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CN1032020C - 用乙醇酸制备乙醛酸的方法 - Google Patents

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CN1032020C CN90109451A CN90109451A CN1032020C CN 1032020 C CN1032020 C CN 1032020C CN 90109451 A CN90109451 A CN 90109451A CN 90109451 A CN90109451 A CN 90109451A CN 1032020 C CN1032020 C CN 1032020C
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Abstract

本发明是关于用乙醇酸的乙醇酸催化氧化制备乙醛酸的改进方法。本发明提供了通过提高起始底物的浓度和选择性物使用提高收率的添加剂制备乙醛酸的工业上实用的方法。

Description

用乙醇酸制备乙醛酸的方法
本发明是关于通过乙醇酸的乙醇酸氧化酶催化氧化制备乙醛酸的改进方法。虽然乙醇酸与氧的酶催化氧化反应已经发现许多年，但是上述方法由于一些原因在工业上没有优点。这些原因中最重要的是上述反应在乙醇酸高度稀释(一般浓度为40mM或更低)的条件下进行。乙醛酸的选择性和乙醛酸产物的产率通常是低的。使用很稀的起始乙醇酸浓度的缺点是必须用大而昂贵的反应设备以达到高产率。还由于乙醛酸通常以50％水溶液(Ullmans)销售，所以，浓缩用稀释的起始反应物生产的稀乙醛酸的费用是昂贵的。另外，如果用蒸发或反渗透进行上述浓缩，任何不挥发的副产物，例如草酸和甲酸和/或它们的盐，和未反应的乙醇酸会留在溶液中成为杂质。最后，如果反应中使用的比较昂贵的酶能比较有效地使用或比较有效的循环，并且不产生对环境有损害的废物，该方法是有利的。
本发明提供工业上实用的制备乙醛酸的方法，该方法包括用提高起始物质浓度和使用所选的提高产率的添加剂，进行乙醇酸的乙醇酸氧化酶的催化氧化。
本发明是用酶，即乙醇酸氧化酶作为反应的催化剂，用氧氧化乙醇酸制备乙醛酸的方法。
N.E.Tolhert等人在J.Biol.Chem.Vol.181，905—914(1949)中报导了从烟叶中提取的酶催化氧化乙醇酸，经过中间体乙醛酸将乙醇酸氧化成甲酸和CO2。他们还发现某些化合物如乙二胺能阻止中间体乙醛酸氧化成其它产物。氧化在PH约8、乙醇酸浓度约3—40mM(毫摩尔)的条件下进行，除了一个试验外(907页)，其余说明得很不够，其中乙醇酸的起始浓度大约132～196mM。关于该试验给出的仅有说明是乙醇酸的大约浓度，事实是氧化进行的不完全，一定量的乙醛酸的2，4—二硝基苯腙被离析出来。特别是关于产率和反应时间没说明。据报导乙醇酸氧化的最佳PH值是8.9。据报导草酸(100mM)能抑制乙醇酸氧化酶的催化作用。
I.Zelitch和S.Ochoa在J.Biol.Chem.，Vol.201，707～718(1953)中报导，在乙醇酸的乙醇酸氧化酶催化氧化中，甲酸和CO2的生成是由H2O2与乙醛酸非酶催化反应引起的，这些是乙醇酸的酶催化氧化的初产物。因此，他们观察到，加入过氧化氢酶，即一种催化H2O2分解的酶，由于抑制了甲酸和CO2的生成，显著地改善了乙醛酸的产率。他们使角的乙醇酸氧化酶是从菠菜叶中分离出来的。其在PH约8、起始的乙醇酸浓度为10mM时使用。他们还发现，加入FMN(黄素单核苷酸)显著地提高乙醇酸氧化酶的效率。
J.C.Robinson等人在J.Biol.Chem.，Vol.237，2001—2009(1962)中还报导，过氧化氢酶提高了由乙醇酸生成乙醛酸的产率。显然地，他们使用的过氧化氢酶与乙醇酸氧化酶的比例约80∶1。他们还得出结论，过氧化氢酶分解在乙醇酸与氧的乙醇酸氧化酶催化的反应中生成的过氧化氢(在他们的论文中，乙醇酸氧化酶被认为是“短链L—α—羟基酸氧化酶”)。他们发现，FMN有助于保持乙醇酸氧化酶的活性。他们还测定了用乙醇酸氧化酶催化的乙醇酸的最大氧化速度在乙醇酸(底物)的浓度为3.3mM时出现，并且“发现反应被……(e)高浓度的这些底物(乙醇酸)所抑制，和……”。
K.E.Richardson和N.E.Tolbert在J.Biol.Chem.，Vol.236，1280—1284(1961)中说明含有三(羟甲基)氨基甲烷的缓冲剂能抑制在乙醇酸的乙醇酸氧化酶催化的氧化中草酸的生成。他们也在PH值约8时进行了他们的反应，并发现FMN提高了乙醇酸氧化酶的效率。他们使用的乙醇酸的最大浓度是20mM。
C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris在J.Biol.Chem.，Vol.178，977—987(1949)中公开了乙醇酸与氧的乙醇酸氧化酶催化氧化的最佳PH值是约7.8—8.6，最佳温度是35—40℃。他们使用的最大底物(乙醇酸)浓度是约20mM。
有许多用乙醇酸氧化酶催化氧化乙醇酸的其他参考文献，例如：
酶的分离(通常包括试验方法)：
I.Zelitch，Methods of enzymology，Vol.1，P.528—532(1955)，Academic Press，New York，(从菠菜和烟叶)；
