CN103323410A - 一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置和方法，装置包括光源、镜筒、样品台、荧光成像用CCD、支架、计算机、显微物镜、用于对通过显微物镜放大显示后形成的图像进行滤波的LCTF和成像透镜组件，光源根据入射方式不同设置在相应位置，镜筒固定在支架上，样品台设置在支架底座上，CCD设置在镜筒一端，并与计算机相连，CCD、镜筒、成像透镜组件、LCTF、显微物镜位于同一光轴上，样品放置在显微物镜正下方的样品台上，LCTF与计算机相连。方法是通过显微物镜将样品进行放大，通过控制液晶滤波器件的扫描范围及扫描步长获得在某一波段内各个波长下样品被放大部分的成像。本发明能够快速、准确地获得高质量的显微成像，放大倍数连续可调，适用性广。
Description
技术领域
本发明涉及光谱分析及显微成像技术领域，特别涉及一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置和方法。
背景技术
物质对光产生的吸收、发射或散射的本质是光和物质的相互作用。研究这一个作用过程，即光强随频率的变化并绘制相应的曲线便可得到分子光谱。根据光辐射的波长范围和作用形式的不同，分子光谱可以分为紫外-可见光谱、荧光光谱、拉曼光谱、双光子荧光光谱、红外光谱等。不同的光谱可以为研究者提供分子内部不同信息。光谱检测技术具有灵敏度高和特异性好等特点，已成为现代检测技术中常用的方式之一，广泛应用于药物分析、食品卫生、环境检测、工农业、地质勘探和司法刑侦等领域。
如利用光谱学分析中药成分[赵静,庞其昌,马骥,刘传明,王琳,崔代军,孟庆霞,中药黄连黄柏混合粉末的光谱成像分析技术.光学学报,2010,3(11):3259-3263]。又如早在2003年澳大利亚的Claude Roux等就使用液晶可调波长滤光镜(LCTF)光谱成像装置进行了检验指印纹线的初步实验研究[Exline D L,Wallace C,Roux C,et al.Forensic applications of chemical imaging:latentfingerprint detection using visible absorption and luminescence[J],Forensic science.2003,48(5):1-7]。随着光电技术的进步，如光源、成像设备、检测设备等不断改进，光谱分析技术深入到了显微成像领域，并与生物及医学高度结合起来。如采用光谱分析的方法，对细胞的凋亡过程进行检测[National Human GenomeResearch Institute.NHGRI seeks next generation of sequencing technologies.http://www.genome.gov/12513210.2009,11,4],又如采用FT-IR显微光谱对大肠线癌作聚类分析[Peter Lascha,Wolfgang Haenschb,Dieter Naumannc,Max Diema,et al.Imaging of colorectal adenocarcinoma using FT-IR micro spectroscopy and clusteranalysis[J],Biochimica et Biophysica Acta.2004,1688:176-186],也有采用二次谐波及双光子荧光对动脉血管微观结构进行观测的相关报道[Aikaterini Zoumi,Xiao Lu,Ghassan S.Kassab,and Bruce J.Tromberg.Imaging Coronary ArteryMicrostructure Using Second-Harmonic and Two-Photon Fluorescence Microscopy[J],Biophysical Journal.2004,87:2778–2786]。光谱分析与显微成像的结合，发展了一系列新型的检测系统，拓展了生物医学的研究领域并深化了对许多微观组织的研究深度。
