CN103347900A

CN103347900A - 葡聚糖

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Publication number: CN103347900A
Application number: CN2011800568279A
Authority: CN
Inventors: 罗尔夫·英斯塔德; 托尔·内科兰德
Original assignee: Biotec Pharmacon ASA
Current assignee: Danstar Ferment AG
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: JP2014503621A; US9623043B2; GB201020190D0; US20170056433A1; JP5932824B2; CA2818584C; CN103347900B; EP2646475A1; CA2818584A1; US20130310338A1; EP2646475B1; KR20130121137A; US10646506B2; WO2012073018A1; KR101874660B1; DK2646475T3

Abstract

本发明涉及葡聚糖、其生产方法、其医疗用途，对其应用了葡聚糖或其上浸渍了葡聚糖的物理支持体，以及皮肤细胞的体外增殖方法，该方法包括使皮肤细胞群与葡聚糖接触，所述葡聚糖具有以单链基础计15,000至50,000g/mol的重均摩尔质量和在水溶液中以聚集体基础计4至20x10⁵g/mol的重均摩尔质量，并且在25℃和中性pH下以浓度≥1%的水溶液凝胶形式存在，并且当所述葡聚糖以2%的浓度溶解于水中时具有30至44℃的熔化温度（凝胶至溶胶）。

Description

葡聚糖

本发明涉及一种新的葡聚糖产品，其生产方法，以及其作为药物、加入医疗装置、作为营养品、美容产品等的用途。

葡聚糖是在植物、细菌、真菌和原生动物的细胞壁等中发现的一组异质的葡萄糖聚合物。葡聚糖具有骨架链，并且在一些情况下具有侧链，侧链根据葡聚糖的来源包括β（1,3）、β（1,4）和/或β（1,6）-连接的葡糖基单元。根据来源和分离方法，β-葡聚糖在骨架和侧链中具有不同的分支程度和键合类型。侧链中键合的频率和类型与分子的生物活性高度相关。葡聚糖在其分子量及其链聚集趋势方面高度不同，两者都是这些分子的效力谱的必要特征。大部分真菌和酵母来源的β-葡聚糖在其天然状态下是不溶于水的，但是可以通过酸水解或者通过衍生化而变得可溶，所述衍生化将外来基团如-磷酸、-硫酸酯、-胺、-羧基甲基等引入分子。

在欧洲、亚洲和美国，特别是来自面包酵母（Bakers’Yeast）的β-葡聚糖一直被用作动物饲料添加剂，用于美容产品中，用作人类膳食补充剂，例如在伤口治疗中作为免疫调节剂，以及作为皮肤乳霜制剂中的活性成分。如WO02/058711所示，葡聚糖已经被用于治疗癌症。在该上下文中，β-葡聚糖被视为免疫刺激剂，部分地通过诱导定位于癌症的充分调节和部位限制的炎症反应而增加白细胞活性。其在治疗炎性肠病的用途也已经描述于WO2009/063221。葡聚糖在伤口治疗中的进一步应用描述于EP815144和US6875754，以及用于治疗哮喘和过敏症的用途描述于US12/528,215。

谷物葡聚糖一般包括β（1,3）的未分支链和显著比例的β（1,4）键合，而酵母葡聚糖主要由β（1,3）连接的葡糖基残基与用作可以包括β（1,3）和β（1,6）连接的葡糖基残基的侧链分支点的β（1,6）键合构成。被分类为葡聚糖的其他分子包括凝胶多糖（curdlan），一种由β（1,3）连接的葡糖基残基构成而没有分支的基本上线性的分子。香菇多糖是具有β（1,3）连接的骨架但加入了单个β（1,6）连接的葡糖基残基的葡聚糖，β（1,6）连接的葡糖基残基与骨架基本上规律地连接产生该分子的发梳结构。与骨架连接的单个β（1,6）连接的葡糖基残基等同于β（1,3,6）键合点，但是没有其他分子与该键合点连接，因此如香菇多糖的葡聚糖没有侧链。该组葡聚糖的其他实例有硬葡聚糖、昆布多糖和裂裥菌素。

侧链结构的分支和长度的变化导致形成对比的二级和三级结构和由此的生物活性。葡聚糖的高级结构显著变化，并且分子量、溶解度和粒度都将以一般不可预测的方式影响活性。一些产品是靶细胞中炎性细胞因子的非常有效的诱导剂，而其他产品具有相反作用，完全抑制细胞因子释放。对于许多不溶性β-葡聚糖产品典型的是整个范围炎症反应的诱导，其中例如，不溶性β-葡聚糖制剂的注射伴随肉芽肿形成、关节炎诱导和针对革兰氏阴性败血症增加的易感性。另一方面，未报道可溶性β-葡聚糖受这种不良副作用的妨碍，但是已知其作为免疫刺激剂的效力明显变化。

例如，已经显示（WO95/30022），已经被葡聚糖酶处理修饰以选择性去除（1,6）连接的侧链的衍生自酵母的葡聚糖产品在刺激鱼的免疫系统方面比具有完整（1,6）连接的侧链的产品更有效。

葡聚糖具有极大的作为治疗剂和佐剂的潜力，但是许多结构可变性、此类大且复杂分子的分析问题以及缺乏对这些分子作用机制和受体的了解，意味着依然存在对改良的葡聚糖产品和生产同类产品的可控且可重复方法的巨大需求。本发明解决了这些问题。本发明通过操纵葡聚糖的一级和二级分子结构以建立最终产品的药学上有益的三级结构而加强葡聚糖效力。

已知β-葡聚糖是所谓的病原体相关的分子模式，因为它们存在于许多致病（微）生物、特别是真菌的表面。因此，高等生物体具有用于识别这些类型结构的进化机制以发现并摧毁属于这类生物体的入侵者。在哺乳动物中，所谓的先天免疫细胞表达识别β-葡聚糖的特异性受体，并且最重要的受体之一被称为Dectin-1，但是其他受体也参与β-葡聚糖诱导的识别或信号转导，这些中有CD11b/CD18（CR3）和toll受体2和4（TLR2和TLR4）。参与识别β-葡聚糖的细胞有先天免疫系统的典型吞噬细胞，即，单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和粒细胞，而且天然杀伤细胞以及许多内皮细胞和其他更加组织特异性的细胞具有表达β-葡聚糖受体的能力。

在靶细胞中诱导生物反应的关键步骤是与受体的初始结合，而且，似乎是β-葡聚糖制剂交联足够数目的受体以诱导充分的信号转导进入细胞的能力。本发明描述了一种产品和制备产品的方法，所述产品具有交叉结合诱导特定类型的生物活性的受体的能力。这与能够通过交叉结合大量受体而诱导大规模反应并随后被吞噬的不溶性产品相反，这是由于不溶性（或“结晶样”）葡聚糖的性质导致诱导NLRP炎性激活的细胞内的溶酶体破裂。不溶性β-葡聚糖还可以诱导ROS（活性氧类），ROS（活性氧类）还将触发炎性激活，导致不利的炎症反应。本发明描述了能够诱导显著炎症反应的β-葡聚糖产品，炎症反应将激活几种免疫机制，但是不触发对于许多（聚集的不溶性）β-葡聚糖产品典型的炎性激活。

