CN103409445A - 抗草甘膦基因mtp-smg2-epsps及其在培育抗草甘膦玉米中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工改造合成的抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS，具有SEQ ID NO2：25-1476所示的核苷酸序列，是根据玉米密码子偏好性进行设计、改造后用人工合成的方法获得的。本发明设计、改造后人工合成的5’-烯醇式丙酮酸莽草酸-3’-磷酸合成酶基因，经鉴定在玉米中能高效表达，获得的抗草甘膦玉米与非转基因对照相比具有明显的抗草甘膦除草剂的能力。

Description

抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS及其在培育抗草甘膦玉米中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体说明了一种抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS及其在培育抗草甘膦玉米中的应用。

背景技术

从1996年转基因抗草甘膦作物首次商业化至今，耐除草剂性状始终是转基因作物的主要性状。据国际农业应用服务组织(I S A A A)统计，在2011年，耐除草剂性状被运用在大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，种植面积为9390万公顷，占全球转基因作物种植面积的59％。同时，有25个国家和地区批准了进口耐除草剂大豆用于食品和饲料以及释放到环境，其次是耐除草剂玉米，获得了23个国家和地区的批准。

草甘膦(glyphosate)是孟山都公司1971年开发生产的一种非选择性的、有机磷类茎叶处理除草剂。草甘膦喷于植株茎叶后，易被植物吸收，并能迅速输导到整个植株及其根部，因此它不仅能杀死几乎所有的一年生和多年生、禾本科、莎草科、阔叶杂草、灌木及双子叶植物的地上部分，而且能铲除其地下根茎。几十年来，草甘膦所具有的除草效率高，杀草谱宽，对哺乳动物、鸟禽、鱼类的毒性低、土壤吸附能力强、自然环境残留少、广谱灭生性等其它除草剂不可比拟的优点使其成为世界上使用面积最大的除草剂品种。然而草甘膦作为一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用，这就限制了其使用范围和使用时间，如果能有抗草甘膦的农作物出现，不仅能免除田间锄草作业，减免农业劳动强度、节省农业生产费用，还能促进草甘膦工业的发展，更能加强水分保持，减少土壤碳的损失以及二氧化碳的排放，避免因大量使用农药造成的环境污染。

草甘膦的作用机理。在真菌、细菌、藻类、高等植物的莽草酸合成代谢途径中，磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸莽草酸在5’-烯醇式丙酮酸莽草酸-3’-磷酸合酶(EPSPS)的催化作用下生成5’-烯醇式丙酮酸-3’-磷酸莽草酸(EPSP)。在此过程中，S3P首先与EPSPS合酶结合，形成S3P-EPSPS复合物。草甘膦在喷于植株茎叶后，被植物吸收，草甘膦与S3P-EPSPS复合物结合，占据了第二个底物PEP的结合位点，从而竞争性抑制了EPSPS合酶的活性使EPSP合成受阻，并进一步导致分枝酸合成受到限制，结果致使体内莽草酸含量增加，色氨酸、酩氨酸、苯丙氨酸等植物体所必需的芳香族氨基酸的生物合成减弱或停止，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使植物失绿死亡。

抗草甘膦转基因育种主要是通过四条途径。一是过量表达EPSPS基因，提高mRNA表达量，增强EPSPS合酶活性，从而提高对草甘膦除草剂的抗性，达到作物吸收草甘膦后仍然能进行正常代谢的目的；二是使EPSPS基因发生突变，使得EPSPS合酶对底物PEP的亲和力增强，对草甘膦的敏感性降低，进而产生草甘膦抗性；第三种途径是转入草甘膦代谢酶基因，降低分生组织中草甘膦的浓度，在草甘膦发生作用前将其降解或解毒，减小作物对草甘膦的吸收、转运作用；第四种途径是将草甘膦限制在细胞的液泡等隔室内，以达到限制草甘膦吸收、转运的作用，从而降低草甘膦的新陈代谢，将草甘膦对植物的影响降至最低。

CP4-EPSPS基因是美国Mosanto公司从根癌农杆菌CP4中分离克隆的EPSP合成酶基因，因其编码产物对草甘膦的高抗性和对底物PEP的高亲和力而在耐除草剂转基因育种中得到了广泛应用，然而Monesanto公司拥有CP4-EPSPS基因的多项专利，限制了该基因的使用。

生物中普遍存在同义密码子的非均衡使用。经过长期进化，任一物种或基因都会形成特定的密码子的使用偏好，被优先使用的这些密码子就是该物种或基因的最优密码子，利用率低或不被经常利用的称为该物种的稀有密码子。如果外源基因含有大量宿主表达系统的稀有密码子，特别是这些稀有密码子成连续分布时，就会造成表达量降低或翻译提前终止，因此利用宿主的密码子偏好性对外源基因进行改造(将外源基因的稀有密码子替换为最优密码子)对提高外源基因表达水平有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在玉米中能高效表达的抗草甘膦基因，以提高转基因玉米的抗除草剂能力。

