CN103405487A - 一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有治疗类风湿性关节炎作用的中药复方有效部位，该有效部位是由10-50份乳香、10-50份没药通过水或乙醇提取后，通过乙醇沉淀去杂，然后上大孔吸附树脂柱，用优化浓度的乙醇梯度洗脱纯化，制备得到。本发明根据中医药理论和风湿性、类风湿性关节炎发病机制精炼组方，通过现代分析仪器和药理实验筛选制备得到，实验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位具有很好的抗炎、镇痛、调节免疫功能等功效，可用于治疗类风湿性、风湿性关节炎，增生性关节炎以及炎症疼痛性疾病，且成分清楚，临床用量少，不良反应更低，有望开发成为新一代治疗关节炎的药物。

Description

一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位

技术领域：

本发明涉及一种中药复方有效部位，具体涉及一种能预防并治疗类风湿性关节炎的中药有效部位及其在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎（RheumatoidArthritis，RA）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能发生障碍，甚至残废。血管炎病变累及全身各个器官，故本病又称为类风湿病。其病因尚未明了，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。该病多发于手、腕、足等小关节，反复发作，且呈对称分布。早期有关节红肿热痛和功能障碍，晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。从病理改变的角度来看，类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜（以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌腱），其次为浆膜、心、肺及眼等结缔组织的广泛性炎症疾病。类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外，还有发热、疲乏无力、心包炎、皮下结节、胸膜炎、动脉炎、周围神经病变等。

广义的类风湿性关节炎除关节部位的炎症病变外，还包括全身的广泛性病变。这种疾病多见于中年女性，女性患者发病率约为男性的2/3倍，发病高峰为45-65岁，并且，在成年人口中发达国家的患病率大约1%，我国发病率约为0.37%。虽然到目前为止这种疾病尚不能根治，但是早期发现并合理治疗，病情可以得到较好的控制和缓解。

类风湿性关节炎（RA）在传统中医学中属“痹证”范畴，又称为“周痹”、“历节”、“顽痹”、“骨痹”等。如《玉机微义·痹症门》曰：“痹，感风寒湿之气则阴受之，为病多重痛沉重，患者易得难去。”论痹首见于《扁鹊心书·痹病》曰“风寒湿气合而为痹，走注疼痛，或臂腰足膝拘挛，两肘牵急，乃寒邪凑于分肉之间也。痹者，气血凝痹而不行，留滞于五脏之外，和而为病”；《济生方·痹》曰“皆因体虚，腠理空疏，受风寒湿气而成痹也”。

西药治疗RA疾病普遍存在价格高、毒副作用大，伴随产生的药源性疾病使患者很难达到一个理想的治疗平台，并且无法根治。然而，中医药治疗RA的历史悠久，积累了精辟的理论和丰富的防治方法。采用中医药辩证论治，疗效好、副作用小、祛邪治本、可增强人体免疫力，在RA的防治与治疗中越来越显示出其优势。但目前的中药复方制剂，大多存在药味组成复杂，用药量大，存在一定的不良反应等不足之处。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种组方配比更加精炼，配比科学合理、有效成分明确、疗效好、副作用小、服用方便的具有治疗类关节炎作用的中药复方有效部位，本发明另一个目的是提供其在制备治疗关节炎药物中的应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，它由下列方法制备得到：

(1)取乳香10-50份、没药10-50份，加入总药材重量5-10倍量的水或醇提取，合并提取液在20-70℃减压浓缩得浓缩液；

(2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到60-90%，放置，沉淀，分离得上清液，浓缩，得浓缩物；

(3)取步骤(2)得到的浓缩物上大孔吸附树脂柱，用浓度60%至80%的乙醇梯度洗脱，收集浓度为60%至80%的乙醇洗脱液，回收溶剂，得中药复方有效部位中包含有重量百分比20-90%的乳香酸类化合物、没药倍半萜类化合物和二萜类化合物。

作为优选方案，以上所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，步骤(1)中乳香35-45份、没药25-35份。

本发明在对古今治疗风湿性、类风湿性关节炎及其发病机制分析的基础上，在中医药理论的指导下，辨证施治，结合其发病机理和发病症状进行精炼组方，确定以乳香活血、没药散血进行组方，以宣通脏腑、流通经络。其中乳香辛苦性温，气香窜，偏入气分而善于调气，止痛力强。没药苦平，气淡薄偏入血分，而长于散瘀，破泻力大。二药合用，气血并治，相得益彰，功增效宏。二药味配伍后具有活血散瘀、消肿止痛之功效，临床主用于心胃胁腹肢体关节诸痛，疗效显著。

