CN103172568A - 组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类新的化合物，由下式表示

其中R¹、R²、和R³的含义由本发明表示，其为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，包括但不限于组织蛋白酶K、L、S和B。这些化合物适用于治疗其中显示了骨吸收抑制的疾病，例如骨质疏松、骨关节炎和类风湿性关节炎。

Description

组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶抑制剂

本申请是申请号为“200680024616.6”，发明名称为“组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶抑制剂”的发明专利申请的分案申请。

背景技术

人类和其它哺乳动物中的多种疾病都涉及或者与异常的骨吸收相关。这些疾病包括但不限于骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、佩吉特病、异常升高的骨转换、牙周病、牙齿损害、骨折、类风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症病、恶性肿瘤的高钙血症或者多发性骨髓瘤。这些疾病中最常见的一种疾病是骨质疏松症，它在绝经后的女性中发生最为频繁。骨质疏松症是一种全身骨骼疾病，其特征在于低骨重量和骨组织微结构退化，同时随之而来的使得骨骼脆性和易遭受骨折性增加。骨质疏松骨折是导致老年人群发病和致死的主要原因。多达50％的女性和三分之一的男性会遭受骨质疏松骨折。大部分老年人群已经具有低骨骼密度并且具有高骨折风险。显著需要预防和治疗骨质疏松症以及其它与骨吸收相关的症状。因为骨质疏松症以及其它与骨骼损害相关的疾病通常都是慢性症状，因此，人们确信适当的疗法一般将需要慢性处理。

组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶总科。这些蛋白酶在正常生理学以及病理的结缔组织退化中起作用。组织蛋白酶在细胞内蛋白质降解、代谢转换和改造中起着举足轻重的作用。迄今为止，多种组织蛋白酶已经在多种来源中得到了鉴定和排序。这些组织蛋白酶天然地存在于多种组织中。例如，组织蛋白酶B、C、F、H、L、K、O、S、V、W和Z已经得到了克隆。组织蛋白酶L与正常的溶菌酶蛋白质水解以及若干病态相牵连，包括但不限于黑素瘤转移。组织蛋白酶S与阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化症、慢性阻塞性肺病和某些自身免疫疾病相牵连，包括但不限于青少年发作糖尿病、多发性硬化、慢性天疱疮、Graves’疾病、重症肌无力、全身红斑狼疮、类风湿性关节炎和桥本氏甲状腺炎；与变应性紊乱相牵连，包括但不限于哮喘；以及与外源性免疫反应相牵连，包括但不限于器官移植排斥或者组织移植排斥。升高的组织蛋白酶B水平和酶的重新分配在肿瘤中得到了发现，这表示它在肿瘤发病和转移中起作用。此外，异常的组织蛋白酶B活性与某类疾病状态相牵连，如类风湿性关节炎、骨关节炎、肺孢子虫肺炎、急性胰炎、炎性的气道疾病和骨与关节病症。

哺乳动物组织蛋白酶与引起疾病的寄生虫表达的类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶相关，所述寄生虫包括原生动物、扁蠕虫、植物线虫和节肢动物家族的寄生虫。这些半胱氨酸蛋白酶在这些有机体的生命周期中起着主要作用。

人类I型胶原，骨中的主要胶原，是组织蛋白酶K的优良底物。参见Kafienah，W.等人，1988，Biochem J，331：727-732，其全部内容在此引入作为参考。对组织蛋白酶K使用反义寡核苷酸的体外试验已经显示了降低的体外骨吸收，这可能是由于组织蛋白酶K信使RNA翻译的减少。参见Inui，T.等人，1997，J Biol Chem，272：8109-8112，其全部内容在此引入作为参考。组织蛋白酶K的晶体结构已经得到了解析。参见McGrath，M.E.等人，1997，Nat Struct Biol，4：105-109；Zhao，B.等人，1997，Nat Struct Biol，4：109-11，其全部内容在此引入作为参考。同样，对选择性肽基的组织蛋白酶K抑制剂已经进行了研究。参见Bromme，D.等人，1996，Biochem J，315：85-89；Thompson，S.K.等人，1997，Proc Natl Acad Sci USA，94：14249-14254，其全部内容在此引入作为参考。因此，组织蛋白酶K抑制剂可以降低骨吸收。这些抑制剂对治疗涉及骨吸收的病症将会有用，涉及骨吸收的病症例如骨质疏松症。

本领域所需要的是治疗与组织蛋白酶K活性关联的疾病的治疗剂，所述疾病包括骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、佩吉特病、异常疾病、牙齿损害、骨折、类风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症病、动脉粥样硬化、肥胖症、青光眼、慢性肺梗塞疾病和癌症，包括转移性骨疾病、恶性肿瘤的高钙血症和多发性骨髓瘤。

发明概述

本发明涉及能够在需要其的哺乳动物中治疗和预防组织蛋白酶依赖症状或者疾病状态的化合物。本发明的一种实施方案通过式I化合物和其药学上可接受的盐、立体异构体和N-氧化物衍生物进行说明：

发明详述

本发明涉及以下化学式的化合物：

其中R¹是卤代；

R²是卤代；

R³是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、芳基或杂芳基；

或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

在本发明的一个实施方案中，或者R¹是氟或氯。

在本发明的一个实施方案中，或者R²是氟或氯。

在本发明的一个实施方案中，R³是氢、C_1-6烷基或C_1-6卤代烷基。在本发明的一个类别中，R³是C_1-6卤代烷基。在本发明的一个子类中，R³是2，2，2-三氟乙基。

除非另有说明，如上所述的优选实施方案意指包括所有具体和优选基团的组合。

本发明的具体实施方案包括但不限于：

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氯-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氯-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

或其药学上可接受的盐、立体异构体或N-氧化物衍生物。

在本发明范围内还包括含有如上所述的式I化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还预期包括含有药学上可接受的载体和任何在本申请中明确公开的化合物的药物组合物。根据本文所含的教导，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。

应用

本发明化合物为组织蛋白酶抑制剂，并且因此可以用于治疗或者预防哺乳动物组织蛋白酶依赖疾病或者症状，优选人类。特别地，本发明化合物为组织蛋白酶K抑制剂，并且因此可以用于治疗或者预防哺乳动物组织蛋白酶K依赖性疾病或者症状，优选人类。

与现有技术中已知的结构类似化合物相比，本发明化合物的优点在于它们具有显著的改良代谢和药物动力学分布。明确而言，本发明化合物具有优良的生物利用度，例如但不限于，在0.5-1％甲基纤维素(methocel)或PEG-200中，剂量为10毫克/千克雄性Sprague Dawley大鼠。另外，本发明化合物在很多临床前动物种类中具有改进的半寿期，从而提供了比本领域已知的结构类似化合物更长的全身药物曝置期。

“组织蛋白酶依赖疾病或者症状”是指依赖一种或多种组织蛋白酶活性的病理情况。“组织蛋白酶K依赖疾病或者症状”是指依赖组织蛋白酶K活性的病理情况。与组织蛋白酶K活性相关的疾病包括骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、佩吉特病、异常疾病、牙齿损害、骨折、类风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、动脉粥样硬化症、肥胖病、青光眼、慢性阻塞性肺病和癌症(包括转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症和多发性骨髓瘤)。在用本发明要求保护的化合物治疗这些症状中，需要的治疗剂量将根据具体疾病而不同，并且本领域熟练技术人员可以轻易确定该剂量。虽然治疗和预防都预期在本发明范围内，但是这些症状的治疗是优选的用途。

本发明的一种实施方案是在需要其的哺乳动物中抑制组织蛋白酶活性的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。

本发明的一类实施方案是方法，其中组织蛋白酶活性是组织蛋白酶K活性。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防组织蛋白酶依赖症状的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。

本发明的一类实施方案是方法，其中组织蛋白酶活性是组织蛋白酶K活性。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中抑制骨损害的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中降低骨损害的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在抑制骨吸收(其包括异常升高的骨转换、骨折、佩吉特病、骨脆症病和假体周围溶骨症)中的应用在文献中是已知的，参见Stroup，G.B.，Lark，M.W.，Veber，DF.，Bhattacharrya，A.，Blake，S.，Dare，L.C.，Erhard，K.F.，Hoffman，S.J.，James，I.E.，Marquis，R.w.，Ru，Y.，Vasko-Moser，J.A.，Smith，B.R.，Tomaszek，T.和Gowen，M.Potent and selective inhibition of humancathepsin K leads to inhibition of bone resorption in vivo in a nonhumanprimate.J.Bone Miner.Res.，16：1739-1746；2001；和Votta，B.J.，Levy，M.A.，Badger，A.，Dodds，R.A.，James，I.E.，Thompson，S.，Bossard，M.J.，Carr，T.，Connor，J.R.，Tomaszek，T.A.，Szewczuk，L.，Drake，F.H.，Veber，D.和Gowen，M.Peptide aldehyde inhibitors of cathepsin Kinhibit bone resorption both in vivo and in vitro.J.Bone Miner.Res.12：1396-1406；1997。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防骨质疏松症(包括肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症)的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何上述药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在治疗或者预防骨质疏松症中的应用在文献中是已知的，参见Saftig，P.，Hunziker，E.，Wehmeyer，O.，Jones，S.，Boyde，A.，Rommerskirch，W.，Moritz，J.D.，Schu，P.和Vonfigura，K.Impaired osteoclast bone resorption leads to osteopetrosis in cathepsinK-deficient mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13453-13458；1998。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防牙周病(包括牙齿损害)的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何上述药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在治疗或者预防牙周病和牙齿损害中的应用已经在文献中进行了论述，参见Tsuji Y等人，Expression of cathepsin K mRNA and protein inodontoclasts after experimental tooth movement in the mouse maxilla by insitu hybridization and immunoelectron microscopy.Cell Tissue Res.2001Mar；303(3)：359-69。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防类风湿性关节炎症状的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中，已知关节周的骨的渐进破坏是类风湿性关节炎(RA)病人中关节机能障碍和关节无力的主要原因，参见Goldring SR，“Pathogenesis of bone erosions in rheumatoidarthritis”.Curr.Opin.Rheumatol.2002；14：406-10。患有RA的患者的关节组织分析已经提供证据，组织蛋白酶K阳性破骨细胞是介导与类风湿性滑液损害有关的病灶骨吸收的细胞类型，参见Hou，W-S，Li，W，Keyszer，G，Weber，E，Levy，R，Klein，MJ，Gravallese，EM，Goldring，SR，Bromme，D，“Comparison of Cathepsin K and S expression within theRheumatoid and Osteoarthritic Synovium”，Arthritis Rheumatism2002；46：663-74。此外，全身性骨损害是导致与严重RA有关的病状的主要原因。在患有慢性RA的患者中，臀部和脊柱的骨折频率得到了显著增加，参见Gould A，Sambrook，P，Devlin J等人，“Osteoclastic activation is theprincipal mechanism leading to secondary osteoporosis in rheumatoidarthritis”.J.Rheumatol.1998；25：1282-9。组织蛋白酶K抑制剂在关节下骨吸收和全身性骨损害的治疗或者预防中的应用表明了在类风湿性关节炎的进行上药理学介入的合理方法。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防骨关节炎进行的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中，已知骨关节炎(OA)伴随有明确的关节变化，包括关节软骨表面侵蚀、周围关节软骨内骨化/骨赘增生和软骨下骨硬化和孢囊形成，参见Oettmeier，R，Abendroth，K，“Osteoarthritis and bone：osteologic types of osteoarthritis of the hip”，Skeletal Radiol.1989；18：165-74。最近，已经提出了软骨下骨硬化可能具有促使OA开始和进行的作用。当关节响应重复的冲动负载时，变硬的软骨下骨只能较差地减弱和分散通过关节的压力，使得其遭受通过关节软骨表面的更大机械应力。这进而也促进了软骨磨损和纤化，参见Radin，EL和Rose RM，“Role of subchondral bone in the initiation andprogression of cartilage damage”，Clin.Orthop.1986；213：34-40。通过抗吸收试剂(例如组织蛋白酶K抑制剂)抑制过多的关节下骨吸收，将导致软骨下骨转换受到抑制，由此可能会对OA进行产生有利的影响。