本发明通过在最终产品中建立药学上有益的超分子结构而加强葡聚糖效力。

β-葡聚糖的高级结构的重要性和个体葡聚糖链或链和高级结构的特征对葡聚糖产品总体活性的贡献描述于Sletmoen等人.Biopolymers第89卷，第4期，pp310-321，2008。高级结构可以包括规则排列，例如三股螺旋或更松散的聚集。

本发明提供了当遭遇靶细胞时被视为中等大小实体的葡聚糖制剂，但当被吞噬时，葡聚糖容易被摄取进入吞噬体而不诱导溶酶体破裂。因此，本发明描述了具有良好胶凝性质的高效可溶性β-葡聚糖的新组织。不希望受理论束缚，似乎葡聚糖分子以一种更复杂和松散的“稻草堆”排列方式而排列，通过沿着葡聚糖骨架结构的频繁–OH基团之间的相对弱的氢键保持在一起。“稻草堆”组织具有在其表面呈现许多可用于靶细胞上特定葡聚糖受体识别的部位的潜力。然而，“稻草堆”组织的分子不具有不溶性产品的刚性，但是将更容易变得“降解”并因此在所述部位或者在吞噬之后“固定化”。这种大的高级组织与不溶性和已知的可溶性产品相比是有利的，因为它产生免疫调节反应，模拟许多使用微粒和不溶性β-葡聚糖观察到的效应，但不诱导已知与不溶性β-葡聚糖相关的较不可控和可能有害的效应。

一方面，本发明提供了具有以单链基础计15,000至50,000g/mol的重均摩尔质量和在水溶液中以聚集体基础计4至20x10⁵g/mol的重均摩尔质量的葡聚糖，所述葡聚糖在25℃和中性pH下以浓度≥1%在水中溶解时以凝胶形式存在，并且当所述葡聚糖以2%的浓度溶解于水中时具有30至44℃、优选约33℃的熔化温度（凝胶至溶胶）。重均摩尔质量值可以常规地通过SEC-MALS-RI分析来测定。

优选地，葡聚糖以1.5至6%、更优选1.5至5%、甚至更优选2至4%、最优选约2%的水溶液存在。要理解，“凝胶”形式可以被认为是水溶液。

在一个优选方面，葡聚糖是β葡聚糖，优选地，它具有β（1,3）连接的葡糖基残基的骨架和通过β（1,6）键合与之连接的β（1,3）连接的葡糖基残基的侧链（例如，至少2、5、10或20个连接的葡糖基残基的侧链）。

“中性pH”表示pH7。

“侧链”指个体葡聚糖分子，即，其中葡糖基残基共价连接的葡聚糖分子。“聚集体”通过氢键相互作用而形成，并且限定了超分子或高级结构。这种结合比共价键合所提供的结合较不持久，但是本文描述的方法得到了可识别的聚集模式，其平均摩尔质量可以使用本文提到的技术来分析。“水溶液”通常是pH7。

换个角度，本发明提供了水溶液中包含浓度为1至6%的葡聚糖的凝胶葡聚糖产品，所述葡聚糖具有以聚集体计4至20x10⁵g/mol的重均摩尔质量和以单链基础计15,000至50,000g/mol的重均摩尔质量，所述凝胶葡聚糖产品具有30至44℃、优选约33℃的熔化温度（凝胶至溶胶）。

如提到的，当葡聚糖以2%的浓度溶解于水中时，凝胶葡聚糖产品具有30至44℃、优选约33℃的熔化温度（凝胶至溶胶）。要理解，可以通过在产品中加入其他剂、例如胶凝剂和/或通过使用更高浓度的葡聚糖来实现更高的熔化温度。

葡聚糖产品通常是微粒、半可溶或在一些情况下完全可溶于水溶液，后者给出如例如在美国专利5,322,841中描述的流体澄清溶液，或者一些给出如Steiner等人（Prog Colloid Polymer Science77,1988）描述的粘性溶液。可溶性β-葡聚糖的真实凝胶形式是不常见的，特别是对于可溶性酵母葡聚糖，但是已经发现本发明凝胶产品与其他葡聚糖产品相比提供优良的生物活性，特别是在伤口愈合中。在伤口愈合中，最重要的是以保证伤口湿润的方式应用药物或医疗装置，并且产品必须覆盖并粘附于伤口表面以避免感染并提供医疗工作者认为相关或根据伤口类型必要的施用特征。通常，微粒、半可溶或液体形式的葡聚糖不满足这些基本要求，因为它们不是有效的，或者它们处于不可用于伤口愈合目的的状态，或者两者。本发明的葡聚糖组合了这些必要特征，因此使它可用于其中纯的葡聚糖凝胶可以找到适当用途的所有应用。除了严格局部应用，其他可能的用途可以是口服施用和/或粘膜施用，例如除了癌症治疗以外，治疗胃肠道或口腔疾病。根据本发明的葡聚糖的优良的粘附性质使它能够覆盖作用部位的粘膜衬里，并因此加速愈合过程。因此，本发明的葡聚糖在治疗口腔粘膜炎和影响粘膜的其他适应症中具有特定效用。

根据本发明，进行基本的加热和冷却过程以建立和“冷冻”优选的三维的复杂且连续的葡聚糖结构。这种加热和快速冷却建立了具有非常有益的葡聚糖链三维结构的凝胶网络，其显示了本文示例的优良的愈合特征。β葡聚糖的三级或三维结构，本案中作为整体的葡聚糖凝胶的分子链排列似乎对于效力而言是最重要的。不确立被理论束缚的限制，似乎只有生物上有效的分子结构提供了对靶细胞不同受体的结合。单链、短链或没有适当的三维复杂方式结构的产品将不能以相同方式刺激机体免疫系统。

存在表征由其单链构成的凝胶的三维（还定义为三级或超分子结构）分子结构的有限方式。描述这种凝胶的一般方式可以通过单链的平均摩尔质量和摩尔质量分布，以及物理特征，例如粘度。在免疫调节产品的情况下，凝胶还可以直接由其生物效力特征来描述，或者换言之测量所谓的“生物指纹”。当使用分子量作为定义性物理特征时，发现分析方法一般是破坏性的，导致凝胶产品的单链组分或较小聚集结构的分析，而不是给出产生生物有效的三维三级结构所必要的、这些单链之间分子相互作用的详细图像。然而，包括与生物效力特征组合的其粘度的葡聚糖的几个其他物理特征的详细分析使技术人员能够区分许多不同的葡聚糖。这些标准之一是特定的分子量范围。可以不同的方式测定葡聚糖的摩尔质量。在可溶性葡聚糖产品的情况下，常规地通过SEC-MALS-RI分析测量摩尔质量，并且这种分析提供了样品的重均摩尔质量值（M_W）以及样品内不同分子量分布。在本发明中，重均分子量（M_w）被定义如下：

M_{w} = \frac{{Σn}_{i} M_{i}^{2}}{{Σn}_{i} M_{i}} = \frac{{Σc}_{i} M_{i}}{{Σc}_{i}}