并且本发明根据组方药味的理化性质特点，对复方的提取物通过现代分离纯化手段进行去粗存精，根据现代分析仪器和药理筛选结果表明，所得的有效部位活性成分更明确，活血散瘀、消肿止痛、抗炎作用强，不良反应更低。

作为优选方案，以上所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，步骤(1)中提取溶剂醇为浓度10-80%的乙醇，提取方法为回流提取或索氏提取法，提取次数为1-3次。

作为优选方案，以上所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。本发明通过对不同极性和不同型号树脂进行吸附和纯化能力的筛选，确定型号为D101、D102或AB-8型的大孔吸附树脂吸附和纯化效果较佳，同时本发明对5%至95%不同浓度乙醇的洗脱能力进行了优选，以总洗脱物得率和乳香酸类、倍半萜类、二萜类的含量作为指标，确定浓度为30%至90%的乙醇的洗脱物总含量较高，乳香酸类、倍半萜类、二萜类有效成分含量高，且杂质少，因此确定浓度30%至90%的乙醇为梯度洗脱溶剂，作为进一步的优选方案，浓度60%至80%的乙醇洗脱，得到的乳香酸类、倍半萜类、二萜类有效成分含量最高，活性最强。因此，本发明收集浓度60%至80%的乙醇洗脱液。

作为优选方案，以上所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，经HPLC/HPLC-MS分析，步骤(3)得到的中药复方有效部位中分别包含有重量百分比10%-60%的乳香酸类化合物，1%-30%的倍半萜类化合物，1%-40%的二萜类化合物。

作为优选方案，本发明步骤(2)中加入乙醇，使乙醇的浓度达到75-85%，放置沉淀，可以沉淀去除提取液中大量极性大的大分子化合物，如多糖、树脂、蛋白质等，有利于后续的分离纯化工艺，提高纯化效率。

本发明所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制备治疗关节炎药物中的应用。

作为优选方案，本发明所述的关节炎为风湿性关节炎、类风湿性关节炎或增生性关节炎。

本发明所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制备治疗关节炎药物中的应用，把中药复方有效部位和药学上可接受的载体制成软胶囊、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制成片剂时把具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位制成胶囊剂时把具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位制成颗粒剂时，把具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制备成其它剂型时，按照中国药典2005年版所述方法制备得到。

有益效果：本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位和现有技术相比具有以下优点:

本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，根据中医药理论和类风湿性关节炎的发病机制选取原料精炼组方，二组份配比科学合理，并根据组方药味化学成分的性质特点，对组方进行提取，并对提取物通过现代分离纯化手段进行去粗存精，根据现代分析方法和药理跟踪筛选结果表明，本发明所得的有效部位活性成分更明确，具有很好的活血散瘀，行气止痛的作用，用量少，且起效快、标本兼治、不易复发，长期使用无不良反应，且本发明提供的具有治疗关节炎作用的中药复方可以方便的和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，方便临床服用。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为：

(1)按比例称取乳香10份、没药10份，经粉碎至粒径为40目，混合，用水煎煮提取2次，第一次加总药材10倍量水煎煮1.5h，第二次加总药材8倍量水煎煮1h，合并两次煎出液，浓缩至1g生药/ml，得浓缩液；

(2)用浓度为95%乙醇调步骤(1)得到的浓缩液至乙醇浓度为80%，放置12h，过滤沉淀，取上清液，浓缩至5kg，得浓缩物；

(3)取步骤(2)得到的浓缩物上D101大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、浓度为10%-95%的乙醇进行梯度洗脱，收集浓度60%-80%乙醇洗脱部位，浓缩，即得具有治疗关节炎的中药复方有效部位。

经过HPLC/HPLC--MS分析，以上中药复方有效部位中含有重量百分比分别为20%的乳香酸类化合物；15%的倍半萜类化合物；30%的二萜类化合物。

取以上制备得到的有效部位10g，加入药用淀粉16g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，制成颗粒，装入胶囊，每粒0.2g，或者取有效部位10g，玉米淀粉20g，加入润滑剂硬脂酸镁5g，混合均匀，然后压片制成片剂。

