫苗疗效的区别关键在于肿瘤抗原的选择及抗原加载方式。国内常用的抗原加载方法是将肿瘤匀浆与DC混合即可。这样操作的危害性在于，肿瘤抗原属于自体抗原，简单而低效率加载的自体抗原不仅不能诱导免疫反应，反而会导致免疫滞胀，结果适得其反。

发明内容

本发明的目的是提供一种能克服以上缺陷的对树突状细胞靶向加载肿瘤抗原肽的方法。

本发明利用抗DEC-205分子的抗体基因与编码肿瘤抗原肽MUC1的基因体外重组和表达，获得与树突状细胞DC表面DEC-205受体分子高效结合的融合蛋白V，得到对树突状细胞靶向加载的肿瘤抗原肽MUC1。

具体步骤是：

1）将抗DEC-205的抗体基因与编码MUC1的基因在体外合成并重组，得到保藏号CGMCC为 NO：7686的表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV；

2）将表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV转入大肠杆菌，经过诱导，得到表达融合蛋白V前体；

3）将融合蛋白V前体经过变性和复性后，获得具有活性功能的融合蛋白V；

4）采用生物素标记的具有活性功能的融合蛋白V与树突状细胞DC结合，用荧光标记的亲和素来检测对树突状细胞靶向加载的肿瘤抗原肽MUC1。

本发明采用一种靶向加载的方法，向成熟DC细胞表面加载肿瘤抗原肽MUC1。具有抗原递呈功能的成熟DC细胞表面具有一种特征性的受体DEC-205，因此设计一种抗DEC-205的单链抗体基因，并与编码肿瘤抗原肽MUC1的基因在体外合成并重组，然后在大肠杆菌中表达获得融合蛋白前体；融合蛋白前体经过复性后，成为具有抗体活性的融合蛋白V。该蛋白分子在N端有抗DEC-205的单链抗体，同时在C端含有肿瘤抗原肽MUC1；利用生物素标记融合蛋白V后，再与成熟的DC细胞结合和流式细胞仪检测，经采用流式细胞仪检测融合蛋白V抗体活性，确认融合蛋白V可以将肿瘤抗原肽MUC1靶向加载到成熟DC细胞表面，可有效提高DC细胞递呈肿瘤抗原的能力。

采用对DC细胞靶向加载肿瘤抗原肽的方法，能特别高效地递呈肿瘤抗原，诱发机体针对肿瘤抗原非常高效的免疫反应，能调动、激活及扩增具有肿瘤靶向的杀伤细胞（CD8+T细胞），同时可产生长效性的记忆细胞，以达到长期的、可持续性的抗肿瘤，防复发的效果。

本发明的有益效果是：本发明方法采用具有抗体活性的融合蛋白与DC细胞表面受体分子DEC-205紧密结合，向DC细胞靶向加载肿瘤抗原肽MUC1, 能极大提高DC细胞递呈肿瘤抗原肽MUC1的能力。

以上步骤3）变性的目的或意义、复性的的目的或意义：本发明的融合蛋白V是采用原核生物大肠杆菌蛋白表达系统，所表达的蛋白缺乏正确的空间结构。变性过程是将影响蛋白空间结构的二硫键还原，然后在特定的条件下再将蛋白缓慢氧化，恢复二硫键和正确的蛋白空间结构，获得具有抗DEC-205活性的融合蛋白V。

在所述步骤1）中，将抗DEC-205的抗体分子与肿瘤抗原肽MUC1重组在同一融合蛋白中。可保持抗DEC-205的抗体活性。

在所述步骤2）中，将抗DEC-205分子的抗体基因与编码肿瘤抗原肽MUC1的基因体外重组成的核酸序列，克隆到蛋白表达质粒上，经过诱导在大肠杆菌中表达。

附图说明

图1为表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV的构建图。

图2为重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳鉴定图。

图3、4、5、6、7分别为空白对照组、阴性对照组1、阴性对照组2、测试样本和阳性对照组的融合蛋白V与DC细胞表面DEC-205受体分子结合的FACS分析图。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照相应的原料制造厂商所建议的条件。

一、融合蛋白V的制备和生物素标记：

1、重组基因表达载体构建：

将抗DEC-205的抗体分子与肿瘤抗原肽MUC1重组在同一融合蛋白中的具体措施：

根据功能示意和相应的核酸序列，采用商业化人工合成核酸的方法，合成具有抗DEC-205的抗体分子（antiDEC-ScFV）的744个碱基、MUC1多肽（MUC1）的72个碱基和表达纯化所需要的功能区（TEV、Myc、His6）的69个碱基。将合成的全基因片段（855个碱基）克隆到商业化质粒载体pET41a(+)上二个酶切位点Nde I 和 Xho I 之间。并且通过基因测序的方法，验证重组基因序列和质粒构建。