目前为了获得显微情况下的光谱图像，一般使用滤波片、棱镜和光栅光谱仪（单色仪）进行滤波，从而在成像的CCD上获得某一或某些波长下的图像。如Quest innovations公司生产的多光谱相机中，就有采用光学棱镜分光及滤光片轮滤波等形式，广泛用于遥感和显微成像中。采用滤波片或者棱镜进行滤波或者分光，所获得的光谱图像相对零散，只能够获得某几个特定光谱下的成像，而不能获得其完整的、较宽范围内的光谱特性。Specim公司推出的各种高光谱成像仪则是采用光栅光谱仪进行滤波，其波长波率范围长（根据不同类型，其滤波的波长跨度一般在500nm以上），精度高（光谱分辨率在10nm以下），但采用光栅光谱仪+CCD组合的高光谱成像仪，每次成像只是一个线状（一维），要获得整个样品的二维图像，需要对样品进行推扫并拍摄，最终进行图像拼接而成。这种办法使得在获取光谱图像的过程中不单需要对波长进行扫描，而且还要对样品进行推扫，成像时间长，而图像拼接也会产生额外的噪声，因此也有其不足之处。为了能够迅速、准确地获得二维的光谱图像及样品相应的光谱曲线，发展出了液晶滤波器件（LCTF）+CCD的模式。有关采用液晶滤波器件（LCTF）+CCD的模式获得光谱成像的报道不多，主要集中在宏观物体的光谱图像获取方面（Weilin Wang,Changying Li,Ernest W.Tollner,Glen C.Rains,Ronald D.Gitaitis，A liquid crystal tunable filter based shortwave infrared spectralimaging system:Design and integration[J],Computers and Electronics in Agriculture.2002,80:126-134），也有用此方式对血管中血液PH值和动力学反应进行检测的[Xiaoli Sun,Yaru Wang,Shangbin Chen,Weihua Luo,Pengcheng Li,Qingming Luo,Simultaneous monitoring of intracellular pH changes and hemodynamic responseduring cortical spreading depression by fluorescence-corrected multimodal opticalimaging[J],NeuroImage.2011,57:873-884]。但仍缺乏针对显微系统的整套LCTF+CCD系统。主要问题在于：首先，对于传统的显微光学系统来说，光谱显微系统中间需要增加许多光学原件，要在保证显微图像质量的情况下，同时获得光谱成像难度较大；其次，由于是显微成像，其成像区域非常小，即能够进入CCD的光很小，当光能量平均分配到CCD面上时，其面上的能量密度非常小，对于测量本来就比较微弱的荧光光谱信号、双光子荧光光谱信号、拉曼光谱信号等，其难度相当大。
因此，开发一种可以在显微系统下快速、准确获得光谱图像的方法及相关的设备系统，具有重大的科研意义和应用意义，对进一步拓展光谱分析在生物医学上的应用提供有力的支持。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，该装置能够快速、准确地获得高质量的显微成像，进行光谱拍摄时只需扫描光谱无须扫描样品，适用性广。
本发明还提供了一种基于上述显微光谱成像装置的显微光谱成像方法，该方法无需进行推扫及图像拼接，实时呈现二维图像，且能够直接在图像内对感兴趣点进行取点并获得该点的光谱曲线。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，包括光源、镜筒、样品台、荧光成像用CCD、支架和计算机，光源根据入射方式不同设置在相应位置，镜筒固定在支架上，样品台设置在支架底座上，荧光成像用CCD设置在镜筒一端，并与计算机相连，装置还包括显微物镜、用于对通过显微物镜放大显示后形成的图像进行滤波的液晶滤波器件（Liquid Crystal tunable filter,LCTF）、成像透镜组件，荧光成像用CCD、镜筒、成像透镜组件、液晶滤波器件、显微物镜位于同一光轴上，待检测样品放置在显微物镜正下方的样品台上，液晶滤波器件与计算机相连。
作为优选方案，所述光源为透射式光源，即光源设置在样品下面。
作为另一种优选方案，所述光源为同轴光源，同轴光源入射系统由同轴光输入孔、45度全反镜、显微物镜三部分组成，同轴光输入孔设置在液晶滤波器件、显微物镜之间垂直于光轴轴线方向的侧壁上，45度全反镜设置在光路中，45度全反镜与光轴保持45度夹角，光源从同轴光输入孔进入，被45度全反镜反射至显微物镜并通过聚焦后照射至样品，其中45度全反镜全反红外光及可见光。
