CN103145836A - 抗肌抑素单链抗体及其编码基因、表达载体、重组转化子和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肌抑素单链抗体及编码基因、表达载体、重组转化子和应用，该抗肌抑素单链抗体包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了所述的抗肌抑素单链抗体的编码基因、表达载体和重组转化子。本发明还提供了所述的抗肌抑素单链抗体在制备肌肉萎缩药物或动物增重药物中的应用。本发明抗肌抑素单链抗体可在大肠杆菌中大规模表达生产，成本低，且该抗肌抑素单链抗体分子量小，组织穿透力强，免疫原性低、抗体亲和力强。

Description

抗肌抑素单链抗体及其编码基因、表达载体、重组转化子和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种抗肌抑素单链抗体及其编码基因、表达载体、重组转化子和应用。 

背景技术

畜禽肉产品是人类主要动物性食品之一。随着人们生活水平的不断提高，消费者对畜禽肉产品的需求日益增加。提高动物产肉性能一直是动物生产研究人员所努力的目标。但目前通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高动物生产性能已很难再有大的进展。为了提高动物的生产性能，在饲料中添加各种违禁药物造成食物中毒甚至死亡的事件时有发生，因而研究一种安全、高效、对人类无毒副作用的提高动物生产性能的制剂或产品是目前养殖业所面临的迫切问题。 

人类骨骼肌萎缩是目前世界上比较常见的肌肉疾病，肌肉萎缩可发生于多种生理、病理条件下，如衰老，恶病质，烧伤，肌肉废弃等，主要表现为肌肉体积的缩小，肌细胞数量的减少，肌细胞内蛋白质含量降低等。 

动物的产肉性能或人的肌肉发育总是由促进和抑制两类激素或因子联合控制的。如果把免疫学的方法应用于动物或人肌肉发育的调控，选择对肌肉发育有抑制作用的激素或因子作为研究对象，体外制备这些激素或因子的抗体，对动物或人进行被动免疫，从而抑制或减弱该类激素或因子的生理功能，进而提高动物的产肉性能或治疗人类肌肉萎缩。 

肌抑素（Myostatin，MSTN，GenBank号：NM_005259.2）又称GDF-8（Growth Differentiation Factor8，生长分化因子8），属于TGF-β超家族，其仅在骨骼肌中特异表达并分泌至血浆中，是影响骨骼肌生长发育的抑制因子。 

肌抑素首先以一个376个氨基酸组成的前体非活性形式产生，含有N端的前体肽和C端成熟肽，经两步蛋白酶切后，两个C端亚基通过一个多肽链分子间二硫键形成一个具生物学活性的双亚基成熟肌抑素，同时两 个亚基的其余半胱氨酸残基形成经典的半胱氨酸结。成熟肽的氨基酸序列在人类、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马、鸡和狗间的同源性均是100%。 

该基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。该基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。该基因天然缺失的比利时蓝牛被称为“双肌牛”。该基因的缺失只影响骨骼肌的发育，对心肌、平滑肌等没有任何影响，不对动物的其它性能产生危害，牛自然状态下的双肌现象证明了这一点。因而肌抑素阻断剂在农业畜禽生产方面具有巨大的应用前景。同时，由于阻断肌抑素信号通路还有望缓解许多疾病伴随的肌肉萎缩症状，因此肌抑素阻断剂同样在肌肉萎缩药物研究方面具有重要的应用前景。目前已经有关于肌抑素结合蛋白或其通路阻断剂的研究，以期用于农业及医药生产。这些肌抑素拮抗剂包括：肌肉抑制剂结合蛋白、外源竞争性可溶肌抑素受体、肌抑素特异性单克隆抗体、肌抑素抗原蛋白、针对肌抑素的RNAi和DNA疫苗等。但上述拮抗剂均存在分子量大、组织穿透性差、免疫原性强等不足之处，在使用多次后会引发动物或人产生特异免疫反应，从而大大限制了其运用。而RNAi和DNA疫苗的稳定性和安全性差，应用效果不理想。 