M.Nishimura等人，Arch.Biochem.Biophys.，Vol.222，397—402(1983)，(从南瓜子叶)：
H.Asker和D.Davies，Biochem.Biophys.Acta，Vol.761，103—108(1983)，(从鼠肝)；
M.J.Emes和K.H.Erismann，Int.J.Biochem.，Vol.16，1373—1378(1984)，(从Lemna Minor L.)；
酶的结构：
E.Cederlund等人.Eur.J.Biochem.，Vol.173，523—530(1988)；
Y.Lindquist和C.Branden，J.Biol.Chem.，Vol.264，3624—3628(1989)。
在上述所有参考文献和所有已研究的其它文献中(上述的N.E.Tolbert等人在J.Biol.Chem.，Vol.181，905—914(1949)中的讨论中提出一个例外)，使用的乙醇酸的最大起始浓度是约40mMP，PH值通常约是8—9，有时加入FMN，有时加入胺，有时加入过氧化氢酶。还提到提高乙醛酸产率的其它添加剂。
已经提出许多工业上合成乙醛酸的普通的化学(非酶催化)方法，例如，参见美国专利3,281,460,4,146,731,和4,235,684,以及Ullmanns Encyklopadie der technischen Chemie，4th Ed.，Vol.12，Verlag Chemie，Weinheim，1976，P.381(在这里称作Ullmanns)。这些方法中的几个方法产生对环境有害的产物。其中没有一个方法企图把乙醇酸氧化成乙醛酸。
即使乙醇酸是商品，据申请人所知，以前没有人设想用乙醇酸氧化酶催化氧化乙醇酸以制备乙醛酸。据推测这可能是由于化学家和化学工程师对酶反应(生物化学)不熟悉，生物化学家又没有认识到这个方法是有希望的，在大多数文献中报导该方法的产率和转化率相当低，报导了底物抑制和/或以前使用的低浓度的底物。
本发明是关于乙醛酸的制备方法，该方法包括在PH约7—10的水溶液中，在提高乙醛酸产率的有效量的添加剂存在下，使乙醇酸、乙醇酸氧化酶和氧(O2)接触，其中乙醇酸的起始浓度是200至约2500mM。该方法是实用的工业生产方法，因为其特征是在比较高的乙醇酸浓度下进行。在最佳条件下，在高的转化率下也得到很高的乙醛酸产率，并有效地利用在该方法使用的较昂贵的酶。
可以使用的乙醇酸的浓度是200至约2500mM，除了乙醇酸氧化酶催化剂外，也存在一种或多种化合物，如过氧化氢酶和某些胺，以提高乙醛酸的产率。可选择地加入FMN以提高酶的生产能力，通常使用来自空气的氧或纯氧(例如工业级氧)作为反应中的氧化剂。反应可以在氧压力高于大气压的条件下进行，以提高反应速度。
本发明是关于乙醇酸的乙醇酸氧化酶的催化氧化。
已经测定，在底物起始浓度高达约2500mM时，可以得到高收率的乙醛酸。收率可以进一步通过单独或共同加入过氧化氢酶或其它添加剂达到最大。由报导的乙醇酸氧化酶的底物抑制和/或可能的产物抑制，以及在过氧化氢酶存在时其也可能的抑制看来，高产率是意想不到的(关于底物和产物抑制的讨论，参见M.Dixon等人，Enzymes，3rd Ed.，Academic Press，New York，1979，P96—7，126—7，和T.Godfrey和J.Reichelt，Industrial Enzymology，TheNature Press，New York，1983，P.847)。实际上，我们已经发现，在乙醇酸的起始浓度约大于2500mM的条件下，乙醇酸氧化酶催化反应是比较慢的。在起始浓度高于1500mM时，反应速度的降低是显著的，并且随着底物浓度的增加而逐渐变得更低。幸运的是反应速率的降低是在浓度足够高时发生，以至实际过程可以进行。不能证明反应速度的降低是由于底物或产物的抑制还是由于某个其它因素。加入以提高产率的所选择的添加剂(当存在时)(如胺)浓度高，也能引起一种或两种酶抑制甚至变性。
虽然底物浓度高是这里介绍的工业上有用的方法的关键，但是增加本方法用途的其它因素是对乙醛酸产物的高选择性和底物转化为乙醛酸产物的高转化率。为了使乙醛酸产率高并且使副产物或者副反应很少，已经发现，将提高乙醛酸产率的添加剂，或者过氧化氢酶或者选择的胺如乙二胺加入反应混合物中是有利的。当过氧化氢酶和选择的胺二者都加入反应混合物中时，得到最好的产率。此外，为了提高乙醇酸氧化酶的生产能力，可以选择地加入少量黄素单核苷酸(下文称为FMN)。
在这里，术语“产率”的意思就是以反应开始时存在的乙醇酸的总量为基准得到的乙醛酸的百分数。术语“转化率”的意思就是已经反应的生成任何其它产物的乙醇酸占反应开始时存在的乙醇酸的百分数。术语“选择性”的意思是由已经反应的乙醇酸得到的乙醛酸的百分数。由此得出，在数学上产率等于转化率乘选择性。术语“酶生产能力”的意思就是每单位酶产生的乙醛酸的量。
乙醇酸(2—羟基乙酸)可从E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc买到。在本发明的反应中，它的起始浓度是200至约2500mM，较好是约250至约1500mM，最好是约500至约1000mM。因为乙醇酸氧化酶的催化氧化在PH值7—10的条件下进行，所以在氧化过程中认为乙醇酸以乙醇酸的阴离子存在。当然，当涉及在PH约大于4的介质中的乙醇酸时，这里使用的乙醇酸指的是乙醇酸阴离子。
