CN103070400B - 莲原花青素作为晚期糖基化终产物形成抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲原花青素作为晚期糖基化终产物形成抑制剂的用途，一种以莲原花青素为主要活性成分的药物组合物。各种天然活性成分提取物重量百分比分别为：莲原花青素占70-80%,增效剂如V_E、V_C、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸等复合物占10-20%，其它天然提取物如荷叶提取物和银杏叶提取物等重量之和占5-10%。采用高效液相色谱法检测了莲原花青素及其主要结构单元儿茶素对晚期糖基化终产物形成过程中重要中间物质——甲基乙二醛的清除作用。并用高效液相多级质谱联用法鉴定出4种儿茶素与甲基乙二醛加合产物和9种莲原花青素与甲基乙二醛加合产物。结果证实，莲原花青素对模拟生理环境及模拟食品体系中晚期糖基化终末产物形成都具有良好的抑制作用。

Description

莲原花青素作为晚期糖基化终产物形成抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体涉及一种莲原花青素用于制备抑制晚期糖基化终产物形成的天然药物(抑制剂)在保健食品和食品添加剂中的应用。

背景技术

晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是人体内的还原糖与蛋白质或脂质发生不可逆反应所形成的，是非酶糖基化衰老理论的最终产物。在无酶的参与下，还原糖的醛基或酮基与蛋白质氨基酸氨基基团通过亲核结合，首先生成不稳定的Schiff碱，Schiff碱发生化学重排，形成较稳定的糖化合物Amadori产物，此为糖基化反应的早期阶段。Amadori产物或Amadori产物经过多步脱水和分子重排产生的多种高度反应性羰基化合物，如3-脱氧葡萄糖酮醛和甲基乙二醛等，进一步与其他游离氨基反应，最后形成不可逆性的AGEs，这是糖基化反应的晚期阶段。晚期糖基化终末产物(AGEs)现一般被分为两类：1）荧光型交联AGEs，如交联素(Crossline)、戊糖素(Pentosidine)和吡啶类衍生物(VesperlysineA,B,C)；2）无荧光非交联AGEs，如吡咯素(Pyrraline)、羧甲基赖氨酸(CML)和羧乙基赖氨酸(CEL)。AGEs可通过直接捕获蛋白质和引起蛋白质之间发生交联而影响其功能和结构，AGEs还可与其特异性受体相互作用，通过催化和活化单核巨噬细胞、激活转录因子kB、促进生长因子及细胞因子的合成和释放、灭活一氧化氮以及诱导氧化应激等途径造成组织细胞损伤。因此，寻找有效的AGEs抑制剂也越来越受到世界医药研究机构和多领域科学家的重视。

AGEs生成抑制的机理一般分为两类：1.通过影响Maillard反应底物及反应的中间产物或改变其反应条件来抑制；2.通过将已生成的AGEs交联物进行裂解来抑制。即AGEs形成抑制和AGEs断裂抑制。在较高氧气浓度、金属离子浓度、温度、水分活度及适宜pH下，都会促进AGEs的生成。此外，对于高血糖和糖尿病患者，通过降低其血糖浓度来抑制其体内AGEs的生成也是一条可行的途径。AGEs作为Maillard反应的终末产物，其形成的必要条件是反应初始的羰胺反应，即氨基酸或胺等亲核化合物和带有羰基的化合物（如还原糖）发生亲核反应，并生成希夫碱；之后再经历Amadori（或Heyns）重排，生成较为稳定的Amadori（或Heyns）化合物，并在不同的pH下降解生成各种羰基类化合物，研究表明这些反应性的羰基化合物是形成AGEs的前体化合物。故从反应底物和反应中间产物出发，用不发生美拉德反应的亲核化合物来封闭羰基化合物，是一条较好的抑制途径。再者，还可以用合成抑制剂溴化苯酰甲基噻唑（PTB）、二甲基噻唑（ALT711）通过裂解双羰基之间的C-C键来裂解并清除已生成的AGEs。

氨基胍（AG）是现在广泛研究的一种AGEs形成抑制剂，AG能捕获AGEs的前体物质如乙二醛、甲基乙二醛和葡萄糖酮醛等反应性羰基化合物，形成无活性的替代物，从而抑制AGEs形成。目前，仅有AG达到临床应用阶段，但AG对人体有较大的副作用，如引起胃肠道功能紊乱、破坏肺功能以及引起血管炎等。因此，开发天然无副作用的AGEs抑制剂已成为热点。

