CN103409385A - 一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，以谷氨酰胺转胺酶酶原突变体E62D-tag1为出发菌株，用氨水控制pH不小于7，当溶氧反弹时开始指数流加方式补料；至诱导浓度时，添加甘氨酸和CaCl₂，并开始恒速流加补料液。采用本发明的方法可以大大提高谷氨酰胺转胺酶酶原的产量。

Description

一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。我们要对现有技术进行改造。

发明内容

本发明提供一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，技术方案如下：一用氨水控制pH不小于7，当溶氧反弹时开始指数流加方式补料；至诱导浓度时，添加甘氨酸和CaCl₂，并开始恒速流加补料液。

本发明是以突变体E62D-tag1发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。

所述突变体E62D-tag1构建方法如下：

1）通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062，得到谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，序列如Genbank：EU477523所示；2）通过缺失突变获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3）以在步骤2）获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4）在步骤3）获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体。

其中E62D构建方法如下；

在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyceshygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆或化学全合成方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genbank：EU477523），将其克隆到表达质粒pBB1-1011作为本发明改造中的模板。

a）以上述模板为材料，通过SEQ ID NO.3为上游引物，SEQ ID NO.4为下游引物，PCR获得TG突变体的基因序列，将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4；

SEQ ID NO.2为GAGAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.3为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃1min40s24个循环72℃10min

b）Del1-4基因为模板，对E62进行突变，引物如下。

SEQ ID NO.4为GACAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.5为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，提取质粒测序。测序反应由上海生工生物工程公司完成。将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4/E62D。

由于C端氨基酸对TGase催化活性和热稳定性具有重要作用，因此选取在TGase酶C端添加稳定短肽，通过增加其与成熟酶N端或其他区域之间相互作用，提高蛋白稳定性。在蛋白C端添加适当的短肽可提高蛋白稳定性，将7个氨基酸作为稳定短肽插入到Del1-4/E62D谷氨酰胺转氨酶突变体C端，得到对应突变酶为Del1-4/E62D-tag1。

以突变质粒Del1-4/E62D为模板，进行全质粒PCR。引物如下。

SEQ ID NO.6为：

ATCGGTTGCATCATCCTGACGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG

SEQ ID NO.7为CGACCAGCCCTGCTTCACCTCG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，提取质粒测序。测序反应由上海生工生物工程公司完成。将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体。

上述分批发酵条件与种子培养、接种及初始培养相同。

上述用氨水控制pH不小于7，只控制酸不控制碱。

上述调整转速400-800r/min以维持溶氧不高于30%。

上述方法中诱导浓度为OD₆₀₀为25-80。

本发明中诱导浓度为OD₆₀₀为50-80时，分阶段添加甘氨酸和CaCl₂。

在菌浓OD₆₀₀为50时，添加终浓度为75mmol/L甘氨酸和10mmol/L CaCl₂，当菌浓OD₆₀₀达到80时，向发酵液中再次加入终浓度为75mmol/L甘氨酸和10mmol/L CaCl₂。

本发明采用指数流加方式对突变体进行高密度发酵。

本发明有效的提高了谷氨酰胺转胺酶的产量，为生产中谷氨酰胺转胺酶的应用提供了方便。

附图说明

图1SDS-PAGE分析不同诱导菌浓对蛋白分泌的影响；

（M：蛋白质标准分子量；1和2：诱导菌浓OD₆₀₀25全细胞和发酵上清；3和4：诱导菌浓OD₆₀₀50全细胞和发酵上清；5和6：诱导菌浓OD₆₀₀75全细胞和发酵上清）。

图2诱导菌体浓度对菌体生长、pro-TGase胞外和胞内产量的影响；

（(a)菌体生长曲线，(b)pro-TGase胞外产量，(c)pro-TGase胞内产量，●：诱导OD₆₀₀为25，○：诱导OD₆₀₀为50，

：诱导OD₆₀₀为75）。

图3分批添加甘氨酸和钙离子对pro-TGase发酵过程的影响；

（：OD；●：胞外酶活；○：胞内和胞外总酶活）。

具体实施方式

培养基

发酵培养基(g/L)：甘油8；(NH₄)₂HPO₄6；KH₂PO₄10.5；柠檬酸1.7；MgSO₄·7H₂O3.4；微量元素10mL，pH7.0。

微量元素液(g/L)：FeSO₄·7H₂O10；ZnSO₄·7H₂O5.25；CuSO₄·5H₂O3；MnSO₄·4H₂O0.5；Na₂B₄O₇·10H₂O0.23；CaCl₂2；(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.1。