除上述假设之外，采自OA病人滑膜和关节软骨样品的滑液成纤维细胞、巨噬细胞相似细胞和软骨细胞中的组织蛋白酶K蛋白质表达最近得到了鉴定，参见Hou，W-S，Li，W，Keyszer，G，Weber，E，Levy，R，Klein，MJ，Gravallese，EM，Goldring，SR，Bromme，D，“Comparisonof Cathepsin K and S expression within the Rheumatoid and OsteoarthriticSynovium”，Arthritis Rheumatism2002；46：663-74；和Dodd，RA，Connor，JR，Drake，FH，Gowen，M，“Expression of Cathepsin K messenger RNAin giant cells and their precursors in human osteoarthritic synovial tissues”.Arthritis Rheumatism1999；42：1588-93；和Konttinen，YT，Mandelin，J，Li，T-F，Salo，J，Lassus，J等人“Acidic cysteine endoproteinase cathepsinK in the degeneration of the superficial articular hyaline cartilage inosteoarthritis”，Arthritis Rheumatism2002；46：953-60。由此，这些近期研究涉及组织蛋白酶K在破坏与骨关节炎进行相关的关节软骨II型胶原中的作用。由此，如本发明所述的组织蛋白酶K抑制剂在骨关节炎治疗或者预防中的应用包括两种不同的机制，一种机制是抑制破骨细胞驱动的软骨下骨转换，和第二种机制是直接抑制患有OA的患者的滑膜和软骨中的II型胶原变性。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗癌症的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知组织蛋白酶K在人类乳腺癌、前列腺癌和脊索癌中表达并且其具有基体分解能力，参见Littlewood-Evans AJ，BilbeG，Bowler WB，Farley D，Wlodarski B，Kokubo T，Inaoka T，Sloane J，Evans DB，Gallagher JA，“The osteoclast-associated protease cathepsin Kis expressed in human breast carcinoma，”Cancer Res1997Dec1；57(23)：5386-90.Brubaker KD，Vessella RL，True LD，Thomas R，CoreyE，“Cathepsin K mRNA and protein expression in prostate cancerprogression，”J Bone Miner Res200318，222-30.Haeckel C，Krueger S，Kuester D，Ostertag H，Samii M，Buehling F，Broemme D，Czerniak B，Roessner A，“Expression of cathepsin K in chordoma，”Hum Pathol2000Jul；31(7)：834-40。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗动脉粥样硬化症的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。以下文献中已知组织蛋白酶K在人类动脉粥样化中表达并且具有显著的弹性蛋白酶活性，参见Sukhova GK，Shi GP，Simon DI，Chapman HA，Libby P，“Expression of the elastolyticcathepsins S and K in human atheroma and regulation of their production insmooth muscle cells，”J Clin Invest1998Aug102，576-83。还已知Cat K裸鼠在与ApoE裸鼠杂交时显示出减少的动脉粥样硬化斑区域和对斑破裂的抗性增加，参见E.Lutgens，S.P.M.Lutgens，B.C.G.Faber，S.Heeneman，M.M.J.Gijbels，M.P.J，de Winther，P.Frederik，I.van der Made，D.Black，M.J.A.P.Daemen，K.B.J.M.Cleutjens″Disruption of theCathepsin K Gene Reduces Atherosclerosis Progression and Induces PlaqueFibrosis but Accelerates Macrophage Foam Cell Formation.″Circulation2006113：98-107。对患者给药治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物，增加的斑稳定性会减少其心脏病和中风

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗肥胖病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知组织蛋白酶K mRNA在数种肥胖病鼠模型中的脂肪组织中和肥胖人类男性的脂肪组织中升高，参见Chiellini C，Costa M，Novelli SE，Amri EZ，Benzi L，Bertacca A，Cohen P，Del PratoS，Friedman JM，Maffei M，“Identification of cathepsin K as a novelmarker of adiposity in white adipose tissue，”J Cell Physiol2003，195，309-21。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗青光眼的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。组织蛋白酶K在虹膜、睫状体和视网膜色素上皮细胞中高度表达并且由此可以用于治疗青光眼，参见Ortega，J.，等，“GeneExpression of Proteases and Protease Inhibitors in the Human CiliaryEpithelium and ODM-2cells，”Exp.Eye Res(1997)65，289-299；国际公开WO2004/058238(Alcon，Inc.)。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗慢性阻塞性肺病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知组织蛋白酶K在肺部纤维化中起作用，参见Buhling，F.等人，“Pivotal role of cathepsin K in lung fibrosis，”Am J Pathol.2004Jun；164(6)：2203-16。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗寄生虫感染的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知哺乳动物组织蛋白酶与在这些寄生虫的生命周期中起着重要作用的类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶相关。所述寄生虫涉及疟疾、美洲锥虫病、刚果锥虫病、利什曼病、贾第虫病、滴虫病、变形虫病、血吸虫病、片吸虫病、肺吸虫病和肠蛔虫疾病，参见Lecaille F，Kaleta J，Bromme D.，Human and parasitic papain-like cysteineproteases：their role in physiology and pathology and recent developmentsin inhibitor design.Chem Rev2002102，4459-88。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗严重急性呼吸性综合症(SARS)的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗转移性骨骼疾病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知，破骨细胞引起骨吸收并且由转移性肿瘤诱发的骨组织破坏和高钙血症通过破骨细胞进行。据此，对破骨细胞的抑制可以预防骨组织破坏和骨骼转移，参见Miyamoto，T.和Suda，T.，“Differentiation and function of osteoclasts，”Keio J Med2003Mar；52(1)：1-7。

本发明的另一实施方案是在患有携带骨骼转移危险的原发性肿瘤的哺乳动物中预防转移性骨骼疾病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中描述了抑制破骨细胞功能的化合物可能防止肿瘤细胞粘合到骨骼，参见S.Boissier，M.Ferreras，O.Peyruchaud，S.Magnetto，F.H.Ebetino，M.Colombel，P.Delmas，J.-M.Delaissé和P.Clézardin“BisphosphonatesInhibit Breast and Prostate Carcinoma Cell Invasion，an Early Event in theFormation of Bone Metastases”Cancer Research60，2949-2954，2000。

本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗恶性肿瘤高钙血症或多发性骨髓瘤的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。已经在文献中已知组织蛋白酶K在恶性肿瘤或多发性骨髓瘤高钙血症方面的作用，参见，Faust，J.等人，Multiple myeloma cells and cells of the human osteoclast lineageshare morphological and cell surface markers.J Cell Biochem.1998Dec15；71(4)：559-68；A.lipton，New therapeutic agents for the treatment ofbone diseases.Expert Opin Biol Ther.2005Jun；5(6)：817-32。

本发明的另一实施方案是给药哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何组合物，以治疗与组织蛋白酶S相关的哺乳动物疾病，包括阿兹海默病、动脉粥样硬化症、慢性阻塞性肺病、癌症和某些自身免疫疾病，包括但不限于青少年发作糖尿病、多发性硬化、慢性天疱疮、Graves’疾病、重症肌无力、全身红斑狼疮、类风湿性关节炎和桥本氏甲状腺炎；变应性疾病，包括但不限于哮喘；和异源性免疫反应，包括但不限于器官移植排斥或者组织移植排斥。在文献中已知组织蛋白酶S活性与上述疾病状态相关，参见Munger JS，Haass C，Lemere CA，Shi GP，Wong WS，Teplow DB，Selkoe DJ，Chapman HA.Lysosomal processing of amyloid precursorprotein to A beta peptides：a distinct role for cathepsin S.Biochem J1995 311，299-305，Sukhova GK，Zhang Y，Pan JH，Wada Y，Yamamoto T，Naito M，Kodama T，Tsimikas S，Witztum JL，Lu ML，SakaraY，Chin MT，Libby P，Shi GP.Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.J Clin Invest2003 111，897-906，Zheng T，Zhu Z，Wang Z，Homer RJ，Ma B，Riese RJ Jr，Chapman HA Jr，Shapiro SD，Elias JA.Inducible targeting of IL-13 to the adult lung causes matrixmetalloproteinase-and cathepsin-dependent emphysema.J Clin Invest2000 106，1081-93，Shi GP，Sukhova GK，Kuzuya M，Ye Q，Du J，Zhang Y，Pan JH，Lu ML，Cheng XW，Iguchi A，Perrey S，LeeAM，Chapman HA，Libby P.Deficiency of the cysteine protease cathepsin S impairs microvessel growth.Circ Res2003 92，493-500，Nakagawa TY，Brissette WH，Lira PD，Griffiths RJ，Petrushova N，Stock J，McNeish JD，Eastman SE，Howard ED，Clarke SR，Rosloniec EF，Elliott EA，Rudensky AY.Impairedinvariant chain degradation and antigen presentation and diminished collagen-induced arthritis incathepsin S null mice.Immunity199910，207-17。

本发明的例证是任何如上所述化合物在制备用于在需要其的哺乳动物中治疗和/或预防骨质疏松症的药物中的用途。本发明更进一步的例证是任何如上所述化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防：骨损害、骨吸收、骨折、转移性骨疾病和/或与组织蛋白酶功能相关的病症。

本发明化合物可以单独给药或者优选协同药学上可接受的载体或者稀释剂联合给药至哺乳动物，优选人类，在药物组合物中，根据标准药物实践，任选与已知的辅剂联合，辅剂例如明矾。所述化合物可以口服给药或者胃肠外给药，包括静脉内的、肌内的、腹膜内的、皮下的、直肠的和局部的给药途径。

在用于口服使用的片剂的情况下，通常加入常规使用的载体，包括乳糖和玉米淀粉，和润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有益的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。对于根据本发明的治疗化合物的口服应用，选择的化合物可以通过以下方式给药，例如以片剂或者胶囊形式，或者以水溶液或者悬浮液形式给药。对于片剂或者胶囊形式的口服给药，药物活性成分可以与口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体联合使用，惰性载体例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸氢钙、硫酸钙、甘露醇和山梨糖醇等等；对于液态形式的口服给药，口服的药物组分可以与任何口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体联合使用，惰性载体例如乙醇、甘油和水等等。此外，当期望或者需要时，也可以将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂结合入混合物中。适当的结合剂包括淀粉、明胶、天然糖类(例如葡萄糖或者β-乳糖)、玉米甜味剂、天然树胶和合成树胶(例如阿拉伯胶、西黄蓍胶或者海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇和石蜡等等。用于这些剂型中的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土和黄原胶等等。当含水混悬剂需要口服应用时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂联合使用。如果需要，可以将某些甜味剂和/或增香剂加入其中。对于肌内、腹膜内、皮下和静脉内应用，通常制备活性成分的无菌液，并且应当对溶液的pH值进行适当地调节和缓冲。对于静脉内使用，应该对溶质的总浓度进行控制，以便使得制剂等渗。