原花青素属于缩合单宁，是广泛存在于各种植物的核皮或种籽等部位的一种多酚化合物。原花青素广泛分布于葡萄、山楂、花生、银杏等植物中。研究表明，原花青素具有强大的抗氧化作用，其清除自由基的能力是V_E的50倍、V_C的20倍。此外，原花青素也具有很好的抗癌活性和保护心血管的功能。因而，其广泛应用于食品、化妆品和药品等领域。目前，国内外在葡萄籽原花青素方面的研究取得了突出的成果，尤其是在药理保健方面的功效研究日趋成熟和完善。而对莲科植物中的原花青素的研究本发明人还是首屈一指的。

莲房是莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的成熟花托(又名莲蓬壳，Seedpod of thelotus，简称LS)，其来源丰富，是未被充分利用的绿色环保资源。莲房主要成分包括蛋白质、脂肪、糖类、粗纤维、灰分、胡萝卜素、维生素B₂、尼古酸、维生素C、蹂质及微量莲子碱等。《本草纲目》中指出莲房具有“消瘀、止血”之功效。本发明人已建立了完善的莲原花青素（Lotus Procyanidins,LPC）的提取分离工艺（已获得专利保护ZL02 1 15423.6），对莲原花青素生理活性功效进行了研究，结果显示，莲原花青素有良好的抗氧化，清除自由基、抗肝氧化损伤、抗心肌缺血和降脂等多种功效。其是一种优良的天然抗老年痴呆药物（已获得专利保护0610124805.2），可诱导KB细胞凋亡，影响KB细胞表面粘附分子CD44的表达;同时在整体动物水平上首次证明了LSPC对DMBA诱发金黄地鼠颊囊癌变具有化学预防作用。但是到目前为止，国内外还未见莲原花青素作为晚期糖基化终产物抑制剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂(天然药物)在保健食品和食品添加剂中应用，莲原花青素具体涉及莲原花青素对模拟生理环境及模拟食品体系中晚期糖基化终产物形成的抑制作用，并探讨其作用机制。

为了实现上述的目的,本发明采用以下技术措施:

一种莲原花青素（包括其组成单体、二聚体、三聚体等低聚糖和高聚体及其混合物，以及它们与其他增效剂如V_E、V_C、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸等复合物）用于制备抑制晚期糖基化终产物形成的抑制剂(天然药物)在保健食品和食品添加剂中的应用。申请人首次发现莲科植物中存在大量低聚原花青素，并且建立和完善了莲原花青素的提取分离工艺，已获得中华人民共和国专利授权（ZL02 1 15423.6）。莲原花青素提取工艺简便、原料丰富、无毒副作用。

为达到上述的目的，一种以莲原花青素为主要活性成分的药物组合物。各种天然活性成分提取物重量百分比分别为：莲原花青素占70-80%,增效剂如V_E、V_C、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸等复合物占10-20%，（选取上述增效剂中的一种应用即可）其它天然提取物如荷叶提取物和银杏叶提取物等重量之和占5-10%（荷叶提取物和银杏叶提取物重量的比为1:1）。

莲原花青素的制备方法如下：将一定量的新鲜莲房去籽洗净，尽快撕碎后按照1:10(m/V)的料液比加入体积分数为70%的乙醇，以防止其被氧化。在60℃条件下浸提90min，抽滤得滤液，滤液在50℃条件下用旋转蒸发器减压回收乙醇，然后将浓缩液过AB-8大孔树脂，再用10倍量蒸馏水洗去不被吸附的杂质，之后用70%(v/v)的乙醇洗脱，收集洗脱液，真空回收乙醇，待叶绿素沉淀后倾出上清液，抽滤得滤液，用乙酸乙酯萃取，所得萃取液在40℃条件下用旋转蒸发器减压回收乙酸乙酯，完全旋蒸干后用少量水溶解，溶解后进行真空冷冻干燥，得黄色粉末，即为莲房原花青素低聚体，上述提取工艺参照中国授权专利（ZL02 115423.6）进行。

荷叶提取物得制备方法如下：将荷叶粉末与60%乙醇溶液按照料液比1:14（W/V），超声15min,提取4次，真空回收乙醇，即可得荷叶提取物得水溶液，真空冷冻干燥即得粉末状荷叶提取物。