其中n_i是具有摩尔质量M_i的分子的数目。具有摩尔质量M_i的分子的重量浓度c_i与摩尔质量M_i和分子数目n_i成比例。

c_i=M_in_i=>n_i=c_i/M_i

色谱中每个部分的重量浓度通过RI检测器来测定，而每个部分的摩尔质量通过MALS检测器与RI检测器的组合来测量。计算是基于光散射理论。

具体地，根据本发明的平均摩尔质量（对于单链）通过SEC-MALS-RI在具有0,5%LiCl的DMAc（具有0,5%氯化锂的二甲基乙酰胺）中测定，假定葡聚糖在该溶剂中的dn/dc为0,12。DMAc/LiCl溶剂将所述葡聚糖完全溶解成单链，并且因此，使用具有0,5%LiCl的DMAc作为洗脱剂的随后SEC-MALS-RI分析给出了单链水平上的分子量分布的量度。简单说，DMAc/LiCl中的葡聚糖分析涉及干葡聚糖以大约3mg/ml的浓度溶解在溶剂中，在通过使用3x PLgel Mixed-A LS柱和具有0,5%LiCl的DMAc作为洗脱剂的SEC-MALS-RI分析之前，通过在室温搅拌溶液过夜并在100℃加热1h。通过该方法测定的以单链基础计的本发明葡聚糖的重均摩尔质量是15,000至50,000g/mol、优选25,000至45,000g/mol和更优选30,000至40,000g/mol。

在水溶液中，存在的主要高级结构和聚集体的重均摩尔质量是4-20×10⁵g/mol、优选5-15×10⁵g/mol和更优选6-12×10⁵g/mol。这些平均值是在排除非常大的聚集体（即，摩尔质量高于1.0x10⁷g/mol）时计算的。水溶液中葡聚糖的分析涉及将凝胶溶液在具有0,02%NaN₃的0,1M NaNO₃中稀释至大约3mg/ml，在加帽的玻璃管中加热至100℃持续30min，冷却至室温，通过0,2μm注射器滤器过滤，并通过使用TSKgel G5000PWXL+TSKgel G4000PWXL柱和具有0,02%NaN₃的0,1M NaNO₃作为洗脱剂的SEC-MALS-RI分析。使用例如0,05M Na2SO4/0,01M EDTA作为溶剂/洗脱剂的类似设置得出等同的结果。水溶液中单链和高级结构/聚集体的摩尔质量值的组合产生了凝胶作为整体的分子和三级结构的良好指示，并且有用地定义了本发明的葡聚糖。

本发明葡聚糖进一步特征为在25℃和3至8的pH下、最低浓度为1%的水溶液中为凝胶形式。本发明的葡聚糖凝胶进一步特征为其粘度特征，示例为凝胶的熔化温度（凝胶至溶胶）为30至44℃、优选高于正常体温、更优选39至44℃。

葡聚糖产品的凝胶熔点，即凝胶→溶胶转变温度，通常由小应变振动测量来测定，使用Stresstech HR流变仪或类似物并检查葡聚糖溶液冷却（70→10℃）和加热（10→70℃）期间的粘弹性变化。在这种实验中根据温度绘制的储能模量（G’）的一个实例显示于图3。该特定样品的熔化温度等同于其中递增温度曲线的储能模量平稳时（大约0Pa），其大约33℃。测定凝胶的大致熔化温度的另一方式是测量凝胶在连续更高温度下的粘度（例如，使用旋转粘度计），直至粘度基本消失并且凝胶转变成溶液。熔化温度优选约30-44℃、优选高于体温，以保证局部应用的稳定化葡聚糖凝胶。局部施用要求比口服施用或施用至感染部位相对更低的熔化温度。

本发明的葡聚糖凝胶是水凝胶，而凝胶形式可以通过目视检查来确认，葡聚糖凝胶的非牛顿粘度特征和假塑性和触变性质还可以通过粘度测量来测定，例如通过使用旋转粘度计。根据本发明的2%葡聚糖凝胶具有至少1000cP、优选至少1500cP的粘度，使用具有小样品适配器和主轴SC4-31的Brookfield DV-II+Pro可编程粘度计在25℃和10rpm的旋转速度（对应于3,40sec^-1的剪切速率）下测量。用于测量该假塑性和触变凝胶的粘度的常规方法是使用所谓的升-降速率斜坡，例如在2rpm开始并以2rpm的增量升至10rpm，然后再以2rpm幅度回降。该实验的数据可以说明凝胶的假塑性（随递增的剪切速率递减的粘度）和触变（在接受剪切的时随时间递减的粘度）特征，并且提供例如10rpm粘度的量度。2%葡聚糖凝胶的这种数据的一个实例显示于图6。

本发明的葡聚糖通常衍生自酵母、优选酿酒酵母。这些葡聚糖的基本分子结构通常是β-1,3-骨架（表示通过β-1,3键合连接的葡萄糖分子的链）以及β-1,3侧链（表示通过β-1,3键合连接的至少两个葡萄糖分子的链）和将所述侧链连接至所述骨架的β-1,3,6-键合点。此外，来自酵母的葡聚糖包括β-1,6键合，其可以连接至侧链或者直接连接至骨架。其他类型的键合存在，但是以相对低的水平。可以提供葡聚糖来源的其他酵母包括啤酒酵母，假丝酵母属（Candida sp.）如白假丝酵母（Candidaalbicans）、Candida cloacae、热带假死酵母（Candida tropicalis）、产朊假丝酵母（Candida utilis），汉森酵母属（Hansenula sp.）如温奇汉森酵母（Hansenula wingei）、阿尼汉森酵母（Hansenula arni）、Hansenula henricii和美洲汉森酵母（Hansenula americana），组织胞浆菌属（Histoplasma sp.），克勒克酵母属（Kloeckera sp.），克鲁维酵母属（Kluyveromyces sp.）如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）、多孔克鲁维酵母（Kluyveromyces polysporus），毕赤酵母属（Pichia sp.），红酵母属（Rhodotorula sp.），酵母属（Saccharomyces sp.）如德尔布酵母（Saccharomyces delbruekii）、罗斯酵母（Saccharomyces rosei）、（Saccharomyces microellipsodes）、卡尔斯伯酵母（Saccharomycescarlsbergensis）或不同的酵母菌株如酿酒酵母R4（NRRL Y-15903）和R4Ad（ATCC No.74181），裂褶菌属（Schizophyllum sp.），裂殖酵母属（Schizosaccharomyces sp.）如栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），色串孢属（Torula sp.）和球拟酵母属（Torulopsis sp.）。

然而，本发明的凝胶葡聚糖可以衍生自其他适合的来源，例如细菌、真菌或谷物葡聚糖。各种葡聚糖的治疗活性在本领域充分记载，并且本发明方法一般可用于增强葡聚糖的活性，特别是在葡聚糖产品的物理形式和分子间结构被发明人显示为特别重要的伤口愈合中。不希望受理论束缚，经验法则是根据本发明使用的葡聚糖基于单链计的重均摩尔质量越高，可以产生越有效的葡聚糖凝胶。