优选的，所述成像透镜组件在镜筒中的位置可调。从而可以通过改变其在镜筒中的位置，改变样品在荧光成像用CCD里面的成像大小，即改变其放大倍数，使整个系统可以实现对样品的连续放大。
优选的，当进行红外光谱检测时采用滤波波段在红外的LCTF，当进行荧光光谱、双光子荧光光谱、拉曼光谱、吸收光谱检测时采用滤波波段在可见光的LCTF。
更进一步的，所述装置还包括防止用于激发荧光的紫外光进入液晶滤波器件的紫外滤光镜，该紫外滤光镜为高反紫外光增透可见光及红外光谱的UV镜，紫外滤光镜与显微物镜位于同一光轴上。从而避免紫外光损坏液晶滤波器件。
优选的，所述支架上有一位置可调的挂钩，镜筒通过固定螺丝固定在此挂钩上，同时该挂钩与支架相连处还设有一用于调整挂钩在垂直方向上的高度的Z轴微调旋钮。挂钩在支架上的位置可根据物镜至样品的距离进行粗调，然后通过Z轴微调旋钮进行微调。
作为优选，支架底座上设置有用于调节样品台在支架底座上水平方向位置的X轴微调旋钮和Y轴微调旋钮。从而可以在不移动样品台的情况下，通过这两个微调旋钮来调整样品被放大的部位。
优选的，所述荧光成像用CCD为用以测量红外光谱的红外CCD，或者用以测荧光光谱、双光子荧光光谱、拉曼光谱、吸收光谱的可见-红外CCD。
优选的，所述荧光成像用CCD采用无机械抖动的冷却方式。因为本发明中CCD要求是灵敏度高、能够探测到微弱光，如果采用风冷及水冷等具有机械抖动的冷却方式，CCD接收面阵列会受机械振动影响，导致成像透镜组件在其面上的成像不清晰，严重影响成像质量。
更进一步的，所述荧光成像用CCD采用液氮制冷的冷却方式。
优选的，所述显微物镜为消色差平场无穷远系统的显微物镜。可以为各种放大倍数的显微物镜。采用消色差的显微物镜可以获得更为准确的图像，采用无穷远系统是为了方便在显微物镜后添加各种光学元件，且取消了对镜筒长度的限制，使得可以随时更换不同的LCTF、不同的成像透镜组件以及不同的CCD。
一种基于上述显微光谱成像装置的显微光谱成像方法，通过显微物镜将样品进行放大，通过控制液晶滤波器件的扫描范围及扫描步长获得在某一波段内各个波长下样品被放大部分的成像。
具体包括以下步骤：
（1）根据需要测量的光谱特性，选择光源和入射方式；
（2）根据待检测样品的尺寸，选择适当放大倍数的显微物镜；调节成像透镜组件的位置，进一步确定放大倍数，最后调节显微物镜与样品距离，实现对焦；
（3）设定LCTF的波长扫描范围和扫描步长；
（4）LCTF开始扫描后，荧光成像用CCD在每个波长下拍照一次，直至扫描结束，CCD拍摄到所有波长下样品被放大部分的显微图像。
更进一步的，所述方法还包括以下步骤：
在荧光成像用CCD获得显微图像后，对该图像进行图像处理，包括降噪处理，并选取感兴趣点，绘制光谱图像以及归一化光谱图像，以及保存光谱图像和输出光谱信息，得到感兴趣点处的光谱特性。
具体的，所述步骤（1）中，需要测量吸收光谱，则使用宽光谱的白光光源，采用透射式入射方式；需要测量荧光光谱，则使用紫外光源，使用同轴光输入方式；需要测量拉曼光谱，采用532nm激光光源，采用同轴光输入方式；需要测量双光子荧光光谱，则采用红外激光光源，采用同轴光输入方式；需要测量红外光谱，则使用红光光源，采用同轴光输入方式或透射式入射方式均可。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、本发明通过控制液晶滤波器件的扫描范围及扫描步长能够同时获得显微成像及成像图像中任意位置的光谱曲线，能够快速、准确等获得高质量的显微成像，能够获得宽波段内，高精度（分辨率为1nm）的光谱显微图像。
2、本发明成像透镜组件的位置在镜筒中的位置可调，通过改变其上下位置，改变样品在CCD面的成像大小，即改变其放大倍数，使整个系统可以实现对样品的连续放大。
3、本发明进行光谱拍摄时只需扫描光谱无须扫描样品（二维成像），无需进行推扫及图像拼接，实时呈现二维图像。
4、本发明能够随意选取图像中感兴趣部分获得其光谱特性曲线，其适用性广，通过更换光源可以实现对微细组织进行荧光光谱测量、双光子荧光光谱测量、拉曼光谱测量、红外光谱测量及吸收光谱测量等。
附图说明
图1为本发明装置的结构示意图。