银杏叶提取物、V_E、V_C、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸均为粉末状，V_E、V_C购于Biosharp公司，EGCG购于sigma公司，半胱氨酸购于国药集团，银杏叶提取物购于深圳市汉荣实业发展有限公司。

上述粉末按照一下比例（重量比）混合即得粉末状晚期糖基化终末产物抑制剂：莲原花青素占70-80%，增效剂如V_E、V_C、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸等复合物占10-20%，（选取上述增效剂中的一种应用即可），荷叶提取物和银杏叶提取物等重量之和占5-10%（荷叶提取物和银杏叶提取物重量的比为1:1）。

此种以莲原花青素为主要活性成分的天然药物组合物具有良好的抑制晚期糖基化终末产物形成的作用，可在保健食品和食品添加剂中的应用。

本发明在模拟生理环境（葡萄糖-牛血清白蛋白体系）及模拟食品体系（乳糖-赖氨酸体系）中，利用荧光分光光度计检测了莲原花青素对体系中晚期糖基化终末产物的抑制作用，并利用HPLC法检测了莲原花青素及其主要结构单元儿茶素对晚期糖基化终产物形成过程中重要中间物质——甲基乙二醛（MGO）的清除作用，对莲原花青素、儿茶素与甲基乙二醛的加合产物进行了鉴定。

一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在保健食品和食品添加剂中的应用,其技术方案如下：

A．莲原花青素从莲科植物中提取(专利授权号为:02115423.6），无任何毒负作用，所述的莲科植物中提取的莲原花青素作为药物活性成分，利用现代常用药物制剂手段，可将莲原花青素作成活性成分制成可制备胶囊、微囊、粉剂、颗粒剂、片剂和口服液等任何一种药学上可接受的剂型。所述的莲科植物具体包括莲房、荷叶、莲籽壳、莲藕皮和莲藕节。

B.在模拟生理环境下，研究了莲原花青素对晚期糖基化终产物形成的抑制作用。用pH7.4的0.2mol/L的磷酸缓冲液（PBS）配制成5mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液、0.2mol/L的葡萄糖（Glu）及3mmol/L的叠氮钠（NaN₃）溶液来模拟人体生理环境，用PBS缓冲液配制终浓度为0.01、0.02、0.04、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL莲房原花青素溶液及1mg/mL的氨基胍溶液（AG），实验分4组：1）Control组：BSA+Glu+NaN₃;2）BSA组：BSA+NaN₃;3）LSPC组：BSA+Glu+LSPC+NaN₃;4）AG组（阳性对照）：BSA+Glu+AG+NaN₃，于37℃的隔水式培养箱中密封避光孵育35d。后用荧光分光光度计在晚期糖基化终产物产生的特征激发和发射波长（EX=370nm，EM=440nm）下，检测其荧光值，计算抑制率（IR）。

C．在模拟食品体系下，研究了莲原花青素对晚期糖基化终产物形成的抑制作用。在80℃和100℃分别加热2h和10min时抑制率达最高。80℃时，LSPC对模拟体系中AGEs生成的半抑制浓度IC50为0.162mg/mL；100℃时，LSPC对模拟体系中AGEs生成的半抑制浓度IC50为0.250mg/mL。

D．利用HPLC-MS法探讨了莲原花青素对晚期糖基化终产物形成的抑制机制，鉴定了多种结合反应产物。

一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在保健食品中的应用，其步骤是:

以莲原花青素为主要活性成分的药物组合物。各种天然活性成分提取物重量百分比分别为：莲原花青素占75%,增效剂如V_E、V_C、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸等复合物占15%（选取上述增效剂中的一种应用即可），其它天然提取物如荷叶提取物和银杏叶提取物等占10%，荷叶提取物得制备方法如下：将荷叶粉末与60%乙醇溶液按照料液比1:14（W/V），超声15min,提取4次，真空回收乙醇，即可得荷叶提取物得水溶液，真空冷冻干燥即得粉末状荷叶提取物。银杏叶提取物、VE、VC、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸均为粉末状，VE、VC购于Biosharp公司，EGCG购于sigma公司，半胱氨酸购于国药集团，银杏叶提取物购于深圳市汉荣实业发展有限公司。获得一种莲原花青素作为晚期糖基化终产物形成抑制剂,可通过一种莲原花青素作为晚期糖基化终产物形成抑制剂与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂或辅剂(赋形剂或辅剂通常占30%-70%)（如：淀粉、糊精、蔗糖、木糖醇、碳酸钙等）结合形成各种胶囊、片剂或者饮料等各种保健品（一种莲原花青素作为晚期糖基化终产物形成抑制剂在保健品中的含量通常为40-50重量%）。所述的保健食品包括预防老年病、糖尿病、肾脏疾病和动脉血管病的各种剂型保健食品中的用途。

