CN103124568A

CN103124568A - 结合的聚合物材料及其用途

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Publication number: CN103124568A
Application number: CN2011800287260A
Authority: CN
Inventors: 安东尼·哈里斯; 乔纳森·汤普森; 丽贝卡·罗恩; 希拉·格兰特; 大卫·格兰特
Original assignee: University of Missouri St Louis
Current assignee: University of Missouri St Louis
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2011-06-07
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2031-06-07
Also published as: BR112012031311A2; HK1183829A1; MX2012014302A; CN103124568B; PL2575908T3; JP2016073671A; JP2013528108A; EP2575908B1; US20120070466A1; ES2565059T3; WO2011156410A8; CA2801716A1; IL223499A; DK2575908T3; US20140302104A1; HUE027146T2; US9827323B2; HRP20160275T1; WO2011156410A1; EP2575908B8

Abstract

公开了包含共价结合至颗粒的胶原的组合物，其中在所述胶原的反应基团和所述颗粒的反应基团之间形成了共价键，并且其中所述颗粒具有20至1000纳米范围内的平均粒径。还公开了使用所述组合物的多种方法。

Description

结合的聚合物材料及其用途

相关申请的交叉引用

本专利申请主张2010年6月7日提交的美国临时专利申请No.61/397100的权益。上述专利申请的内容作为参考并入本文。

许诺条款

无

技术领域

本发明涉及共价结合至颗粒的胶原，其导致产生了更耐降解作用(如胶原酶的降解作用)的材料。该材料可以在广泛的应用中使用。

背景技术

胶原在治疗尿失禁、心脏病发作后的充血性心力衰竭、关节折断以及先天性和年龄相关性面部皮肤缺损中的使用受到现用胶原材料的稳定性和完整性的限制。例如，用于处理面部老化(例如，改善面部轮廓、改善皱纹、凹疤痕矫正等)和嘴唇增厚的胶原基皮肤填料在12个月的时间段内对分解高度敏感。

针对胶原分解问题的一个提议的方法是通过在大分子胶原纤维之间形成共价键来使胶原交联。然而，用于交联胶原的化学品的毒性可以是所担心的。例如，戊二醛和二异氰酸己二酯在交联期间结合进胶原支架内并且可以随着胶原的降解将有毒残余物释放到体内。另一个问题是过度交联可以产生坚硬并且不可用的胶原材料。

发明内容

本发明人发现了限制当前胶原基产品的性能问题的解决方法。该方法包括使用能够与胶原形成共价键的平均粒径20至1000纳米的颗粒。所述结合的材料(例如，包含所述材料的组合物，结合的胶原/颗粒或结合的胶原纤维/颗粒)更耐降解(例如，通过胶原酶的降解作用)，是生物相容的并且得到了具有可接受孔隙水平的胶原基质或支架，借此允许细胞内向生长(in-growth)。通过所述新型材料中结合的颗粒加快了细胞的内向生长。在某些情况下，所述结合的材料还具有抗微生物性能，其可以在施用于患者后用于抵抗感染。

在一种情况下，公开了包含共价结合至颗粒的胶原的材料，其中所述颗粒具有20至1000纳米范围内的平均粒径。在具体的实施方式中，所述平均粒径在50至1000纳米之间，尽管考虑了其它直径尺寸和范围，如在本段随后的内容中所讨论的。可以在胶原上的反应基团(例如，羧酸和/或胺基)和颗粒上的反应基团(例如，胺-反应基团、羧酸酯-反应基团、硫醇-反应基团和/或羟基-反应基团)之间形成所述共价键。例如，并且在一个方面，可以在胶原上存在的游离羧酸基和颗粒上的胺反应基团之间形成共价键，其中可以在胶原的羧酸基和颗粒的胺反应基团之间形成酰胺键。如以下所说明的，可以将颗粒官能化以包含能够与胶原的羧酸或胺基反应的反应基团。在某些情况下，胶原还可以通过交联剂(如，碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺))和/或通过颗粒本身(例如，胶原可以与颗粒交联，其中所述颗粒中的至少一种包括至少两个反应基团，并且其中可以在(例如)胶原的羧基和所述至少两个反应基团之间形成至少两个共价键，其中所述两个反应基团可以在(例如)胺基之间形成)交联。在某些方面，交联的胶原是多孔的并且可以具有范围在500纳米至200微米(和其中的任何整数或范围，如550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900纳米)的平均孔径。在具体的方面，可以使用1微米至100微米之间的孔径范围(或其中的任何整数或范围，如10、20、30、40、50、60、70、80或90微米)。在某些情况下，颗粒具有50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000纳米的平均粒径。在具体的实施方式中，所述平均粒径在60至900、70至800、80至700、90至600、100至500、150至400或200至300纳米的范围内。在某些方面，所述平均粒径在50至150、60至140、70至130、80至120或90至110纳米的范围内。所述颗粒可以由金属材料制成或包含金属材料。所述金属材料可以是金、银、铂、钛、镍或铜或它们的任意组合。在具体的方面，所述金属材料是金或银。所述颗粒还可以由陶瓷材料或生物可降解材料制成或包含陶瓷材料或生物可降解材料。在某些实施方式中，颗粒与胶原的比值可以在1×10⁹个颗粒/mg胶原至2×10¹⁰个颗粒/mg胶原的范围内，然而考虑了更宽的范围(例如，1×10⁴至1×10¹⁴/mg胶原，以及其中的任何范围和整数)。在一些方面，可以将2至4mg碳二亚胺交联剂(例如，EDC)/30mg胶原用于形成共价键(在具体的方面，可以使用的所述比值可以是3.2mg+/-0.8mg碳二亚胺交联剂(如EDC)/30mg胶原)。另外，可以将0.5至0.2mg碳二亚胺交联剂(例如，EDC)/1×10⁹-2×10¹⁰个颗粒用于形成共价键。在某些方面，本发明所述的材料还可以包括可用于辅助治疗选择的细胞。这些细胞的非限制性实例包括：胚胎干细胞、成体干细胞、诱导的多能性干细胞和衍生自内胚层、中胚层或外胚层起源细胞的细胞，其包括(但不限于)上皮细胞、外分泌和内分泌细胞、成肌细胞、成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞、基质细胞、肝细胞、胰岛细胞、成神经细胞角化细胞、破骨细胞、骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞和/或肌细胞以及它们的组合。可以使用的胶原包括I、II、III、IV或V型胶原或它们的组合。在具体的实施方式中，所述材料可以是凝胶状态、溶液、糊剂、静电纺丝微米或纳米胶原、胶原片或脱水刚性结构。所述材料可以包含在注射器中或可注射溶液中。所述材料可以是皮肤学可用组合物，或者真皮或表皮皮肤替代物。在某些方面，当与未与颗粒结合的胶原相比时，在结合的胶原/颗粒材料上存在的游离羧基或游离胺基的量少至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90％。换言之，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90％或以上的胶原的游离羧酸或游离胺基是结合的。