图2为本发明实施例采用的显微物镜结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
如图1所示，本实施例一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，包括荧光成像用CCD1、镜筒与CCD链接头2、固定螺丝3、镜筒4、成像透镜组件5、液晶滤波器件6、紫外滤光镜7、同轴光输入孔8、45度全反镜9、显微物镜10、X轴微调旋钮11、样品台12、Z轴微调旋钮13、Y轴微调旋钮14和支架15，本实施例所述装置包括了同轴入射的端口，因此光源可以为同轴光源，同时也可以将光源设置在样品下面，从而光源为透射式光源。所述的荧光成像用CCD1、镜筒与CCD链接头2、镜筒4、成像透镜组件5、液晶滤波器件6、紫外滤光镜7、显微物镜10位于同一光轴上，45度全反镜9与光轴保持45度夹角，同轴光输入孔8与光轴保持90度夹角。所述成像透镜组件5在镜筒4中的位置可调。
样品台12设置在支架15底座上，支架15底座上设置有用于调节样品台在支架底座上水平方向位置的X轴微调旋钮11和Y轴微调旋钮14。待检测样品放置在显微物镜10正下方的样品台12上，液晶滤波器件6与计算机相连。所述支架15上有一位置可调的挂钩16，镜筒4通过固定螺丝3固定在此挂钩16上，同时该挂钩16与支架15相连处还设有一用于调整挂钩在垂直方向上的高度的Z轴微调旋钮13。整个系统设计富有灵活性，在X、Y、Z三轴上均可调节，并着重通过设立由同轴光输入孔8、45度全反镜9组成的同轴光输入系统及通过镜筒4上下移动而大尺度可调的Z轴调节功能使系统光源可采用各种不同的入射方式（透射式或同轴式等）。
所述的光源可以是氪灯、氙灯等气体灯光源、激光光源、LED光源、紫外灯光源、可调谐光源等。根据不同需要可选择不同光源，同时采用恰当的入射方式。光源可以是宽光谱的白光，可以是可调谐的激光，可以是单波长的红外或者紫外激光，也可以是某一单色波长的光波，波长涉及紫外到红外波段。通过不同的光源，可以使系统获得不同的光谱成像。采用光谱带比较宽的气体灯，可以实现吸收光谱的测量，采用紫外灯或者紫外激光可以实现荧光光谱的测量，采用红外超短脉冲激光可以实现双光子荧光光谱的测量，采用532nm激光可以实现拉曼光谱的测量，采用波长调谐激光可以实现三维光谱的测量。
当进行红外光谱检测时采用滤波波段在红外的LCTF，当进行荧光光谱、双光子荧光光谱、拉曼光谱、吸收光谱检测时采用滤波波段在可见光的LCTF。
紫外滤光镜7是为了防止用于激发荧光的紫外光进入液晶滤波器件，具体为高反紫外光增透可见光及红外光谱的UV镜。
荧光成像用CCD1是具有高灵敏度，高分辨率，响应时间快等特点的CCD相机，通过镜筒与CCD链接头与镜筒连接，并与计算机相连，所述荧光成像用CCD为用以测量红外光谱的红外CCD，或者用以测荧光光谱、双光子荧光光谱、拉曼光谱、吸收光谱的可见-红外CCD。同时荧光成像用CCD采用液氮制冷的冷却方式。
所述显微物镜10为消色差平场无穷远系统的显微物镜。
一种基于上述显微光谱成像装置的显微光谱成像方法，通过显微物镜将样品进行放大，通过控制液晶滤波器件的扫描范围及扫描步长获得在某一波段内各个波长下样品被放大部分的成像。
具体包括以下步骤：
（1）根据需要测量的光谱特性，选择光源和入射方式；
（2）根据待检测样品的尺寸，选择适当放大倍数的显微物镜；调节成像透镜组件的位置，进一步确定放大倍数，最后调节显微物镜与样品距离，实现对焦；
（3）设定LCTF的波长扫描范围和扫描步长；
（4）LCTF开始扫描后，荧光成像用CCD在每个波长下拍照一次，直至扫描结束，CCD拍摄到所有波长下样品被放大部分的显微图像；
（5）在荧光成像用CCD获得显微图像后，对该图像进行图像处理，包括降噪处理，并选取感兴趣点，绘制光谱图像以及归一化光谱图像，以及保存光谱图像和输出光谱信息，得到感兴趣点处的光谱特性。
所述步骤（1）中，需要测量吸收光谱，则使用宽光谱的白光光源，采用透射式入射方式；需要测量荧光光谱，则使用紫外光源，使用同轴光输入方式；需要测量拉曼光谱，采用532nm激光光源，采用同轴光输入方式；需要测量双光子荧光光谱，则采用红外激光光源，采用同轴光输入方式；需要测量红外光谱，则使用红光光源，采用同轴光输入方式或透射式入射方式均可。