一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在食品添加剂中的应用,其步骤是:

在食品的加热、烹饪、储藏、运输等过程中，加入一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂（按照重量比1000:1的比例加入），从而抑制食品在这些过程中产生有害的晚期糖基化终末产物。所述的食品添加剂包括抗氧化剂、营养强化剂、着色剂等。所述的营养强化剂为常用的食品营养强化剂:

1、维生素类：维生素A、β-胡萝卜素、B族维生素（硫胺素盐酸盐、核黄素、烟酸）、维生素c。

2、矿物元素强化剂：钙、碘、铁、锌。

3、常用的赖氨酸强化剂有：L-盐酸赖氨酸、L-赖氨酸.L-天门冬氨酸盐、L-赖氨酸-L-谷氨酸盐等。另外，牛磺酸也是常用的一种氨基酸强化剂。

4、目前常用于食品强化的蛋白质有大豆蛋白、乳清蛋白、脱脂乳粉、酵母粉、鱼粉等。

一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在作为食品添加剂添加到固体中的应用,其步骤是:

将固体食品放入以莲原花青素为主要活性成分的药物组合物的水溶液中（浓度为1mgmL）浸渍，然后沥干，然后入锅油炸或翻炒，即能有效减少固体食品在高温烹饪过程中产生的晚期糖基化终末产物。所述的固体食品具体指一些高油高脂的食品如油炸鸡腿、油炸薯条、薯片等。

一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在液体食品中的应用,其步骤是:

在液体食品中加入上述以莲原花青素为主要活性成分的药物组合物（重量比为1000:1），然后再进行热加工（高温蒸煮或微波加热等，温度在120℃-220℃），即能有效减少液体食品在热加工过程中产生的晚期糖基化终末产物。液体食品具体为高脂高蛋白高糖等液体食品如牛奶、咖啡等。

本发明与原有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明采用高效液相色谱法检测了莲原花青素及其主要结构单元儿茶素对晚期糖基化终产物形成过程中重要中间物质——甲基乙二醛（MGO）的清除作用。并用高效液相多级质谱联用法鉴定出4种儿茶素与甲基乙二醛加合产物和9种莲原花青素与甲基乙二醛加合产物。结果证实，莲原花青素对模拟生理环境及模拟食品体系中晚期糖基化终末产物形成都具有良好的抑制作用。具体是:

1.氨基胍（AG）是现在广泛研究的一种晚期糖基化终末产物（AGEs）形成抑制剂。目前，仅有AG达到临床应用阶段，但AG对人体有较大的副作用，如引起胃肠道功能紊乱、破坏肺功能以及引起血管炎等，不宜长期使用。而莲原花青素是一种天然无毒副作用的提取物，且对AGEs的抑制效果优于AG。因此，莲原花青素可以作为一种良好的天然AGEs抑制剂。

2.本发明表示：在体外模拟生理条件，葡萄糖—牛血清白蛋白体系37℃孵育35d下，莲原花青素对晚期糖基化终末产物（AGEs）生成的抑制率随浓度的增加而增加（P<0.01）。其抑制率明显高于相同浓度的氨基胍(AG)。