乙醇酸氧化酶可以从许多来源中分离出来(如上述)。根据书Enzyme Nomenclature，Pg.52～3，Academic Press，New York，1984(国际生物化学联合会命名委员会关于酶催化反应的命名和分类的建议)(下文称为IUB)，这类酶的系统名称是(S)—2—羟基酸氧化酶，其是编号E.C.1.1.2.15。因此，引用IUB作为参考文献。反应中使用的乙醇酸氧化酶应以有效的浓度存在，通常的浓度是约0.001至约1000IU/ml，优选的是约0.1至约4IU/ml。IU(国际单位)定义为每分钟催化转化1微摩尔底物所需的酶的量。该酶的试验方法可在I.Zelitch和S.Ochoa，J.Biol.Chem.，Vol.201，707—718(1953)中查到，其在这里引用作为参考。该方法也用于试验回收的或循环的乙醇酸氧化酶的活性。
反应溶液的PH值应该约为7—10，较好是约8.0—9.5，最好是8.0—9.0。由于酶的活性随PH值变化，可以用缓冲液保持PH。还发现，随着反应的进行反应溶液的PH值稍微降低，所以，在最大的酶，活性的PH值范围内的高值附近，约9.0～9.5，开始反应通常是有利的，在反应过程中使PH下降。还发现某些胺，例如乙二胺和三(羟甲基)甲胺(下文称为TRIS)可提高乙醛酸的产率。虽然可以使用无机缓冲剂，但是最好使用过量(大于乙醇酸的摩尔量)的这些胺作为缓冲剂，来提高产率。乙二胺是优选的。这样，以胺与乙醇酸的摩尔(起始量)约1.0至约3.0。较好约1.0至2.0，最好约1.05至约1.33使用这些胺。在该范围内可以调节到准确的值以得到希望的PH值。在胺与乙醇酸的摩尔比大的情况下用碱性大的胺时，必须通过加入酸如盐酸或硫酸调节PH值。用碱性小的胺如TRIS时，必须加入碱以保持希望的PH值。虽然可以使用较大量的胺，但是较大量的胺通常没有有利作用，并招致费用增大，特别是在分离产物的过程中。因此，最好应使用与得到所希望的产率、选择性和PH值相一致的胺与乙醇酸的最低摩尔比。
为了提高乙醛酸的产率，可以使用的另一种添加剂是过氧化氢酶。过氧化氢酶(这是系统名称，编号E.C.1.11.1.6(IUB)]催化过氧化氢分解成水和氧，认为通过加速过氧化氢的分解可提高本方法的产率，过氧化氢是乙醇酸和氧的乙醇酸氧化酶催化反应生成乙醛酸过程中的初产物。过氧化氢酶的浓度应是约50至约100,000IU/ml，优选的是约350至约14,000IU/ml。最好将过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶的浓度调节至上述范围内，以致过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶的比例(每个均以IU测定)至少约250∶1。
FMN是任选的加入组分，使用浓度是0.0至约2.0mM，优选的是约0.01至约0.2mM。认为FMN能提高乙醇酸氧化酶的生产能力。乙醇酸氧化酶生产能力的意思就是每单位酶将乙醇酸转化为乙醛酸的量当然，加入的FMN的浓度是除了与酶并存的FMN外的FMN，因为在酶的制备中也经常把FMN加入酶中。FMN的结构和其分析方法在K.YagaMethods.of biochemistry Analysis，Vol.X，IntersciencePublishers，New York，1962，P.319～355中可查到。在这里引用该文献作为参考文献。
氧(O2)是乙醇酸转化为乙醛酸的氧化剂。例如，可以通过在气/液界面上搅拌液体或通过可渗透氧的膜将氧以气体形式加入反应中。虽然不想受该前提约束，但是认为在大多数情况下，反应速度至少部分地受氧可能溶解在水介质中的速度的控制。因此，即使氧可以空气中的氧的形式加入反应中，还是最好用比较纯的氧，甚至使用高压。虽然不知道氧压力的上限，但是，较好的氧压力约高达50大气压，最好约高达15大气压。搅拌对保持氧的高溶解(从而反应)速度是重要的。任何方便的搅拌形式都是有效的，如搅动。正如本技术领域熟练的技术人员所熟知的，高剪切搅拌或产生泡沫的搅拌可能降低酶的活性，因此，应该避免使用。
反应温度是重要的变量，因为其影响反应速度和酶的稳定性。可以使用的反应温度是约0～40℃，较好的约为5～30℃，最好是5～20℃。当然，温度不应低至水开始冻结的温度。这些优选温度比以前报导的温度低，是考虑到保持酶活性以及反应(乙醇酸氧化)速度。温度可以用一些普通方法控制(例如用夹套反应器，并使有合适温度的液体通过该夹套)，但是不受这些方法的限制。
反应器可以用对反应组分呈惰性的任何材料制造。
当反应完成时，酶可以用过滤除去。如果酶存在量很少，以至其存在是无害的，则可通过加热到70℃达5分钟而使其变性。用离子交换树脂很容易除去胺。用酸性阳离子交换树脂除去胺。合适的树脂包括Amberlite CG20、Amberlite IR120(Rohm&Haas Co.生产)和Dowex50(Dow Chemical Co.生产)。然后，可以用强碱处理树脂以回收胺，接着循环胺。酶的过滤和胺的回收通过实施例进一步说明。