表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV的构建图如图1所示，其功能示意如下：

Figure DEST_PATH_58590DEST_PATH_IMAGE001

Figure DEST_PATH_975731DEST_PATH_IMAGE002

表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV的核酸序列:

atgcaggctg tggtgactca ggagagtgcc ctgaccacat cacctggcga gacagtgact 60

ctgacctgtc ggagctccac cggggcagtg acaatcagca actacgccaa ttgggtccag 120

gaaaaaccag accacctgtt cacagggctg attggcggga ctaacaatcg agcacccgga 180

gtgcctgcca ggtttagtgg gtcactgatc ggagacaagg ccgctctgac aattactggc 240

gcccagaccg aggatgaagc tatctacttc tgtgcactgt ggtataacaa tcagttcatt 300

tttgggagcg gaacaaaagt gactgtcctg ggcggcggag gaggaagcgg aggaggaggg 360

tccggaggcg ggggatctgg aggaggagga agtgaggtgc agctgcagca gtctggccct 420

gtgctggtca agccaggggc tagtgtgaaa atgtcatgca aggcaagcgg caacaccttc 480

acagacagct ttatgcactg gatgaaacag tcccatggaa agtctctgga gtggatcggc 540

atcattaacc cctacaatgg gggaacctcc tataatcaga agttcaaagg caaggccact 600

ctgaccgtgg ataaatctag ttcaaccgct tacatggagc tgaacagcct gacatccgaa 660

gactctgccg tgtactattg tgctcgcaat ggcgtccgat actattttga ttattggggc 720

caggggacta ccctgacagt gagcacagca cctccagctc atggtgtgac tagcgctcca 780

gatacccgcc cggcacccgg gtctacggcg cctccggaaa acctgtattt tcagggcgaa 840

cagaagctga ttagcgaaga ggatctgcac catcatcacc accat

表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV的蛋白序列:

MQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYNNQFIFGSGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGNTFTDSFMHWMKQSHGKSLEWIGIINPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARNGVRYYFDYWGQGTTLTVSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPENLYFQGEQKLISEEDLHHHHHH

本发明构建的表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV，于2013年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC NO： 7686 ，分类命名：大肠埃氏菌Escherichia coli，其长度为：5905碱基。

另，抗DEC-205的单链抗体基因是已公开的，采用人工合成核酸片段是生物工程领域中的常用商业手段，只要有核酸序列就可以订购核酸片段。

2、表达载体质粒pET41a-antiDEC-ScFV转化大肠杆菌进行蛋白表达：

将测序正确的表达载体质粒pET41a-antiDEC-ScFV用氯化钙转化法导入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，加入SOC培养基37℃震荡培养30分钟后，涂布于LB平板中（终浓度为50ug/ml 硫酸卡那霉素），培养过夜。次日，挑取LB平板上状态良好的菌落，接种于含硫酸卡那霉素的LB培养基中。37℃摇床培养7小时后，按3ml 菌液/L接种于4L自诱导培养基TB中，37℃摇床培养过夜。4000rpm，10分钟离心弃上清，菌体保存于-20℃冰箱备用。

使用12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白表达，如图2所示，确认表达的融合蛋白前体以包涵体形式得到表达。其中，T：诱导后全菌裂解液；S：诱导后全菌经超声破碎后离心上清；P：洗涤后的包涵体。

3、融合蛋白前体的变性、复性和纯化：

提取：将-20℃保存备用的45克菌体置于450ml CRB破菌缓冲液（由5% 甘油、50mM 三羟甲基氨基甲烷-盐酸、50mM 氯化钠、0.5mM乙二胺四乙酸二钠和1mM三(2-羧乙基)膦，pH值为 8.0）中，磁力搅拌均匀，高压均浆破碎菌体5次，以上操作在冰浴中进行；加入NSDB-201于已破碎的菌液中至终浓度125mM，室温搅拌15分钟，9500转，10℃离心15分钟，弃上清；将离心沉淀包涵体重悬于450ml IBWB缓冲液中，室温搅拌15分钟，9500转，10℃离心15分钟，弃上清，重复洗涤一次，最终获得2.3g包涵体，冻存于-80℃备用。

变性：将1g包涵体溶解于20ml GDB缓冲液中（由7M 盐酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0.2M 氯化钠、2.0mM 乙二胺四乙酸二钠和10mM TCEP组成），4℃柔和搅拌过夜。复性：将上述20ml 含融合蛋白的逐滴加入到5L复性液中（由0.5M精氨酸、100mM 三羟甲基氨基甲烷-盐酸、4mM乙二胺四乙酸二钠、240mM 氯化钠、1mM 氯化钾、9mM 还原型谷胱甘肽和1mM氧化型谷胱甘肽组成，pH值为9.0）至终浓度200ug/ml，4℃柔和搅拌过夜。

将超滤膜包依次用2L的0.1M 氢氧化钠，2L无热源的超纯水，2Ltris/Urea 缓冲液（由50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸和150mM 尿素组成，pH值为8.0）清洗，将5L复性液浓缩至300ml，继续超滤浓缩将缓冲液更换为Tris/Urea 缓冲液至终体积100ml，20000g，4℃离心15min除去沉淀，0.2um滤器过滤置于4℃保存以便于下一步纯化。