3.本发明表示：在模拟食品体系（α-乳糖/L-Lysine）中，在80℃和100℃加热条件下，莲原花青素对晚期糖基化终末产物（AGEs）生成都有良好的抑制作用。

附图说明：

图1-1为一种不同时间下LSPC对AGEs生成的抑制。

图1-2为一种不同浓度的LSPC对AGEs生成的抑制。

图2-1为一种80℃不同反应时间下LSPC对模拟体系中AGEs生成的抑制效果。

图2-2为一种100℃不同反应时间下LSPC对模拟体系中AGEs生成的抑制效果。

图2-3为一种80℃不同浓度的LSPC对模拟体系中AGEs生成的抑制效

图2-4为一种100℃不同浓度的LSPC对模拟体系中AGEs生成的抑制效果。

图3-1为一种315nm下MGO清除色谱图。

图3-2为一种AG、LSPC、Catechin对MGO的清除率。

图3-3为一种273nm下Catechin&MGO和LSPC&MGO反应物色谱图。

图3-4为一种4种Catechin&MGO反应产物(A,B,C,D)和9种LSPC&MGO反应产物(E,F，G,H,I,J,K,L,M)的二级质谱图。

图3-5为一种推测的4种Catechin&MGO反应产物(A,B,C,D)和9种LSPC&MGO。

反应产物(E,F，G,H,I,J,K,L,M)的结构图。

具体实施方式

下面用莲原花青素对模拟生理环境及模拟食品体系中晚期糖基化终末产物形成的抑制作用，并探讨其作用机制，说明其在天然药物，保健食品和食品添加剂的新用途。

实施例1：

以莲原花青素为主要活性成分的药物组合物。莲原花青素占70或75或80%,增效剂如VE、VC、没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和半胱氨酸等复合物占10或15或20%，（选取上述增效剂中的一种应用即可）其它天然提取物如荷叶提取物和银杏叶提取物等重量之和占5或8或10%（荷叶提取物和银杏叶提取物重量的比为1:1）。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂或辅剂（如：淀粉、糊精、蔗糖、木糖醇、碳酸钙等）结合形成各种胶囊、片剂或者饮料等各种保健品或食品添加剂，利用现代常用药物制剂手段，可将莲原花青素为主要活性成分的药物组合物制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂任何一种药学上可接受的剂型。

在模拟生理环境下，莲原花青素对晚期糖基化终末产物形成的抑制作用

1实验材料：

1.1实验原料：莲科植物原料采自洪湖种植区，品种名称为“武植2号”(请见遗传资源表)。

将一定量的新鲜莲房去籽洗净，尽快撕碎后按照1:10(m/V)的料液比加入体积分数为70%的乙醇，以防止其被氧化。在60℃条件下浸提90min，抽滤得滤液，滤液在50℃条件下用旋转蒸发器减压回收乙醇，然后将浓缩液过AB-8大孔树脂，再用10倍量蒸馏水洗去不被吸附的杂质，之后用70%(v/v)的乙醇洗脱，收集洗脱液，真空回收乙醇，待叶绿素沉淀后倾出上清液，抽滤得滤液，用乙酸乙酯萃取，所得萃取液在40℃条件下用旋转蒸发器减压回收乙酸乙酯，完全旋蒸干后用少量水溶解，溶解后进行真空冷冻干燥，得黄色粉末，即为莲房原花青素低聚体，上述提取工艺参照中国授权专利（ZL02 1 15423.6）进行。

莲房原花青素低聚体样品利用盐酸正丁醇法检测，其原花青素含量相对于葡萄籽原花青素标品为：106.22±0.46%。

1.2实验试剂：

牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖（Glu）、叠氮钠（NaN₃）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司、氨基胍（AG）购于sigma公司。

1.3主要仪器：

岛津RF5301荧光分光光度计，隔水式培养箱。

2实验方法：

2.1AGEs体外孵育时间的确定：

2.1.1分组方法：实验分3组：1）Control组：BSA+Glu+NaN₃;2）BSA组：BSA+NaN₃;3）LSPC组：BSA+Glu+LSPC+NaN₃，每组3个平行。

2.1.2加样方法：BSA、Glu、NaN₃（防腐剂）和LSPC分别用pH为7.4的0.2M的PBS溶解，加入30ml的具塞玻璃管中，使其最终的浓度为：BSA 5mg/ml;Glu 36mg/ml;NaN₃ 3mM;LSPC 0.2mg/ml。

2.1.3检测方法：

三组试管置于37℃的隔水式培养箱中密封避光孵育，后于3、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70d取1ml反应液进行检测。

取得的1ml反应液，避光冷却至室温，用pH为7.4的PBS稀释到4ml，再用荧光分光光度计检测其荧光值（EX=370nm，EM=440nm，入射和出射狭缝宽度皆为5nm）。其荧光值都按稀释倍数换算到原始浓度的荧光值，抑制率（IR%）按下述公式计算：