本发明的葡聚糖凝胶的侧链通常包括2个或多个β（1,3）连接的葡糖基单元。根据本发明，与主链连接的单一分子不被视为“侧链”。

本发明的葡聚糖优选具有β（1,3）连接的葡糖基单元的侧链，即由或基本上由β（1,3）连接的葡糖基单元组成。除了β（1,3）连接的侧链，葡聚糖还可以具有一个或多个β（1,6）连接的侧链。通过改变结构的链，可能改变最终产品的特征。存在许多改变葡聚糖的不同方式，包括酶处理、使用酸如甲酸或盐酸或不同的碱基以及通过其他方式。优选的葡聚糖是已经通过酸（例如甲酸）或酶或任何其他适合的方法处理以显著减少或消除葡聚糖内重复的（1,6）-连接的葡萄糖分子数目的那些。这些（1,6）-连接的葡糖基部分将正常存在于衍生自酵母的β-葡聚糖的侧链。得到的葡聚糖具有β（1,3）主链和通过单个β（1,6）键合与之连接的β（1,3）侧链，其通过消除处理而被切掉。

优选的葡聚糖基本上不含重复的β（1,6）连接的葡糖基残基。在分支点（β（1,3,6）-分支点）处的单个（1,6）键合不提供“重复的”β（1,6）连接的葡糖基单元。“基本上不含”意思是小于总葡糖基单元的6%、优选小于4%和最优选小于3%。

一些处理，例如酶处理，可能使侧链中最多4个β-1,6-连接的、但通常2个β1,6连接的葡糖基单元保持未切割。这样分子也是“基本上不含”重复的β1,6-连接的葡糖基单元。

本发明优选葡聚糖内键合的分布可以表示如下：

连接的葡糖基残基的类型	%
		β(1,3)	80-98
β(1,6)	0-6
		β(1，3，6)	1-8
末端	0，01-6

β（1,3,6）指在骨架中（1,3）连接并且参与（1,6）连接以提供侧链的分支点残基。

本发明的葡聚糖的形式可以是单一提取的级分或者具有不同的平均分子量的两种或多种不同的级分。

葡聚糖在化学修饰基团方面是未衍生化的。

本发明的葡聚糖由新方法产生。本发明人发现，通过进行特定的加热和冷却步骤，获得了具有与其他类似的葡聚糖产品相比改善的活性的新凝胶葡聚糖产品。通过这样做，将产生不具有“退火的”β-葡聚糖链的典型三螺旋结构的高度随机组织的“稻草堆”凝胶。惊人地，发现该类型凝胶结构作为免疫调节剂比三螺旋构型或多螺旋构型的经典组织化可溶性β-葡聚糖明显更有效。根据该加热和冷却步骤，溶解的β-葡聚糖制品被赋予能量以破坏现有的高级结构并诱导具有大比例（例如>40%，优选>50%，更优选>60%或>70%）的自由单链分子的随机组织。

通过根据本发明的快速冷却，通过快速建立分子间相互作用而将分子“冷冻”成新的分子构型，其中产品不主要形成三螺旋结构。因此，分子以更随机的分子位置冷冻，产生新的分子间组织。然后，该超分子组织导致凝胶形式的最终产品。惊人地，这些新产品与没有经历该处理的那些产品或者没有此类凝胶结构的产品相比，具有明显更好的作为免疫调节剂的效力特征。

因此，在进一步方面，本发明提供了产生如上定义的凝胶葡聚糖产品的方法，其中将葡聚糖分子的水溶液加热至120-130℃、优选120-125℃的温度，并在该温度保持10-30分钟，然后将葡聚糖溶液在不超过80分钟、优选小于60分钟、例如50-60分钟内冷却至35-50℃、优选35-40℃的温度。

上述冷却的持续时间基于其中220升葡聚糖分子的水溶液用作起始材料的商业化方法。要理解，如果使用更小体积，则冷却步骤的持续时间可以比上述方法更短，例如小于50分钟，例如20至50分钟。

加热优选在分离且搅拌的罐中进行，所述灌足够大以容纳整批产品，具有夹套或类似结构以能够实现罐外部的加热。批大小、加热系统的容量、罐的体积表面比和搅拌器的效果应该以如下方式平衡：整批可以在合理时间段内被加热至指定的温度，同时保证整批的均匀加热。可选地，供能步骤可以在产品填充入其最终容器之后发生，通过在高压处理器中加热或者通过可选的供能形式，例如超声或微波。

因此在进一步方面，本发明提供了产生如上定义的凝胶葡聚糖产品的方法，其中葡聚糖分子水溶液用能源处理以破坏葡聚糖链之间的高级结构，然后处理以允许分子间相互作用的快速重建。与加热一样，适合的能源包括超声和微波。在超声和微波的情况下，仅仅停止暴露于超声或微波可能足以允许分子间相互作用的快速重建。

如果已经在罐中对整批进行了供能步骤，则主动冷却优选在相同罐中进行，并且将需要利用罐夹套冷却罐表面的能力。同样，批大小、冷却系统的容量、罐的体积表面比和搅拌器的效果应该被平衡以允许冷却在指定时间内发生，同时保证整批的均匀冷却。这种初始冷却之后应该是产品填充入最终容器，随后冷却容器至室温。优选地，冷却步骤在加热步骤开始后立即进行，即，在葡聚糖在升高的温度下保持10-30分钟后立即进行（目前为止对于涉及设备是实用的）。

在工业化方法中进行加热和冷却步骤的适合程序描述于实施例1。

如果已经在最终容器中进行了供能步骤，这些容器应该在上述时间范围内被冷却至室温。

上述加热和冷却步骤可以被例如再次重复。

在加热和快速冷却步骤之前水溶液中葡聚糖的浓度优选是1.5-6%、更优选2至4%、最优选约2%。优选地，葡聚糖凝胶中葡聚糖的浓度是约2%，例如1.8%至2.2%。因此，优选地，在加热和快速冷却步骤之前水溶液中葡聚糖的浓度也是约2%。本发明方法不排除其中额外的剂或材料被添加至溶液的进一步步骤的存在。如果进行这样的步骤，则它们可以增加水溶液的体积，并因此降低溶液中葡聚糖的浓度。然而，优选地，溶液体积不显著变化，使得葡聚糖在起始产品和终产品中的浓度大致相等。当然，技术人员将理解，如果需要，可以在起始产品中使用更高浓度的葡聚糖，使得在额外步骤中剂或材料的添加导致最终产品中精确的、所需的葡聚糖浓度。技术人员能够计算起始产品中适当的葡聚糖浓度和要添加以实现所得凝胶产品中所需葡聚糖浓度的剂和材料的适当体积。

上述加热和冷却步骤可以对葡聚糖分子的任何水溶液进行；优选的葡聚糖，包括具有修饰分支的葡聚糖，在上文讨论，并且葡聚糖溶液优选是酵母葡聚糖溶液。起始溶液中葡聚糖的重均摩尔质量（M_w）优选以单链基础计优选是高的，溶液中葡聚糖的重均摩尔质量高于15,000、更优选高于20,000、最优选高于25,000g/mol。测定这些质量值的适当方法在上文给出。