本发明化合物还可以以微脂粒输送系统的形式进行给药，微脂粒输送系统例如小单层囊、大单层囊和多层囊。脂质体可以由多种磷脂形成，例如胆固醇、十八胺或者卵磷脂。

本发明化合物也可以通过利用单克隆抗体作为个体载体进行递送，所述化合物分子连接到单克隆抗体上。本发明化合物也可以与作为目标药物载体的可溶性聚合物结合。上述聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、多羟基-乙基天冬酰胺-苯酚或者棕榈酰基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，可以将本发明化合物结合到一类用于实现药物控释的可生物降解的聚合物上，可生物降解的聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或者水凝胶两性嵌段共聚物。

本发明化合物还可以用于与已知可以用于治疗或者预防以下疾病的试剂联合使用，所述疾病为骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、佩吉特病、异常升高的骨转换、牙周病、牙齿损害、骨折、类风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症和多发性骨髓瘤。本发明公开的化合物与其它对治疗或者预防骨质疏松症或者其它骨病症有用的试剂的联合同样包括在本发明范围内。基于药物的特性以及所涉及的疾病，本领域普通技术人员将可以辨别哪些试剂的联合有效。所述试剂包括以下：有机双膦酸酯；选择性雌激素受体调节剂；雄激素受体调节剂；破骨细胞质子ATP酶抑制剂；HMG-CoA还原酶抑制剂；整联蛋白受体拮抗剂；成骨细胞合成代谢剂例如PTH；维生素D；合成维生素D类似物；非甾族抗炎药物；选择性环加氧酶-2抑制剂；白细胞间介素-1β抑制剂；LOX/COX抑制剂；及其药学上可接受的盐和混合物。优选的联合为本发明化合物和有机双膦酸酯的联合。另一优选的组合为本发明化合物和选择性雌激素受体调节剂的组合。另一优选的组合为本发明化合物和雄激素受体调节剂的组合。另一优选的组合为本发明化合物和成骨细胞合成代谢剂的组合。

“有机双膦酸酯”包括但不限于下面化学式的化合物：

其中n为0～7的整数，和其中A和X独立地选自H、OH、卤素、NH₂、SH、苯基、C₁-C₃₀烷基、C₃-C₃₀支链或者环烷基、具有两个或者三个N的二环结构、C₁-C₃₀取代的烷基、C₁-C₁₀烷基取代的NH₂、C₃-C₁₀支链或者环烷基取代的NH₂、C₁-C₁₀二烷基取代的NH₂、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀烷基取代的硫基、苯硫基、卤代苯硫基、C₁-C₁₀烷基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑并吡啶基和苄基，从而使得当n为0时A和X都不选自H或者OH；或者A和X与它们连接的碳原子合起来形成C₃-C₁₀环。

在上述化学式中，所述烷基可以是直链、支链或者环状的烷基，条件是对化学式选择充足的原子。C₁-C₃₀取代烷基可以包含多种取代基，取代基的非限制性实例包含选自以下的取代基：苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯烷基、咪唑基、NH₂、C₁-C₁₀烷基或者二烷基取代的NH₂、OH、SH和C₁-C₁₀烷氧基。

就A和/或X取代基来说，上述化学式还意图包含复杂碳环结构、芳香结构和杂原子结构，这些结构的非限制性实例包括萘基、喹啉基、异喹啉基、金刚烷基和氯代苯硫基。

在此还可以使用双膦酸酯的药学上可接受的盐和衍生物。这些盐的非限制性实例包含选自以下的盐：碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和单-、二-、三-或者四-C₁-C₃₀烷基取代的铵盐。优选的盐选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铵盐。更优选钠盐。所述衍生物的非限制性实例包含选自以下的衍生物：酯、水合物和酰胺。

应当指出，在此使用的涉及本发明治疗剂的术语“双膦酸酯”的含义还包括二膦酸酯、双膦酸和二膦酸，以及这些物质的盐和衍生物。除非明确说明，在关于双膦酸酯中使用的具体命名法并不意味着对本发明范围的限制。因为当前本领域普通技术人员使用混合命名法，因此除非在本文中另有说明，在本发明中涉及双膦酸酯化合物的具体重量或者百分比基于酸活性重量。例如，短语“基于阿仑膦酸活性重量，约5mg选自阿仑膦酸酯、其药学上可接受的盐及其混合物的骨吸收抑制双膦酸酯”是指选择的双膦酸酯化合物的量以5mg阿仑膦酸为基准进行计算。

在此有用的双膦酸酯的非限制性实例包括以下：

阿仑膦酸酯(其也已知为阿仑膦酸)、4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-双膦酸、阿仑膦酸钠或者阿仑膦酸单钠三水合物、4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-双膦酸单钠三水合物。

阿仑膦酸酯描述于美国专利4,922,007中，Kieczykowski等人，颁布于1990年5月1日；5,019,651，Kieczykowski等人，颁布于1991年5月28日；5,510,517，Dauer等人，颁布于1996年4月23日；5,648,491，Dauer等人，颁布于1997年7月15日，它们的全部内容在此引入作为参考。

环庚基氨基亚甲基-1，1-双膦酸，YM175，Yamanouchi(英卡磷酸酯，以前称为cimadronate)，如Isomura等人的颁布于1990年11月13日的美国专利4,970,335所述，其全部内容在此引入作为参考。

1，1-二氯亚甲基-1，1-二磷酸(氯膦酸)和二钠盐(氯膦酸盐，Procterand Gamble)，描述于比利时专利672,205(1966)和J.Org.Chem，32，4111(1967)中，它们的全部内容都在此引入作为参考。

1-羟基-3-(1-吡咯烷基)-亚丙基-1，1-双膦酸(EB-1053)。

1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(依替膦酸)。

1-羟基-3-(N-甲基-N-戊基氨基)亚丙基-1，1-双膦酸，又名BM-210955，Boehringer-Mannheim(埃本膦酸盐)，描述于1990年5月22日颁布的美国专利No.4,927,814中，其全部内容在此引入作为参考。

1-羟基-2-咪唑并-(1，2-a)吡啶-3-基亚乙基(米诺膦酸酯)。

6-氨基-1-羟基亚己基-1，1-双膦酸(奈立膦酸酯)。

3-(二甲基氨基)-1-羟基亚丙基-1，1-双膦酸(奥帕膦酸酯)。

3-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-双膦酸(帕米膦酸酯)。

[2-(2-吡啶基)亚乙基]-1，1-双膦酸(piridronate)，描述于美国专利编号4,761,406中，其全部内容在此引入作为参考。

1-羟基-2-(3-吡啶基)-亚乙基-1，1-双膦酸(利塞膦酸酯)。

(4-氯苯基)硫甲烷-1，1-二膦酸(替鲁膦酸酯)，如美国专利4,876,248，Breliere等人，1989年10月24日中所述，其全部内容在此引入作为参考。

1-羟基-2-(1H-咪唑-1-基)-亚乙基-1，1-双膦酸(唑来磷酸酯)。

双膦酸酯的非限制性实例包含阿仑膦酸酯、cimadronate、氯屈膦酸酯、依替膦酸酯、埃本膦酸酯、英卡磷酸酯、米诺膦酸酯、奈立膦酸酯、奥帕膦酸酯、帕米膦酸酯、piridronate、利塞膦酸酯、替鲁膦酸酯和唑来磷酸酯，及其药学上可接受的盐和酯。特别优选的双膦酸酯是阿仑膦酸盐，特别是阿仑膦酸的钠、钾、钙、镁或者铵盐。优选的双膦酸盐的例证是阿仑膦酸钠盐，特别是水合阿仑膦酸钠盐。所述盐可以与整摩尔数的水或者非整摩尔数的水进行水合。优选的双膦酸盐的其它例证是水合阿仑膦酸钠盐，特别是当水合盐是阿仑膦酸单钠三水合物时。

应当认可，可以使用两种或更多种双膦酸酯活性物质的混合物。

有机双膦酸酯的精确剂量将随着给药方案、选择的具体双膦酸酯、哺乳动物或者人类的年龄、大小、性别和状态、要进行治疗的病症的性质和严重程度以及其它相关的医疗和物理因素而变化。因此，精确的药学有效量不能预先规定，可以由护理者或者临床医生即时确定。适宜的量可以通过动物模型和人类临床研究的常规试验进行确定。通常，对双膦酸酯的适宜量进行选择以获得骨吸收抑制作用，即给药骨吸收抑制量的双膦酸酯。对于人类，双膦酸酯的有效口服剂量一般为约1.5～约6000μg/kg体重，并且优选约10～约2000μg/kg体重。对于阿仑膦酸单钠三水合物，一般人类给药剂量通常为约2毫克/天～约40毫克/天，优选为约5毫克/天～约40毫克/天。对于阿仑膦酸单钠三水合物，美国目前批准的用于预防骨质疏松症的剂量是5毫克/天，用于治疗骨质疏松症的剂量是10毫克/天，用于治疗佩吉特疾病的剂量是40毫克/天。

在另一种给药方案中，双膦酸酯可以每隔一段时间给药而不是每天给药，例如每周一次给药、每周两次给药、每两周一次给药和每月两次给药。在每周一次的给药方案中，阿仑膦酸单钠三水合物将按35毫克/周或者70毫克/周的剂量给药。

“选择性雌激素受体调节剂”是指干扰或者抑制雌激素结合至受体的化合物，与机制无关。雌激素受体调节剂的实例包含但不限于雌激素、孕激素、雌二醇、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、伊多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2，2-二甲基丙酸酯、4，4′-二羟基二苯甲酮-2，4-二硝基苯基-腙和SH646。

“雌激素受体β调节剂”是一种选择性激动或者拮抗雌激素受体β的化合物(ERβ激动ERβ经ERβ介导作用促进色氨酸羟化酶基因的转录(TPH，5-羟色胺合成中的关键酶))。雌激素受体β激动剂的实例可以PCT国际公开WO01/82923(公开于2001年11月8日)和WO02/41835(公开于2002年5月20日)中发现，它们的全部内容都在此引入作为参考。

“雄激素受体调节剂”是指干扰或者抑制雄激素结合至受体的化合物，与机制无关。雄激素受体调节剂的实例包含非那甾胺以及其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他米特、必卡他胺、利阿唑和阿比特龙醋酸盐。

“破骨细胞质子三磷酸腺苷酶抑制剂”是指质子三磷酸腺苷酶的抑制剂，发现于破骨细胞的顶膜上，并且据报道，其在骨吸收过程中起着显著的作用。此质子泵代表着设计可能可以用于治疗和预防骨质疏松症和相关代谢疾病的骨吸收抑制剂的诱人目标。参见C.Farina等人，“Selective inhibitors of the osteoclast vacuolar proton ATPase as novelbone antiresorptive agents”，DDT，4：163-172(1999)，其全部内容在此引入作为参考。

“HMG-CoA还原酶抑制剂”是指3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的抑制剂。对HMG-CoA还原酶具有抑制活性的化合物可以通过使用现有技术中众所周知的验定法轻易得到鉴定。例如，参见美国专利4,231,938第6栏和WO84/02131第30～33页中描述或者引用的测定法。当在此使用时，术语“HMG-CoA还原酶抑制剂”和“HMG-CoA还原酶的抑制剂”具有相同的含义。

可以使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的实例包括但不限于洛伐他汀

参见美国专利Nos.4,231,938，4,294,926和4,319,039)、辛伐他汀(

参见美国专利Nos.4,444,784、4,820,850和4,916,239)、普伐他汀(

参见美国专利Nos.4,346,227、4,537,859、4,410,629，5,030,447和5,180,589)、氟伐他汀(

参见美国专利Nos.5,354,772、4,911,165、4,929,437、5,189,164、5,118,853、5,290,946和5,356,896)、阿伐他汀(