通过抗体工程技术来克服上述不足，用完全人源化或者畜禽来源的序列构建单链抗体或单结构域抗体，可以消除潜在的抗免疫球蛋白的特异免疫反应。单链抗体由于其分子量小而具有较强的组织穿透力，免疫原性也比单克隆抗体的大大降低，进而极大地减少了产生抗免疫球蛋白特异免疫反应的可能性。同时由于单链抗体与抗原的结合位点没有改变，其抗体亲和力不会因为分子量降低而变弱。此外，单链抗体还可通过常规基因重组技术在体外工程菌等生物反应器大量获得，与单克隆抗体生产相比大大降低了成本，因此无论在治疗人类肌肉萎缩及提高动物生产性能方面均具有很好的应用前景。 

目前关于单链抗体的研究主要是针对细菌或病毒的抗原，通过制备相应的单链抗体来中和这些致病细菌或病毒。细菌或病毒是原核生物，其表达的膜抗原等结构简单，针对这些抗原的单链抗体的制备也较方便。但高等动物的内源性激素或因子往往是蛋白肽链经过各种折叠及二硫键相连等形成的具高级结构的多维蛋白，如肌抑素单体蛋白必须通过二硫键形成二聚体后才有生物活性。因此目前尚未发现针对内源性激素的单链抗体的 相关研究。 

发明内容

本发明提供了一种抗肌抑素单链抗体，免疫原性低，与肌抑素亲和力强，并可在大肠杆菌中高效表达。 

一种抗肌抑素单链抗体，包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

该抗肌抑素单链抗体分子量小，组织穿透力强，免疫原性低、抗体对肌抑素亲和力强。 

适宜的连接肽可避免影响抗体蛋白的折叠及其水溶性。本发明所选用的连接肽为(Gly₄Ser)₄，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

本发明还提供了编码所述的抗肌抑素单链抗体的基因。该编码抗肌抑素单链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 

如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，经大肠杆菌喜爱的密码子设计优化得到，适宜在大肠杆菌中表达，避免了因大肠杆菌的密码子偏好导致的抗肌抑素单链抗体翻译效率和表达水平低的问题。 

本发明还提供了包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的表达载体。 

构建表达载体时，选用的原始载体可以为pET-30a(+)。 

本发明还提供了包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的重组转化子。 

本发明所述的抗肌抑素单链抗体，由包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的重组转化子在16～18°C，180～220r/min，诱导表达30～38h后得到。 

采用低温、长时诱导表达的方案进行抗肌抑素单链抗体可溶性诱导表达，这样蛋白产物不会形成包涵体，不需经过蛋白变性复性的过程，可使蛋白保持天然活性。 

优选的，诱导表达的温度为18℃，转速为200r/min，时间为36h。 

构建重组转化子，即将重组表达载体转化至宿主菌中。所述的宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）。 

本发明还提供了所述的抗肌抑素单链抗体在制备肌肉萎缩药物中的应用。 

本发明还提供了所述的抗肌抑素单链抗体在制备动物增重药物中的应用。 

MSTN基因的缺失或阻断只影响骨骼肌的发育，对心肌、平滑肌等没有任何影响，不对动物的其它性能产生危害，牛自然状态下的双肌现象证明了这一点。因此，将抗肌抑素单链抗体作为肌抑素拮抗剂，制备动物增重药物，可促进肌肉发育，中和肌抑素对肌肉发育的抑制作用，促进成肌细胞增殖及肌细胞生长分化，增加肌肉产量，提高动物的生产性能。 

本发明抗肌抑素单链抗体为抗人源肌抑素单链抗体，可以用来中和肌抑素对肌肉发育的抑制作用。由于肌抑素成熟肽的氨基酸序列在人类、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马、鸡和狗间的同源性均是100%，因此本发明所研制的抗肌抑素单链抗体适用于人类及上述各类动物。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