乙醛酸产物用于制备香草醛、乙基香草醛，以及用于离子交换树脂，在医药工业(Ullmanns)中用作酸催化剂。如上所述，乙醛酸通常以50％(重量)水溶液销售。也应了解，本申请中谈及的乙醛酸也可以意指乙醛酸阴离子，特别是当乙醛酸在PH值约大于2.3的溶液中存在时是这样。
在下面的实施例和试验中，除另有说明外，搅拌是用磁性搅拌棒进行。剩余酶的活性通常从反应混合物中取出等分试样，并直接用标准试验方法(上述)测定。
在这些实施例和试验中有精确的分析方法是关键。已经发现高效液体色谱(HPLC)是相当好的分析方法，它用于在这里报导的分析。
高效液体色谱法
分析试样用100μl反应混合物与300μl，0.1N H2SO4混合来制备，用Millipore Ultrafree MC过滤器(10,000mW截止)过滤得到的溶液。乙醇酸、乙醛酸、草酸和甲酸的分析用HPLC在Bio-RadAminex HPX—87H柱(30×7.8mm)中于40℃下进行，用H2SO4(0.01N)和1—羟基乙烷—1，1—二膦酸(0.1mM)作溶剂，流速1.0ml/分。仪器是Waters840HPLC系统，装有510型泵、712WISP自动取样器，并依次装有490EUV检测器和410差示折光计。UV分析在210nm进行。草酸、乙醛酸、乙醇酸、甲酸和丙酸(内标物)的保留时间分别是4.29、6.09、7.77、8.79和11.41分。
试验1
由菠菜制备乙醇酸氧化酶
在含有1000ml 0.1MPH为8…0的磷酸钾缓冲溶液的4L工业混合机中，在40℃下将2000g菠菜叶搅匀。将得到的浆挤压通过4层粗平布，得到1800ml浆汁。将该浆汁加入大约1ml冰醋酸酸化至PH5.2。混合物以14000×g离心15分钟以除去固体。为了使饱和度为20％，向上清液中加入固体硫酸铵(10.6g/100ml浆汁)。加入6N KOH保持PH在7.8-8.0。溶液放置15分钟后，以14000×g离心20分钟，排除沉淀物。向上清液中加入硫酸铵(8.3g/100ml)使总饱和度达35％。以14000×g离心20分钟，在15分钟后收集沉淀物。沉淀物溶解于最小体积(约180ml)的PH8.0、含有2mM黄素单核苷酸的20mM乙二胺盐酸盐中。在溶解后加入硫酸铵使最终浓度为3.2M。乙醇酸氧化酶—硫酸铵悬浮液保藏在4℃的黑暗处。
实施例1
乙醇酸的氧化
向3盎司(ounce)Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放置磁性搅拌棒并加入10ml含有乙醇酸(250mM)、乙二胺(EDA)(330mM)、FMN(0.01mM)、丙酸(HPLC内标物，75mM)、乙醇酸氧化酶(GAO)(由菠菜制备；2.0IU/ml)和过氧化氢酶(由黑曲霉制备；1400IU/ml)的水溶液。该溶液最终PH是8.9。密封该反应器，将反应混合物冷却到15℃。然后，反应器在搅拌下用氧加压至70psig再排气至大气压以进行冲洗，冲洗5次。然后，反应器充氧加压至70psig并搅拌混合物。为了监测反应过程，在规定的时间间隔，从取样口(反应器无压力损失)取出等分试样(0.10ml)用HPLC分析。在4小时后，HPLC分析的乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是98.9％、0.5％和0％，0.6％的乙醇酸剩下。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性都是它们起始活性值的100％。
实施例2
乙醇酸的氧化
重复实施例1的反应，只是用K2HPO4(330mM)代替乙二胺，溶液的最终PH值用浓HCl调节至8.0。在4小时后，用HPLC分析，乙醛酸草酸和甲酸的产率分别是24.4％、0.3％和8.4％，67.1％的乙醇酸剩下。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们起始活性值的95％和44％。
实施例3
乙醇酸的氧化
向3盎司Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放置磁性搅拌棒并加入50ml含有乙醇酸(750mM)、乙二胺(862mM)、FMN(0.1mM)、丙酸(HPLC内标物；75mM)、乙醇酸氧化酶(由菠菜制备；1.0IU/ml)和过氧化氢酶(由黑曲霉制备；1400IU/ml)的水溶液。该溶液的最终PH是8.9。密封该反应器，将反应混合物冷却到15℃。然后，反应器在搅拌下充氧加压至70psig，再排气至大气压以进行清洗，清洗五次。然后，反应器充氧加压至70psig，搅拌该混合物。为了监测反应进程，在规定的时间间隔取出0.10ml等分试样，用HPLC分析。在90小时后，HPLC分析的乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是99.8％、0.2％和0％，.无乙醇酸剩下。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们起始活性值的34％和88％。
实施例4
乙醇酸的氧化