参见美国专利Nos.5,273,995、4,681,893、5,489,691和5,342,952)和西立伐他汀(还称为西伐他汀和参见美国专利No.5,177,080)。这些和另外可以用于本发明方法中的HMG-CoA还原酶抑制剂的结构式描述于M.Yalpani的“Cholesterol Lowering Drugs”，Chemistry&Industry，85～89页的第87页(1996年2月5日)中和美国专利Nos.4,782,084以及4,885,314中。在此使用的术语“HMG-CoA还原酶抑制剂”包含所有药学上可接受的内酯和开放酸形式(即，其中内酯环开放从而形成游离酸)，以及具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物的盐和酯形式，并且因此上述盐、酯、开放酸和内酯形式的用途都包括在本发明范围内。内酯部分的实例及其相应的开放酸形式如下结构I和II所示。

在其中可以存在开放酸形式的HMG-CoA还原酶抑制剂中，盐形式和酯形式优选可以由开放酸形成，并且所有这些形式都包含在在此使用的术语“HMG-CoA还原酶抑制剂”的含义内。优选HMG-CoA还原酶抑制剂选自洛伐他汀和辛伐他汀，并且最优选辛伐他汀。在此，关于HMG-CoA还原酶抑制剂的术语“药学上可接受的盐”将意指用于本发明中的化合物的无毒盐，它们通常通过游离酸与适当的有机或者无机碱进行反应制备，尤其是那些由阳离子形成的盐，阳离子例如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌和四甲铵，以及由胺形成的盐，胺例如氨、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苄基-2-四氢吡咯-1′-基-甲基苯并咪唑、二乙胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷。HMG-CoA还原酶抑制剂的盐形式的其它实例可以包含但不限于，醋酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙盐、右旋樟脑磺酸、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托红霉素、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基阿散酸盐、己基间苯二酸盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、乙二酸盐、pamaote、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸酯/二磷酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。

所述HMG-CoA还原酶抑制剂化合物的酯类衍生物可以作为前药，当将其吸收到恒温动物血液中去时，酯类衍生物可以以一定方式裂开以释放药物形式和使得药物提供改善的治疗效能。

以上所应用的“整联蛋白受体拮抗剂”是指选择性拮抗、抑制或者抵消生理配体结合至α_vβ₃整联蛋白的化合物，指选择性拮抗、抑制或者抵消生理配体结合至α_vβ₅整联蛋白的化合物，指拮抗、抑制或者抵消生理配体结合至α_vβ₃整联蛋白和α_vβ₅整联蛋白的化合物，和指拮抗、抑制或者抵消表达于毛细血管内皮细胞上的特定整联蛋白的化合物。该术语还指α_vβ₆、α_vβ₈、α₁β₁、α₂β₁、α₅β₁、α₆β₁和α₆β₄整联蛋白拮抗剂。该术语还指α_vβ₃、α_vβ₅、α_vβ₆、α_vβ₈、α₁β₁、α₂β₁、α₅β₁、α₆β₁和α₆β₄整联蛋白任何组合的拮抗剂。H.N.Lode和其同事，PNAS USA，96：1591-1596，1999年，在自发肿瘤转移的根除中，已经观察到血管原性α_v整联蛋白拮抗剂和肿瘤特异性抗体细胞因子(白细胞介素-2)融合蛋白之间的协同作用。他们的结果表明这种联用对于癌症和转移性肿瘤生长的治疗可能有用。α_vβ₃整联蛋白受体拮抗剂通过与所有现有药物不同的新机理抑制骨吸收。整联蛋白是介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用的异源二聚的横跨膜粘着受体。α和β整联蛋白亚单位非共价相互作用，并且以二阶阳离子依赖方式结合细胞外基质配体。破骨细胞上最大量的整联蛋白是α_vβ₃(＞10⁷/破骨细胞)，它们看来似乎在对细胞迁移和极化至关重要的细胞骨架组织中起着限速的作用。α_vβ₃的拮抗作用选自骨吸收抑制作用、再狭窄抑制作用、黄斑变性抑制作用、关节炎抑制作用和癌症以及转移性生长抑制作用。

“成骨细胞合成代谢剂”是指构造骨的试剂，例如PTH。已经表明，甲状旁腺激素(PTH)或者它的氨基末端片段及其类似物的间歇给药在动物和人类中预防、阻止、部分逆转骨损害和刺激骨生成。关于其论述，参考D.W.Dempster等人，“Anabolic actions of parathyroid hormone onbone”，Endocr Rev，14：690-709(1993)。研究已经表明了甲状旁腺激素在刺激骨生成并且从而提高骨质量和强度中的临床益处。结果报道于RM Neer等的New Eng J Med，344：1434-1441(2001)中。

此外，甲状旁腺激素相关蛋白质片段或者其类似物，例如PTHrP-(1-36)已经表明具有有效的抗钙尿作用[参见M.A.Syed等人，“Parathyroid hormone-related protein-(1-36)stimulates renal tubularcalcium reabsorption in normal human volunteers：implications for thepathogenesis of humoral hypercalcemia of malignancy”，JCEM，86：1525-1531(2001)]，并且还可以具有成为治疗骨质疏松症的合成代谢剂的可能性。

“维生素D”包括但不限于维生素D₃(胆钙化醇)和维生素D₂(麦角钙化醇)，它们是天然存在的维生素D(1α-羟基维生素D；25-羟基维生素D和1α，25-二羟基维生素D)的羟基化生物学活性代谢产物的生物学惰性前体。维生素D₂和维生素D₃在人类中具有相同的生物学效力。当维生素D₂或者D₃进入循环系统时，它通过细胞色素P₄₅₀-维生素D-25-羟化酶进行羟基化，从而得到25-羟基维生素D。所述25-羟基维生素D代谢产物是生物学惰性的，并且它在肾中通过细胞色素P450-单加氧酶25(OH)D-1α-羟化酶得到进一步羟基化，从而给出1，25-二羟基维生素D。当血清钙降低时，甲状旁腺激素(PTH)的形成增加，它通过将25-羟基维生素D转化成1，25-二羟基维生素D调节钙的体内平衡和提高血浆钙水平。

认为1，25-二羟基维生素D是维生素D对钙和骨骼代谢产生作用的物质。所述1，25-二羟基代谢产物是保持钙吸收和骨骼完整性所需的活性激素。通过将单核细胞干细胞诱化异化成破骨细胞和将钙保持在正常范围内，钙的体内平衡通过1，25-二羟基维生素D得到保持，这通过将钙羟磷灰石沉积在骨骼表面上导致骨盐沉积，参见Holick，MF，VitaminD photobiology，metabolism，and clinical applications，”In：DeGroot L，Besser H，Burger HG等人编辑，Endocrinology，第三版，990-1013(1995)。然而，升高的1α，25-二羟基维生素D₃的水平会导致血液中钙浓度升高和由骨骼代谢对钙浓度的异常调节，导致高钙血症。1α，25-二羟基维生素D₃还间接调节骨骼代谢中的破骨活性，并且可以预期其升高的水平可以增强骨质疏松症中的过度骨吸收。

“合成维生素D类似物”包括与维生素作用相似的非天然存在的化合物。

“非甾族抗炎药物”或者NSAIDs经环加氧酶(COX)-1和COX-2抑制花生四烯酸向促炎性前列腺素的代谢。NSAIDs的非限制性实例包括：阿斯匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、依托度酸、fenoporfen、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、二氟苯水杨酸、甲氯胺苯酸盐和苯丁唑酮。

“选择性环加氧酶-2抑制剂”或者COX-2抑制剂是指抑制COX-2辅酶的非甾族抗炎药物(NSAID)，其有助于体内疼痛和炎症。COX-2抑制剂的非限制性实例包括：塞来考昔、艾托考昔、帕瑞考昔、罗非考昔、伐地考昔和鲁米昔布。

“白细胞间介素-1β抑制剂”或者IL-1β是指IL-1的抑制剂，它是由活化T-淋巴细胞和加强它们对促细胞分裂剂或者抗原的响应的单核细胞、巨噬细胞和其它细胞形成的可溶性因子。IL-1β抑制剂的非限制性实例包括双醋瑞因和大黄酸。

“LOX/COX抑制剂”是指所有涉及花生四烯酸途径的三种主要酶(即，5-LOX、COX-1和COX-2)的抑制剂。LOX/COX抑制剂的非限制性实例为利克飞龙(licofelone)。

如果配制成固定剂量，那么所述组合产品使用如下所述剂量范围的本发明化合物和在其批准剂量范围内的其它药学活性剂。当组合制剂不适宜时，本发明化合物可以另外与已知的药学上可接受的试剂一起顺序使用。

与本发明化合物相关的术语“给药”及其变形(例如，“用药”化合物)，意指将化合物或者化合物的前体药物引入到需要治疗的动物系统中。当本发明化合物或者其前药与一种或多种其它活性剂(例如细胞毒素剂等等)组合提供时，应当将“给药”及其变形理解为包含所述化合物或者其前药和其它试剂同时和顺序引入。本发明包括本发明化合物的前药。通常，所述前药将是可以在体内轻易转换成所需要的化合物的本发明化合物的功能性衍生物。因此，在本发明治疗方法中，术语“给药”应该包含使用明确公开的化合物或者使用可以不必明确公开但是在给药患者后体内转化成指定化合物的化合物进行的多种所述症状的治疗。选择和制备合适前药衍生物的常规程序记载在例如“Design ofProdrugs”，编者H.Bundgaard，Elsevier，1985，将其全文引入作为参考。这些化合物的代谢产物包含当将本发明化合物引入生物环境时所产生的活性物质。

在本文中使用的术语“组合物”意图包括含有指定量的指定成分的产品，以及任何由指定量的指定成分的组合直接或者间接得到的产品。

在此使用的术语“治疗有效量”是指能够在组织、系统、动物或者人类中引起生物反应或者药物反应的活性化合物或者药物制剂的量，其由研究人员、兽医、医疗医生或者其他临床医生进行探索。

在此使用的术语疾病的“治疗”包括：预防疾病，即导致疾病的临床症状不在哺乳动物中发展，所述哺乳动物可能暴露于疾病或者易感染所述疾病，但是又没有经历或者显示疾病症状；抑制疾病，即阻止或者降低疾病或者其临床症状的发展；或者减轻疾病，即导致疾病或者其临床症状消退。

在此使用的术语“骨吸收”是指一个过程，经该过程破骨细胞降解骨。

本发明还包含用于治疗骨质疏松症或者其它骨骼病症的药物组合物，包括给药治疗有效量的本发明化合物，含有或者不含有药学上可接受的载体或者稀释剂。本发明适宜的组合物包括含有本发明化合物和药理学上可接受的载体(例如盐水，pH值水平为例如7.4)的水溶液。所述溶液可以通过局部弹丸注射引入到患者血液中。

当将根据本发明的化合物给药入人类对象时，每日剂量通常由开药医师确定，同时剂量通常依据个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度而不同。

在一个示范性应用中，将适宜量的化合物给药到对组织蛋白酶依赖状态进行治疗的哺乳动物。当用来产生所显示的效果时，本发明的口服剂量为约0.01毫克/千克体重/天(mg/kg/天)～约100mg/kg/天，优选0.01～10mg/kg/天，并且最优选0.1～5.0mg/kg/天。对于口服给药，组合物优选以片剂形式提供，其中含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100和500毫克的活性成分以便根据进行治疗的患者的症状调整给药剂量。所述药物一般含有约0.01mg～约500mg活性成分，优选约1mg～约100mg活性成分。对于静脉内给药，在恒速输液期间，最优选的剂量为约0.1～约10mg/kg/min。有利地，本发明化合物可以以单一日剂量给药，或者每日总剂量可以分为每日两次、三次或者四次剂量给药。此外，本发明的优选化合物可以以鼻内形式经局部使用合适的鼻内载体进行给药，或者经透过皮肤路线，利用那些本领域普通技术人员熟知的皮肤表层贴片形式进行给药。为了以透皮分配系统的形式进行给药，剂量给药当然将持续整个给药方案期间而非间歇性的给药。