还考虑了共价结合到至少一种颗粒的胶原纤维，其中所述至少一种颗粒具有20至1000纳米或50至1000纳米范围内的平均粒径。在具体的方面，可以在胶原纤维上的游离羧酸和/或胺基以及颗粒表面上存在的反应基团之间形成共价键。所述反应基团可以是(例如)胺反应基团、羧酸酯反应基团、硫醇反应基团和/或羟基反应基团。在一个方面，可以在胶原纤维上存在的游离羧基和颗粒上的胺反应基团之间形成共价键，其中可以在胶原纤维的羧基和颗粒的胺反应基团之间形成酰胺键。

在另一个实施方式中，公开了填充空隙、缺损或增加哺乳动物中组织体积的方法，其包括向对其有需要的患者或哺乳动物(例如，人、马、牛、猪、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等)施用通过本说明书所公开的材料中的任一种。可以通过皮内或皮下注射施用所述材料、结合的胶原/颗粒或结合的胶原纤维/颗粒。所述空隙可以是细纹或皱纹，并且在施用后可以减少所述细纹或皱纹的出现。可以将材料、结合的胶原/颗粒或结合的胶原纤维/颗粒施用于哺乳动物的嘴唇，其中在施用后所述嘴唇的组织体积增加。

在其它实施方式中，公开了增大对其有需要的哺乳动物中软组织或硬组织的方法，其包括将通过本说明书所公开的材料中的任一种施用或应用于所述软或硬组织。所述软组织可以是心肌、平滑肌、骨骼肌、半月板组织、软骨、腱、韧带、筋膜、皮肤、血管、纤维组织或细胞外基质。例如，所述材料可以用于支持易于发生或已发生心脏病发作的患者的心肌肌肉。就硬组织而言，非限制性实例包括骨或齿。通过将所述材料应用于骨折或需要增加骨内向生长的骨，所述材料可以用于治疗骨折或者可以用于增加骨内向生长。

在具体的实施方式中，公开了通过增加人组织体积来增大关节软骨体积的方法，其包括向对其有需要的人施用通过本说明书所述的材料或组合物中的任一种至关节囊。

在一个方面，公开了降低通过酶促分解的体外或体内胶原降解的方法，其包括将胶原与平均粒径在20至1000纳米或50至1000纳米范围内的颗粒结合，其中在胶原和所述颗粒之间形成了共价键，并且其中当与未与颗粒结合的胶原相比时，借此降低了胶原通过胶原酶的降解。所述结合可以是通过胶原的游离羧酸基或游离胺基以及所述颗粒表面上存在的反应基团之间的共价键。所述反应基团可以是(例如)胺-反应基团、羧酸酯-反应基团、硫醇-反应基团和/或羟基-反应基团。在一个方面，可以在胶原上存在的游离羧酸基和颗粒上的胺反应基团之间形成共价键，其中可以在胶原的羧酸基和颗粒的胺反应基团之间形成酰胺键。所述方法还可以包括将所述结合的胶原施用至哺乳动物(例如，皮内或皮下注射或局部应用)。

在另一个实施方式中，公开了提高体外或体内细胞附着的方法，其包括将胶原与平均粒径在20至1000纳米或50至1000纳米范围内的颗粒结合，其中在胶原和所述颗粒之间形成了共价键，并且其中所述纳米颗粒的表面积与体积比吸引细胞再增殖和胶原合成。所述结合可以是通过胶原的游离酸羧基或游离胺基以及所述颗粒表面上存在的反应基团之间的共价键。所述反应基团可以是(例如)胺-反应基团、羧酸酯-反应基团、硫醇-反应基团和/或羟基-反应基团。在一个方面，可以在胶原上存在的游离羧酸基和颗粒上的胺反应基团之间形成共价键，其中可以在胶原的羧酸基和颗粒的胺反应基团之间形成酰胺键。所述方法还可以包括将所述结合的胶原施用至哺乳动物(例如，皮内或皮下注射或局部应用)。

在其它实施方式中，公开了用于产生组织的方法，其包括将通过本说明书公开的材料中的任一种与以下细胞接种：胚胎干细胞、成体干细胞、诱导的多能干细胞和来源于内胚层、中胚层或外胚层细胞来源的细胞或与这些细胞接种的细胞，其包括(但不限于)上皮细胞、外分泌和内分泌细胞、成肌细胞、成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞、基质细胞、肝细胞、胰岛细胞、成神经细胞角化细胞、破骨细胞、骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞和/或肌细胞。所述方法还可以包括将所述结合的胶原施用于哺乳动物。

通过本说明书公开的材料还可以用于通过向对其有需要的哺乳动物施用所述材料、结合的胶原/颗粒或结合的胶原纤维/颗粒来治疗泌尿疾病(例如，尿失禁)。举例来说，所述材料可以形成为骨盆吊带或与现有的骨盆吊带一起使用。作为另外一种选择，所述材料可以是可注射的形式，并且可以作为膨胀剂使用以通过将所述材料注射到哺乳动物中来减少或防止尿失禁。

还公开了用于使血液凝固的方法，其包括向对其有需要的哺乳动物施用通过本说明书公开的材料至需要血液凝固的位点(例如，内部或外部伤口)。外部伤口的非限制性实例包括褥疮、割伤、刮伤、切口、开放伤口、四肢缺失等。