葡聚糖一般以微粒形式从其来源材料（例如，真菌、酵母或谷物）提取，但是从微粒葡聚糖产生可溶性形式的方法是本领域已知的，并且包括酸或碱处理，例如WO95/30022中描述的甲醛分解步骤。来自谷物如大麦的可溶性葡聚糖产品可获自Sigma Chemical。根据本发明，例如可以通过WO95/30022的实施例1中的方案制备的微粒起始材料将优选通过在甲酸中加热至少两小时而被溶解。对微粒葡聚糖起始材料进行的甲醛分解可以常规地引起任何β（1,6）连接的葡糖基侧链的选择性去除以及溶解微粒葡聚糖。

本发明方法还优选包括在上述加热和快速冷却步骤之前的初步加热步骤，其中甲酸处理的产品沸腾（>100℃）至少30分钟。在产品冷却之后，其优选通过本领域已知的常规方法、例如通过离心或过滤处理以去除微粒材料。

被处理以产生用于根据本发明加工的可溶形式的微粒葡聚糖优选衍生自细胞壁、特别是酵母细胞壁，其已经例如通过洗涤去除了蛋白组分和其他残余物如甘露糖和壳多糖。

适合的微粒酵母葡聚糖产品的一个实例由Biotec Pharmacon ASA生产，其衍生自面包酵母（酿酒酵母）并被称为

。微粒葡聚糖原材料的另一实例是全葡聚糖颗粒如产品Imprime WGP^TM。是天然的未衍生的（就化学修饰基团而言）微粒β（1,3）/（1,6）葡聚糖，通过NMR和化学分析表征为由含有β-1,3和β-1,6-连接的D-葡萄糖的侧链的β-1,3-连接的D-葡萄糖的聚合物组成。

本发明的优选凝胶产品的视觉外观是坚硬、不透明且带白色的，对其他表面具有高粘附能力。

在进一步的方面，本发明提供了通过前述方法的任何一种获得或可获得的葡聚糖产品。

本发明的葡聚糖是有效的治疗剂，并且在进一步的方面，本发明提供了用于治疗，特别是用于治疗其中受试者需要系统或局部增强免疫应答、例如其中存在组织损伤或感染的病症的本文描述的葡聚糖。葡聚糖在辅助伤口或溃疡愈合和治疗口腔粘膜炎和癌症或减少肿瘤大小中具有特别效用。

因此，在进一步的方面，本发明提供了在有相应需要的受试者中辅助伤口或溃疡愈合或治疗口腔粘膜炎的方法，该方法包括给所述受试者施用本文描述的本发明葡聚糖。

提及“辅助”伤口或溃疡愈合是因为一些伤口或溃疡会自然愈合，而其他伤口或溃疡可能不会自然愈合，但已经显示本发明的葡聚糖加速伤口和溃疡愈合。在一些情况下，愈合在无治疗的情况下可能不会令人满意地发生。需要愈合治疗的此类伤口的一个实例是糖尿病性足溃疡。在该适应症中，患者基于糖尿病的潜在原因而发展伤口。由于经常未治疗的潜在原因和这些伤口存在于患者足上的事实，这些溃疡不会自我愈合并且引起患者的巨大问题，通常结果是足的切除。

在进一步的方面，本发明提供了在受试者中治疗癌症或减少肿瘤大小的方法，该方法包括给所述受试者施用本文描述的本发明葡聚糖。优选地，口服施用葡聚糖。优选地，葡聚糖以5至200mg/kg/天、更优选20至100mg/kg/天的剂量施用。

在进一步的方面，本发明还提供了药物组合物，包含如上定义的凝胶形式的葡聚糖和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体、优选水和任选一种或多种生理上可接受的稳定剂或其他稀释剂或载体。所述组合物可以常规配制成任何局部剂型。局部剂型可以是乳霜、洗剂、溶液、凝胶、软膏、糊剂、喷雾剂、膜等。

在一些变化形式中，本文描述的组合物是软膏形式。软膏基质可以是含油基质、可乳化基质、乳液基质或水溶性基质。在其他变化形式中，根据本发明的组合物是乳霜形式。乳霜可以是粘性液体或水包油或油包水的半固体乳液。乳霜基质可以是可水洗的，并且含有油相、乳化剂和水相。而在进一步的变化形式中，本发明的组合物是洗剂形式。洗剂可以被配制为固体的悬液，并且含有悬浮剂以产生更好的分散液。根据本发明的组合物还可以被配制为糊剂。糊剂是其中活性剂悬浮于适当基质中的半固体剂型。根据基质性质，糊剂分成脂肪糊剂或由单相水凝胶制成的那些。

在一些变化形式中，组合物在伤口表面形成膜。为了辅助膜形成，使用膜形成剂，例如但不限于丙烯酸及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物例如聚甲基丙烯酸丁酯和聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、卡波姆、巴西棕榈蜡、纤维素衍生物例如醋酞纤维素、rosca甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素和相关化合物、酞酸羟丙基甲基纤维素、酞酸羟丙甲纤维素、鲸蜡醇及衍生物、微晶蜡、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氨酯、聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯酞酸酯、聚乙烯醇、硅酮橡胶和衍生物、紫胶、甘油三酸酯衍生物及其组合。

组合物还可以包括至少一种膜增塑剂，其可以用于软化由膜形成剂形成的聚合物膜，使得它足够柔韧以随应用机体区域移动，而不破裂或剥离。

在一些变化形式中，组合物可以在应用至伤口之前被流延成膜，或者直接应用至伤口，其中组合物原位聚合。“铺展”膜当应用至皮肤时聚合，并且可以作为来自管的乳霜或软膏、滚涂和喷雾等递送。可以通过将硅酮橡胶加入外相而产生膜。在与外相混合后，允许得到的乳液固化并提供“铺展”膜，其当应用至伤口时聚合。乳液可以铺展在基底上以达到所需的厚度。

在其他情况下，组合物可以预先形成层或贴片。贴片可以具有各种厚度。贴片还可以被切割以具有一般符合伤口边缘的形状。

在一些变化形式中，贴片可以包括药学可接受的粘合剂材料，其用于将贴片固定于伤口或皮肤。还可以包括贴片支持层。

当作为喷雾剂使用时，根据本发明的组合物可以包括至少一种有机溶剂。

组合物可以直接置于伤口上，或者置于应用于伤口上的基底上。任何基底（载体）可用于本文描述的组合物。例如，可以使用织造、非织造、编织、泡沫和粘合剂基底。还可以使用吸收或非吸收基底。在一些变化形式中，组合物被喷洒或铺展于基底上。在其他变化形式中，组合物被浸渍在基底内。

伤口敷料可以被应用任何适当的时间段。例如，它们可以经一天的时段、经数日、经数周或者数月或更长的时段来应用。一般而言，伤口敷料被重复应用，直至伤口愈合。用本文描述的敷料治疗伤口的持续时间可以取决于如下因素：待治疗的伤口类型、伤口位置和被应用的组合物的形式。根据使用的形式，组合物可以从伤口用水去除，或者擦除或剥离。