本发明化合物可以与其它用于治疗组织蛋白酶介导症状的试剂组合使用。上述组合的单个组分可以在治疗期间的不同时间给药，或者以分开或者单一组合的形式同时给药。因此，应当将本发明理解为包含所有上述联合治疗或者轮流治疗的方案，并且术语“给药”应当据此进行理解。应当理解，本发明化合物与其它可用于治疗组织蛋白酶介导状态的试剂的组合范围原则上包含任何与可用于治疗与雌激素功能相关病症的药物组合物的组合。

因此，本发明的范围包含本发明要求保护的化合物协同第二试剂的应用，所述第二试剂选自：有机双膦酸酯；选择性雌激素受体调节剂；雄激素受体调节剂；破骨细胞质子三磷酸腺苷酶抑制剂；HMG-CoA还原酶抑制剂；整联蛋白受体拮抗剂；成骨细胞合成代谢剂，例如PTH；维生素D；合成维生素D类似物；非甾族抗炎药物；选择性环加氧酶-2抑制剂；白细胞间介素-1β抑制剂；LOX/COX抑制剂；和其药学上可接受的盐及其混合物。

根据包含于本文中的教导，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。

定义

本发明化合物可以具有不对称中心、手性轴和手性面(如E.L.Eliel和S.H.Wilen，Stereochemistry of Carbon Compounds，John Wiley&Sons，New York，1994，p1119-1190中所述)，并且可以作为外消旋物、外消旋混合物和单一非对映异构体存在，所有可能的异构体及其混合物(包括旋光异构体)都包括在本发明范围内。此外，在此公开的化合物可以以互变异构体形式存在，两种互变异构形式都意图包括在本发明范围内，即便仅仅表明了一种互变结构。例如，以下化合物A的任何权利要求都应当理解为包括互变结构B，并且反之亦然，及其混合物。

当任何组成部分中的任何变量(例如R¹、R²、R³等等)出现多于一次时，其各次出现时的定义独立于其再次出现时的定义。并且，只有当组合能够产生稳定的化合物时，取代基和/或变量的组合才是允许的。从取代基画入环系统中的线表示所示键可以连接在任何可取代环碳原子上。如果所述环为多环，那么该键仅仅连接在最接近的环上的任何适宜碳原子上。

应当理解，可以由本领域普通技术人员对本发明化合物上的取代基和取代形式进行选择，从而提供化学性质稳定并且可以通过本领域已知的方法以及以下所述方法由易于得到的原料轻易合成的化合物。如果取代基自身被多于一个基团取代，那么应当理解所述多个基团可以在相同碳原子上或者在不同碳原子上，只要得到稳定结构即可。短语“任选被一个或者多个取代基取代”应当理解为等价于短语“任选被至少一个取代基取代”，在所述情形中，优选实施方案将具有0～3个取代基。

除非另作说明，在此使用的“烷基”意图包括具有1～10个碳原子的支链和直链的饱和脂族烃基。例如，在“C₁～C₁₀烷基”中的C₁～C₁₀定义为包括在直链、支链或者环状结构中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个碳原子的基团。例如，“C₁～C₁₀烷基”特别包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基等等。

除非另有说明，术语“卤代烷基”指由1-5个，优选1-3个卤素取代的如上定义的烷基。代表性实例包括但不限于三氟甲基、二氯乙基等。

在此使用的“芳基”是指任何稳定的在各环中具有至多12个原子的单环或者二环碳环，其中至少一个环是芳香环。上述芳基单元的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基或者苊基。在芳基取代基是二环并且一个环是非芳香环的情况中，可以理解，所述连接是通过芳环进行的。

在此使用的术语“杂芳基”表示各环中具有至多10个原子的稳定的单环、二环或者三环，其中至少一个环是芳香环并且含有1～4个选自O、N、和S的杂原子。在此定义范围内的杂芳基包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并

唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、二氢吲哚基、吲哚基、中氮茚基(indolazinyl)、吲唑基、异苯并呋喃基、异氮杂茚基、异喹啉基、异噻唑基、异

唑基、萘吡啶基、二唑基、

坐基、

唑啉、异

唑啉、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并

唑基、二氢吲哚基、二氢喹啉基、亚甲二氧基苯、苯并噻唑基、苯噻吩基、喹啉基、异喹啉基、唑基和四氢喹啉。在其中杂芳基取代基是二环取代基并且一个环是非芳香环或者不包含杂原子的情况下，可以理解，所述连接分别通过芳环或者通过含杂原子的环进行。如果杂芳基含有氮原子，可以理解，其相应的N-氧化物也包含在该定义中。

如熟练的技术人员所理解，在此使用的“卤代”或者“卤素”意指包括氯、氟、溴和碘。

在某些情况下，取代基可以被定义具有一定范围(包括零)的碳，例如(C₀-C₆)亚烷基-芳基。如果芳基为苯基，则该定义将包括苯基自身以及-CH₂Ph，-CH₂CH₂Ph，CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)Ph等等。

本发明还包括式I化合物的N-氧化物衍生物和受保护的衍生物。例如，当式I化合物含有可氧化的氮原子时，可以通过本领域熟知的方法将氮原子转化成N-氧化物。并且，当式I化合物含有比如羟基、羧基、硫醇或者任何含有氮原子的基团时，可以用适当的保护基对这些基团进行保护。适当保护基的综合目录可以在T.W.Greene，Protective Groups inOrganic Synthesis，John Wiley&Sons，Inc.，1981中发现，其全部内容在此引入作为参考。式I化合物的受保护衍生物可以通过本领域熟知的方法进行制备。

本发明化合物的药学上可接受的盐包括无机或者有机酸形式的本发明化合物的常规无毒盐。例如，常规的无毒盐包括由无机酸得到的盐，所述无机酸比如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸和硝酸等等，以及由有机酸制备的盐，所述有机酸比如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、安息香酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基-安息香酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙基二磺酸、草酸、羟乙磺酸和三氟乙酸等等。如上所述药学上可接受的盐以及其它一般药学上可接受的盐的制备由Berg等人，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.，1977，66：1-19进行了更全面的描述，其全文在此引入作为参考。本发明化合物药学上可接受的盐，可以由含有碱性或者酸性部分的本发明化合物通过常规化学方法进行合成。通常，碱性化合物的盐或者通过离子交换色谱法进行制备，或者通过在适当溶剂或者多种溶剂组合中，使游离碱与化学计算量或者与过量的形成期望盐的无机酸或有机酸反应进行制备。类似地，酸性化合物的盐通过与适宜的无机或者有机碱反应而得到形成。

对于本说明书目的，以下缩略语具有所示含义：

BuLi＝正丁基锂

CBr₄＝四溴甲烷

CH₂Cl₂＝二氯甲烷

CHCl₃＝氯仿

(CH₃O)₂CO＝碳酸二甲酯

DAST＝二乙基氨基三氟化硫

DIBAL-H＝二异丁基氢化铝

DIPEA＝二异丙基乙胺

DMF＝N，N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲亚砜

Et₃E＝三乙胺

EtOH＝乙醇

KH₂PO₄＝磷酸二氢钾

HCl＝氢氯酸

LG＝离去基团

MeOH＝甲醇

MgBr＝溴化镁

MgSO₄＝硫酸镁

Na₂CO₃＝碳酸钠

NaOMe＝甲醇钠

Na₂SO₄＝硫酸钠

PCl₅＝五氯化磷

PdCl₂(dppf)＝[1，1′-二(二苯膦基)二茂铁]二氯化钯(II)

PG＝保护基

PPh₃＝三苯基膦

Pr₂NEt＝N，N-二异丙基乙胺

PyBOP＝苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)

-六氟磷酸盐

rt＝室温

sat.aq.＝饱和水溶液

TBAF＝四丁基氟化铵

TfO＝三氟甲烷磺酸盐

THF＝四氢呋喃

tlc＝薄层色谱法

TMSBr＝溴代三甲基甲硅烷

Me＝甲基

Et＝乙基

n-Pr＝正丙基

i-pr＝异丙基

n-Bu＝正丁基

i-Bu＝异丁基

s-Bu＝仲丁基

t-Bu＝叔丁基

方案

本发明的化合物可以根据如下所示的方案1制备。被结合到可接受的手性助剂的受保护的4-羟基-2-丁烯酸与合适的2-取代的-1，3-丁二烯在合适的路易斯酸催化剂的存在下于低温进行Diels-Alder反应。非对映体富集烯醇-醚的中间体与含水酸的水解产生酮，其通过用合适的卤化试剂例如DAST、PCl₅或肼/CuCl₂/Et₃N处理而转化为相应的偕-二卤化的化合物(R¹，R²＝氯或氟)。备选地，该助剂可以在引入卤素取代基之前被除去。手性助剂的还原去除将对映体富集(其被氧化为醛并且与4-(甲硫基)-苯基乙酸酯的金属化衍生物反应)的醇释放出来。所得羟醇的氧化得到了酮-酯，其与N-单取代的-肼在合适的催化剂存在下反应得到羟基吡唑。该羟基基团随后转化为合适的离去基团(例如氯、溴、碘或烷基/芳基磺酸酯)并且甲基硫醚被氧化为相应的甲基砜。用氢在钯/炭的存在下处理得到离去基团的还原去除。保护基团随后的断裂将伯醇释放出来，其被氧化为相应的羧酸并且偶合到1-氨基环丙烷腈得到本发明的化合物。

方案1

本发明的化合物也可以根据方案2制备，如下所示。由此，来自1，3-丁二烯和N¹-取代-(2E)-3-(4-溴-1H-吡唑-3-基)-丙-2-烯酸的Diels-Alder加成物(参见WO2005/000800的实施例4)可以通过TMSBr/DMSO/DIPEA而转化为溴代内酯(参见Miyashita，K.；Tanaka，A.；Mizuno，H.；Tanaka，M.；Iwata，C.J.Chem.Soc.PerkinTrans.1，1994，847-851)。甲醇盐催化的内酯开环提供了溴代羟基酯，其通过氧化醇随后例如用锌的还原脱溴化而转化为相应的酮。所述酮随后通过用DAST或肼/CuCl₂/Et₃N处理来分别转化为相应的偕-二溴(R¹，R²＝F)或偕-二氯(R¹，R²＝Cl)化合物(参见Takeda，T.；Sasaki，R.；Yamauchi，S.；Fujiwara，T.Tetrahedron1997，53，557)。用含水碱来皂化酯官能团，用1-氨基-环丙烷腈偶合，氧化甲基硫醚为相应的甲基砜，提供本发明的化合物。

方案2

以下实施例描述了所选的本发明化合物的合成，且用于阐述性目的，并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺

二异丙基乙基胺(51mL，290mmol)被缓慢加入到机械搅拌的0℃浆料(由在乙腈(260mL)中的{2-[(4R)-4-苄基-2-氧代-1，3-

唑烷-3-基]-2-氧代乙基}膦酸酯(94.8g，267mmol；参见Shapiro，G.；Chengzhi，C.Tetrahedron Lett.1992，33，2447)和干燥的氯化锂(12.5g，280mmol)组成)。搅拌10min之后，将2-苄基氧基乙醛(40.0g，267mmol)在乙腈(20mL)中的溶液在10分钟内滴加。随后除去冷却浴，将反应混合物在室温搅拌12小时，随后在醚和水之间分配，层分离。用额外的醚萃取含水相，将合并的有机相(总共700mL)与2M HCl(350mL)在rt搅拌1小时。随后用饱和NaCl和NaHCO₃水溶液洗涤有机相，然后经Na₂SO₄和MgSO₄的混合物干燥，真空浓缩。硅胶上的残余物的快速色谱法(用10/90丙酮/苯洗脱)得到(4R)-4-苄基-3-[(2E)-4-(苄基氧基)丁-2-烯酰基]-1，3-

唑烷-2-酮，用醚研制则为无色固体。

¹HNMR(500MHz，d₆-丙酮)δ7.57(1H，d，J＝15.6Hz)，7.43-7.27(10H，m)，7.21-7.15(1H，m)，4.84(1H，t，J＝8.2Hz)，4.64(2H，s)，4.43(1H，t，J＝8.5Hz)，4.32(2H，m)，4.29(1H，dd，J＝2.9，8.9Hz)，3.24(1H，dd，J＝3.1，13.5Hz)，3.03(1H，dd，J＝8.4，13.5Hz).