在一个具体的实施方式中，公开了用于治疗骨关节炎的方法，其包括向对其有需要的哺乳动物施用通过本说明书公开的材料中的任一种。例如，可以将所述材料作为膨胀剂施用至关节囊或软骨以促进再生长和减少疼痛。

在另一个具体的实施方式中，公开了用于提高神经生长的方法，其包括向对其有需要的哺乳动物施用通过本说明书公开的材料中的任一种。例如，所述材料可以作为管施用给神经以用于神经生长或再生长。

还公开了用于制备本发明的胶原/颗粒结合材料的方法。该方法包括：1)将预选择的颗粒官能化和2)在存在生物结合试剂的情况下将所述官能化的颗粒与可溶性胶原交联。所述方法还可以在交联步骤后包括聚合反应的培育期。在一个方面，所述方法包括：(1)获得官能化颗粒(例如，金属颗粒，如用半胱胺官能化的金)；(2)将官能化颗粒加入到包含EDC和NHS以及(任选地)缓冲液的溶液中；和(3)在搅拌条件下，将胶原加入到所述溶液中。在某些实施方式中，颗粒与胶原的比值可以在1×10⁹个颗粒/mg胶原至2×10¹⁰个颗粒/mg胶原的范围内，然而考虑了更宽的范围(例如，1×10⁴至1×10¹⁴个/mg胶原，以及其中的任何范围和整数)。另外，可以将2至4mg碳二亚胺交联剂(例如，EDC)/30mg胶原用于形成共价键(在具体的方面，可以使用的所述比值可以是3.2mg+/-0.8mg碳二亚胺交联剂(如EDC)/30mg胶原)，和/或可以将0.5至0.2mg碳二亚胺交联剂(例如，EDC)/1×10⁹-2×10¹⁰个颗粒用于形成共价键。

在另一个实施方式中，公开了用于提高细胞性，促进细胞流入，促进细胞粘附或促进细胞向胶原植入物或胶原基膨胀剂的迁移的方法，其包括使用通过本说明书公开的材料或组合物中的任一个来制备胶原植入物或胶原基膨胀剂。还公开了用于提高细胞性，促进细胞流入，促进细胞粘附或促进细胞向胶原植入物或胶原基膨胀剂的迁移的方法，其包括将胶原与颗粒共价结合以形成胶原植入物或胶原基膨胀剂，其中在胶原的游离羧酸基和所述颗粒的胺反应基团之间形成了共价酰胺键，并且其中所述颗粒具有尺寸范围在50至1000纳米的平均粒径。这些方法还可以包括将所述胶原植入物或胶原基膨胀剂施用至对其有需要的人。

考虑了通过本说明书公开的所述材料可以包含在皮肤学可用的载体、药物可用的载体或药理学可用的载体内。这些载体是当施用于哺乳动物(如人)时，不产生所禁止的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应和/或等等的那些。另外，这些组合物可以是粉末形式、脱水的、静电纺丝的、液体形式、凝胶形式、半固体或固体。在这点上，本发明的组合物可以具有范围在10多至100000000cps之间的粘度，如以2.5rpm在25℃下使用TC转子在布氏粘度计上所测量的。在具体的方面，可以使用150000至250000的范围。

本发明所述的材料和组合物的施用途径可以随待治疗的病况的位置和性质而不同。举例来说，局部应用、皮内、肠胃外、肌内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、直接注射(例如，可注射溶液)和手术(例如，通过切口和放置在目标区域)。

据考虑相对于本发明的任何方法或组合物，可以实施在说明书中所讨论的任何实施方式反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。

“可注射胶原”包括均一的或非均一的胶原糊剂、凝胶剂、溶液或悬液，其包含在配备有适合的柱塞或系统的注射器、管或其它容器内，其设计以通过针或喷嘴挤出胶原。可注射胶原设计用于注射、通过套针手术应用或直接应用到伤口表面上。

“哺乳动物”包括人、马、牛、猪、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。

“胶质组织”包括作为哺乳动物最外层保护面布置的含有角质的层并且包括(但不限于)皮肤、毛发和指甲。

“局部应用”表示将组合物应用或涂布到角质组织的表面上。“局部皮肤组合物”包括适合于在角质组织上局部施用的组合物。这些组合物通常是皮肤学可用的，其中当应用于皮肤时，它们不具有过度的毒性、不相容性、不稳定性等。本发明的局部皮肤护理组合物可以具有选择的粘度以避免应用于皮肤后的显著下滴或合并。

如本领域技术人员所理解的，将术语“约”或“大约”定义为接近，并且在一个非限制性实施方式中，将该术语定义为10％以内，优选地5％以内，更优选地1％以内，并且最优选地0.5％以内。

当在权利要求和/或说明书中使用时，术语“抑制”或“降低”或这些术语的任何变化包括任何可测量的减少或完全抑制以实现所需的结果。

当在说明书和/或权利要求中使用时，术语“有效的”表示足以完成所需、期望或预期的结果。

在权利要求和/或说明书中，当结合术语“包括”使用时，单词“一个”的使用可以表示“一个”它还与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义相同。

单词“包含”(以及任何形式的包含)、具有(以及任何形式的具有)、包括(以及任何形式的包括)或“含有”(以及任何形式的含有)是包括在内的或开端的，并且不排除其它、未引用元素或方法步骤。

本发明的其它目标、特征和优势将通过以下详细说明而变得显而易见。然而，应理解尽管说明了本发明具体的实施方式，但是详细说明和实施例仅是为了进行说明。另外，考虑了根据该详细说明在本发明的精神和范围内的变化和改变对于本领域那些技术人员来说将是显而易见的。

附图说明

下列附图构成了本发明说明书的一部分并且包含下列附图以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合以下所提供的具体实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。

图1.通过在胶原的游离羧酸基和用半胱胺(MEA)官能化的颗粒的反应性胺基之间形成酰胺键将胶原(表示为“1”)与金颗粒(表示“2”)共价结合的示意图。将1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(磺基-NHS)用于辅助结合。