本文描述的组合物可用于治疗由任何病因导致的伤口。例如，伤口可以是由于烧伤、感染、局部缺血、淋巴水肿、赘生物、神经病变、放射损伤、外科手术、静脉机能不全和外伤。本发明组合物在辅助伤口或溃疡愈合中具有特别效用。

本发明还提供了物理支持体，例如已经应用了（包括浸渍其中）本文定义的本发明葡聚糖的用于医疗用途的任何医疗装置或材料。

这种β葡聚糖的一个重要特征是其持水量和即使在缺乏可能促进凝胶愈合的条件如非中性pH或阳离子下的凝胶形成特征。一些β-葡聚糖将在低如1%、但更通常在2-4%范围内的浓度下形成凝胶。来自如本文描述的一种酵母的可溶性β-葡聚糖在3-7的pH范围内以1-6%的浓度溶解于水溶液中时将形成触变和假塑性凝胶，不依赖阳离子的存在。

本发明组合物优选包含水溶液中1.5-6%β葡聚糖，更优选地，组合物包含水溶液中约2-5%葡聚糖。不同浓度的使用取决于目的和不同的施用方式。作为一般规则，在水溶液中浓度超过4-5%且不含其它稳定物质的上述酵母葡聚糖将得到由于其固体凝胶性质而难以生产的最终凝胶产品。

术语“伤口”和“溃疡”包括表面伤口、手术伤口、烧伤、开放性骨折、腿溃疡、口腔溃疡、糖尿病溃疡和褥疮溃疡。伤口可以作为损伤、手术或疾病的结果，但是全部以皮肤完整性缺失为特征，皮肤可以被撕裂、切割或穿孔，并且需要皮肤再生来封闭开口。已经显示本发明葡聚糖加速伤口闭合。如实施例所示，可以通过测量开放伤口的大小来容易地证明效力。

组合物优选地被局部应用，例如作为凝胶、透皮贴片、洗剂、软膏、乳霜等。组合物可以每天、更频繁或更不频繁地例如每天两次或每两天一次应用，并且持续如临床医师或者在一些情况下由患者或其他健康顾问决定的持续时间。治疗持续时间取决于伤口或溃疡的性质和严重度，进展一般通过目测检测而容易地确定。

局部施用包括口腔施用，并且用于递送至口腔粘膜的适合的凝胶、锭剂、糊剂、喷雾剂等是本领域已知的。

葡聚糖和含有葡聚糖的组合物在人药和兽药中具有效用。如本文使用的，术语“医疗”包括兽医应用和环境。人是优选的治疗受试者，但是可以被有效治疗的其他动物包括家畜和伴侣动物。

本发明的葡聚糖和含有本发明葡聚糖的组合物可应用于或加入物理/固体支持体，例如贴片、敷料、贴膏、绷带、膜、纱布等，其可应用于伤口或溃疡部位，并且这样的产品构成了本发明的进一步方面。

本发明的葡聚糖还在用于培养皮肤细胞系的体外应用中具有效用，例如用于皮肤移植物。因此，在进一步的方面，本发明提供了繁殖皮肤细胞的体外方法，该方法包括使皮肤细胞群与本文描述的本发明葡聚糖接触。

要理解，适用于本发明一个方面或实施方案的优选特征加以必要变更应用于所有方面和实施方案。

如实施例所示，本发明的葡聚糖作为抗癌剂和伤口愈合剂具有优良的体内效力。实施例还显示了本发明葡聚糖刺激在许多治疗环境中是相关的细胞因子生成的能力。实施例显示，本发明的优选葡聚糖触发了小鼠腹膜巨噬细胞中TNFα和CXCL2/MIP2α的表达。与凝胶多糖或LPS反应相比，TNFα的弱诱导还见于衍生自外周血单核细胞的人骨髓树突细胞。

优选的β葡聚糖对TNFα释放的效应是剂量依赖性的，并且似乎在过表达β葡聚糖受体dectin-1的RAW细胞系变体中高于某一阈值、例如2-4μg/ml的葡聚糖浓度时减少。TNFα和CXCL-2的中到低诱导对于本发明产品是特殊的。TNFα和CXCL-2都是伤口愈合的手段。鼠趋化因子CXCL2刺激细胞迁移和血管生成，并且可用作炎症肉芽组织中血管生成活性的替代标志。

本发明的优选葡聚糖不引发IP-10（CXCL-10）的强表达。IP-10是趋化细胞因子的α或半胱氨酸-X氨基酸-半胱氨酸（CXC）趋化因子家族的成员。在许多慢性人类炎性病症中已经检测到了高水平的IP-10表达，所述病症包括一种常见的炎性皮肤疾病，银屑病。患者一般已经显示出异常的伤口愈合反应，特征为更强烈的炎症期和延长且无组织的粒化期，具有受损血管形成。本发明的葡聚糖不应该增强人类树突细胞的LPS诱导的IP10表达，并且优选地抑制从db/db小鼠收获的巨噬细胞的LPS诱导的IP10表达。这表明，根据本发明的优选葡聚糖开启了伤口愈合过程的有益要素，同时它们关闭了导致延长愈合期的抑制剂。

此外，实施例显示了本发明凝胶葡聚糖激活补体系统的能力，如通过末端补体复合物（TCC）的累积所证明的。

现在，在以下非限制性实施例和附图中进一步描述本发明，其中：

图1示例说明了许多批次的具有<2%重复β（1,6）连接的葡糖基单元的分支β（1,3）葡聚糖在含有0,5%LiCl的DMAc中分析的SEC-MALS-RI色谱图，假定dn/dc=0.12。如可以看到的，分子量分布以单链水平计在大约10,000g/mol至大约200,000g/mol的范围内。

图2显示在水性缓冲液（0,1M NaNO₃）中分析的许多批次的葡聚糖产品的SEC-MALS-RI色谱图，假定dn/dc=0.15。如可以看到的，分子量分布在大约10,000g/mol至高于10,000,000g/mol的范围内。水性SEC-MALS-RI结果与在DMAc/LiCl中的结果组合显示，葡聚糖作为聚集体在水溶液中存在。

图3显示了储能模量G’（Pa），针对根据本发明的葡聚糖凝胶的温度绘制。通过使用Stresstech HR流变仪的小应变振动测量和一下温度扫描获得数据：以1/3℃/min的速率70至10℃，在10℃保持2h，然后以1/3℃/min的速率10至70℃。基于当递增温度曲线平稳时（G’≈0Pa），测定该凝胶（凝胶至溶胶）的熔化温度为大约33℃。

图4显示使用升-降速率斜坡方法的根据本发明的2%葡聚糖凝胶的粘度测量。在30℃获得数据，在第一次测量之前以2rpm的平衡时间3min和之后以每个连续速度测量之前30sec平衡。在Brookfield EngineeringInc的Rheocalc软件中从IPC Paste模型计算的10rpm粘度是1772cP。