Et₂AlCl(1.8M，在甲苯中，158mL，284mmol)溶液沿烧瓶壁缓慢加入到(4R)-4-苄基-3-[(2E)-4-(苄基氧基)丁-2-烯酰基]-1，3-

唑烷-2-酮(70.9g，202mmol)在CH₂Cl₂(200mL)中的-78℃溶液。10分钟之后，将2-(三甲基甲硅烷基)氧基-1，3，-丁二烯(100g，700mmol)在CH₂Cl₂(120mL)中的溶液以相同方式在15分钟内引入。在-78℃继续搅拌过夜(18h)。然后将反应烧瓶内容物温热到-50℃。然后在45分钟内小心加入THF(150mL)和6M HCl(150mL)组成的溶液，随后在rt搅拌1小时。随后将水、乙酸乙酯和C

加入，混合物过滤通过C

垫。将滤出物转移到分液漏斗并且分层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相，经Na₂SO₄和MgSO₄的混合物干燥并真空浓缩。对硅胶上的残余物进行快速色谱法(用13/87乙酸乙酯/苯洗脱)得到(4R)-4-苄基-3-({(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4-氧代环己基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮，为无色固体。

¹HNMR(400MHz，d₆-丙酮)δ7.38-7.32(6H，m)，7.31-7.25(4H，m)，4.59-4.53(1H，m)，4.47(2H，q，J＝8.5Hz)，4.19(1H，dd，J＝3.0，9.0Hz)，4.15-4.09(1H，m)，4.03(1H，t，J＝8.6Hz)，3.53-3.47(2H，m)，3.13(1H，dd，J＝3.4，13.6Hz)，2.97(1H，dd，J＝8.2，13.5Hz)，2.70-2.60(1H，m)，2.54-2.46(1H，m)，2.44(2H，d，J＝9.3Hz)，2.41-2.29(2H，m)，1.92-1.82(1H，m).

将

(21mL，110mmol)在5分钟内缓慢加入到CH₂Cl₂(100mL)中(4R)-4-苄基-3-({(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4-氧代环己基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮(18.7g，44.4mmol)的0℃溶液中。在该温度2小时之后，通过小心加入等体积的冰水猝灭反应。相分离之后，用CH₂Cl₂萃取水层，合并的有机物用水和饱和NaHCO₃水溶液洗涤，干燥(Na₂SO₄)。将含有粗产物的二氯甲烷溶液浓缩到100mL体积，用纯化的间氯过苯甲酸(6.0g，35mmol)在rt搅拌处理3小时。随后加入额外的CH₂Cl₂(100mL)，然后是Me₂S(3mL)和Ca(OH)₂(20g)，在rt搅拌15分钟。通过C

过滤浆料并且真空浓缩滤出物。对在硅胶上的残余物进行的快速色谱法(1/3乙酸乙酯/己烷洗脱)得到(4R)-4-苄基-3-({(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮，为稠的无色液浆。

¹H NMRδ(500MHz，d₆-丙酮)7.36-7.32(6H，m)，7.26(4H，dd，J＝7.3，24.1Hz)，4.54-4.50(1H，m)，4.48-4.42(2H，m)，4.19-4.15(1H，m)，3.99(1H，t，J＝8.6Hz)，3.80-3.74(1H，m)，3.47(2H，d，J＝5.5Hz)，3.13-3.09(1H，m)，2.94(1H，dd，J＝8.2，13.5Hz)，2.56-2.48(1H，m)，2.26-2.12(3H，m)，1.95-1.71(3H，m).

在0℃将n-BuLi溶液(2.5M，在己烷中，10mL)缓慢加入到苄硫醇(3.6mL，40mmol)在THF(40mL)中的溶液中。将所得浅黄色溶液在0℃搅拌10min，随后引入(4R)-4-苄基-3-({(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮(8.52g，19.2mmol)在THF(30mL)中的溶液。10min之后，将LiAlH₄溶液(1.0M，在THF中，22mL)缓慢加入到反应混合物中，在0℃继续搅拌45min。然后将冰水缓慢加入以破坏过量的氢化物，随后加入6M HCl(20mL)到pH1。用两份乙酸乙酯萃取混合物，并且用饱和含水NaCl洗涤合并的有机物，经Na₂SO₄干燥。真空浓缩并且对在硅胶上的残余物进行的快速色谱法(用45/55乙酸乙酯/己烷洗脱)得到{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}甲醇，其为稠的无色液浆。

¹H NMR(500MHz，d₆-丙酮)δ7.36(4H，m)，7.34-7.28(1H，m)，4.56-4.49(2H，m)，3.67-3.53(5H，m)，2.20-2.12(1H，m)，2.09-2.02(1H，m)，1.91-1.71(4H，m)，1.58-1.50(2H，m).

在0℃将Dess-Martin periodinane(9.84g，23.2mmol)加入到(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}甲醇(5.01g，20.2mmol)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液。将混合物在0℃搅拌5min，然后在rt搅拌1h。加入乙酸乙酯(100mL)、NaHCO₃的饱和水溶液(100mL)、水和Na₂S₂O₃·5H₂O(28.9g，120mmol)，在rt搅拌30分钟。各层分离且水相由额外的乙酸乙酯萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机物并干燥(Na₂SO₄)。真空浓缩，且用16/84乙酸乙酯/己烷洗脱的硅胶上的快速色谱法得到(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己烷甲醛，为无色液体。

1H

NMR(500MHz，d₆-丙酮)δ9.66(1H，d，J＝3.0Hz)，7.37-7.33(4H，m)，7.31-7.29(1H，m)，4.52(2H，m)，3.55(1H，dd，J＝4.8，9.3Hz)，3.51-3.45(1H，m)，2.43-2.33(2H，m)，2.20-2.12(2H，m)，1.98-1.66(4H，m).

n-BuLi(11mL，23mmol)在己烷中的2.1M溶液被缓慢加入到二异丙基胺(4.0mL，28mmol)在THF(10mL)中的0℃溶液。在该温度继续搅拌额外的10分钟，随后冷却到-78℃。[4-(甲硫基)苯基]乙酸乙酯(4.64g，18.9mmol)在THF(15mL)中的溶液随后被引入且混合物在-78℃搅拌10min，在-40℃搅拌10min，最后在0℃搅拌5min。将溶液再冷却到-78℃且在5min内沿着烧瓶壁加入(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己烷甲醛(4.64g，18.9mmol)在THF(15mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌30min，然后在-40℃搅拌1h。加入NH₄Cl的饱和水溶液，然后将反应混合物温热到rt且在乙酸乙酯和水之间分配。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相并经Na₂SO₄干燥。真空浓缩且在由3/7乙酸乙酯/己烷洗脱的硅胶上的快速色谱法得到3-{2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-3-羟基-2-[4-(甲硫基)苯基]丙酸乙酯，为浅黄色稠液浆。

¹H NMR(400MHz，d₆-丙酮)δ7.43-7.33(5H，m)，7.33-7.29(2H，m)，7.15-7.11(2H，m)，4.66(1H，m)，4.57-4.49(2H，m)，4.16-4.00(2H，m)，3.74(2H，d，J＝10.7Hz)，3.45(1H，dd，J＝2.8，9.5Hz)，2.46(3H，s)，1.84-1.75(2H，m)13.5Hz)，1.73-1.63(1H，m)，1.17(3H，t，J＝7.1Hz).

将草酰氯(2.9mL，34mmol)滴加到-78℃的二甲基亚砜(2.9mL，41mmol)在CH₂Cl₂(40mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌额外的10min，随后沿着烧瓶壁缓慢引入3-{2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-3-羟基-2-[4-(甲硫基)苯基]丙酸乙酯(5.09g，10.6mmol)和三乙基胺(16mL，120mmol)在CH₂Cl₂(40mL)中的溶液。混合物在-78℃保持额外的10min，随后快速温热到rt，随后倾入分液漏斗中的2M HCl。振荡各层且分层，用额外份额的CH₂Cl₂萃取含水相。合并的有机物用水洗涤，干燥(Na₂SO₄)且浓缩。对在硅胶上的残余物进行的快速色谱法(用1/4乙酸乙酯/己烷洗脱)得到3-{2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-2-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代丙酸乙酯，为稠的棕褐色液浆。

将3-{2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-2-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代丙酸乙酯(4.43g，9.31mmol)，1，1，2，2-四氯乙烷(100mL)和MgSO₄(50g)组成的浆料在120℃加热3天。随后在冰和水(200mL)中冷却混合物，随后加入6M HCl至pH1。分层且用两份CH₂Cl₂萃取含水相。用水洗涤合并的有机物，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。在用15/85丙酮/苯洗脱的硅胶上的快速色谱法得到3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲硫基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-醇，作为黄色泡沫。

¹H NMR(400MHz，d₆-丙酮)δ9.66(1H，br s)，7.36-7.26(5H，m)，7.20(4H，m)，4.78(1H，m)，4.37(1H，d，J＝11Hz)，4.30(1H，d，J＝11Hz)，3.38(2H，m)，2.75-2.92(3H，m)，2.50(3H，s)，2.41(1H，m)，2.23(1H，m)，2.00-1.75(4H，m).

3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲硫基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-醇(3.95g，7.5mmol)和吡啶(0.95mL，12mmol)在CH₂Cl₂(30mL)中的溶液被冷却到0℃且用三氟甲烷磺酸酐(1.5mL，9.2mmol)处理。在0℃15分钟后，反应容器内容物在水和CH₂Cl₂之间分配，分离各层。用额外份额的CH₂Cl₂萃取含水层且合并的有机物用水洗涤，干燥(Na₂SO₄)且浓缩。在用15/85乙酸乙酯/己烷洗脱的硅胶上的快速色谱法得到3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲硫基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基三氟甲烷磺酸酯，为浅黄色固体。

在0℃加入1份纯化的间-氯代过氧化苯甲酸(2.62g，15.2mmol)到3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲硫基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基三氟甲烷磺酸酯(4.36g，6.63mmol)在CH₂Cl₂(40mL)中的溶液。所得浆料在0℃搅拌5min，然后在rt搅拌30min，随后用CH₂Cl₂(40mL)稀释处理，用二甲基硫化物(0.25mL)和Ca(OH)₂(9.0g，160mmol)处理。在rt搅拌10min之后，过滤(C

)混合物，真空浓缩滤出物。在用3/7乙酸乙酯/己烷洗脱的硅胶上的快速色谱法得到3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基三氟甲烷磺酸酯，为无色泡沫。

¹HNMRδ¹HNMR(400MHz，d₆-丙酮)δ7.97(2H，d，J＝8.1Hz)，7.70(2H，d，J＝8.1Hz)，7.36-7.26(3H，m)，7.19(2H，m)，5.17-5.07(2H，m)，4.35(1H，d，J＝11.9Hz)，4.28(1H，d，J＝11.9Hz)，3.37-3.27(2H，m)，3.13(3H，s)，2.97(1H，m)2.41(1H，m)，2.22(1H，m)，2.10-2.02(2H，m)，2.00-1.80(3H，m).