图2.显示用β-半胱胺(MEA)官能化的金颗粒的紫外光谱。

图3.金颗粒结合的凝胶支架的SEM。

图4.显示交联颗粒是支架结构内的金颗粒的EDS图像。

图5.显示与金颗粒结合的胶原对胶原酶降解作用的耐受性改善的柱状图。

图6.显示在存在与金颗粒结合的胶原的情况下的细胞存活力的柱状图。

图7.与金颗粒结合和未结合的胶原的傅里叶变换红外光谱显示当与单独的胶原相比时，结合的胶原/金颗粒材料中游离羧基减少了18％。

图8.每个支架组和处理随时间的DNA浓度。对于每个组，分别为第7天是左侧柱，第14天是右侧柱。

图9.每个支架组和处理随时间的糖胺聚糖(GAG)浓度。对于每个组，分别为第7天是左侧柱，第14天是右侧柱。

图10.第7天时，所有组的活/死染色显示高存活力和细胞化。

图11.在两个时间点时，各组的细胞化显示第7天时的表面增殖比第14天时的具有更精细的内部渗透性。注意到AuNP相关通道和腔的细胞化。

具体实施方式

本发明人发现通过在胶原或胶原纤维的游离羧酸基处将颗粒共价结合至胶原可以降低胶原的降解。这导致产生了当施用于哺乳动物以治疗或防止特定疾病或皮肤病况时更稳定的胶原基材料。此外，通过使用平均粒径为20至1000纳米、50至1000纳米或甚至50至150纳米的颗粒，所得的胶原/颗粒材料产生了促进细胞生长和浸润(例如，将存在于患者内的细胞或引入到所述材料中的细胞吸引至所述颗粒，其使得与不包含这些颗粒的胶原相比时细胞能够比预期更持续和活跃地生长)的环境，并同时与小于20纳米或小于50纳米的颗粒相比时显示出降低的毒性。也就是说，本发明人发现了通过降低胶原降解作用并同时还促进细胞生长来稳定胶原的有效方法，并且该方法还不具有在现有胶原基材料中所见的毒副作用风险。

不希望受理论束缚，据信在胶原的游离羧基位点上形成的共价键阻碍和/或阻断了一些胶原酶的结合位点，并且所述粒径提供了允许细胞粘附、提高细胞性和蛋白质吸附的足够的表面积和表面能，借此促进了细胞的增殖和生长。另外，金属颗粒可以提供降低可以损害细胞的活性氧及其它自由基的抗氧化效果，并且金属颗粒可以提供抗微生物效果。此外，通过防止或降低所述颗粒的细胞吸收，所述粒径足以在周围环境中降低毒性。

本发明的这些和其它方面在下文中得到了进一步非限制性地详细说明。

A.胶原

胶原是哺乳动物中存在的一类蛋白质，其连接并支持身体组织，如皮肤、骨、腱、肌肉和软骨。它还为内脏提供支撑并且存在于牙齿中。体内天然存在的胶原超过25类，所有这些胶原可以在本发明的背景中使用。更普遍的胶原包括I型(存在于皮肤、腱、血管、结扎线、器官、骨中)、II型(存在于软骨中)、III型(存在于网状纤维中)、IV型(形成细胞基底膜的基底)和V型(存在于细胞表面、毛发和胎盘中)。胶原的一些更普遍的结构特征包括丰富的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、游离羧酸基和游离胺基，参见“胶原结构和力学(CollagenStructure and Mechanics)”(2008)。

就皮肤而言，胶原为皮肤提供了强度、柔韧性和弹性。它还为皮肤中的细胞和血管生长提供了框架。在皮肤中，胶原降解(例如，在衰老皮肤、患病、损伤皮肤(如疤痕、晒伤、粉刺等)中)导致出现细纹、皱纹、凹痕、结节、皱褶等。减少这些皮肤缺损的出现的一种方法是将胶原注射到皮肤中，其导致所述皮肤缺损的填充，因此是“皮肤填充剂”。胶原还具有几种医学用途，其包括提高关节移动性、治疗灼伤及其它开放皮肤伤口，治疗成骨不全(即，脆骨症疾病)和在本说明书中公开和主张的其它医学用途。

可以在本发明的背景中使用的胶原可以提取自广泛的来源(例如，猪、牛、人、鱼、大鼠尾等)。可以使用的非限制性胶原材料包括重组人胶原、组织工程的人基胶原、猪胶原、人胎盘胶原、牛胶原、自体同源胶原、胶原纤维和人组织胶原基质。还可以使用的其它胶原和胶原基产品是可商购的，其非限制性实例列于“国际化妆品成分词典和手册(International Cosmetic Ingredient Dictionaryand Handbook)”，第12版，第1卷，656页(2008)中，其作为参考并入。可以在本发明的背景中使用的可商购胶原产品的其它非限制性实例包括

1和2、

和所有这些产品均由Inamed Corp.，Santa Barbara CA.

生产。在具体的实施方式中，使用了猪胶原。

B.颗粒和与胶原之间的共价键形成

如上所述，平均粒径尺寸为20至1000纳米、50至1000纳米或50至150纳米的颗粒可以在本发明的背景中使用。可以通过动态光散射(DLS)确定平均粒径尺寸。DLS是提供悬浮颗粒的尺寸分布谱图的技术。可以根据尺寸分布谱图确定平均粒度(Thomas(1987))。另外，存在几种可以购买或获得具有特定直径尺寸的颗粒的可用资源(例如，得自Ted Pella，Inc.(Redding，CA)的

NanoXact & BioPure金和银胶体；得自NanoPartz，Inc.(Loveland，CO)的精密球形金纳米颗粒、Gold Nanorodz、Microgold、金纳米珠、金纳米丝、铂、钯和三金属纳米颗粒；和得自Nanoparticle Biochem Inc(Columbia，MO)的金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒、钯纳米颗粒和绿色纳米颗粒)。

可以使用的颗粒可以包括金属材料、陶瓷材料和/或生物可降解材料或其组合，或者由上述材料组成。就金属颗粒而言，非限制性实例包括金、银、铂、钛、镍和/或铜。在具体的情况下，用于所述颗粒(例如，金或银)的材料可以具有抗微生物性能，其对于降低感染的可能性可以是有用的。此外，这些颗粒材料可以起电子受体的作用，并因此可以降低由活性氧(“ROS””)所引起的自由基损害。