图5描述了从在200μg/ml本发明葡聚糖凝胶、凝胶多糖或LPS存在下培养的外周血单核细胞衍生的人骨髓树突细胞的TNF-α的释放。使用商业可获得的ELISA试剂盒在刺激后24h测量培养基上清液中的细胞因子。

图6示例说明了从在200μg/ml本发明葡聚糖凝胶、凝胶多糖或LPS存在下培养的外周血单核细胞衍生的人骨髓树突细胞的CXCL10（IP10）的释放。使用商业可获得的ELISA试剂盒在刺激后24h测量培养基上清液中的趋化因子。

图7显示了从由LPS和本发明葡聚糖凝胶体外共刺激的db/db小鼠收获的巨噬细胞的CXCL-10的分泌。泳道1；单独LPS，泳道2；LPS+20μg/ml本发明葡聚糖凝胶，泳道3；LPS+2μg/ml本发明葡聚糖凝胶。*p<0,05.*p<0,01

图8显示了使用在水溶液2%和4%浓度的根据本发明的葡聚糖凝胶与具有已知效力特征的生长因子混合物相比的伤口愈合实验的结果。使用敷料+水作为媒介物对照。2%和4%浓度都是有效的，4%更有效，但不如GF混合物有效。

图9显示通过不同批次β-葡聚糖的补体激活。测量了人类血清中流体相末端补体复合物的累积。241-7、231-0、411-8、391-8是代表本发明葡聚糖的凝胶形式的β-葡聚糖。VLMSG代表可溶性β-葡聚糖的非补体激活的制剂，其不是凝胶形式。水平虚线代表人类血清中自发的补体激活。

图10显示从过表达dectin-1的RAW细胞系变体的TNFα分泌。可溶性酵母β葡聚糖421-4代表本发明的葡聚糖，而161194、30395、xx0995和51196是澄清的非胶凝变体。

图11显示如实施例1所述经受加热和快速冷却（HC）的可溶性葡聚糖（SG）在过表达dectin-1的RAW细胞系中的生物效应。GC065rn9270是如表1所描述的具有破裂凝胶的可溶性葡聚糖产品。根据实施例1的治疗拯救了破裂产品的生物效应。

图12显示如实施例1所述经受加热和快速冷却（HC）的可溶性葡聚糖（SG）在过表达dectin-1的RAW细胞系中的生物效应。421-4是对应于如表1中软凝胶所述的产品的SG产品。根据实施例1的治疗增强了SG批次421-4的生物效应。

实施例

实施例1

本发明的凝胶葡聚糖产品的制备

如下所述处理1.5至2%酵母葡聚糖分子的水溶液。通过甲醛分解以选择性去除β-1,6侧链并随后纯化和渗滤以从甲醛分解溶液去除微粒物质和低分子量组分，从微粒葡聚糖制品制备该水溶液。适合的甲醛分解步骤公开于EP0759089B1的实施例3。通过用碱、乙醇和水单独萃取而从面包酵母（啤酒酵母）细胞壁制备微粒葡聚糖本身，每次提取之后伴随适当的干燥（喷雾干燥和真空干燥）。

a.热处理

调节葡聚糖浓度之后进行热处理，一般在封闭且搅拌的800升罐中在大约60℃的温度下产生大约220升的产品体积，通过将蒸汽引入罐周围的夹套而加热罐。

产品被缓慢加热至大约105℃以确保整批的平均加热，然后更快速地加热至123℃。从60至123℃的正常加热时间是40–50分钟。然后使产品在123–125℃保持20分钟。

b.主动冷却：

然后开始主动冷却。通过直接开放和关闭手动阀来人工操作。首先，从夹套小心抽空蒸汽以排放，排放阀保持开放。然后将冷却水小心引入夹套，开始时缓慢地以避免对罐的钢体产生过度热应力。随着温度下降，增加水流。正常继续冷却，直至产品温度达到35–40℃。从123至40℃的正常冷却时间是50–60分钟。

实施例2

小鼠模型中的体内伤口愈合

通过在糖尿病（db/db）小鼠模型（即BKS.Cg-m Dock7^m+/+Lepr^db/J小鼠）中分析全层切除皮肤伤口的修复来考察测试葡聚糖和对照对伤口愈合的影响。适应后（5-7天，无干扰），根据Home Office法规和糖尿病动物的特定要求，分组圈养动物，每组5只动物。实验受伤之后，将动物圈养于个体笼子（笼子尺寸35x15x15cm，具有锯末底层，每两天更换一次），环境保持在23°C的环境温度，12小时明/暗循环。小鼠被自由供给食物（标准啮齿类动物饮食）和水。在所有麻醉事件之后，将动物置于温暖环境并监测，直至它们从程序完全恢复。所有动物在手术后接受适当镇痛药（丁丙诺啡叔丁啡）和如需要的其他镇痛药。所有动物程序在HomeOffice许可的机构中进行，Home Office许可证（PCD:50/2505;PPL:40/3300;PIL:50/3482;PIL:70/4934）。在整个研究期间，每天监测动物健康。

在第0天，麻醉动物（异氟烷&空气），并且背部剃毛并用盐水浸泡的纱布清洁。在每个实验动物的左背侧皮肤中产生单个标准化的全层伤口（10.0mm x10.0mm）。随后用透明膜敷料Bioclusive^TM（Systagenix WoundManagement,UK）的圆周条带包扎所有治疗组中的伤口；之后它们通过使用29号针头经由Bioclusive膜注射50μl纯水中的2%溶液而接受葡聚糖或对照。使用适当软件将糖尿病动物随机分入治疗方案之一。对于接受葡聚糖的实验组，在受伤后第2、4和6天再次应用治疗。这些动物中的伤口部位被密切监测应用剂的过度累积和过度的伤口部位水化；如果过度应用的剂累积/水化明显，在再次应用之前通过抽吸去除之前应用的材料。对于阳性对照组，每天重复应用治疗，直至受伤后第6天，该组中的伤口接受总共7次生长因子组合治疗的应用。在受伤后第4、8和12天，所有动物被再次麻醉，去除它们的膜敷料和任何游离碎片，使用盐水浸泡的无菌纱布清洁它们的伤口。在第4和8天照相之后，如上使用Bioclusive膜敷料再次包扎伤口。愈合被测定为相对于第0天伤口大小的伤口闭合。

结果显示于以下表1和图8。

表1

糖尿病小鼠中的伤口治疗

软凝胶葡聚糖产品和固体凝胶葡聚糖产品都是通过本发明方法制备的酵母衍生的葡聚糖。两者是已经用甲酸处理以去除天然酵母葡聚糖侧链中存在的β（1,6）连接的葡糖基单元的酵母衍生的葡聚糖。已经使用本文描述的新的加热和快速冷却方案制备了固体和软凝胶葡聚糖（实施例1）。惊人地，固体凝胶（4%产品）证明了与软凝胶葡聚糖产品（2%产品）相比增强的伤口愈合活性。

“破碎的凝胶产品”描述了酵母衍生的葡聚糖产品，其中凝胶中分子的（分子内）构象已经通过暴露于干扰氢键的剂而在很大程度上被破坏。该葡聚糖不能发挥与本发明凝胶产品相比类似的有益效力/愈合特征。该结果清楚显示，根据本发明的葡聚糖的凝胶结构对于体内效力而言是惊人重要的性质。