本实施例中，可通过计算机控制CCD的曝光时间、增益、白平衡等。使LCTF每改变一个透过率的同时，激发CCD进行拍照，在CCD进行拍照完成后，再激发LCTF改变透过率，如此循环直至波长扫描完成。
所述图像处理可对CCD所拍摄的图像进行降噪处理（包括图像平滑、图像边缘检测以及图像区域生长），并能通过鼠标在图片上选取感兴趣点并绘制光谱图像以及归一化光谱图像，以及保存光谱图像和输出光谱信息。
所述系统的运行机制如下：通过选择合适的光源及合适的入射方式将光直接作用到样品上激发出样品相应的光（或者吸收的光），通过显微物镜将样品某部分进行放大，其光线被整形为平行光束，该光束通过紫外滤光镜进入液晶滤波器件（LCTF），控制液晶滤波器件（LCTF）可将到达液晶滤波器件的光束（即被放大后的实像）中某一波长的光波过滤出来，此光波通过成像透镜组件入射到CCD阵列面上，从而获得样品被放大部分某一波长下的成像（灰度图像）。通过控制液晶滤波器件（LCTF）的扫描范围及扫描步长便可以获得在某一波段内各个波长下样品被放大部分的成像。由于样品所产生的光其每个波长强弱不一样，所以所成的像其灰度等级也不一样，不同灰度值代表着不同波长的强弱程度，通过图像处理将所有图像中某一点的灰度值依次取出来，便可以描绘出某个波段内样品图像中某一点的光谱曲线。实现了同时获得显微成像和样品的光谱特性的功能，且可以选择获取图像中任意点的光谱特性，使光谱分析更加实用和准确。
本实施例中所采用CCD采用广州明美提供的MC20系列CCD相机，其主要功能如下：
a)传感器（Sensor Type)：高灵敏度2/3"Sony ICX285Exview HAD CCD，彩色/黑白可选；
b)分辨率（Resolution)：1360x1024,，140万像素；
c)像素（Pixel Size）6.45μm x6.45μm；
d)像素混合模式（Binning Modes）2x2或4x4，彩色；
e)曝光控制（Exposure Control）0.5毫秒到40分钟，自动曝光；
f)制冷类型（Cooling Type）可选，深度四级制冷至-35度；
g)实时预览（Real-time Viewing）全幅实时预览速度25幅/秒；
h)帧频率（Frame Rate）全分辨率帧频15幅/秒；
i)数字界面（Digital Interface）Usb2.0接口；
j)快门控制（Shutter Control）电子快门（Electronic shutter）；
所采用的液晶滤波器件（LCTF）主要技术参如下：
a)光谱响应400nm－1100nm；
b)光谱分辨率～0.5nm；
c)空间分辨率：50线对/mm；
d)信噪比>40dB；
e)曝光时间60μs—2000ms；
所采用镜筒垂直有效行程为10mm<H<240mm，Z轴微调精度0.002mm，所采用聚焦透镜可使成像从0.7X到7X连续变倍，所采用底座其尺寸240X180X25(mm)带移动工作台，台面移动距离42X42(mm)，X、Y轴微调精度0.002mm，所采用的显微物镜为奥林巴斯的40倍放大消色差平场无穷远系统透镜，出射光为平行光束，方便后面光学原件的叠加，同时具有消色差功能以及平场防畸变功能，如图2所示，在此显微物镜中，总长度为48.79mm，齐焦距离为45.06mm，工作距离为0.6mm，通过φ0.800×36的RMS螺纹固定在镜筒上。本实施例采用高功率紫外激光（氩离子激光器）作为光源，并采用透射式入射方式。采用石英玻璃载玻片和盖玻片制作的红细胞标本作为样品（石英玻璃可以透紫外光）。
将紫外激光调至输出平均功率为20mW，经过一个焦距为50mm的双凸薄透镜聚焦后入射到样品，激发出其荧光，调节适当的焦距和放大倍数，获得清晰的显微成像，然后设置扫描波长为400nm至750nm，扫描步长为5nm，并启动扫描，扫描结束后即可获得红细胞在不同波长下的显微成像。在进行图像处理时，可选取细胞上任意一点为测量点，将在每个波长下拍摄的图片中取出该点的灰度值，以纵坐标为相对强度，以横坐标为波长，描绘出光谱曲线
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，其特征在于，包括光源、镜筒、样品台、荧光成像用CCD、支架和计算机，光源根据入射方式不同设置在相应位置，镜筒固定在支架上，样品台设置在支架底座上，荧光成像用CCD设置在镜筒一端，并与计算机相连，装置还包括显微物镜、用于对通过显微物镜放大显示后形成的图像进行滤波的液晶滤波器件、成像透镜组件，荧光成像用CCD、镜筒、成像透镜组件、液晶滤波器件、显微物镜位于同一光轴上，待检测样品放置在显微物镜正下方的样品台上，液晶滤波器件与计算机相连。