$\mathrm{IR}\%=\frac{F\left(\mathrm{Control}\right)-F\left(\mathrm{LSPC}\right)}{F\left(\mathrm{Control}\right)-F\left(\mathrm{BSA}\right)}*100$

其中:IR：抑制率；F：荧光值；LSPC：莲原花青素；Control：模型组；BSA：牛血清白蛋白。

2.2不同浓度的LSPC对体外AGEs生成的抑制：

2.2.1分组方法：实验分4组：1）Control组：BSA+Glu+NaN₃;2）BSA组：BSA+NaN₃;3）LSPC组：BSA+Glu+LSPC+NaN₃;4）AG组（阳性对照）：BSA+Glu+AG+NaN₃，每组5个平行。

2.2.2加样方法：用pH7.4的0.2M的PBS配制所需的溶液：BSA、Glu、NaN3和LSPC（最终浓度为0.01、0.02、0.04、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/ml）、AG（最终浓度为1mg/ml），加入5ml的离心管中，每支管体系最终体积为1ml。

2.2.3检测方法：三组试管置于37℃的隔水式培养箱中密封避光孵育35d。孵育后的反应液按2.1.3方法进行荧光检测，并计算其荧光值和抑制率。

3数据处理:

所得数据均由SPSS 18.0进行统计处理（以平均值+标准差表示），IC50由SPSS 18.0中的Probit回归程序计算，图形均由OriginPro 8.0绘制。

4实验结果:

4.1AGEs体外孵育时间的确定：AGEs体外长期孵育的结果如图1-1所示，Control组和LSPC组的荧光值均随着时间而增加，Control组的增加速度明显快于LSPC组，说明LSPC对体外AGEs的生成能起到较好的抑制效果（BSA组的荧光值为58.259±4.351-426.300±10.981，图中未显示）。从抑制曲线可以看出从3d到42d，LSPC对AGEs生成的抑制率不断增加，28d后趋于平稳，42d后，由于LSPC组荧光值急剧上升，其抑制率有一定程度的下降，故选35d为最终的孵育天数。

4.2不同浓度的LSPC对体外AGEs生成的抑制：不同浓度的LSPC对体外AGEs生成的抑制结果如图1-2所示，LSPC对AGEs生成的抑制率随浓度的增加而增加（P<0.01）。其抑制率随浓度0.01-1mg/ml变化分别为19.86±0.77%,28.95±1.91%,48.04±0.79%,67.65±1.08%,73.10±0.96%,80.44±0.39%,95.48±0.48%,111.26±0.43%，其抑制率明显高于相同浓度的AG（57.20±1.96%）。其对AGEs生成的IC50=0.039mg/ml（95%置信区间=0.035~0.043mg/ml）。

实施例2：在模拟食品体系下，莲原花青素对晚期糖基化终产物形成的抑制作用

1实验材料：

1.1实验原料：原料制备方法如实施例1

1.2实验试剂：

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、α-乳糖均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；L-赖氨酸(L-Lysine)生化试剂，购于日本BIOSHARP公司。

1.3主要仪器：

岛津RF5301荧光分光光度计，HH-2S恒温水浴锅。

2实验方法：

2.1不同反应时间下LSPC对AGEs的抑制效果，确定加热反应时间：

2.1.1实验方法：

准确称取α-乳糖1.8016g和L-Lysine0.731g（物质的摩尔比为1：1），分别用蒸馏水定容至50mL，称取0.08g莲房原花青素，用蒸馏水定容至10mL。取0.1mol/L的α-乳糖溶液4.5mL，0.1mol/L的L-Lysine溶液4.5mL，莲房原花青素溶液1mL，制成反应液10mL。设置在80℃条件下的反应时间为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h；在100℃条件下的反应时间为4min、6min、8min、10min、15min、20min、30min、60min。设置不添加莲房原花青素并且加热的对照组，以及不加莲房原花青素也不加热的空白组，均做三个平行，取平均值。

2.1.2检测方法：

孵育后的反应液按实施例1中2.1.3方法进行荧光检测，并计算其荧光值和抑制率。

2.2不同浓度LSPC对AGEs的抑制效果:

2.2.1实验方法：

准确称取α-乳糖1.8016g和L-Lysine0.731g（物质的摩尔比为1：1），分别用蒸馏水定容至50mL，准确称取0.1g莲房原花青素，用蒸馏水中定容至10mL，制成1mg/mL莲房原花青素溶液，再根据需要稀释。80℃添加莲房原花青素浓度分别为1mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.02mg/mL；100℃添加莲房原花青素浓度分别为1mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL。取0.1mol/L的α-乳糖溶液和L-Lysine溶液各4.5mL，及不同浓度的莲房原花青素溶液1mL，制成反应液10mL。根据实施例2中2.1的实验结果，设置在80℃下反应2h，在100℃下反应10min。设置不加莲房原花青素并且加热的对照组，与不加莲房原花青素不加热的空白组，均做三个平行，取平均值。

2.1.2检测方法：孵育后的反应液按实施例1中2.1.3方法进行荧光检测，并计算其荧光值和抑制率。

3数据处理:

所得数据均由SPSS 18.0进行统计处理（以平均值+标准差表示），IC50由SPSS 18.0中的Probit回归程序计算，图形均由OriginPro 8.0绘制。

4实验结果:

4.1不同反应时间下LSPC对AGEs的抑制效果,确定加热反应时间：

图2-1和图2-2反映了两种温度下α-乳糖/L-Lysine模拟体系中AGEs的生成量随着反应时间的增加而变化的趋势，以及LSPC对AGEs生成的抑制效果。图2-1反映了80℃时，反应时间增加，荧光强度也迅速增加，加入LSPC后荧光强度相对减小，起到明显的抑制作用，时间越长抑制效果越明显，相对抑制率在0.5h到2h间随着时间的增加而增加，2h时达到93.7%，之后有减缓趋势。图2-2反映了100℃时，随着反应时间的增加荧光强度迅速增加，加入LSPC后荧光强度减小，起到明显的抑制作用，时间越长抑制效果越明显，相对抑制率在4min到10min间随着时间的增加而增加，10min时达到63.7%，之后有减缓趋势。故选择80℃反应2h,100℃反应10min作为探究不同浓度LSPC对AGEs抑制作用探究的反应时间。

4.2不同浓度LSPC对AGEs的抑制效果:

图2-3和图2-4反映了不同浓度的LSPC对α-乳糖/L-Lysine模拟体系中AGEs生成的抑制效果。不同温度条件下，LSPC浓度增加，相对抑制率亦增加。80℃时，LSPC对模拟体系中AGEs生成的半抑制浓度IC₅₀为0.162mg/mL；100℃时，LSPC对模拟体系中AGEs生成的半抑制浓度IC₅₀为0.250mg/mL。

实施例3：莲原花青素对晚期糖基化终末产物形成的抑制机制的探讨

1实验材料：

1.1实验原料：原料制备方法如实施例1相同。

1.2实验试剂：

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲基乙二醛、邻苯二胺均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；氨基胍（AG）、2,3-二甲基喹喔啉、儿茶素均为分析纯，购于sigma公司；甲醇色谱纯，购于美国Fisher Scientific公司。

1.3主要仪器：

Waters e2695高效液相色谱仪，Agilent 1100高效液相色谱-质谱联用仪。

2实验方法：

2.1LSPC及其单体Catechin对MGO的清除效果

2.1.1实验方法：

用pH7.4的50mM的PBS配制以下溶液：MGO(5mM)、PD(20mM,活性羰基衍生反应物)、DQ(5mM,内标)、AG(5mM,阳性对照)、LSPC(2.5mg/ml)和Catechin(5mM，甲醇助溶)。实验分3组：1）Control组：MGO(0.25ml)+PBS(0.25ml);2）AG组：MGO(0.25ml)+AG(0.25ml);3）LSPC组：MGO(0.25ml)+LSPC(0.25ml);4）Catechin组：MGO(0.25ml)+Catechin(0.25ml)，每组3个平行。每一组均加到5ml的离心管中，于37℃的水浴锅中密封反应1小时，取出置于冰浴中冷却5min，随后在每一组中加入0.125ml的PD和0.125ml的DQ，漩涡震荡10s混匀，再于37℃的水浴锅中继续密封反应0.5小时，取出置于冰浴中冷却5min。制好的反应液过0.22μm的针筒式滤膜，后用反相高效液相色谱法进行分离检测。