在本发明的背景中使用的所述颗粒可以包括反应基团，其非限制性实例包括胺-反应基团、羧酸酯-反应基团、硫醇-反应基团、羧酸反应基团或羟基-反应基团或它们的任意组合。这些官能化颗粒是可商购的并且可以由本领域的普通技术人员制备。另外，交联剂的用途可以用于促进胶原和颗粒之间共价键的形成并且还可以用于促进胶原本身之间的交联(例如，当所述颗粒具有至少两个官能团，其中一个官能团与胶原形成共价键而另一个官能团与胶原形成第二共价键或者在通过交联剂在胶原本身之间形成共价键的情况下，可以通过所述颗粒发生胶原的交联)。以下提供了非限制性方法。

在具体的实施方式中，所述颗粒包含能够与胶原中所存在的游离羧酸基形成酰胺键的胺反应基团。举例来说，图1描述了这种实施方式。具体地，图1显示首先通过EDC使胶原纤维1上的羧酸官能团活化，然后通过亲核加成在胶原纤维和金属纳米材料2之间产生酰胺键。EDC与胶原纤维上的羧酸酯基团形成活性酯官能团；但是快速发生水解，并因此EDC通常与磺基-NHS偶联以形成磺基-NHS酯中间体。然后，所述酯中间体与金属纳米颗粒上的胺基反应。EDC-磺基-NHS有利于胶原和连接到所述颗粒上的MEA之间形成酰胺键并释放出异脲副产物。通常将NHS加入到EDC中以提高稳定性和结合。

应考虑用于促进胶原和颗粒之间共价键形成和使胶原交联的化学品的毒性。戊二醛、二异氰酸己二酯和EDC均是常用的交联剂，但是只有碳二亚胺是无毒的并且不会在交联期间结合到胶原支架中(参见Shanmugam(2006)、Lee(2001)、Rault(1996)、Grtzer(2001)、Chan(2005)、Billiar(2001)、Pieper(1999)、Haidekker(2006))。相反，戊二醛和二异腈酸己二酯确实会在支架内结合并且可以随着支架的降解将有毒残余物释放到体内。另外，过度交联可以剧烈改变微观结构并且使支架对降解作用具有很强的耐受性从而使其被纤维层包裹并无法被健康组织取代。

C.制备结合物的方法

以下程序是制备本发明所述的结合材料的非限制性方法。

(1)获得未聚合的胶原：

a.将30mg冻干的胶原与1mL乙酸(10mM)混合。

b.缓慢转动所述小瓶在室温下溶解3小时。

(2)制备浓缩的官能化纳米材料：

a.以7000rpm转动1.344mL 100nm金纳米颗粒悬液(AuNP浓度5.6×10⁹个颗粒/mL)5分钟。

b.除去1.144mL水，留下0.2mL AuNP水悬液。

c.将9.1μL的0.12M半胱胺(＝β-巯基乙胺；MEA)加入至0.2mL AuNP悬液。

d.通过移液管翻倒3次或通过在室温下涡旋5秒来混合以获得官能化纳米材料。

(3)制备10×磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液

(4)在0.2mL 10×PBS缓冲液中溶解0.0032g EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和0.00424g磺基-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)。

(5)如果使用大鼠胶原，将全部0.209mL官能化纳米材料加入到0.2mL EDC和NHS在10×PBS缓冲液中的溶液中。如果使用人胶原，那么可以使用相同的缓冲液体系或者可以使用不同的体系(例如，磷酸二钠缓冲液体系)。

(6)将0.045mL 1M NaOH加入到纳米材料在PBS缓冲液中的溶液中。

(7)将0.454mL官能化纳米材料、EDC、NHS在10×PBS缓冲液中的溶液与NaOH混合至1mL胶原溶液(30g/L)。

(8)上下吸取5-10次以确保混合。

(9)在37℃在培育箱中放置90分钟进行聚合。

(10)将新形成的支架从培育箱中除去并调节为从30Ga针头中注射出或制备其它形式的支架。

如上所述，该方法是在本发明的背景中制备颗粒/胶原结合物的一种方法的非限制性实例。考虑并且可以做出改变和变化以制备用于特定治疗选择的所需制成品。

D.本发明的组合物

如上所述，本发明所述的结合材料(例如，结合的胶原/颗粒或结合的胶原纤维/颗粒)可以包含在组合物(如可注射组合物、局部组合物、可植入组合物)中并且可以采取多种形式(例如，液体、粉末、脱水形式、半固体、凝胶、固体、刚体等)。根据给药途径的性质和/或待治疗的特定疾病，所述组合物还可以包括其它成分，如化妆品成分(活性和非活性)和药物成分(活性和非活性)。

“CTFA国际化妆品成分词典和手册(CTFA International Cosmetic IngredientDictionary and Handbook)”(2008)，第12版中描述了可以在本发明的背景中使用的多种非限制性化妆品成分。可以对局部产品有用的这些成分的实例包括吸附剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、溶剂、保湿剂(其包括(例如)软化剂、湿润剂、成膜剂、密封剂和影响皮肤天然保湿机制的试剂)、防水剂、维生素(例如，A、B、C、D、E和K)、植物提取物、抗微生物试剂、抗氧化剂(例如，BHT和维生素E)、螯合剂(例如，EDTA二钠和EDTA四钠)和防腐剂。

还可以使用的药物成分的非限制性实例包括止痛剂、麻醉剂、抗炎剂(包括非甾族抗炎药物、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗微生物剂)、抗癌活性物质、治牛皮癣药、抗皮脂溢剂、生物学活性蛋白质和肽、烧伤治疗试剂、灼烙剂、皮肤保护剂/屏障剂、类固醇(包括激素和皮质类固醇)、伤口治疗剂、伤口愈合剂等。

E.试剂盒

还考虑了在本发明的某些方面中使用的试剂盒。例如，可以将材料或本发明的组合物包含在试剂盒中。试剂盒可以包括容器。容器可以包括瓶子、金属管、层压管、塑料管、注射器、分散器、加压容器、防渗性容器、包装容器、隔室或其它类型的容器，如其中保留了所述材料或组合物的注塑或吹塑塑料容器。试剂盒还可以包括使用所述试剂盒和/或组合物的说明书。说明书可以包括对如何应用、使用和保持所述组合物的解释。