将3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基三氟甲烷磺酸酯(4.54g，6.58mmol)和10％钯/炭(2.20g)的混合物在乙酸乙酯(60mL)中于rt在氢气氛下一起搅拌16h。通过C

过滤，浓缩滤出物且在用45/55乙酸乙酯/己烷洗脱的硅胶上的快速色谱法得到3-{{1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑，为无色稠液浆。

将3-{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}-4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑(2.15g，3.97mmol)和Pearlman′s催化剂(1.0g)的混合物在含有乙酸(5mL)的乙酸乙酯(50mL)中于rt在氢气氛下一起搅拌20h。随后将反应混合物过滤通过C

垫，且滤出物用NaHCO₃和NaCl的饱和水溶液洗涤，随后经Na₂SO₄干燥。真空溶剂去除得到{(1R，2R)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己基}甲醇，为浅黄色稠液浆。

¹HNMR(400MHz，丙酮d₆)δ8.06(1H，s)，7.96(2H，d，J＝8.4Hz)，7.79(2H，d，J＝8.4Hz)，5.08(2H，q，J＝8.8Hz)，3.70(1H，m)，3.47(1H，m)，3.36(1H，m)，3.16(3H，s)，3.09(1H，m)，2.38(1H，m)，2.25(1H，m)，2.15-1.30(5H，m).

在0℃用Jones试剂(3.8mL)处理丙酮(40mL)中的{(1R，2R)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己基}甲醇(1.64g，3.63mmol)溶液，随后在rt搅拌30min。加入水并且混合物用两份乙酸乙酯萃取。用水洗涤合并的有机物两次，然后用饱和的NaCl水溶液洗涤，随后经Na₂SO₄干燥。真空浓缩得到(1R，2R)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷羧酸，为浅黄色泡沫。

加入1份二异丙基乙基胺(3.2mL，18mmol)到(1R，2R)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷羧酸(1.69g，3.63mmol)，1-氨基环丙烷腈盐酸盐(1.16g，9.83mmol)和HATU(1.72g，4.53mmol)在DMF(10mL)中的溶液，在rt搅拌2.5h。随后反应容器内容物在乙酸乙酯和水之间分配且各层分离。用额外的乙酸乙酯萃取含水相且用2M HCl、10％Na₂CO₃和饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机物，随后经Na₂SO₄干燥。真空浓缩且在用22.5/77.5丙酮/苯洗脱的硅胶上的快速色谱法提供标题化合物，其一旦用己烷和醚的混合物研制则成为无色粉末.

¹H NMR(400MHz，丙酮d₆)δ8.03(1H，s)，7.99(2H，d，J＝8.5Hz)，7.83(1H，重叠m)，7.81(2H，d，J＝8.5Hz)，5.05(2H，q，J＝8.8Hz)，3.36(1H，m)，3.18(3H，s)，3.12(1H，m)，2.23(1H，m)，2.15-1.95(4H，m)，1.79(1H，m)，1.37(2H，m)，1.05(1H，m)，0.81(1H，m).MS：(+ESI)531.0[M+H]⁺.

实施例2

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氯-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺

将三氟甲烷磺酸三甲基甲硅烷基酯(2.5mL)滴加到(4R)-4-苄基-3-({(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4-氧代环己基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮(57.89g，138mmol)和1，2-双-(三甲基甲硅烷基氧基)乙烷(35.4g，172mmol)在CH₂Cl₂(400mL)中的0℃溶液，随后在rt搅拌4h。随后在0℃加入三乙基胺(3mL)，且混合物由饱和NaHCO₃水溶液洗涤并经Na₂SO₄干燥。真空浓缩得到(4R)-4-苄基-3-({(7R，8R)-7-[(苄基氧基)甲基]-1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮，为棕褐色稠液浆。

¹H NMR(500MHz，d₆-丙酮)δ7.36-7.22(10H，m)，4.48(1H，m)，4.42(2H，s)，4.11(1H，dd，J＝3.1，8.9Hz)，3.97(4H，m)，3.94-3.90(1H，t，J＝9.0Hz)，3.67(1H，m)，3.44-3.38(2H，m)，3.09(1H，dd，J＝3.3，13.5Hz)，2.92(1H，dd，J＝8.3，13.5Hz)，2.52(1H，m)，1.97(1H，m)，1.86-1.76(3H，m)，1.57-1.50(1H，m)，1.44(1H，t，J＝12.8Hz).

在0℃将n-BuLi溶液(2.4M，在己烷中，75mL)缓慢加入到苄基硫醇(25mL，210mmol)在THF(250mL)中的溶液。将所得浅黄色的溶液在0℃搅拌15min，然后引入(4R)-4-苄基-3-({(7R，8R)-7-[(苄基氧基)甲基]-1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基}羰基)-1，3-

唑烷-2-酮(64.2g，138mmol)在THF(250mL)中的溶液。30min之后，将LiAlH₄溶液(1.0M，在THF中，150mL)缓慢加入到反应混合物中，在0℃继续搅拌30min。随后将冰水(15mL)缓慢加入以破坏过量氢化物，随后加入6M HCl(110mL)至pH4。用两份乙酸乙酯萃取混合物且用饱和的NaCl水溶液洗涤合并的有机物并经Na₂SO₄干燥。真空浓缩且对在硅胶上的残余物进行的快速色谱法(用20/80丙酮/苯洗脱)得到{(7R，8R)-7-[(苄基氧基)甲基]-1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基}甲醇，为浅黄色稠液浆。

¹H NMR(500MHz，d₆-丙酮)δ7.36(4H，m)，7.29(1H，m)，4.50(2H，q，J＝9.6Hz)，3.90(4H，s)，3.61(1H，m)，3.52-3.42(3H，m)，3.43(1H，t，J＝5.5Hz)，1.88-1.72(4H，m)，1.55-1.41(4H，m)..

将在乙酸(220mL)和水(80mL)混合物中的{(7R，8R)-7-[(苄基氧基)甲基]-1，4-二氧杂螺[45]癸-8-基}甲醇(33.6g，115mmol)组成的溶液在85℃加热2h。减压下旋转蒸发除去溶剂，残余物在乙酸乙酯和水之间分配。用额外份额的乙酸乙酯萃取含水相，且用饱和的NaHCO₃和NaCl水溶液洗涤合并的有机物，经Na₂SO₄和MgSO₄的混合物干燥。真空浓缩得到黄色液浆，将其置于甲醇(250mL)中，用K₂CO₃(20g，150mmol)在rt搅拌处理30min。随后蒸发甲醇且将残余物至于乙酸乙酯中且用水、饱和的NaCl溶液洗涤，经Na₂SO₄和MgSO₄的混合物干燥。真空浓缩得到(3R，4R)-3-[(苄基氧基)甲基]-4-(羟基甲基)环己酮，其为黄色的稠液浆。

¹H NMR(500MHz，d₆-丙酮)δ7.36(4H，m)，7.30(1H，m)，4.56-4.50(2H，m)，3.70(1H，m)，3.66-3.60(2H，m)，3.56(1H，dd，J＝5.4，9.3Hz)，3.54-3.48(1H，dd，J＝4.0，9.3Hz)，2.44-2.26(4H，m)，2.13-2.07(2H，m)，1.91(1H，m)，1.67(1H，m).

将水合肼(110mL.2.3mol)加入到活性4A分子筛粉末(110g)在甲醇(350mL)中的悬浮液，在rt搅拌15分钟。随后将甲醇(300mL)中(3R，4R)-3-[(苄基氧基)甲基]-4-(羟基甲基)环己酮(27.7g，112mmol)的溶液加入，混合物在rt搅拌3h。过滤除去分子筛，用甲醇充分洗涤。在高度真空下旋转蒸发来蒸发掉甲醇和过量肼并在50℃加热除去最后痕量的肼。同时，在rt用三乙基胺(55mL，400mmol)搅拌处理甲醇(370mL)中的CuCl₂(106.6g，795mmol)溶液15min，随后冷却到0℃。将甲醇(300mL)中的粗腙溶液随后在35min内滴加，随后在4h内缓慢温热到10℃。蒸发甲醇，残余物在乙酸乙酯和水之间分配，且加入浓缩的NH₄OH直到所有固体溶解。振荡各层并分离，用额外的乙酸乙酯萃取含水相。用浓缩的NH₄OH水溶液、饱和NH₄Cl和NaCl水溶液洗涤合并的有机物，随后经Na₂SO₄和MgSO₄的混合物干燥。真空浓缩，对在硅胶上的残余物进行的快速色谱法(用2/3乙酸乙酯/己烷洗脱)得到{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氯环己基}甲醇，为浅黄色液浆。

¹H NMR(500MHz，d₆-丙酮)δ7.37(4H，m)，7.31(1H，m)，4.51(2H，q，J＝12.2Hz)，3.65-3.51(5H，m)，2.66(1H，dt，J＝3.9，14.3Hz)，2.54(1H，dq，J＝3.3，13.8Hz)，2.29-2.19(2H，m)，1.86(1H，m)，1.75(1H，m)，1.56(1H，m).

由{(1R，2R)-2-[(苄基氧基)甲基]-4，4-二氟环己基}甲醇根据用于制备实施例1的流程将该物质转化为标题化合物(无色粉末)。

¹HNMR(500MHz，丙酮d₆)δ8.03(1H，s)，8.01(1H，重叠br s)，7.98(2H，d，J＝8.4Hz)，7.80(2H，d，J＝8.4Hz)，5.06(2H，q，J＝8.8Hz)，3.43(1H，m，)，3.29(1H，dt，J＝3.3，11.7Hz)，3.19(3H，s)，2.71(1H，m)，2.58-2.68(3H，m)，2.00-1.94(2H，m)，1.43-1.31(2H，m)，1.10(1H，m)，0.86(1H，m).MS：(+ESI)563.1[M+H]⁺.

实施例3

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺

N-(氰基甲基)-5，5-二氟-2-{1-甲基-3-[4-(甲硫基)苯基]-1H-吡唑-4-基}环己烷甲酰胺(参见WO2005/000800实施例4)(795mg，1.84mmol)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液在0℃由纯化的m-CPBA(760mg，4.40mmol)处理，在该温度搅拌30min。加入二甲基硫化物以猝灭过量m-CPBA且混合物在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。有机相被干燥(Na₂SO₄)且浓缩，残余物通过在二氧化硅上的快速色谱法纯化得到无色粉末的标题化合物。

¹HNMR(500MHz，丙酮d₆)：δ7.92(2H，d，J＝8.5Hz)，7.80(1H，s)，7.77(1H，s)，7.72(2H，d，J＝8.5Hz)，3.88(3H，s)，3.28(1H，m)，3.14(3H，s)，3.03(1H，m)，2.20(1H，m)，2.10-1.90(4H，m)，1.80(1H，m)，1.35(1H，m)，1.30(1H，m)，1.00(1H，m)，0.77(1H，m).MS：(+ESI)463.1[M+H]⁺.