流加培养基(g/L):甘油500；蛋白胨15；酵母粉30；MgSO₄·7H₂O30。

流加速率F的计算公式：

$F=\frac{\mathrm{\μ}\left({\mathrm{VX}}_0\right)}{Y_{X/S}(S_F-S)}\exp \left(\mathrm{\μt}\right)---\left(1\right)$

X和S分别为细胞和底物浓度，g/L；μ为比生长速率，h^-1；V为发酵液体积，L；S_F为补加底物的浓度，g/L；Y_X/S为细胞对底物的得率系数，g/g；(VX₀)为培养体系的初始细胞量，g；t为流加时间，h；其中μ设定为0.2h^-1。

以大肠杆菌合成发酵培养基进行补料分批发酵时，种子培养、接种及初始培养条件与分批发酵相同，用氨水控制pH不小于7(只控酸不控碱)。当溶氧反弹时开始指数流加，并调整转速400-800r/min以维持溶氧不高于30%，至诱导浓度时，降温诱导的同时添加150mmol/L的甘氨酸和20mmol/L的CaCl₂，并开始恒速流加。

本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定：

比色法测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。

试剂A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的Tris-HC缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。

试剂B：3mol/L的HCL，12%TCA，5%FeCL₃按1：1：1混合。

配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100℃加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL)=(6.8548×OD₅₂₅-0.0164)×稀释倍数

最适反应温度检测：20mmol/L Tris缓冲液(pH6.0)中，测定TGase在30～70℃之间催化酶活力，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下TGase酶的相对酶活力，确定TGase最适反应温度。

实施例1

为提高pro-TGase产量，选用指数流加方式来实现突变体E62D-tag1（本实验室前期研究过程中构建的突变体）高密度发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原pro-TGase。

流加速率F的计算公式：

$F=\frac{\mathrm{\μ}\left({\mathrm{VX}}_0\right)}{Y_{X/S}(S_F-S)}\exp \left(\mathrm{\μt}\right)---\left(1\right)$

X和S分别为细胞和底物浓度，g/L；μ为比生长速率，h^-1；V为发酵液体积，L；S_F为补加底物的浓度，g/L；Y_X/S为细胞对底物的得率系数，g/g；(VX₀)为培养体系的初始细胞量，g；t为流加时间，h；其中μ设定为0.2h^-1。

以大肠杆菌合成发酵培养基进行补料分批发酵时，种子培养、接种及初始培养条件与分批发酵相同，用氨水控制pH不小于7(只控酸不控碱)。当溶氧反弹时开始指数流加，并调整转速400-800r/min以维持溶氧不高于30%，至诱导浓度时，降温诱导的同时添加150mmol/L的甘氨酸和20mmol/L的CaCl₂，并开始恒速流加。

采用发酵培养基，在菌体生长至溶氧反弹时开始指数流加，使菌体快速生长，当菌体浓度到达诱导浓度时，改为恒速流加至发酵结束。

与分批发酵相比，上述流加方法使菌体量显著提高，菌浓OD₆₀₀由23.8增加到123.1。

实施例2

重组蛋白表达会对菌体代谢形成一定压力，因此在不影响菌体生长前提下，选择合适诱导时间对重组菌产酶具有重要影响。在高密度培养条件下，诱导菌浓一般较高，但对于重组大肠杆菌生产pro-TGase，较高诱导菌浓会使pro-TGase蛋白聚集在细胞内，而不能被分泌到胞外。前期对pro-TGase发酵研究发现，诱导菌浓OD₆₀₀超过20时，pro-TGase聚集在胞内而不能分泌到胞外，需在添加诱导剂时加入终浓度为150mmol/L甘氨酸与20mmol/L CaCl₂才可促进pro-TGase由胞内向胞外的分泌。因此，本节选取诱导菌浓OD₆₀₀为25、50及75，在添加诱导剂时同时加入甘氨酸和CaCl₂，以促进蛋白分泌。