实施例

包含了以下实施例以显示本发明的某些非限制性方面。本领域技术人员应理解在以下实施例中公开的技术代表本发明人所发现的在本发明的实践中良好实施的技术。然而，根据本发明公开，本领域技术人员应理解可以在不背离本发明的精神和范围的情况下在所公开的具体实施方式中做出多种改变并仍获得类似或相似的结果。

实施例1

(官能化AuNP)

用15μM 2-巯基乙基胺(半胱胺)(MEA)将平均粒径尺寸为20纳米的金纳米颗粒(AuNP)官能化。FT-IR光谱法确认AuNP上存在官能化基团。另外，通过加入电解质(10％NaCl)前后UV-Vis光谱法的使用确定了MEA的最佳浓度。将最佳浓度定义为稳定AuNP的MEA的浓度，其甚至在加入10％NaCl之后还能防止聚集并维持分散。如图2中所示，用MEA官能化时，UV/Vis光谱发生了吸收峰的移位。然后，将官能化的纳米材料与2mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺)和5mM磺基-NHS(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)混合以有利于共价结合至所述胶原纤维的羧基。

实施例2

(AuNP-胶原结合材料)

为了形成AuNP-胶原凝胶支架，将2.5mL大鼠尾胶原(浓度9mg/ml)加入到0.5mL 10×PBS、0.057mL 1M NaOH、4.0mg EDC、5.3mg磺基-NHS和0.5mL官能化AuNP溶液(9.408×10⁹个颗粒)的混合物中。随后，将所述基质在培育箱中在37℃放置90分钟以进行聚合和交联。纳米颗粒的个数和胶原溶液之间的比值为3.8×10⁹个AuNP/9mg大鼠尾胶原。

图3是通过半胱氨酸EDC/NHS交联剂连接了20nm AuNP的示例性胶原凝胶支架的SEM。SEM表征了胶原凝胶支架中金纳米颗粒的分布和密度。如以100×显示AuNP-胶原材料的SEM的图3中所示，AuNP存在于整个支架中，其表示AuNP将会结合至胶原纤维。凝胶经历彻底清洗，其从胶原支架中除去任何未结合的AuNP(Haidekker(2006))。

尽管图3中所示的SEM显微照片确认了纳米颗粒的连接，但是图4确认所连接的颗粒是金颗粒。图4是共价固定至所述胶原支架的金纳米颗粒的EDS(能量散射光谱法)图像。

实施例3

(降解测定)

如上所述，本发明人相信通过用颗粒阻断胶原纤维上的羧酸结合位点的一部分，将会发生胶原酶活性的降低和降解速率的相应降低。这已通过实验确认(参见图5中的数据)。如图5中所示，检验了不同浓度的纳米材料对胶原降解的影响并与无纳米材料的样品进行了比较。对于每个样品，金纳米颗粒(AuNP)的直径尺寸恒定为100nm，并且在本说明书的具体实施方式C节(“制备结合物的方法”)中描述了制备所述结合材料的方法，该节作为参考并入本实施例。不同样品间的浓度不同(1×、2×、4×)。不同样品间零长交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的浓度也是不同的。对照样品含有通过无纳米颗粒的ECD(1×)交联的大鼠尾胶原。实施胶原酶测定以测试交联样品的生物稳定性。通过羟脯氨酸释放量测量通过样品降解的生物稳定性。在图5中报告了相对于对照(EDC 1×无纳米颗粒)的降解基质的百分比。误差线表示由8个样品计算的标准偏差。零长交联剂ECD浓度的简单加倍将支架的降解显著降低了30％(p＜0.001)。将金纳米颗粒加入到所述基质中还对降低所述基质的降解具有显著作用(p＜0.001)。1×浓度的100nm金纳米颗粒降低了50％的降解，而2×浓度显著降低至少至7％的降解(p＜0.01)。AuNP(2×)和AuNP(4×)以及具有提高至2×浓度的EDC的AuNP(1×)之间没有显著差别。结果表明100nm金纳米颗粒的加入有助于胶原的蛋白分解耐受性并且提高了基质的生物稳定性。结果还表明纳米材料沿胶原纤维与胶原酶结合位点的连接降低了支架的降解速率。结果还表明可以使用一定范围大小和形状的纳米材料，如直径在约20至约1000纳米之间的纳米棒。

此外，通过用胺基(MEA)官能化所述纳米材料，可以使所述纳米材料和胶原之间所形成的键的个数最大化。另外，每个纳米颗粒可以提供多个(两个以上)连接位点，尽管大部分交联剂通常在胶原纤维之间提供两点连接。该方法可以使得能够制造最适于组织内向生长和天然胶原沉积的具体预定的胶原基质孔径尺寸。由于金纳米材料起到自由基清除剂的作用，因此支架还将有助于抗氧化作用并同时还提供抗微生物作用。

一旦插入体内，其它蛋白质可以结合至所述纳米材料以有利于特异性相互作用。例如，可以将纤维蛋白加入到具有MEA的纳米材料中以辅助伤口愈合期间的血液凝固。

实施例4

(细胞存活力测定)

图6提供了显示通过WST-1活力测定的所使用的金纳米颗粒对细胞存活力的影响的数据。具体地，将如实施例3中以1×、2×、4×和8×浓度制备的具有金纳米颗粒的胶原支架与细胞一起培育3天。通过将WST-1转化为用UV-Vis记录的吸光值确定了细胞的存活力。图3中所示的结果表明对照的存活力不显著高于存在纳米颗粒的情况下的细胞存活力。因此，纳米材料具有极低的细胞毒性。通过从较高浓度的金纳米颗粒读取较大的吸光度表明在存在金纳米颗粒的情况下细胞更新程度更大以转化更多WST-1，或者在2×AuNP浓度下结合位点数饱和，从而在媒介中留下金纳米颗粒并且阻碍UV-Vis吸光值。