在3盎司Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放置磁性搅拌棒，并加入10ml含有乙醇酸(2000mM)、乙二胺(2100mM)、FMN(0.01mM)、乙醇酸氧化酶(由菠菜制备；1.2IU/ml)和过氧化氢酶(由黑曲霉制备；1400IU/ml)的水溶液。该溶液最终的PH是9.0。密封该反应器，将反应混合物冷却到15℃。然后，反应器在搅拌下充氧加压至70psig再排气至在气压以进行清洗，清洗五次。然后，反应器充氧加压至70psig，并搅拌该混合物。为了监测反应进程，在规定的时间间隔取出0.10ml等分试样，用HPLC分析。在31小时后，乙醇酸氧化酶无活性，所以再加2.0IU/ml乙醇酸氧化酶。在143小时后，用HPLC分析，乙醛酸、革酸和甲酸的产率分别为96.8％、2.2％和1.0％，无乙醇酸剩下。乙醇酸氧化酶(以总量为基准)和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们起始活性值的69％和100％。
实施例5
乙醇酸的氧化
在3盎司Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器中放置磁性搅拌棒并加入10ml含有乙醇酸(250mM)、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS、330mM)、FMN(0.02mM)、丙酸(HPLC内标物，75mM)、乙醇酸氧化酶(由菠菜制备，0.25IU/ml)和过氧化氢酶(由黑曲霉制备.1400IU/ml)的水溶液。该溶液最终PH用5％NaOH调节至8.3。密封该反应器，将反应混合物冷却到30℃。然后，反应器在搅拌下充氧加压至15psig再排气至大气压进行清洗，清洗五次。然后，反应器在搅拌下充氧加压至15psig。为了监测反应进程，在规定的时间间隔由取样口(反应器无压力损失)取出等分试样(0.10ml)，用HPLC分析。在30小时后，用HPLC分析的乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是89.5％，3.3％和2.8％，无乙醇酸剩下。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们起始活性值的52％和60％。
实施例6
乙醇酸的氧化
重复实施例4的反应，只是乙醇酸和乙二胺的浓度分别是2500mM和2630mM，在31小时不再加乙醇酸氧化酶。在143小时后，HPLC分析的乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是27.4％、0％和0％，72.6％的乙醇酸剩下。说明在2500mM乙醇酸的条件下反应速度降低。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别是它们起始活性值的68％和80％。
实施例7
温度对乙醇酸氧化的影响
过氧化氢酶和GAO活性对反应温度的依赖关系用3盎司Fischer-Porter玻璃气溶胶反应器测定。10ml含有乙醇酸(250mM)、乙二胺(330mM)、乙醇酸氧化酶(0.5IU/ml)、过氧化氢酶(1400IU/ml)和FMN(0.01mM)的水溶液，在PH8.3及1大气压氧下在各种温度下搅拌。在1小时后，在40℃、30℃、15℃和5℃下进行反应得到的乙醛酸产率分别是92％、96％、99％和99％，而剩余的过氧化氢酶/GAO活性分别是38％/87％、60％/100％、100％/100％和100％/100％。在高的乙醛酸选择性条件下，较低的反应温度导致较高的剩余酶活性。
实施例8
氧压力对乙醇酸氧化的影响
用实施例1中描述的方法，将10ml含有乙醇酸(250mM)、TRIS缓冲溶液(330mM，PH8.3)、丙酸(HPLC内标物，75mM)、乙醇酸氧化酶(由菠菜制备，0.25IU/ml)、过氧化氧酶(由黑曲霉制备，1400IU/ml)和FMN(0.2mM)的水溶液在30℃和压力为1大气压空气(0.2大气压氧)或1、2、3、6或10大气压氧条件下搅拌。在使用的各种氧压力下产生乙醛酸(超过反应的最初10～15％)的起始速率列于下表。
氧压力               速率
(大气压)       (μmol/ml/min)
0.2                  0.027
1.0                  0.156
2.0                  0.301
3.0                  0.494
6.0                  0.752
10.0                 1.025
实施例9
乙醇酸氧化酶浓度对乙醇酸氧化的影响
用实施例1中描述的方法，将10ml含有乙醇酸(250mM)、EDA(330mM)、丙酸(HPLC内标物，75mM)、乙醇酸氧化酶(0.20、0.40或4.0IU/ml)、过氧化氢酶(1400IU/ml)和FMN(0.01mM)的水溶液在15℃、PH8.9和6大气压氧条件下搅拌。在使用0.20IU/ml、0.40IU/ml或4.0IU/ml甜菜GAO的条件下，产生乙醛酸(超过反应的最初10～15％)的起始速率分别是1.37μmol/ml/min、1.33μmol/ml/min和1.32μmol/ml/min。在这些一般的反应条件下，反应速度对酶浓度无依赖关系。
实施例10
乙醇酸的氧化