不同诱导时间菌体生长差异并不明显，诱导菌浓OD₆₀₀为25时，最高菌浓OD₆₀₀仅为108.2，而当诱导菌浓OD₆₀₀为50和75时，最高菌浓OD₆₀₀分别为118.4和122.1。但不同诱导时间对pro-TGase胞外产量具有重要影响，诱导菌浓OD₆₀₀为25、50和75对应最高胞外酶活分别为8.2、32.5和1.2U/mL。此外，不同诱导时间培养条件下，胞内pro-TGase积累量也不同，诱导时间越迟，胞内蛋白积累越多，当诱导菌浓OD₆₀₀为75时，胞内pro-TGase积累最高，达6.8U/mL。选取不同培养条件下胞外酶活最高点样品，利用SDS-PAGE分析pro-TGase分布，如图1所示，胞内和胞外都有明显pro-TGase条带，其中诱导菌浓OD₆₀₀为25和75的胞内pro-TGase条带较明显，而诱导菌浓OD₆₀₀为50时，胞内虽有pro-TGase积累，但占总蛋白比例较低。由上述结果可看出，不同诱导时间对重组pro-TGase合成和分泌具有重要影响，在菌体指数生长前期和后期进行诱导都不利于重组蛋白合成和分泌，而在菌体指数生长中期进行诱导可以获得较高产量，且大部分蛋白可以分泌到胞外。

实施例3

尽管在菌浓OD₆₀₀50时进行诱导可以获得较高pro-TGase产量，但在胞内仍有部分pro-TGase积累，约占pro-TGase总酶活的15.4%。为促使胞内pro-TGase转运到胞外，对甘氨酸和钙离子的添加策略进行优化。

甘氨酸和钙离子浓度过高影响会菌体正常生长，而浓度过低则对蛋白分泌影响较小，因此将甘氨酸和钙离子分两次加入到发酵液中。在菌浓OD₆₀₀为50时，添加诱导剂和终浓度为75mmol/L甘氨酸和10mmol/L CaCl₂。当菌浓OD₆₀₀达到80时，向发酵液中再次加入终浓度为75mmol/L甘氨酸和10mmol/L CaCl₂。在该培养条件下，菌浓OD₆₀₀最高可达130.7，胞外最高酶活可达47.4U/mL，占总酶活的95%以上，胞外最高生产强度为1.05U/mL/h。该结果表明分阶段添加甘氨酸和CaCl₂对菌体生长影响较小，且有助于胞内pro-TGase向胞外的分泌。

Claims (10)

1.一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，其特征在于，用氨水控制pH不小于7，当溶氧反弹时开始指数流加方式补料；至诱导浓度时，添加甘氨酸和CaCl₂，并开始恒速流加补料液。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，以谷氨酰胺转胺酶酶原突变体E62D-tag1为出发菌株，所述谷氨酰胺转胺酶酶原突变体E62D-tag1构建方法如下：1）通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062，得到谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，序列如Genbank：EU477523所示，克隆到表达载体；2）通过缺失突变获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3）以在步骤2）获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4）在步骤3）获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体，转化大肠杆菌获得含有谷氨酰胺转胺酶突变体的工程菌。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述调整转速400-800r/min以维持溶氧不高于30%。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，指数流加比生长速率为0.2h^-1。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导浓度OD₆₀₀为25-80。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述诱导浓度OD₆₀₀为50-80。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述发酵培养基：甘油8g/L，(NH₄)₂HPO₄6g/L，KH₂PO₄10.5g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄·7H₂O3.4g/L，微量元素10mL/L，pH7.0。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述补料液：甘油500g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L，MgSO₄·gS₂O30g/L。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导的同时添加150mmol/L的甘氨酸和20mmol/L的CaCl₂。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，在菌浓OD₆₀₀为50时，添加终浓度为75mmol/L甘氨酸和10mmol/L CaCl₂，当菌浓OD₆₀₀达到80时，向发酵液中再次加入终浓度为75mmol/L甘氨酸和10mmol/L CaCl₂。

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