2.根据权利要求1所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，其特征在于，所述光源为透射式光源，即光源设置在样品下面。
3.根据权利要求1所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，其特征在于，所述光源为同轴光源，同轴光源入射系统由同轴光输入孔、45度全反镜、显微物镜三部分组成，同轴光输入孔设置在液晶滤波器件、显微物镜之间垂直于光轴轴线方向的侧壁上，45度全反镜设置在光路中，45度全反镜与光轴保持45度夹角，光源从同轴光输入孔进入，被45度全反镜反射至显微物镜并通过聚焦后照射至样品，其中45度全反镜全反红外光及可见光。
4.根据权利要求1所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，其特征在于，所述成像透镜组件在镜筒中的位置可调；
当进行红外光谱检测时采用滤波波段在红外的LCTF，当进行荧光光谱、双光子荧光光谱、拉曼光谱、吸收光谱检测时采用滤波波段在可见光的LCTF；
所述荧光成像用CCD为用以测量红外光谱的红外CCD，或者用以测荧光光谱、双光子荧光光谱、拉曼光谱、吸收光谱的可见-红外CCD；
所述荧光成像用CCD采用无机械抖动的冷却方式；
所述显微物镜为消色差平场无穷远系统的显微物镜。
5.根据权利要求4所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，其特征在于，所述装置还包括防止用于激发荧光的紫外光进入液晶滤波器件的紫外滤光镜，该紫外滤光镜为高反紫外光增透可见光及红外光谱的UV镜，紫外滤光镜与显微物镜位于同一光轴上；
所述荧光成像用CCD采用液氮制冷的冷却方式。
6.根据权利要求1所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置，其特征在于，所述支架上有一位置可调的挂钩，镜筒通过固定螺丝固定在此挂钩上，同时该挂钩与支架相连处还设有一用于调整挂钩在垂直方向上的高度的Z轴微调旋钮；
支架底座上设置有用于调节样品台在支架底座上水平方向位置的X轴微调旋钮和Y轴微调旋钮。
7.一种基于权利要求1所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像装置的显微光谱成像方法，其特征在于，通过显微物镜将样品进行放大，通过控制液晶滤波器件的扫描范围及扫描步长获得在某一波段内各个波长下样品被放大部分的成像。
8.根据权利要求7所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）根据需要测量的光谱特性，选择光源和入射方式；
（2）根据待检测样品的尺寸，选择适当放大倍数的显微物镜；调节成像透镜组件的位置，进一步确定放大倍数，最后调节显微物镜与样品距离，实现对焦；
（3）设定LCTF的波长扫描范围和扫描步长；
（4）LCTF开始扫描后，荧光成像用CCD在每个波长下拍照一次，直至扫描结束，CCD拍摄到所有波长下样品被放大部分的显微图像。
9.根据权利要求8所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像方法，其特征在于，还包括以下步骤：
在荧光成像用CCD获得显微图像后，对该图像进行图像处理，包括降噪处理，并选取感兴趣点，绘制光谱图像以及归一化光谱图像，以及保存光谱图像和输出光谱信息，得到感兴趣点处的光谱特性。
10.根据权利要求8所述的基于液晶滤波器件的显微光谱成像方法，其特征在于，所述步骤（1）中，需要测量吸收光谱，则使用宽光谱的白光光源，采用透射式入射方式；需要测量荧光光谱，则使用紫外光源，使用同轴光输入方式；需要测量拉曼光谱，采用532nm激光光源，采用同轴光输入方式；需要测量双光子荧光光谱，则采用红外激光光源，采用同轴光输入方式；需要测量红外光谱，则使用红光光源，采用同轴光输入方式或透射式入射方式均可。
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