为解决上述技术问题而提供的一种人工改造合成的抗草甘膦基因，其是根据抗草甘膦基因2mG2-epsps的氨基酸组成，利用玉米密码子偏好性进行设计、改造后用人工合成的方法获得的。

一种人工改造合成的抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS，具有SEQ ID NO2：25-1476所示的核苷酸序列，是根据玉米密码子偏好性进行设计、改造后用人工合成的方法获得的。

设计方案如下：

1.设计、改造后用人工合成的方法获得的抗草甘膦基因，不改变原2mG2-epsps基因的氨基酸组成。

2.以玉米中高频使用的密码子部分置换原有的同义密码子。

3.去除了常用的限制性内切酶识别位点，以利于后续基因的改造应用。改造后的基因命名为SMG2-EPSPS，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.在上述人工改造合成的抗草甘膦基因核苷酸序列的5’端融合了一段来源于玉米的乙酰乳酸合成酶的编码叶绿体导肽的核苷酸序列。

5.在改造基因的5’和3’端分别引入多克隆限制性酶切位点，该序列命名为MTP-SMG2-EPSPS，具有SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列，其中1-24为限制性内切酶识别位点，25-1476为新设计的基因序列，1477-1501为限制性内切酶识别位点。多克隆位点序列有利于目的基因插入到表达载体中。

本发明的第二个目的在于提供一种含有上述抗草甘膦基因的植物表达载体。

构建方法：用Ncol和Pmacl限制性酶切位点将改造后的基因克隆到植物表达载体pCAMBIA3301中，获得植物表达载体Pcambia3301-MTP-EPSPS。

本发明的第三个目的在于提供含有上述核苷酸序列分子的具有草甘膦抗性的植物细胞，并利用这些植物细胞分化培育成转基因植株，使转基因植株(尤其是转基因玉米)获得极显著的抗除草剂能力。

本发明的第四个目的在于提供了上述核苷酸序列分子，在玉米转基因细胞培养中作筛选标记。

本发明设计、改造后人工合成的5’-烯醇式丙酮酸莽草酸-3’-磷酸合成酶基因，经鉴定在玉米中能高效表达，获得的抗草甘膦玉米与非转基因对照相比具有明显的抗草甘膦除草剂的能力。

附图说明

图1植物表达载体Pcambia3301-MTP-SMG2-EPSPS的构建；

图2采用农杆菌介导法获得的转MTP-SMG2-EPSPS基因玉米；A：玉米幼胚；B：胚性愈伤组织；C：愈伤组织的筛选；D：愈伤的分化；E：抗性玉米苗；F：转基因植株移栽到大田；

图3T₀代转化体中目的基因MTP-SMG2-EPSPS的PCR检测结果；M：DL2000Makerck：水ck-：阴性对照ck+：阳性对照1-4：T₀代转化植株；

图4未转化株系(左)与T₂转化株系(右)的草甘膦抗性测试；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例12mg2-epsps基因的改造及合成

本发明对原始基因进行了细致的分析，用玉米中高频使用的密码子(玉米waxy基因和基因组的密码子用法研究，刘汉梅，2008)部分置换原有的同义密码子，以期获得在玉米中能高效表达的抗草甘膦基因。利用生物软件DNAMAN对优化后的序列作限制性酶切分析，对含有的常见限制性酶切位点作同义修饰，消除常用酶切位点(本案例中消除的酶切位点包括SacIXmaI SmaI)。改造后的基因命名为SMG2-EPSPS，具有SEQ TDNO：1所示的核苷酸序列，与原始的2mG2-epsps基因同源性仅为72％。

表1改造前后密码子相对使用度

密码子相对使用度指某一特定密码子在编码对应的氨基酸的同义密码子间的相对概率。如果密码子的相对使用度为1，则该密码子的使用没有偏好。

实施例2玉米来源的叶绿体导肽基因及多克隆酶切位点的添加

根据NCBI上的序列(X63554.1)，直接合成玉米乙酰乳酸合成酶的叶绿体导肽的核苷酸序列连接于抗草甘膦基因SMG2-EPSPS的5’；在叶绿体导肽的5’和抗草甘膦基因SM62-EPSPS3’端分别引入两段不同的多克隆限制性内切酶酶切位点。在设计序列的5’端添加的序列为AAGCTTTCTAGACCCGGGCCATGG(SEQ ID NO：3)，其包含的酶切位点分别为HindIII，XbaI，XmaI，SmaI，NcoI。在设计序列的3’端添加的序列为CACGTGGTACCTCGAGCTCGAATTC(SEQ ID NO：4)，其包含的酶切位点分别为PmaCI，Acc65I，KpnI，XhoI， SciI，EcoICRI，SacI，EcoPI。新设计的序列命名为MTP-SMG2-EPSPS，具有SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列，其中1-24为限制性内切酶识别位点，25-1476为新设计的基因序列，1477-1501为限制性内切酶识别位点。多克隆位点序列有利于目的基因插入到表达载体中。将新设计的序列MTP-SMG2-EPSPS送上海英俊公司人工合成，并克隆到PMD19-T载体上，得T载体质粒PMDMTP-SMG2-EPSPS。