实施例4

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氯-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

根据实施例3的流程制备为无色粉末，用DAST替代肼/CuCl₂/Et₃E(参见Takeda，T.；Sasaki，R.；Yamauchi，S.；Fujiwara，T.Tetrahedron1997，53，557)用于反应。

¹HNMR(500MHz，丙酮d₆)：δ7.92(2H，d，J＝8.5Hz)，7.87(1H，s)，7.80(1H，s)，7.71(2H，d，J＝8.5Hz)，3.88(3H，s)，3.33(1H，m)，3.20(1H，m)，3.13(3H，s)，2.67(1H，m)，2.55-2.40(3H，m)，1.95-1.90(2H，m)，1.38(1H，m)，1.32(1H，m)，1.03(1H，m)，0.80(1H，m).MS(+ESI)：495.0[M+H]⁺.

实施例5

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

根据Butler和Dewald(参见Butler，D.E.；Dewald，H.A；J.Org.Chem.1975，40，1353)的流程对5，5-二氟-2-{1-甲基-4-[4-(甲硫基)苯基]-1H-吡唑-3-基}环己烷羧酸中的吡唑脱甲基(参见WO2005/000800中的实施例4)得到5，5-二氟-2-{4-[4-(甲硫基)苯基]-1H-吡唑-3-基}环己烷羧酸。通过与1-氨基环丙烷腈偶合且用m-CBPA氧化(根据前述实施例中的标准流程)将该化合物转化为标题化合物。

¹HNMR(400MHz，丙酮d₆)：δ12.2(1H，brs)，7.97(2H，m)，7.92(1H，br s)，7.78(2H，m)，7.77(1H，s)，3.38(1H，br m)，3.18(3H，s)，3.10(1H，m)，2.22(2H，m)，2.10(2H，m)，2.00(2H，m)，1.35(2H，m)，0.98(1H，m)，0.74(1H，m).MS(+ESI)：449[M+H]⁺

药物组合物

作为本发明的具体实施方案，将100mg(1R，2R)-5，5-二氟-N-(1-氰基环丙基)-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺与充分细碎的乳糖一起进行配制，从而得到总量580～590mg，将其装填在0号的硬胶囊中。

在本申请中公开的化合物在以下测定中显示出了活性。此外，公开于本申请中的化合物相对于先前公开的化合物具有增强的药理学谱。

测定

组织蛋白酶K测定

在二甲亚砜(DMSO)中，对试验化合物浓度为500μM～0.0085μM的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和在测定缓冲液溶液中的25μL人类组织蛋白酶K(0.4nM)中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。水解香豆素离去基团(AMC)，随后进行10分钟分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)。通过将实验值拟合至剂量响应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。

组织蛋白酶L测定

在二甲亚砜(DMSO)中，对浓度为500μM～0.0085μM的试验化合物的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶L(0.5nM)的测定缓冲液溶液中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。水解香豆素离去基团(AMC)，随后进行10分钟分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)。通过将实验值拟合至剂量响应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。

组织蛋白酶B测定

在二甲亚砜(DMSO)中，对浓度为500μM～0.0085μM的试验化合物的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶B(4.0nM)的测定缓冲液溶液中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。水解香豆素离去基团(AMC)，随后进行10分钟分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)。通过将实验值拟合至剂量响应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。

组织蛋白酶S测定

在二甲亚砜(DMSO)中，对浓度为500μM～0.0085μM的试验化合物的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶S(20nM)的测定缓冲液溶液中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。水解香豆素离去基团(AMC)，随后进行10分钟分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)。通过将实验值拟合至剂量响应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。

在大鼠中的药物动力学

在大鼠中的口服(PO)药物动力学

方法：

根据加拿大议会关于动物饲养的准则对动物进行圈养、进食和照顾。

在各次PO血液水平研究之前，将雄性Sprague Dawley大鼠(250-400g)禁食过夜。

一次将大鼠置于制动器中一只并且将箱体牢牢固定。通过从尾部顶端划破一小片(1mm或者更小)伤口，获得零血样。然后通过稳定但是平缓的从顶部到底部的动作对尾部进行冲击将血液挤出。将大约0.5mL血液收集入肝素化的真空采血管中。

根据需要，将化合物制备成10mL/kg的标准剂量体积，并且通过16号(gauge)、3″灌食针进行口服给药进入食道内。

随后按照与零血样相同的方式进行血液收集，但是不再需要划破尾部。用一片纱布将尾部擦净并且如上所述挤入/冲击入适当标记的管中。

在取样之后，立即对血液进行离心、分离，将血浆置入清楚标记的管形瓶中并且将其贮存入冷冻机中，直至进行分析。

在PO给药之后，测定大鼠血液的一般时点为：

0、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h

在放血4小时时点之后，将食物任意提供给大鼠。在研究期间一直提供水。

赋形剂：

可以将以下赋形剂(具有相应的剂量体积)用于PO大鼠血液水平测定中：

PEG200/300/400(在水中为0-60％)：等于或者小于10mL/kg

甲基纤维素制剂(在水中为0.5％-1.0％)：等于或者小于10mL/kg

Tween80(在水中为1-10％)：等于或者小于10mL/kg

用于PO血液水平研究的化合物可以为混悬剂形式。为了获得更好的均一性，可以将上述混悬剂置入超声波发生器中大约5分钟。

为了进行分析，用1.2～1.5倍体积的任选含有内标的乙腈对试样进行稀释并且对其进行离心，从而除去蛋白沉淀物。将上清液直接注射入带有质谱(MS)或者紫外线吸光度(UV)或者荧光(Fluo)检测的C-18HPLC柱中。相对于利用掺入了在任选含有内标的乙腈中已知量药物的清洁血样得到的标准曲线，进行定量。将另外任选含有内标的乙腈加入至初始血液量的1.2～1.5倍体积以对应于样品情形。通过比较i.v.对p.o曲线下的面积(AUC)，对生物利用度(F)进行评价。

$F=\frac{\mathrm{AUCpo}}{\mathrm{AUCiv}}\×\frac{\mathrm{DOSEiv}}{\mathrm{DOSEpo}}\×100\%$

和

AUC＝(C1+C2)*(T2-T1)/2

其中C是在给定时间T时通过MS或者UV或者Fluo测定的浓度

大鼠中的静脉内药物动力学

方法：

根据加拿大议会关于动物饲养的准则对动物进行圈养、进食和照顾。

在这些研究中使用雄性Sprague Dawley(325-375g)非禁食大鼠。

根据需要，将化合物制备为1mL/kg的标准剂量体积。

利用25号的针，经颈静脉静脉内给药有意识的大鼠所述剂量。这构成零时点。

通过划破尾部顶端的一块(1-2mm)，在5分钟时进行放血。然后通过稳定但是平缓的从尾部的顶部到底部的动作对尾部进行冲击以将血液从尾部挤出。将大约0.5mL血液收集入肝素化收集管形瓶中。随后按照相同的方式进行放血，但是不再需要划破尾部。用一片纱布将尾部擦净并且如上所述采血入适当标记的管中。

在I.V.给药之后，测定大鼠血液的一般时点为以下任意时点：

0，5min，15min，30min，1h，2h，4h，6h

或0，5min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，24h

赋形剂：

可以将以下赋形剂用于IV大鼠血液水平测定中：

葡萄糖：1mL/kg

Moleculosol25％：1mL/kg

DMSO(二甲亚砜)：限制为10％的剂量体积至高达0.1mL/千克动物

PEG200：不多于80％的PEG200与20％无菌水混合-1mL/kg

如果溶液浑浊，可以将葡萄糖或者碳酸氢钠加入其中。

为了进行分析，用1.2～1.5倍体积的任选含有内标的乙腈对试样进行稀释并且对试样进行离心，从而除去蛋白沉淀物。将上清液直接注射入带有质谱(MS)或者紫外线吸光度(UV)或者荧光(Fluo)检测的C-18HPLC柱中。相对于利用掺入了在任选含有内标的乙腈中已知量药物的清洁血样得到的标准曲线，进行定量。将另外任选含有内标的乙腈加入至初始血液量的1.2～1.5倍体积以对应于样品情形。通过比较i.v.对p.o曲线下的面积(AUC)，对生物利用度(F)进行评价。

$F=\frac{\mathrm{AUCpo}}{\mathrm{AUCiv}}\×\frac{\mathrm{DOSEiv}}{\mathrm{DOSEpo}}\×100\%$

和

AUC＝(C1+C2)*(T2-T1)/2

其中C是在给定时间T时通过MS或者UV或者Fluo测定的浓度。

肝细胞培养

对于大鼠肝细胞培养，在0.5mL的Krebs-Henseleit缓冲液中稀释的1×10⁶个细胞先在37℃在95％：5％O₂：CO₂(BOC气体：Montreal，Canada)下于48孔板中制备20min，然后将5μL溶解在乙腈中的10mM化合物溶液加入到每个孔中至50μM的最终浓度。在37℃在95％：5％O₂：CO₂气氛下培养2h之后，在每个孔中加入1体积的乙腈。还制备掺入了母体化合物和空白物的被猝灭的培养物作为对照。一旦样品被转移，则用Eppendorf5415C离心机(Hamburg，Germany)在14000rpm离心样品10min，上清液用作LC/UV/MS分析。

Claims (11)

1.一种以下化学式的化合物：

其中R¹是卤代；

R²是卤代；

R³是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_3-6环烷基、芳基或杂芳基；

或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

2.权利要求1的化合物，其中R¹是氟或氯；或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

3.权利要求2的化合物，其中R²是氟或氯；或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

4.权利要求3的化合物，其中R³是氢、C_1-6烷基或C_1-6卤代烷基；或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

5.权利要求4的化合物，其中R³是C_1-6卤代烷基；或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

6.权利要求4的化合物，其中R³是2，2，2-三氟乙基；或其药学上可接受的盐、立体异构体、或N-氧化物衍生物。

7.权利要求1的化合物，其为：

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氯-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-甲基-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氟-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

(1R，2R)-N-(1-氰基环丙基)-5，5-二氯-2-[4-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-3-基]环己烷甲酰胺；

或其药学上可接受的盐、立体异构体或N-氧化物衍生物。

8.一种药物组合物，包括根据权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。

9.权利要求1的化合物在制备可用于在需要其的哺乳动物中治疗以下疾病的药物中的用途，所述疾病为：骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、佩吉特疾病、异常升高的骨转换、牙周病、牙齿损害、骨折、类风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、动脉粥样硬化症、肥胖病、青光眼、慢性阻塞性肺病、转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症或者多发性骨髓瘤，所述药物含有有效量的根据权利要求1的化合物。

10.一种药物组合物，包括权利要求1的化合物和另一种选自以下的试剂：有机双膦酸酯、选择性雌激素受体调节剂、雌激素受体β调节剂、雄激素受体调节剂、破骨细胞质子ATP酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、整联蛋白受体拮抗剂或者成骨细胞合成代谢剂、维生素D、合成维生素D类似物、非甾族抗炎药物、选择性环加氧酶-2抑制剂、白细胞间介素-1β抑制剂、LOX/COX抑制剂及其药学上可接受的盐和混合物。

11.权利要求1的化合物和另一种试剂在制备可用于在需要其的哺乳动物中治疗以下疾病的药物中的用途，所述另一种试剂选自：有机双膦酸酯、选择性雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、破骨细胞质子ATP酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、整联蛋白受体拮抗剂、成骨细胞合成代谢剂、维生素D、合成维生素D类似物、非甾族抗炎药物、选择性环加氧酶-2抑制剂、白细胞间介素-1β抑制剂、LOX/COX抑制剂及其药学上可接受的盐和混合物，所述疾病为：骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、佩吉特疾病、异常升高的骨转换、牙周病、牙齿损害、骨折、类风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、动脉粥样硬化症、肥胖病、青光眼、慢性阻塞性肺病、转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症或者多发性骨髓瘤。