纯化：将上一步复性好的融合蛋白溶液样品上样于已平衡好的10ml Q-FF阴离子交换柱，使用2个柱体积的缓冲液A(50 mM Tris, pH 8.0)和5个柱体积的5% 缓冲液 B(50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0)冲洗至基线附近，5%-100% B 10倍柱体积的线性梯度洗脱，最后用5倍柱体积100% 缓冲液B洗脱。收集组分3-8后，用截留分子量为10kDa透析袋透析过夜，样品用0.2um滤器过滤后置于-80℃保存备用。经过蛋白浓度测定，融合蛋白V最终产量：12.46毫克。

4、纯化后的融合蛋白V用生物素（Biotin）标记：

取2.8毫克融合蛋白V用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）透析过夜；用1ml DMSO 溶解1mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHSB）浓度是1mg/ml；向含融合蛋白V溶液中加入NHSB溶液(融合蛋白V 与NHSB 的比例为 8:1(摩尔比)，室温静置2小时；再加入24微升1 mol/L NH₄Cl (每25 μg NHSB 加1 μl)与多余的NHSB反应，在室温下搅拌10分钟；在4℃，用PBS充分透析，以除去游离的生物素，获得生物素标记的融合蛋白V。

二、检测生物素标记的融合蛋白V与成熟的DC细胞结合效率：

1、外周血单个核细胞（PBMC）采集制备：

使用健康人的全血100毫升，用生理盐水按1︰1 （体积比）稀释，比重为1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Paque Plus与稀释血按1:2加入离心管中，离心1500rpm/30min，取界面层细胞，PBS洗涤2次，重悬于适量 GT-T551 无血清培养基中。

2、单核细胞分离、未成熟DC培养及成熟DC诱导：

A. 取 1.5×10⁸ 细胞至 T150 细胞培养瓶中，加入 GT-T551 无血清培养至 20 ml，置 37℃ ，5% CO2 培养箱中培养 2 小时；

B. 吸去细胞培养液，加入 20 ml 生理盐水洗涤 2 次；

C. 向细胞培养瓶中加入 25 ml 含终浓度 1000U/ml GM-CSF、1000U/ml IL-4 的无血清 DC 培养基，置 37℃ ，5% CO2 培养箱中培养 4 天。

D. 向细胞培养瓶中加入终浓度 1000U/ml 的 GM-CSF、50ng/ml 的 TNF-α、1nmol/ml 的 PGE2，置 37℃ ，5% CO2 培养箱中继续培养 2 天。

3、成熟DC细胞收获：

A. 将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，转至 50 ml 离心管中，1500rpm 离心 10分钟，去上清；

B. 加入 10 ml 生理盐水重悬洗涤，1500rpm 离心 5 分钟，弃上清；

C. 加入 1 ml PBS 重悬，转至 1.5 ml 离心管中，1500rpm 离心 5 分钟；

D. 弃上清，用 500 μl 含 1% BSA 的 PBS 重悬细胞，取少量细胞加台盼蓝计数，细胞密度 6.45×10⁶/ml，细胞活率 93%。

4、用流式细胞仪（FACS）分析重组蛋白V与成熟DC细胞表面受体的结合效率：

需鉴定的分子：重组蛋白V，先用生物素（Biotin）标记，浓度 0.403μg/μl；然后使用带荧光的第二抗体 PE Streptavidin（亲和素，浓度 0.2μg/μl）检测；阳性对照采用商品化抗体（Peprotech），带荧光PE标记（浓度 50ng/μl），与重组蛋白V一样针对成熟DC细胞上的同一受体。

将细胞悬液 50μl/管（3.22×10⁵细胞）分装到 5 个 1.5 ml 离心管中；一管为空白对照，剩余 4 管分别加入3微升生物素标记的重组蛋白V（阴性对照1），6微升PE-Streptavidin（阴性对照2），3微升生物素标记的重组蛋白V 和 6微升PE-Streptavidin（测试样本），10微升PE标记的商品化抗体（阳性对照）；流式细胞仪上样，进行 FACS 分析。

如图3、4、5、6、7所示，分别为空白对照组、阴性对照组1、阴性对照组2、测试样本和阳性对照组的融合蛋白V与DC细胞表面DEC-205受体分子结合的FACS分析图。

结论：测试样本与阳性对照的FACS图形显示有PE荧光标记的蛋白与成熟DC细胞结合（R3区域）。测试样本中有61.09% 成熟DC细胞与重组蛋白V结合，阳性对照中有75% 成熟DC细胞与商品化抗体结合。因此，重组蛋白V与成熟DC细胞表面受体结合效率是商品化抗体的 81.45%，本发明可以有效向成熟DC细胞靶向加载肿瘤表面抗原肽MUC1。