本发明抗肌抑素单链抗体是世界上首例能够中和内源抑制性激素-肌抑素的单链抗体，抗体分子量小，组织穿透力强，免疫原性低、抗体亲和力强。 

本发明抗肌抑素单链抗体可在大肠杆菌中大规模表达生产，成本低。 

附图说明

图1a为RNAstructure software预测的优化前单链抗体序列的mRNA二级结构； 

图1b为RNAstructure software预测的优化后单链抗体序列的mRNA二级结构； 

图1c为Vienna RNA web server software预测的优化前单链抗体序列的mRNA二级结构； 

图1d为Vienna RNA web server software预测的优化后单链抗体序列的mRNA二级结构； 

图2a为SOE-PCR合成全长单链抗体（scFv）基因示意图； 

图2b为单链抗体全基因合成后的DNA电泳结果； 

其中，E：含scFv的重组质粒酶切图；M：Marker；F1-10：F1-10片段；F9-20：F9-20片段；scFv：单链抗体全基因； 

图3a为抗肌抑素单链抗体的SDS-PAGE电泳； 

其中，各列从左向右分别为：蛋白Marker（kD）；阳性菌株的裂解液上清；阳性菌株的裂解液沉淀；纯化的单链抗体； 

图3b为抗肌抑素单链抗体的Western blot检测图； 

其中，各列从左向右分别为：蛋白Marker；单链抗体； 

图4为ELISA检测纯化后的单链抗体与肌抑素的亲和力（n=5）； 

其中，scFv：单链抗体；^#为结合100μL0.4μg/mL肌抑素所需要的单链抗体的中间有效浓度EC50； 

图5a为MTT法检测单链抗体对鼠成肌细胞C2C12增殖的影响(n=5)； 

图5b为MTT法检测单链抗体对鼠成肌细胞C2C12增殖的影响(n=5)； 

其中，图5a和图5b中，不同的小写字母代表差异显著(P<0.05)，不同的大写字母代表差异极显著(P<0.01)； 

图6为单链抗体对小鼠成肌细胞数量的影响； 

其中，各图中的比例尺是100μm。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。 

实施例1抗肌抑素单链抗体的设计、拼接及密码子优化 

根据已公开专利（Chin ER,等.Antibodies to myostatin.USA patent No:7807159.10/05/2010.http://www.patentstorm.us/patents/7807159/fulltext.ht ml）的抗肌抑素单克隆抗体序列，将其重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过(Gly₄Ser)₄linker连接成‘VH-linker-VL’，称为优化前DNA序列（SEQ ID NO.27），然后据此DNA序列推出相应的氨基酸序列（SEQ ID NO.26），再根据该氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性、GC含量、mRNA二级结构稳定性等优化出核苷酸序列（序列优化由上海生工公司完成），为优化后DNA序列（SEQ ID NO.4）。 

将优化前后的DNA序列用OPTIMIZER服务器比较其序列同源性、GC含量、CAI(密码子适用指数，Codon Adaptation Index)值（PuigbòP,等.OPTIMIZER:a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res,2007,35(Web Server issue):W126-W131）、mRNA二级结构（Do CB,等.CONTRAfold:RNA secondary structure prediction without physics-based models.Bioinformatics,2006,22:e90-e98；Gruber AR,等．The vienna RNA websuite.Nucleic Acids Res,2008,36:W70-W74）等（见表1和图1）。 

表1单链抗体(VH-linker-VL)氨基酸序列及优化前后核苷酸序列比对 

优化前后的单链抗体核苷酸序列均登录到GenBank，登录号分别为No.JQ818147和No.JQ818148。比较优化前DNA序列和优化后DNA序列（表1）的序列同源性，发现有75%同源，优化后DNA序列的GC含量为55.6%～55.9%，与大肠杆菌基因组GC含量基本一致，CAI值从0.394升至0.716，更接近大肠杆菌中高表达基因的CAI值，这些结果表明优化后的单链抗体序列（优化后DNA序列）可能更适合在大肠杆菌中重组表 达。 