实施例2

一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为：

(1)取乳香35份、没药25份，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度为60%乙醇回流提取3次，第一次加8倍量60%乙醇回流2h，第二次加6倍量60%乙醇回流2h，第三次加6倍量60%乙醇回流1.5h，合并提取液，在50-70℃减压浓缩得浓缩液5kg；

(2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到90%，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物；

(3)取步骤(2)得到的浓缩物上D102型大孔吸附树脂柱，用浓度10%至95%的乙醇梯度洗脱，收集60%-80%乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗类风湿性关节炎的中药复方有效部位。

经过HPLC/HPLC--MS分析，中药复方有效部位中含有重量百分比分别为30%的乳香酸类；5%的倍半萜类；10%的二萜类化合物。

取以上制备得到的有效部位10g，加入药用淀粉16g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，制成颗粒，装入胶囊，每粒0.2g，或者取有效部位10g，玉米淀粉20g，加入润滑剂硬脂酸镁5g，混合均匀，然后压片制成片剂。

实施例3

一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为：

(1)取乳香50份、没药50份，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度为80%乙醇回流提取2次，第一次加80倍量80%乙醇回流2h，第二次加8倍量80%乙醇回流1.5h，合并提取液，在50-70℃减压浓缩得浓缩液7kg；

(2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到90%，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物；

(3)取步骤(2)得到的浓缩物上AB-8型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10%-95%的乙醇进行梯度洗脱，收集60%-80%乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗关节炎的中药复方有效部位。

经过HPLC/HPLC--MS分析，中药复方有效部位中含有重量百分比分别为50%的乳香酸类；8%的倍半萜类；15%的二萜类化合物。

取以上制备得到的有效部位15g，加入药用淀粉30g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，整粒，制成颗粒剂，或者取有效部位15g，玉米淀粉30g，加入润滑剂硬脂酸镁6g，混合均匀，然后压片制成片剂。

实施例4对佐剂性关节炎大鼠的影响

1.实验材料

仪器Drict-Q5超纯水机（Millipore）；旋转蒸发器（南京金正教学仪器有限公司）；电子天平（SartorisBP211D）；显微镜（型号OLMPUSCKX31）；酶标仪（型号680，BIO-RAD）；酶标仪（DENLEYDRAGONWellscanMK3，Thermo）；洗板机（Wellwash4MK2，Thermo）；电子天平（型号JA2003N，上海精密科学仪器有限公司）；离心机（AnkeLXJ-IIB）；恒温水浴箱（HH-S金坛市医疗仪器厂）；漩涡混合器（XW-80A，上海青浦沪西仪器厂）。

试剂与样品Freund’s完全佐剂（100M8717CAS9007-81-2，sigma）；聚山梨酯80（上海申宇医药化工有限公司，95-18661）；无水乙醇（无锡市亚盛化工有限公司）；大鼠IL-2ELISA试剂盒、大鼠PGE₂ELISA试剂盒、大鼠TNFαELISA试剂盒（均购自于上海西唐生物科技有限公司）；吲哚美辛（上海辛帕斯制药有限公司，批号：H31020148）；戊巴比妥钠（德国分装，批号：WS20080810）；枸橼酸钠（南京化学试剂有限公司，批号：050580052）；超纯水为自制；样品均为自制。

动物清洁级SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）。饲养条件：清洁级动物实验室，室温23-25℃，相对湿度40%-70%，每天适当通风换气15次。

2.实验方法

2.1大鼠佐剂型关节炎模型的建立

SD大鼠72只，雌雄各半，体重在180-220g，用自制的简易足跖测量装置测各鼠左、右后足跖体积，按体质量随机分出8只作为空白对照组，其余64只按文献方法进行造模。常规方法对SD大鼠右后足跖底部皮肤进行消毒，用微量注射器皮内注射Freund’s完全佐剂0.1mL/只进行致炎。造模后第13天，测量每只大鼠左右足跖容积，模型组足跖容积与空白组比较有显著差异，并观察发现足跖红肿明显提示造模成功。

2.2实验分组

实验按大鼠体质量和足肿胀程度随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（Indomethacin,IMT）、本发明实施例1制备得到的中药复方有效部位高剂量组（FH）、有效部位低剂量组（FL）、有效部位中剂量组（FM）。