实施例5

(羧酸结合分析)

分析如实施例3中所制备的胶原支架以确定保留在所述支架上的游离羧基的量。具体地，对具有和不具有金颗粒的支架使用傅里叶变换红外光谱。该技术用于表明羧酸处峰的减小，其显示了金与胶原上COOH的结合。如图7中所示，观察到了1125-920nm区域中峰的减小，这是C-OH键(游离COOH基团)减少的指示。曲线下的面积从0.3680变为0.3，胶原/颗粒结合物支架上游离羧基减少了18％。

实施例6

(细胞性、细胞保留和细胞外基质产生的体外评价)

本实施例提供了显示与未处理的对照相比，结合的胶原/颗粒材料对细胞性、细胞存活力、细胞外基质产生和细胞分布的影响的数据。

材料和方法

支架组分配：评价了5种不同的金纳米颗粒和胶原凝胶的组合。将这些组编号为1至5，并在表1中列出。将共计10个构件与真皮成纤维细胞接种并培育7和14天。分析了总计50个样品。

表1

成纤维细胞的收获和培养：从出于与本研究无关的原因通过过量服用巴比妥酸盐人道安乐死的狗中收获皮肤真皮。将组织置于具有10％胎牛血清、0.008％Hepes缓冲液、0.008％非必需氨基酸、0.002％青霉素(100IU/mL)、链霉素(100μg/mL)、两性霉素B(25μg/mL)、0.002％L-抗坏血酸盐、0.01％L-谷氨酰胺(DMEM+FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基中以用于运输。使用#10手术刀在无菌技术条件下将真皮组织切成2mm×2mm的块。将组织片段以浓度为7.5mg/mL的RPMI 1640溶液与无菌IA型梭状芽孢杆菌胶原酶溶液(Sigma，USA)合并。将混合物在培育箱中在37℃、5％CO₂、95％的湿度的条件下搅动6小时。将消化溶液以1000RPM离心10分钟。倒掉上清液并将细胞颗粒在5mLDMEM+FBS中再悬浮。将烧瓶在37℃、5％CO₂、95％的湿度的条件下培育，并且每3天更换一次无菌培养基。使用倒置显微镜监测成纤维细胞的生长直至在每个组织培养瓶中观察到95％的细胞汇合。通过继代培养将细胞转移到75mL组织培养瓶中直至实现第3次传代，然后冷冻备用。随后，在使用前将细胞融化，从单层中释放并放入溶液中。

支架接种：从每个组和处理中形成体积近似为250μL的胶原凝胶。将每个组的10个(n＝10)构件在组织培养板的各个孔的PBS中放置24小时，所述组织培养板在作为预浸湿条件的37℃、5％CO₂、95％的湿度的条件下放置于内部无菌的培育箱中。先前的微生物培养和敏感性检查确认在将构件培养3天的一段时间后无生长。在预浸湿后，从每个孔中除去培养基并更换为浓度为1×10⁶个细胞/mL的成纤维细胞溶液。将构件与细胞溶液一起静态培养24小时，此时在研究期间将细胞溶液替换为DMEM+FBS培养基。

构件的收获和评价：在第7天和第14天从每个组收获5个(n＝5)构件。获取每个构件的横截面用于细胞存活力和分布的评价。通过使用乙锭均二聚物-1(4μL/ml PBS)和钙黄绿素AM(乙酰甲酯)(0.4μl/ml PBS)荧光染色(活/死细胞存活力/细胞毒性试剂盒，Molecular Probes Co.)和使用紫外线显微术确定细胞存活力。制备1毫米切片并且在室温下与染色剂一起培育20分钟，放置在玻璃显微镜用载玻片上，用几滴PBS润湿，使用荧光双标记技术染色。在10×放大下检查切片。通过Olympus DP-70(Olympus，Melville，NY)数字照相机数字捕获每个切片的图像并保存为Tiff文件。将剩余的每个构件冷冻干燥并获得干重，然后与1ml木瓜蛋白酶溶液混合。通过二甲基亚甲蓝测定使用每个消化物的部分确定GAG含量，并且通过确定羟脯氨酸浓度确定胶原含量。将剩余的溶液在60℃在水浴中培育4小时。将Quant-iT PicoGreenTM双链DNA定量测定(Invitrogen)用于确定剩余支架的细胞性。将从牛胸腺提取的双链DNA与TE缓冲液(Invitrogen)混合以产生1000、100、10和1ng/ml的标准DNA浓度。将标准品和100μl的每种木瓜蛋白酶消化样品(在以上GAG和羟脯氨酸测定中使用)加入到96孔板中。将100μL 2μg/ml的Pico Green试剂加入到每个孔中并且将所述板培育5分钟。通过Syngergy HT-KC-4分光光度读板器(BioTec，Winooski Vermont)在485nm激发光/528nm发射光条件下读取样品的荧光。使用FT4软件(BioTec，Winooski Vermont)将吸光值转化为ng/l浓度并且将总双链DNA得率以ng表示。

检验每个数据集并且通过保留数据集之外的大于或小于2倍标准偏差的那些值和弃去的那些值确定离群值。用单向方差分析对组内和组间差异进行统计分析，其中各个组之间的差异通过统计显著性设置为p＜0.05的多种事后成对(post-hoc all-pairwise)检验确定。

结果

作为细胞性量度的双链DNA评价：如图8中所示，第7天：组1比组2、3和5具有显著更高的DNA量。未检测到其它显著差异。第14天：组2比组5具有显著更高的DNA量。未检测到其它显著差异。组1显示出随时间DNA含量的显著降低，而组2和3显示出在两个时间点之间DNA的增加。未检测到其它显著差异。

糖胺聚糖(GAG)评价：如图9中所示，第7天：组1比组5具有显著更高的GAG量。未检测到其它显著差异。第14天：组2比组1和5具有显著更高的GAG量。未检测到其它显著差异。组1显示出随时间GAG含量的显著降低，而组2和3和5显示出在两个时间点之间GAG的增加。未检测到其它显著差异。