RNA结构预测结果如下：RNAstructure software预测优化前后单链抗体转录后相应的mRNA序列的最小自由能，结果为从-299.9kcal/mol（优化前）升高到-292.6kcal/mol（优化后），而Vienna RNA web server software预测结果为从-316.51kcal/mol（优化前）升到-300.70kcal/mol（优化后），两种软件预测方法均表明自由能有升高的趋势，从而表明优化后单链抗体序列的RNA结构较不稳定，因而更有利于翻译的进行。同时，如图1a、图1b、图1c和图1d，mRNA二级结构预测表明：优化后序列的mRNA结构更加松散，具有更多的环状结构，而棍状结构减少。该结果同样表明优化后序列的RNA结构较不稳定，因而更有利于翻译的进行。 

实施例2抗肌抑素单链抗体全基因的构建 

根据优化后的单链抗体DNA序列（优化后DNA序列），合成21个引物（P1-P21，见表2），覆盖优化后的单链抗体全序列，每条引物大小50-60bp，两个相邻引物间有约20bp序列重叠，使用引物自身为模板，经过重叠拼接扩增（splicing overlap extension PCR,SOE PCR）首先得到两条相互间有91bp左右重叠区的序列，分别命名为F1-10和F9-20。 

PCR反应体系为：1×pfu buffer(含Mg²⁺)，2.5mM dNTP，10μM P1～P10或P9～P20，2.5U pfu酶。 

PCR反应程序为：94°C预变性3min；94°C变性30s，55°C退火30s，68°C延伸60s，30个循环；68°C延伸5min。 

再以F1-10和F9-20两段序列为模板，P1和P21为引物，进行SOE PCR得到全长的单链抗体基因序列。 

PCR反应体系为：1×pfu buffer(含Mg2+)，2.5mM dNTP，10μM P1和P21,2.5U pfu酶。 

PCR反应程序为：94°C预变性3min；94°C变性30s，55°C退火30s，68°C延伸90s，30个循环；68°C延伸5min。 

PCR产物割胶回收、TA克隆、测序按常规分子生物学方法进行。 

(1)用于单链抗体全基因合成的引物： 

表2单链抗体全基因合成所用引物 

（2）单链抗体全基因的合成及克隆 

图2a显示了单链抗体全基因的构建过程。首先，引物P1～P10经SOE PCR得到单链抗体前半部分片段F1-10，引物P9-P20经SOE PCR得到单链抗体后半部分片段F9-20，前半部分片段的末尾和后半部分片段的起始有91bp的重叠区，然后再以该两片段为模板，以P1和P21为引物进行SOE PCR，得到单链抗体全基因序列。 

如图2b所示，经过第一轮SOE PCR，分别得到大小为378bp（F1-10）和472bp（F9-20）的特异条带，该两个片段间有91bp的重叠区域；经过 第二次SOE PCR后，最终得到全长为759bp的scFv基因序列(图2b)。该合成的scFv基因经过TA克隆、测序、比对，与理论设计的序列100%吻合。 

实施例3抗肌抑素单链抗体表达载体的构建及蛋白表达 

经测序验证的单链抗体基因用Nco I/Xho I(TaKaRa)酶切后，构建在pET-30a(+)载体(Novagen公司产品)上的两个His tag之间，与His tag共表达。将构建完成的重组载体（表达载体）转化至大肠杆菌BL21DE3(Novagen公司产品)菌株中，筛选出阳性重组子（重组转化子）。 

将上述筛选出的阳性重组子接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，200r/min培养2-3h至OD₆₀₀值为0.6左右时加入终浓度为1mM的IPTG，18°C，200r/min，诱导表达36h。 