大规模的乙醛酸酶合成实验在Amicon 2000型高产量搅拌反器(Amicon Moldel 2000 High output Stirred Cell)中进行，其中1.6mm厚的TeflonR板代替了过滤膜，有磁力驱动的桨式搅拌器。将乙醇酸氧化酶(2000IU，从菠菜中分离的)加到2.0L含有乙醇酸(113g，1.49mol)、乙二胺(95g，1.58mol)、FMN(9.7mg、0.02mmol)和过氧化氢酶[2.8×106IU，由黑曲霉制备(Sigma)]的溶液中。得到的混合物(最终PH＝8.9)在15℃和6大气压的氧下搅拌。为了监测反应进程，在规定的时间间隔取出等分试样，用HPLC进行分析。在77小时后，反应混合物的HPLC分析表明乙醛酸(110g，产率99.6％)、甲酸(产率0.2％)和草酸(产率0.2％)是仅有的反应产物；达到乙醇酸的完全转化。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性分别是他们起始活性的74％和87％。用氮气喷射溶液使反应终止，然后，在氮气保护下将反应混合物加热至70℃计5分钟。用离心法除去沉淀的蛋白质，用活性炭过滤反应混合物除去FMN。用具有10,000mW截止过滤器的Millipore Minitan Filtration System进行过滤除去任何剩余的可溶蛋白质，然后，用离子交换色谱分离乙醛酸和乙二胺(EDA)。
将Amberlite CG—120(900g，Rohm & Haas生产，100—200目，4.5meq/g)悬浮于1.0NHCl中，得到2.0L溶胀树脂，然后，用蒸馏水漂洗以除去过量的HCl。50×100cm Pharmacia K柱中装入1900ml洗过的树脂，以8.0ml/min的流量泵送2.0L蒸馏水通过该柱。然后，将一半乙醛酸/乙二胺(EDA)反应混合物(含有0.78mol EDA和0.75mol乙醛酸)以8ml/min的流量加入该柱中。在起始水洗脱相中收集乙醛酸，其是通过在254nm吸收而监测的。大约收集2.2L含有乙醛酸的洗脱液。用3.4L 1N NaOH洗脱乙二胺，得到0.77mol EDA(回收率为99％)。该柱用1N HCl(2.4L)洗涤达到再平衡，接着用3L蒸馏水洗涤除去氯化物。将由离子交换柱分离两份1.1L乙醛酸/EDA洗脱液的部分而得到的含乙醛酸的混合柱部分混合，在40℃下用旋转蒸发浓缩，得到含有1.40mol乙醛酸的50％溶液(产率94％)；通过13C NMR波谱和HPLC分析测定，得到的乙醛酸纯度大于99.5％。
实施例11
乙醇酸的氧化
重复实施例1的反应，只是不加入过氧化氢酶。在4小时后，HPLC分析的乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是6.2％、0.7％和16.3％，而7.1％的乙醇酸剩下，证明当过氧化氢酶不存在时，选择性较低。乙醇酸氧化酶的剩余活性是其起始活性值的5％。
实施例12
乙醇酸的氧化
通过将12.5g去离子水、300mg乙醇酸、1.2g TRIS和1.0g 0.02mM在PH6.8的磷酸盐缓冲剂中的FMN溶液混合，制备原料溶液。将一份10g原料溶液和2mg牛肝过氧化氢酶(由Sigma Chemical Co.St.louis，MO，63178获得，目录号C一10，约1200IU/mg)加入250mlErlenmeyer烧瓶中。一份0.5g乙醇酸氧化酶悬浮液(Sigma目录号G—4136，由糖甜菜制备，该溶液含有2.4M(NH4)2SO4、10mM TRIS、5mM FMN，约7.5IU/ml)进行离心分离，除去液体。固体加到在Erlenmeyer烧瓶中的溶液中。PH是8.5。烧瓶用氧以约200ml O2/min清洗5分钟。密封该烧瓶，然后，用轴动作振动器振动23小时。HPLC分析(与上述的相似但不完全相同)表明乙醇酸已经完全氧化成乙醛酸和少量草酸。
实施例13
用“膜反应器”氧化乙醇酸
将12.4ml去离子水、305mg乙醇酸、在PH7.5的磷酸盐缓冲剂中的1.0g 0.15mM的FMN和1.3g 20％乙二胺的水溶液混合，制备原料溶液。将12g原料溶液，4mg牛肝过氧化氢酶(Sigma目录号C—10，约2800IU/ml)和由1.0g商品乙醇酸氧化酶悬浮液(Sigma目录号G—8620，含有3.2M(NH4)2SO4、2mM FMN，2.8IU/ml、由菠菜中分离的乙醇酸氧化酶)离心分离的固体混合，制备反应混合物。PH是9.1。
反应器有3个部件，一根长3.65米内径1.6mm外径3.2mm的硅橡胶管(Dow Corning Corp.)，一台Masterflex蠕动泵，一只内径1Omm长100mm用作贮存器的(玻璃)试管。由泵接出并回到泵的这些管通过靠近试管贮存器的隔膜。反应混合物加入反应器中，然后通过硅橡胶管以3.5ml/min的流量泵送23小时。在这期间，约5ml在管中，5ml在贮存器中(但是全部都在循环)。硅橡胶管在和缓的空气流中松驰地绕成盘状。HPLC分析(与上述的相似但不完全相同)表明乙醇酸完全氧化成乙醛酸和少量草酸。
试验2
乙醇酸的氧化