细胞存活力/完整性评价：在所有时间点，所有组中主观上细胞存活力＞95％(图11A)。在所有组中标记的细胞筏(cell rafting)明显，从而由于活细胞性的压倒性汇合而使得无法通过计算机图像分析进行特异存活力定量。没有组显示出将解释为细胞死亡迹象的原因。每个组表现出细胞粘附、保持和增殖(图12)。7天组显示出大筏中更多细胞表面增殖的迹象，而第14天，在每个组中观察到了凝胶构件内部更深的渗透。主观上，在组间细胞渗透的程度或范围方面未检测到差异。在凝胶中观察到AuNP结合腔的那些切片中，注意到细胞增殖沿该通道是丰富的(参见第7天，组2和5)。

结论

实施例6中的这些数据表明尽管最初胶原凝胶的细胞化似乎在未处理的凝胶中是最佳的，但是长期分析显示一般AuNP处理组似乎比未处理凝胶构件能够更好地保留细胞或支持它们增殖。应注意这些观察很大程度上是基于仅截止于14天时的趋势，与组间DNA含量有关的仅有的统计差异是组2比组5具有更好的细胞系。这两个组之间处理的差异是组5中EDC浓度加倍，这可能对细胞保留或增殖产生有害作用。但是检验每个处理内的两个时间点，组1是唯一表现出细胞性随时间显著降低的组，而组2和3显示出提高。尽管在本文中未具体检验细胞的有丝分裂发生或增殖，但是由于在任何时间点均未加入额外的细胞，因此那些组中细胞性的增加可能是细胞性提高的(部分)结果。所有组均显示出随时间保留细胞和支持它们整合到凝胶构件内部并且无可检测细胞死亡迹象的能力。根据成对dsDNA/细胞存活力数据，似乎尽管组1中在第7天和第14天之间细胞保留的成功性较低(但是不必须经历提高的细胞死亡量)，因此这表明处理组还更适合细胞保留，特别是在组2和3(2×和1×AuNP浓度)中。细胞性的这种提高可能是由于组2在第14天时GAG产生的相应较大提高所造成的。就以羟脯氨酸检验作为胶原产生的决定因素而言，组1、2和3的活性在两个时间点是非常相似的。有趣地，组4(4×AuNP)显示出较低水平的HP浓度，特别是在第14天。组5显示出初始HP含量的增加，其随时间显著降低。

根据本发明，不需要进行过多实验就可以制备并实施本说明书中所公开并主张权利的所有材料、组合物或方法。尽管已通过具体实施方式说明了本发明所述的材料、组合物或方法，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下这些变化可以应用于所述材料、组合物或方法。

参考文献

下列参考文献以为本说明书中所述的那些内容提供示例性程序或其它细节补充的程度作为参考并入本文。

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Claims

1.包含共价结合至颗粒的胶原的组合物，其中在所述胶原的游离羧酸基和所述颗粒的胺反应基团之间形成了共价酰胺键，并且其中所述颗粒具有尺寸范围在50至1000纳米的平均粒径。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胶原是交联的。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述交联的胶原是多孔的并且具有范围在500纳米至200微米或1微米至100微米的平均孔径。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述胶原是通过所述颗粒交联的，其中在所述胶原的游离羧酸基和至少一个颗粒上的至少两个胺反应基团之间形成了至少两个共价酰胺键。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中用碳二亚胺交联剂使所述胶原交联。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述颗粒具有50至150纳米之间的平均粒径。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述颗粒包含金属材料。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述金属材料选自金、银、铂、钛、镍和铜。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述金属材料是金。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述颗粒包含陶瓷材料或生物可降解材料。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述反应基团是巯基乙胺或胱胺或两者。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述颗粒与胶原的比在1×10⁹个颗粒/mg胶原至2×10¹⁰个颗粒/mg胶原的范围内。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中使用2至4mg碳二亚胺交联剂/30mg胶原来形成共价键。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中使用0.5至0.2mg碳二亚胺交联剂/1×10⁹至2×10¹⁰个颗粒来形成共价键。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，还包含胚胎干细胞、成体干细胞、诱导的多能干细胞、上皮细胞、外分泌或内分泌细胞、成肌细胞、成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞、基质细胞、肝细胞、胰岛细胞、成神经细胞角化细胞、破骨细胞、骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞或肌细胞，或者它们的任意组合。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述组合物是凝胶、溶液、糊剂或脱水刚性结构。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含在注射器内。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物是真皮或表皮皮肤替代物。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中通过酰胺键将所述胶原的15至20％的游离羧酸基共价结合至所述颗粒。

20.用于通过在人中增加组织体积来使关节软骨膨胀的方法，其包括向对其有需要的人施用根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中通过注射至关节囊中施用所述组合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述胶原是交联的和多孔的并且具有范围在500纳米至200微米的平均孔径。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述颗粒具有50至150纳米之间的平均粒径。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述反应基团是巯基乙胺或胱胺或两者。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述颗粒与胶原的比在1×10⁹个颗粒/1mg胶原至2×10¹⁰个颗粒/1mg胶原的范围内。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述组合物是凝胶、溶液、糊剂或脱水刚性结构。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中通过酰胺键将所述胶原的15至20％的游离羧酸基共价结合至所述颗粒。

27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中使用2至4mg碳二亚胺交联剂/30mg胶原来形成共价键。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中使用0.5至0.2mg碳二亚胺交联剂/1×10⁹-2×10¹⁰个颗粒来形成共价键。

29.用于填充空隙、缺损或增加人体中组织体积的方法，其包括向对其有需要的人施用根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物是通过皮内或皮下注射施用的。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述空隙是面部细纹、皱纹、皱褶、凹痕或结节，并且其中在施用所述组合物后，所述面部细纹、皱纹、皱褶、凹痕或结节的出现减少。

31.根据权利要求29所述的方法，其中将所述组合物施用至人的嘴唇，并且其中在施用所述组合物后所述嘴唇的体积增加。

32.降低通过酶促分解的体外或体内胶原降解的方法，其包括将胶原与具有反应胺基并且具有50-1000纳米范围内的平均粒径的颗粒结合，其中在所述胶原的游离羧基和所述颗粒的反应胺基之间形成了共价酰胺键，并且其中借此降低了所述胶原通过胶原酶的降解。