实施例4抗肌抑素单链抗体的蛋白纯化 

由于单链抗体蛋白是与His tag共表达的，因此用His亲和层析法纯化目的蛋白。His亲和层析柱购于上海生工公司。 

收集实施例3中低温（18℃，200r/min）诱导培养36h的菌体并用PBS洗涤，然后加入含100mM PMSF(phenylmethanesulphonyl fluoride)的PBS，超声波破碎细胞后，离心弃沉淀收集上清，上清经0.22μm滤膜过滤去除颗粒杂质。 

将His亲和层析柱混匀填料，根据培养物量及其表达水平装柱2-5ml，并用2-5个柱床体积Lysis buffer平衡柱子后，在柱中小心加入过滤后的上清，打开开关使液体流出； 

随后分别按照顺序用含0.5%Triton X-100、Nonidet P40(NP-40)、DNase(15μL,1mg/ml)、1%Triton X-114、0.5%Triton X-100的pBS(pH8.0)、pBS(pH8.0)各洗涤2-5个柱床体积； 

用适量Elution buffer洗脱蛋白，反复洗脱3-4次； 

洗脱后蛋白用PBS透析48小时，最后用超滤管超滤浓缩得到目的蛋白。 

下述实施例5～9均采用该实施例4方法纯化后的单链抗体蛋白。 

实施例5抗肌抑素单链抗体的SDS-PAGE和Western Blot检测 

SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度、蛋白浓度用总蛋白试剂盒测定。 

由于单链抗体与His tag共表达，因此使用His抗体进行Western blot检测目的蛋白的特异性。 

SDS-PAGE电泳、蛋白浓度测定及Western blot均按常规分子生物学方法进行。 

如图3b所示，以His抗体western杂交检测目的蛋白的特异性，结果可得到大小约为30kD的区域有特异条带出现，与SDS-PAGE结果(图3a)吻合，预示着已成功表达并纯化了抗肌抑素单链抗体蛋白。 

实施例6抗肌抑素单链抗体与肌抑素抗原的结合能力检测 

采用ELISA法检测。 

（1）100μL含0.4μg/mL肌抑素（R&D system）的包被液包被在酶标板中，4℃包被过夜，然后PBST洗3次，每次5min； 

（2）用300μL的0.5%BSA的PBST室温封闭2小时后，PBST洗3次，每次5min； 

（3）加入不同稀释倍数的纯化的单链抗体50μL，37℃处理1h后，用PBST洗3次，每次5min； 

（4）加入100μL6×HIS小鼠单抗（1:5000），37℃处理1h后，用PBST洗3次，每次5min； 

（5）加入100μL HRP-标记的兔抗小鼠IgG（1:5000），4℃处理1h后，用PBST洗3次，每次5min； 

（6）每孔加入50mL TMB，37℃显色10min； 

（7）加入50μL浓度为2M的H₂SO₄终止显色，并检测OD₄₅₀吸光值。 

比较各个加样孔的吸光值，便反映出纯化的单链抗体与肌抑素间的亲和力。纯化后的单链抗体与肌抑素的亲和力经ELISA检测结果如图4所示，纯化后的单链抗体可有效结合肌抑素，且其对肌抑素的亲和性随着其浓度的增加而增加，呈剂量依赖性。结合100μL浓度为0.4μg/mL的肌抑素所需要的单链抗体的中间有效浓度EC50为1.6μg/mL。 

实施例7抗肌抑素单链抗体对小鼠成肌细胞增殖的影响 

采用MTT法进行检测。首先，小鼠C2C12成肌细胞（ATCC,USA）培养于含10%胎牛血清、青链霉素的高糖DMEM完全培养液中，调整细胞密度至2000-3000/孔，分接于96孔板中，37℃5%CO₂培养7-8h。细胞贴壁后换液，给予以下不同的处理， 