将3ml含有乙醇酸(3.3mM)、K2HPO4(33mM，PH8.0)、乙醇酸氧化酶(由菠菜制备，0.33IU/ml)、过氧化氢酶(由牛肝制备，1400IU/ml)和FMN(0.01mM)的水溶液加到15ml聚丙烯离心管中。该溶液保持在30℃的空气中，取出0.15ml等分试样，用Millipore 10,000MW截止过滤器过滤，用HPLC分析。在1小时后，乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是80.9％、3.8％和0％，15.5％的乙醇酸剩下。在2小时后，乙醛酸、草酸和甲酸的产率分别是80.6％、19.7％和0％，无乙醇酸剩下。
虽然本发明的优选方案已经在上文中说明，但是，应当理解为本发明不限制在这里公开的明确解释内，还应当理解为保留对在附上的权利要求定义的本发明的范围内所有变化和改进的权利。

Claims (101)

1.乙醛酸的制备方法，包括在pH7至10的水溶液中，在提高乙醛酸产率的有效量的过氧化氢酶和/或胺的存在下，于0℃至40℃的温度使乙醇酸、乙醇酸氧化酶和氧接触，其中乙醇酸的起始浓度是200mM至2,500mM。
2.权利要求1的方法，其中乙醇酸的起始浓度是250mM至1,500mM。
3.权利要求2的方法，其中乙醇酸的起始浓度是500mM至1,000mM。
4.权利要求1的方法，其中乙醇酸氧化酶的浓度是0.001至1,000IU/ml。
5.权利要求4的方法，其中乙醇酸氧化酶的浓度是0.1至4IU/ml。
6.权利要求1的方法，其中pH是8.0至9.5。
7.权利要求6的方法，其中pH是8.0至9.0。
8.权利要求3的方法，其中pH是8.0至9.5。
9.权利要求1的方法，其中pH在反应开始时调节至9.5，随着反应的进行使其降低至8.0。
10.权利要求1的方法，其中提高乙醛酸产率的添加剂是胺，选自乙二胺和三(羟甲基)甲胺。
11.权利要求10的方法，其中添加剂是乙二胺。
12.权利要求3的方法，其中提高乙醛酸产率的添加剂是胺，选自乙二胺和三(羟甲基)甲胺。
13.权利要求12的方法，其中添加剂是乙二胺。
14.权利要求10的方法，其中胺添加剂的量超过乙醇酸的摩尔量。
15.权利要求14的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比率是1.0至3.0。
16.权利要求15的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比率是1.0至2.0。
17.权利要求16的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比率是1.05至1.33。
18.选择性制备乙醛酸的方法，包括在pH7至10的水溶液中，在过氧化氢酶存在下，使乙醇酸、乙醇酸氧化酶和氧接触，其中上述乙醇酸的起始浓度是200mM至2,500mM。
19.权利要求18的方法，其中过氧化氢酶的浓度是50至100,000IU/ml。
20.权利要求19的方法，其中过氧化氢酶的浓度是350至14,000IU/ml。
21.权利要求19的方法，其中过氧化氢酶与乙醇酸氧化酶的比例是至少250∶1。
22.权利要求1的方法，其中过氧化氢酶和选择的胺都以添加剂存在。
23.权利要求22的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比例是1.0至2.0，过氧化氢酶的起始浓度是50至100,000IU/ml，乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.001至1,000IU/ml。
24.权利要求23的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比例是1.05至1.33，过氧化氢酶的起始浓度是350至14,000IU/ml，乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.1至4.0IU/ml。
25.权利要求24的方法，其中pH是8.0至9.5。
26.权利要求25的方法，其中温度是0℃至40℃。
27.权利要求26的方法，其中温度是5℃至30℃。
28.权利要求27的方法，其中温度是5℃至20℃。
29.权利要求1的方法，其中氧在大气压下以气体形式如入。
30.权利要求1的方法，其中氧在超过大气压的压力下以气体形式加入。
31.权利要求30的方法，其中氧在最高50大气压的压力下以气体形式加入。
32.权利要求31的方法，其中氧在最高15大气压的压力下以气体形式加入。
33.权利要求3的方法，其中过氧化氢酶和选择的胺都以添加剂存在。
34.权利要求33的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比例是1.0至3.0，过氧化氢酶的起始浓度是50至100,000IU/ml，乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.001至1.000IU/ml。
35.权利要求34的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比例是1.05至1.33，过氧化氢酶的起始浓度是350至14,000IU/ml，乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.1至4.0IU/ml。
36.权利要求35的方法，其中pH是8.0至9.0。