2.3大鼠一般状态的观察及关节肿胀度的评定

造模前及给药前后观察大鼠体毛色泽及活动状况，食量的增加变化及关节红肿情况，并于造模前、造模后第13d、造模后第20d、造模后第24d、造模后第27d、造模后第30d测量大鼠的体重（g）和左、右跖的容积（mL）。

体重：用电子称称量大鼠体重；足跖容积：用自制足跖测量装置测各组大鼠左右后跖的容积，比较给药后各组大鼠足跖肿胀程度的变化。

2.4给药剂量及给药方式

在造模后第13d，分组并测量大鼠左、右足跖容积及体重后，开始灌胃给药。吲哚美辛阳性对照组组（10mg/Kg·d）、中药复方有效部位高剂量组（FH）（90.48mg/Kg·d）、有效部位低剂量组（FL）（56.12mg/Kg·d）、有效部位中剂量组（FM）（76.92mg/Kg·d）灌胃2mL，正常对照组和模型组给予等量千分之二的聚山梨酯-80，共给药17天。

2.5大鼠血浆、组织样本的采集及处理

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈动脉取血，用3.8%枸橼酸钠（血与抗凝剂体积比为9:1）抗凝收集全血于10mL的离心管中，用低速离心机以3000r/min转速离心10min，吸取上清液，-20℃下冰冻保存，检测血浆中NO、MDA、PGE₂、IL-2、TNF_α。同时剪下右后足肿胀足跖去皮、剔骨，用生理盐水浸泡（组织与生理盐水体积比为1:9），3000r/min离心10min，吸取上清液，-20℃冷冻保存，检测组织液中NO、MDA、PGE₂、IL-2、TNF_α。

2.6大鼠组织中BCA蛋白浓度的测定方法

实验采用上海西唐生物生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定方法如下：

1）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

2）完全溶解蛋白标准品，取25μL用0.9%NaCl或PBS稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。

3）将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。

4）加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升。

5）各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30分钟。

6）测定波长为562nm，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

2.7NO的测定方法

按一氧化氮（Nitricoxide，NO）试剂盒（酶法）说明书操作，测定NO的释放量。NO化学性质活泼，体内代谢很快转为NO2-和NO3-，而NO2-又进一步转化为NO3-，本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。

取上述所得血浆、组织上清液，每个样品各取八管，每管100μL，作为测定管，取100μL100μmol/LKNO₃作为标准管共八管，取100μL的双蒸水作为空白管共八管，每管加入400μL混合试剂（硝酸还原酶），轻轻混匀，37℃水浴1小时后，各管依次加试剂3，试剂4，充分涡旋混匀30秒，室温静置40分钟，离心取上清，加入显色剂反应60min，540nm测各管OD值，按下式计算：

（1）血清中NO含量的计算公式：

（2）组织中NO含量的计算公式：

2.8丙二醛（MDA）的测定方法

实验按照丙二醛（MDA）测定试剂盒说明书的操作方法，测定MDA的释放量。MDA试剂盒测试原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色的产物，在532nm处有最大吸收峰。

按试剂盒说明配置试剂，取上述所得血清、组织上清液，每个测试样品取八管，每管50μL，空白管和标准管各取八管，每管50μL，每管分别加入混合试剂1000μL，用涡旋混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000r/min，离心10分钟。取上清200μL于96孔板中，532nm处测各管的吸光度值，按下述公式计算：

（1）血清中MDA含量的计算公式：

（2）组织中NO含量的计算公式：

2.9白介素-2（IL-2）、PGE2、TNFα的测定方法

实验采用双抗夹心ABC-ELISA法，用抗大鼠IL-2单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-2与单抗结合，加入生物素化得抗大鼠IL-2，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-2浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中IL-2的浓度。PGE₂、TNF_α含量的检测原理与IL-2的检测原理相似。

按试剂盒的要求配置标准品、10×标本稀释液、洗涤液。取出96孔酶标板，每孔依次加入标准品和待测样品100μL，将反应板充分混匀后置37℃孵育120分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干后，每孔中加入第一抗体工作液100μL，将反应板充分混匀后37℃孵育60分钟，洗板，印干后每孔加底物工作液100μL，将反应板置暗处反应15分钟。每孔再加入100μL的终止液混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/mL为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应的IL-2、PGE₂、TNF_α的含量。