（1）PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄）组：加入量为100μL/孔； 

（2）不同浓度的单链抗体组：加入量为100μL/孔，使scFv终浓度分别达0.4、2、8μg/mL； 

（3）肌抑素（MSTN）组：加入量为100μL/孔，使肌抑素终浓度达0.4μg/mL； 

（4）肌抑素与不同浓度的单链抗体共同处理组：加入量为100μL/孔，0.4μg/mL肌抑素+0.4、2或8μg/mL scFv（均为终浓度）； 

37℃5%CO₂培养24h后，然后在96孔板中各孔加入10μL的5mg/mL MTT溶液，继续培养4h。随后1500rpm离心10min，弃上清，沉淀用150μL的DMSO溶解10min后，检测各孔的OD₄₉₀吸光值。 

MTT法检测单链抗体对小鼠成肌细胞细胞增殖的影响，结果（图5a）发现单链抗体可剂量依赖性地增加C2C12细胞的活性，当单链抗体浓度为8μg/mL时，与PBS组相比细胞活性可增加31.11%(P=0.0008)；同时肌抑素处理细胞可显著降低C2C12细胞活性达21.43%（P=0.017），用肌抑素和单链抗体共同处理时，单链抗体可剂量依赖性地减弱肌抑素对成肌细胞增殖的抑制。与肌抑素组相比，肌抑素和单链抗体（8μg/mL）共处理可增加细胞活性达55.48%(P<0.00001)（图5b）。 

实施例8抗肌抑素单链抗体对小鼠成肌细胞活性的影响 

采用电镜法。小鼠C2C12成肌细胞培养于含10%胎牛血清、青链霉素的高糖DMEM完全培养液中，调整细胞密度至2000-3000/孔，接种于96孔板中，37℃5%CO₂培养7-8h，细胞贴壁后换液，然后向培养板各孔中加入单链抗体，使其终浓度达8μg/mL，37℃5%CO₂继续培养24h和36h后，用荧光显微镜观查细胞的形态。 

对成肌细胞进行形态观察，如图6所示，单链抗体处理可显著增加小鼠C2C12成肌细胞的数量。 

以上结果显示，单链抗体可能通过促进C2C12细胞的增殖来增加细胞活性，而且该促进作用可能是通过结合并抑制肌抑素的活性来实现。 

实施例9抗肌抑素单链抗体对小鼠肌肉发育的影响 

将20只4周龄雌性各半的SPF昆明小鼠（购自浙江大学实验动物中心）随机分为2组，每组10只。以每千克小鼠体重肌肉注射90mg剂量单链抗体对小鼠进行被动免疫。注射部位为小鼠后肢股四头肌，采用肌肉纵向多点注射的方式注射。对照组以生理盐水代替单链抗体。然后每两周加强注射一次，共进行4次注射。每次注射前称量小鼠体重。末次注射后10天时处死动物进行肌肉产量的统计分析。 

表3单链抗体被动免疫对小鼠体重及产肉性能的影响(n=10) 

	对照组(g)	scFv组(g)	scFv与对照组相比
				体重	36.43a	39.65b	提高8.84%
股二头肌	0.265a	0.372c	提高40.38%
				股四头肌	0.223a	0.314c	提高40.81%
腓肠肌	0.172a	0.251c	提高45.93%
				胸大肌	0.169	0.175	提高3.55%
总肌重	0.829a	1.112c	提高34.14%

同行中不同上标字母表示差异显著，a,b表示p<0.05，a,c表示p<0.01. 

如表3所示，经单链抗体免疫后，小鼠的体重显著增加，总肌重提高了34.14%，其中股二头肌、股四头肌和腓肠肌肌肉重量增加极显著，与对照组相比，肌肉重量均提高40%以上。以上数据表明，本发明所研制的抗肌抑素单链抗体有效地减弱了小鼠内源肌抑素对肌肉发育的抑制作用，提高了其肌肉产量。 

对比例常规的大肠杆菌表达抗肌抑素单链抗体方案 

将实施例3筛选出的阳性重组子接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，200r/min培养2-3h至OD₆₀₀值为0.6左右时加入终浓度为1mM的IPTG，然后，37°C，200r/min，进行诱导表达约6h。 