37.权利要求36的方法，其中温度是0℃至40℃。
38.权利要求37的方法，其中温度是5℃至30℃。
39.权利要求38的方法，其中温度是5℃至20℃。
40.权利要求37的方法，其中氧在最高50大气压的压力下以气体形式加入。
41.权利要求40的方法，其中气在最高15大气压的压力下以气体形式加入。
42.权利要求1的方法，其中有FMN存在。
43.权利要求10的方法，其中有FMN存在。
44.权利要求18的方法，其中有FMN存在。
45.权利要求22的方法，其中有FMN存在。
46.权利要求42的方法，其中加入的FMN的起始浓度是2.0mM或小于2.0mM。
47.权利要求46的方法，其中加入的FMN的起始浓度是0.01至0.2mM。
48.权利要求1的方法，其中反应的氧以气体形式加入，通过在氧和反应溶液之间的介面上搅拌溶液使氧与水溶液接触。
49.权利要求22的方法，其中反应的氧以气体形式加入，通过在氧和反应溶液之间的介面上搅拌溶液使氧与水溶液接触。
50.权利要求1的方法，其中氧通过可渗透氧的膜加入。
51.权利要求22的方法，其中氧通过可渗透氧的膜加入。
52.权利要求48的方法，其中氧以空气形式加入。
53.权利要求51的方法，其中氧以空气形式加入。
54.权利要求48的方法，其中氧基本上是纯的。
55.权利要求49的方法，其中氧基本上是纯的。
56.权利要求1的方法，其中进行搅拌。
57.权利要求1的方法，其中反应温度是0℃至40℃，条件是温度不低至使反应混合物中的水冻结。
58.权利要求57的方法，其中反应温度是5℃至30℃。
59.权利要求58的方法，其中反应温度是5℃至20℃。
60.权利要求3的方法，其中反应温度是0℃至40℃，条件是温度不低至使反应混合物中的水开始冻结。
61.权利要求60的方法，其中反应温度是5℃至30℃。
62.权利要求61的方法，其中反应温度是5℃至20℃。
63.权利要求1的方法，其中在反应后存在的任何酶过滤除去。
64.权利要求18的方法，其中乙醇酸的起始浓度是500mM至1,000mM。
65.权利要求64的方法，其中乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.001至1,000IU/ml。
66.权利要求65的方法，其中乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.1至4IU/ml。
67.权利要求18的方法，其中pH是8.0至9.0。
68.权利要求65的方法，其中pH是8.0至9.5。
69.权利要求22的方法，其中胺选自乙二胺和三(羟甲基)甲胺。
70.权利要求69的方法，其中存在的仅有的胺是乙二胺。
71.权利要求69的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比例是1.0至2.0。
72.权利要求71的方法，其中起始的胺与乙醇酸的比例是1.05至1.33。
73.权利要求72的方法，其中过氧化氢酶的起始浓度是50至100,000IU/ml。
74.权利要求73的方法，其中过氧化氢酶的起始浓度是350至14,000IU/ml。
75.权利要求71的方法，其中过氧化氢酶的起始浓度是350至14,000IU/ml。
76.权利要求75的方法，其中乙醇酸氧化酶的起始浓度是0.1至4IU/ml。
77.权利要求76的方法，其中起始的过氧化氢酶与乙醇酸氧化酶的比例是至少250∶1。
78.权利要求77的方法，其中pH是8.0至9.5。
79.权利要求78的方法，其中温度是0℃至40℃。
80.权利要求79的方法，其中温度是5℃至30℃。
81.权利要求80的方法，其中温度是5℃至20℃。
82.权利要求79的方法，其中FMN的起始浓度小于2.0mM。
83.权利要求82的方法，其中FMN的起始浓度是0.01至0.2mM。
84.权利要求81的方法，其中过氧化氢酶与乙醇酸氧化酶的比例是至少250∶1。
85.权利要求3的方法，其中有FMN存在。
86.权利要求44的方法，其中FMN的起始浓度小于2.0mM。
87.权利要求86的方法，其中FMN的起始浓度是0.01mM至0.2mM。
88.权利要求37的方法，其中有FMN存在。
89.权利要求26的方法，其中有FMN存在。
90.权利要求89的方法，其中FMN的起始浓度小于2.0mM。
91.权利要求90的方法，其中FMN的起始浓度是0.01mM至0.2mM。
92.权利要求43的方法，其中FMN的起始浓度小于2.0mM。
93.权利要求92的方法，其中FMN的起始浓度是0.01mM至0.2mM。
94.权利要求20的方法，其中乙醇酸氧化酶的浓度是0.1IU/ml至4IU/ml。
95.权利要求94的方法，其中pH是8.0至9.5。
96.权利要求95的方法，其中温度是0℃至40℃。
97.权利要求96的方法，其中温度是5℃至20℃。
98.权利要求97的方法，其中有FMN存在。
99.权利要求1的方法，其中反应后存在的任何酶过滤和/或加热除去。
100.权利要求10的方法，其中反应后存在的任何胺用离子交换树脂除去。
101.权利要求22的方法，其中反应后存在的任何胺用离子交换树脂除去。
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