3实验结果

3.1致炎后各组大鼠一般情况的观察比较

3.1.1致炎后各组大鼠一般状态变化

正常对照组大鼠进食量多，精神状态佳，被毛有光泽，活动灵活，无异常状态出现，随着饲养时间的延长，体形渐长，体重增加明显。模型组大鼠，雌性食量减少较明显，体重减少明显，精神不佳，毛发干枯没有光泽，活动量减少，后期负重困难，关节活动出现障碍；雄性大鼠食量有减少但不明显，体重减少也不明显，精神不佳，毛发少光泽，活动量也减少，但不如雌性大鼠明显。本发明提供的中药复方有效部位高、中、低剂量组大鼠毛发、精神状态、体重和关节活动障碍较模型组均有明显好转。

3.1.2致炎后各组大鼠不同时间体重的变化

给药前各组大鼠体重与模型组体重比较，正常组体重与模型组体重有显著性差异（P≤0.05），其余各组与模型组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.2致炎后各组大鼠不同时间右足跖肿胀程度的影响

致炎后各组大鼠不同时间右足跖肿胀程度的影响，表1可知，造模前，正常组、给药组大鼠右足跖容积均与模型组无显著性差异（P＞0.05）；造模后第13d，正常组与模型组比较有极显著性差异（P＜0.001），其余各组与模型组比较均无显著性差异（P＞0.05）；造模后第20d，正常组、IMT组、药物组与模型组比较有极显著性差异（P＜0.001），中药复方有效部位高、中剂量组与模型组比较有非常显著性差异（P＜0.01），低剂量组与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）；造模后第24d，中药复方有效部位高、中剂量组与模型组比较有非常显著性差异（P＜0.01），其余各组与模型组比较均有显著性差异（P＜0.01）；造模后第27d、第30d各组大鼠右足跖容积与模型组比较均匀极显著性差异（P＜0.01），本发明提供的中药复方有效部位显示出了很好的消肿功效。

表1大鼠右足跖肿胀程度的变化

注：与模型组比较，*P＜0.05表示有显著性差异，**P＜0.01表示有非常显著性差异，***P＜0.001表示有极显著性差异。

3.3对各组大鼠血浆中NO、MDA、IL-2、PGE2、TNFα的影响

由表2可知，本发明中药复方有效部位高、中、低剂量组能够显著抑制大鼠血浆中NO水平，与模型组比较有极显著差异（P＜0.001）；正常组大鼠血浆中MDA含量与模型组比较有非常显著差异（P＜0.01），ITM组、中药复方有效部位高、中、低剂量组与模型组比较有非常显著差异（P＜0.01）；IMT组、中药复方有效部位高、中、低剂量组大鼠血浆中IL-2、PGE₂、TNF_α水平，与模型组比较均有极显著差异（P＜0.001）。结果表明本发明制备得到的中药复方有效部位具有显著的抑制佐剂性关节炎大鼠血浆中NO、MAD、IL-2、PGE₂、TNF_α水平，具有很好的抗炎效果。

表2对大鼠血浆中NO、MDA、IL-2、PGE2、TNFα含量的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05表示有显著性差异，**P＜0.01表示有非常显著性差异，***P＜0.001表示有极显著性差异。

3.4对大鼠右足跖肿胀组织中NO、MDA、IL-2、PGE2、TNFα的影响

由表3可知，IMT组、本发明中药复方有效部位高、中、低剂量组大鼠右足跖肿胀组织中NO、PGE₂、TNF_α的含量与模型组比较均有极显著差异（P＜0.001），实验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位能够显著抑制足跖肿胀组织中NO、MDA、IL-2、PGE2、TNFα水平，显示出了很好的抗炎效果。

表3对大鼠右足跖肿胀组织中NO、MDA、IL-2、PGE2、TNFα含量的影响

（注：与模型组比较，*P＜0.05表示有显著性差异，**P＜0.01表示有非常显著性差异，***P＜0.001表示有极显著性差异。）

实施例5抗氧化活性评价

1.实验材料

仪器680BIO-RAD酶标仪，JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），Drict-Q5超纯水机（Millipore），各种规格的移液枪。