收集菌体用超声波细胞破碎仪破碎（120kw,5sec,20times），高速离心后，收集上清液，沉淀用PBS(pH7.4)重悬，分别对上清和沉淀中的蛋白进行检测，进行表达产物可溶性分析。经可溶性分析显示，表达产物大多以包涵体形式存在于沉淀中。将沉淀中以包涵体形式存在的目的蛋白用裂解液进行裂解变性，然后用HIS亲和层析柱进行纯化，再将纯化后的目的蛋白透析复性，得到单链抗体蛋白。 

常规大肠杆菌表达蛋白的纯化及透析步骤如下： 

(1)蛋白的纯化： 

1)离心收集IPTG诱导的阳性菌株（阳性重组子），用50mM PBS(pH8.0)洗涤两次，弃上清，沉淀臵冰上放臵15min； 

2)每克菌体湿重加入5ml含有100μl100mM PMSF(phenylmethanesulphonyl fluoride)的PBS(pH8.0)悬浮菌体，超声波破碎（300W,4s,50～80times）至澄清； 

3)10000g离心30min，弃上清，留沉淀少许进行SDS-PAGE电泳检测，其余沉淀分别按照顺序用含0.5%Triton X-100、Nonidet P40(NP-40)、DNase(15μl,1mg/ml)、1%Triton X-114、0.5%Triton X-100的pBS(pH8.0)、pBS(pH8.0)各洗涤30min后，10000g离心15min收集经洗涤的包涵体； 

4)每克洗涤后的包涵体加入5ml Lysis buffer在4℃溶解过夜，10000g离心30min，弃沉淀，上清经0.22μm滤膜过滤； 

5)将HIS亲和纯化柱混匀填料，根据培养物量及其表达水平装柱2-5ml，并用2-5个柱床体积Lysis buffer平衡柱子后，在柱中小心加入离心上清，打开开关使液体流出； 

6)用2-5个柱床体积的Wash buffer洗涤柱子，除去杂蛋白； 

7)用适量Elution buffer洗脱蛋白，反复洗脱3-4次。 

(2)蛋白的透析复性： 

将上述收集的洗脱液依次用6、4、2、1、0.5mol/L的尿素溶液(以50mM PBS(pH8.0)缓冲液溶解)透析，透析液中加入还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽至终浓度分别为2mmol/L和0.4mmol/L。每隔8h换一次液,共透析48h。 

由于经过常规表达的单链抗体蛋白均在细菌包涵体中，细菌裂解后离 4，单链抗体蛋白在裂解液的包涵体沉淀中，需要对其进行变性和复性等过程，经过这些处理以后，我们发现所表达的单链抗体不能与肌抑素相结合，没有生物活性。 

因此，我们改进了表达方法，即实施例2中采用的18°C，200r/min，IPTG诱导表达36h进行蛋白表达，表达的单链抗体存在于细菌的细胞质中，细菌裂解后离心，目的蛋白在裂解液上清中，不需对之进行变性、复性等过程，直接进行过滤和HIS亲和层析纯化，纯化后的蛋白保持天然活性，显示能与肌抑素相结合。 

Claims (10)

1.一种抗肌抑素单链抗体，包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的抗肌抑素单链抗体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.编码如权利要求1或2所述的抗肌抑素单链抗体的基因。

4.包含如权利要求3所述的抗肌抑素单链抗体的基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，原始载体为pET-30a(+)。

6.包含如权利要求3所述的抗肌抑素单链抗体的基因的重组转化子。

7.如权利要求1或2任一项所述的抗肌抑素单链抗体，其特征在于，

由包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的重组转化子在16～18°C，180～220r/min，诱导表达30～38h后得到。

8.如权利要求7所述的抗肌抑素单链抗体，其特征在于，所述重组转化子的宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）。

9.如权利要求1或2任一项所述的抗肌抑素单链抗体在制备肌肉萎缩药物中的应用。

10.如权利要求1或2任一项所述的抗肌抑素单链抗体在制备动物增重药物中的应用。

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