结果清楚显示，根据本发明生产的葡聚糖凝胶的使用在伤口治疗模型中引发了与递送媒介物和阴性对照相比更有效的响应。“破碎的凝胶”产品产生较差结果的事实也意味着完整凝胶结构或葡聚糖凝胶内特定高级构象存在的必要性。

实施例3

摩尔质量的测定

使用如之前说明书中定义的尺寸排阻色谱测定了一系列酵母葡聚糖产品的摩尔质量。使用葡聚糖水溶液进行实验，因此得出葡聚糖样品中葡聚糖聚集体而非单链基础上的摩尔质量值。测试了5个葡聚糖样品，全部衍生自酵母并且全部已经消除了它们的β（1,6）连接的侧链。4个样品是溶液，并且第5个样品是根据本发明的凝胶葡聚糖（根据实施例1制备）。

水溶液中四种葡聚糖的计算的平均摩尔质量范围1.0-3.74x10⁵g/mol。

本发明葡聚糖具有8x10⁵g/mol的平均摩尔质量。

在其他实验中，本发明的葡聚糖具有范围5-15x10⁵g/mol的摩尔质量。

实施例4

熔点的测定

根据本发明生产的葡聚糖凝胶的熔点的测定如说明书所述进行，结果显示于图3。

实施例5

粘度测量

根据本发明生产的葡聚糖凝胶（根据实施例1制备）的粘度的测定如说明书所述进行，结果显示于图4。

实施例6

生物活性

各自根据实施例1制备为不同批次的本发明凝胶葡聚糖对TNFα和CXCL-2和-10释放的效应在本文描述并显示于附图。

此外，测量了β葡聚糖激活补体系统的能力。补体系统由一系列血清蛋白组成。该系统是先天免疫系统的一部分，并且在感染或检测病原体相关分子模式时被激活。该系统的激活导致补体蛋白裂解的级联，其最终导致末端补体复合物（TCC）的形成。TCC的累积可以通过使用单克隆抗体检测新表位来测量，并且可以因此用作补体激活的指示。

葡聚糖在人类血清中稀释（1:10）至100μl的体积。混合物在37℃孵育30min，然后在使用商业可获得的针对人TCC的ELISA-检测试剂盒一式三份测定流体相TCC的相对量之前在PBS中稀释1:5。结果显示于图9。

凝胶形式的本发明的可溶性β-葡聚糖激活了人类血清中的补体系统。然而，补体激活不是可溶性β-葡聚糖的共同特征，如图9中VLMSG所示例。VLMSG的分子量范围从10³至约5x10⁶g/mol，平均值1,3x10⁴g/mol，并且产生澄清溶液。

证明了根据实施例1制备的本发明的形成凝胶的可溶性酵母β葡聚糖刺激了TNFα从过表达dectin-1的RAW细胞释放，而非胶凝的、澄清的可溶性酵母β葡聚糖变体明显以低得多的程度产生这种刺激（图10）。

Claims

1.一种葡聚糖，所述葡聚糖具有以单链基础计15,000至50,000g/mol的重均摩尔质量和在水溶液中以聚集体基础计4至20x10⁵g/mol的重均摩尔质量，并且在25℃和中性pH下以浓度≥1%的水溶液凝胶形式存在，并且当所述葡聚糖以2%的浓度溶解于水中时具有30至44℃的熔化温度（凝胶至溶胶）。

2.如权利要求1所述的葡聚糖，所述葡聚糖具有以单链基础计20,000至40,000g/mol的重均摩尔质量。

3.如权利要求1或权利要求2所述的葡聚糖，所述葡聚糖具有以单链基础计25,000至30,000g/mol的重均摩尔质量。

4.如权利要求1至3任一项所述的葡聚糖，其中所述葡聚糖以浓度约2%在水溶液中。

5.如权利要求1至4任一项所述的葡聚糖，所述葡聚糖衍生自酵母。

6.如权利要求5所述的葡聚糖，所述葡聚糖衍生自酿酒酵母。

7.如权利要求1至6任一项所述的葡聚糖，所述葡聚糖是包括β-（1,3）-连接的葡糖基残基的骨架和包括2个或多个β-（1,3）-连接的葡糖基残基的侧链的β葡聚糖，所述侧链通过β-（1,6）-键合连接至所述骨架。

8.如权利要求1至7任一项所述的葡聚糖，所述葡聚糖基本不含重复的β（1,6）连接的葡糖基残基。

9.一种包含在水溶液中浓度为1至6%的葡聚糖的凝胶葡聚糖产品，所述葡聚糖具有以聚集体基础计4至20x10⁵g/mol的重均摩尔质量和以单链基础计15,000至50,000g/mol的重均摩尔质量，所述凝胶葡聚糖产品具有30至44℃的熔化温度（凝胶至溶胶）。

10.一种生产如任一项前述权利要求所述的葡聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：

a）加热葡聚糖分子的水溶液至120℃至130℃的温度，并使所述溶液在该温度保持10至30分钟；和

b）在小于80分钟的时段内冷却所述葡聚糖溶液至35℃至50℃的温度。

11.如权利要求10所述的方法，其中在步骤a）中，所述葡聚糖分子的水溶液被加热至120℃至125℃的温度。

12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中在步骤a）中，所述葡聚糖在120℃至125℃或120℃至130℃的温度下保持约20分钟。

13.如权利要求10至12任一项所述的方法，其中所述葡聚糖在50至60分钟的时段内被冷却。

14.如权利要求10至14任一项所述的方法，所述方法之前存在甲醛分解步骤，其中微粒葡聚糖起始材料悬浮于甲酸中以去除β-（1,6）连接的葡糖基侧链,并增加所述微粒葡聚糖的溶解度。

15.如权利要求14所述的方法，其中被甲醛分解的产品通过约0.2μ的网目过滤。

16.一种可通过如权利要求10至15任一项所述的方法获得的葡聚糖。

17.一种药物组合物，包含如权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。

18.用于治疗的如权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖。

19.用于辅助伤口或溃疡愈合的如权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖。

20.如权利要求18或权利要求19所述用途的葡聚糖，其中所述葡聚糖被局部应用于受试者。

21.一种在有相应需要的受试者中辅助伤口或溃疡愈合或治疗口腔粘膜炎或癌症的方法，该方法包括给所述受试者施用如权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖。

22.如权利要求18至21任一项所述用途或方法的葡聚糖，其中所述溃疡是糖尿病溃疡。

23.用于治疗口腔粘膜炎或癌症的如权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖。

24.一种对其应用了或其中浸渍了如权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖的物理支持体。

25.如权利要求24所述的物理支持体，选自由以下组成的组：织造、非织造、编织、泡沫或粘合剂基底；贴片、敷料、贴膏、绷带、膜或纱布。

26.一种体外增殖皮肤细胞的方法，所述方法包括使皮肤细胞群与权利要求1至9或16任一项所述的葡聚糖接触。