试剂和样品无水乙醇（无锡市亚盛化工有限公司），DPPH·（sigma公司），维生素C（国药集团化学试剂有限公司），超纯水自制，样品均为自制。

2.实验方法

准确称取DPPH·用无水乙醇配成6.5×10^-4mol/L的储备液，冰箱避光保存30min即可使用。维生素C（阳性对照）用蒸馏水溶解，乳香-没药配伍前后各效应部位用不同浓度的无水乙醇溶解。分别把100μL本发明实施例1制备得到的中药复方有效部高浓度（F01）、中浓度（F02）和低浓度（F03）加到96孔板中，然后加入100μLDPPH·溶液（终浓度为80μM），摇晃均匀，避光反应30min，在517nm处测定OD值。按照以下公式计算自由基清除率：

清除率=[1-(A₁-A₂)/A₀]×100%

式中，A₀为溶剂与DPPH·作用后的吸光度；A₁为受试物与DPPH·作用后的吸光度；A₂为未加DPPH·的吸光度。

半数抑制率的计算：半数抑制率(IC₅₀)指清除率为5O%时所需抗氧化剂的浓度，根据不同浓度抗氧化剂的清除率作曲线求出。

3.实验结果

根据样品的溶解度不同将样品溶于不同的溶剂，按照上述方法测定各样品对DPPH·的清除率，结果见表4。由表4可知，本发明实施例1中药复方有效部位高剂量组清除DPPH自由基活性最强，IC₅₀为67.11μg/mL；中、低剂量组IC₅₀分别为111.55μg/mL、93.53μg/mL；表明本发明制备的有效部位具有较强的抗氧化活性。

表4清除DPPH自由基半数抑制作用（n=4）

实施例6小鼠热板致痛实验

1.实验方法

雌性ICR小鼠，50只，体重22～26克，随机分为模型对照组、阳性药组（杜冷丁），本发明实施例1制备得到的中药复方有效部位高剂量组（FH）、有效部位低剂量组（FL）、有效部位中剂量组（FM），每组10只。以热板刺激法评价中药复方有效部位的镇痛效应。小鼠先用热板测痛仪器（55.5℃）分别测定每只小鼠的正常痛阈值。每天给药1次，连续2天，于末次给药后30分钟，1小时，2小时，4小时，10小时测定痛阈时间，比较组间差异。

2.实验结果

本发明实施例1制备得到的中药复方有效部位组在给药后对热板刺激所致小鼠痛阈时间较给药前痛阈时间有延长作用，且10小时后依然有明显的镇痛作用，与空白对照组相比，能显著提高小鼠痛阈时间。具体实验结果如表5。

表5中药复方有效部位对小鼠热板实验的镇痛作用(n=10)

与给药前比较，**P<0.01，*P<0.05；与生理盐水组比较，△△P<0.01，△P<0.05。

由以上表5的实验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位具有很好的镇痛作用，可以提高痛阈值，且持续时间较长，在治疗关节炎病症时能发挥很好的抗炎镇痛功效。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，其特征在于，它由下列方法制备得到：

(1)取乳香10-50份、没药10-50份，加入总药材重量5-10倍量的水或醇提取，合并提取液在20-70℃减压浓缩得浓缩液；

(2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到60-90%，放置，沉淀，分离得上清液，浓缩，得浓缩物；

(3)取步骤(2)得到的浓缩物上大孔吸附树脂柱，用浓度30%至90%的乙醇梯度洗脱，收集浓度为60%至80%的乙醇洗脱液，回收溶剂，得中药复方有效部位中包含有重量百分比20-90%的乳香酸类化合物、没药倍半萜类化合物和二萜类化合物。

2.根据权利要求1所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，其特征在于，步骤(1)中乳香35-45份、没药25-35份。

3.根据权利要求1所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，其特征在于，步骤(1)中提取溶剂醇为浓度10-80%的乙醇，提取方法为回流提取，提取次数为1-3次。

4.根据权利要求1所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，其特征在于，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位，其特征在于，步骤(3)得到的中药复方有效部位中包含有重量百分比10%-60%的乳香酸类化合物，1%-30%的倍半萜类化合物，1%-40%的二萜类化合物。

6.权利要求1至5任一项所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制备治疗关节炎药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制备治疗关节炎药物中的应用，其特征在于，所述的关节炎为风湿性关节炎、类风湿性关节炎或增生性关节炎。

8.根据权利要求7所述的具有治疗关节炎作用的中药复方有效部位在制备治疗关节炎药物中的应用，其特征在把于把中药复方有效部位和药学上可接受的载体制成软胶囊、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。