高效液相色谱（Waters e2695，配备二极管阵列检测器）条件如下：色谱柱为Diamonsil TM-C18色谱柱(4.6×200mm,5μm)；流动相A为含0.1%甲酸的纯水；流动相B为纯的甲醇；柱温25℃；流速为1ml/min；进样量为15μl；梯度洗脱程序为：0-3min,5-50%B;3-16min,50-50%B;16-17min,50-90%B;17-19min,90-90%B;19-20min,90-5%B;20-25min,5%B；色谱图在315nm下进行检测。

2.1.2计算方法：

反应液中MGO的降低量用DQ和MQ（MGO和PD的反应产物）的峰面积来计算，公式如下：

$C\left(\mathrm{MQ}\right)=\frac{C\left(\mathrm{DQ}\right)\&times;A\left(\mathrm{MQ}\right)}{A\left(\mathrm{DQ}\right)}=\frac{5\&times;A\left(\mathrm{MQ}\right)}{6\&times;A\left(\mathrm{DQ}\right)}\left(\mathrm{mM}\right)$

其中:C：试剂浓度；A：峰面积；DQ：2,3-二甲基喹喔啉；MQ:1一甲基喹喔啉；MGO：甲基乙二醛；Control：模型组。

2.2LSPC及其单体Catechin和MGO反应产物的鉴定

2.2.1实验方法：

LSPC及Catechin和MGO反应产物按1.2.4中的方法制备(未加内标物DQ)，实验共4组：1）LSPC空白；2）LSPC+MGO；3）Catechin空白；4）Catechin+MGO，每组一个平行，制好的反应液过0.22μm的针筒式滤膜，后用高效液相多级质谱联用法进行分离鉴定。

高效液相多级质谱联用（Agilent 1100）条件如下：色谱柱为Diamonsil TM-C18色谱柱(4.6×200mm,5μm)；流动相A为含0.1%甲酸的纯水；流动相B为纯的甲醇；柱温25℃；流速为1ml/min；进样量为15μl；梯度洗脱程序为：0-3min,5-50%B;3-16min,50-50%B;16-17min,50-90%B;17-19min,90-90%B;19-20min,90-5%B;20-25min,5%B；检测波长273nm。质谱分析的离子化方式为ESI负离子模式；碎片电压为70V；毛细管电压为3000V；雾化压力40psi；干燥气体温度为300℃，流速为10L/min；质谱离子范围为50-800m/z。

3数据处理:

图形均由OriginPro 8.0绘制。

4实验结果:

4.1LSPC及其单体Catechin对MGO的清除效果:

LSPC、Catechin及AG三者和MGO的反应产物的高效液相色谱分析结果如图3-1所示，其中DQ（2,3-二甲基喹喔啉）为内标物，MQ（1-一甲基喹喔啉）为MGO和PD的反应产物，用于定量计算剩余MGO的含量，MQ量越多，就表示MGO被清除的效果则越差。从图4中可以看出，Control组中MQ值最高，从AG到Catechin到LSPC，其值依次降低，即MGO的清除效果依次升高。

从图3-2中可以看出LSPC、Catechin和AG对MGO都有较好的清除能力，其清除率从大到小分别为：LSPC(81.343±1.348%)、Catechin(78.377±3.016%)、AG(72.748±1.469%)。（t双侧检验，两两之间P<0.05）。

4.2LSPC及其单体Catechin和MGO反应产物的鉴定:

LSPC及Catechin和MGO反应产物的色谱图如图3-3所示。

由反应产物的二级质谱图（图3-4）推出可能的4种Catechin&MGO反应产物(A,B,C,D)和9种LSPC&MGO反应产物(E,F，G,H,I,J,K,L,M)的结构图，如图3-5。

Claims (7)

1.一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在保健食品中的应用，所述的保健食品包括预防糖尿病、肾脏疾病和动脉血管病的各种剂型保健食品。

2.一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在食品添加剂中的应用, 所述的食品添加剂包括抗氧化剂、营养强化剂、着色剂。

3.一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在作为食品添加剂添加到固体食品中的应用,所述的固体食品为油炸鸡腿、油炸薯条、薯片。

4.一种莲原花青素制备抑制晚期糖基化终末产物形成的抑制剂在液体食品中的应用, 所述的液体食品为牛奶、咖啡。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征是莲原花青素为莲原花青素的单体和低聚体。

6.根据权利要求1所述的应用，所述的晚期糖基化终产物形成中间产物是活性二羰基化合物甲基乙二醛。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征是莲原花青素为胶囊、微囊、粉剂、颗粒剂、片剂或口服液。

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