实施例3抗草甘膦融合基因植物表达载体构建

用Pmacl和Ncol双酶切T载体质粒PMDMTP-SMG2-EPSPS，用凝胶回收纯化试剂盒回收MTP-SMG2-EPSPS片段。同时用PmaCI和XcoI双酶切植物表达载体pCAMBIA3301，用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的大片段。两个片段进行连接反应，构建得到真核表达质粒Pcambia3301-MTP-SMG2-EPSPS。酶切鉴定结果表明载体构建正确。

实施例4采用农杆菌介导转化玉米愈伤组织

1.玉米胚性愈伤组织的获得

取人工授粉后10-12d(时间与季节及基因型密切相关)且生长旺盛的玉米果穗(果穗表面无病虫害，每包玉米籽粒应大于100粒)，用75％的酒精对果穗苞叶逐层消毒，用剪刀(已用酒精消毒)剪除果穗头部无子粒部分，对剪切处消毒。整个消毒过程应使果穗斜向下，避免酒精倒流入籽粒。待剩下两层苞叶时将果穗转到超净工作台通风口处，剥去剩余苞叶及花丝，用灭菌后的手术刀削去籽粒顶部2/3胚乳至幼胚隐约可见，从中挑出大小为0.8-1.2mm的幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基上诱导愈伤组织形成，每管接种15个幼胚，28℃暗培养。接种15d后，挑选色泽鲜亮、生长旺盛的胚性愈伤组织，转入继代培养基扩大繁殖。每隔20d继代1次，继代三次后，用于遗传转化。

2.农杆菌培养及侵染液制备

从-70℃冰箱取出含植物表达载体Pcambia3301-MTP-SMG2-EPSPS的农杆菌菌株EHA105，在含有50mg/L Kan和50mg/L Rif YEB固体培养基上划线，挑取单菌落活化培养，活化培养后的菌液扩繁至OD0.4-0.5时，转入50mL的无菌离心管中，5000r/min，4℃离心10min，收集菌体，去清液，加入含100mmol/L乙酰丁香酮的等体积侵染液，振荡摇匀，即可用于浸染愈伤组织。

3.浸染及共培养

将上述制备的侵染液倒入含有玉米胚性愈伤(大小为0.3-0.5cm)的培养瓶中，真空负压下(-0.04～-0.05MPa)侵染8-12min。去侵染液，转入共培养基上21℃暗培养3d。

4.洗菌及恢复培养

用无菌水清洗愈伤组织上附着的农杆菌(3-5次)至水变清为止，再用400mg/L的头孢霉素溶液浸泡30min，用无菌滤纸吸干洗液，将愈伤组织接种于恢复培养基上，28℃暗培养1周左右。

5.抗性愈伤的筛选

恢复培养过后的愈伤转接到除草剂浓度为0.5mmol/L、1mmol/L和1.5mmol/L的筛选培养基上，置相同条件下连续筛选3轮，每轮培养3周，在此过程中淘汰严重褐化、死亡的愈伤组织，保留生长良好、颜色淡黄、质地酥松的胚性愈伤组织，以及在褐化愈伤组织上新长出的胚性愈伤组织。

6.抗性愈伤的分化与植株再生

经过梯度筛选后得到的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，27℃光照培养。大约2-4周，将抗性愈伤分化出的幼苗转到生根壮苗培养基上诱导生根。当分化苗长出3条及以上的新根时，开盖炼苗1周，炼苗存活的植株移栽至大田，并做好与周围环境的隔离。

7.检测MTP-SMG2-EPSPS基因在转化植株中的表达

取移栽存活的玉米植株叶片，用CTAB法提取基因组DNA进行PCR扩增，由于所插入的基因片段在玉米基因组内没有同源性，根据插入的基因序列，设计一对特异引物，以玉米总DNA为模板进行PCR扩增，初步检测阳性植株。引物由上海英骏公司合成。序列如下：

上游引物：5’TCAGCTCGCAGTACGTGTCG3’(SEQ ID NO：5)

下游引物：5’GCCGGATCTCGTTCAACCC3’(SEQ ID NO：6)

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec；57℃退火30sec；72℃延伸30sec；循环30次；72℃延伸10min。反应体系见表9。

表2检测目的基因PCR反应体系

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

8.抗除草剂测试

对T₂代转基因玉米进行抗性试验，在玉米三叶一心时向叶片均匀喷洒1.5g/L的草甘膦(草甘膦以草甘膦异丙铵盐形式存在)，至叶片上挂满细小水珠但不掉落，14d后观察发现，非转基因对照枯黄死亡，转基因玉米生长良好。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS，具有SEQ ID NO：2：25-1476所示的核苷酸序列。

2.包含权利要求1所述抗草甘膦基因MTP-SMG2-EPSPS的转化细胞、组织或植株在植物抗除草剂育种上的应用。

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