CN103070068A - 一种基于als靶酶的抗除草剂油菜定向选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于ALS靶酶的抗除草剂油菜定向选育方法，属于植物性状选育方法。选择油菜生产或油菜育种需要的材料，将种子进行EMS处理，诱变种子经隔离扩繁至M2代，在以ALS为靶酶的除草剂选择压下，大群体定向筛选抗除草剂突变性状。为了提高获得突变性状的机率，定向筛选可连续多年或同年多点或多年多点进行，直至筛选到所需的突变材料。
Description
技术领域
本发明涉及到一种抗除草剂油菜的选育方法，具体涉及油菜材料的选择、种子EMS处理方法和除草剂选择压下抗性性状的定向筛选，属于植物性状选育方法。
背景技术
农田杂草严重影响油菜产量和品质，已成为油菜生产主要生物灾害之一，推广应用抗除草剂油菜品种，使用化学除草剂进行杂草防治，不仅快速、有效，而且经济实用。与传统油菜相比，抗除草剂油菜具有农事操作简便、高效，种植者只需在苗期喷施1～2次除草剂就能有效杀灭田间杂草，与人工锄草相比可节省劳动力，降低生产成本，提高经济收益。上世纪九十年代以来，北美的加拿大、美国等已大规模商业化种植抗除草剂油菜，取得了较好的经剂效益。然而，我国抗除草剂油菜至今尚未获准商业化种植，主要有两个原因：（1）抗除草剂油菜一般为转基因作物，进入商业化生产必须要经过严格的安全性评价。（2）迄今为止，国内油菜抗除草剂基因主要来自国外，抗性基因受国际知识产权保护，一旦商业化种植，需要交纳昂贵的专利费，这将大幅度提高油菜生产成本，违背了种植抗除草剂作物的初衷。2004年，我们在油菜和大豆多年轮作的试验田中发现了自然突变的抗咪唑啉酮类除草剂的油菜新种质M9，经多年试验鉴定, 该突变体抗性性状稳定、抗性效应明显，抗咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸的浓度是咪唑乙烟酸有效杀草浓度的2倍以上，具有实用价值。遗传研究表明，该突变体的抗性为显性性状, 由1对核基因控制, 抗性基因在F2和BC1群体中遵循孟德尔遗传规律，应用杂交、回交等常规育种方法就可将抗性基因导入目标品种，为选育具有自主知识产权且不受转基因油菜环境释放条件限制的抗除草剂油菜品种奠定了基础。咪唑啉酮类除草剂是美国氰胺公司在20世纪80年代初期开发成功的一类广谱、高活性除草剂，是目前应用最广泛的除草剂之一，其杀草谱广(包括禾本科和阔叶杂草)、用量低、对哺乳动物低毒和对环境友好。这类除草剂既可作土壤处理剂也可茎叶喷施，除草效率高、使用方便深得广大用户欢迎。研究表明，乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase, ALS）是咪唑啉酮类除草剂的靶酶，咪唑啉酮类除草剂通过与ALS形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS活性，导致支链氨基酸合成受阻，使植物组织失绿、黄化，最后逐渐死亡。但咪唑啉酮类除草剂为长残留性除草剂，具有土壤残留期长和后茬敏感作物的安全性问题。此类除草剂为弱酸性特性，在土壤中既有中性态，又有阴离子态，其残留期是典型的pH依赖型。因土壤pH值不同，其吸咐、淋溶、分解及残留差异较大。在高pH土壤中，阴离子态比例较大，降解迅速，随着土壤pH降低，中性态增多，被吸附量相应增加，降解缓慢，残留期延长。基于上述原因该类除草剂仅能在一熟季地区使用，是我国东北大豆产区的大豆专用除草剂，在长江流域多熟季地区未能登记发放。因此，以抗咪唑啉酮类除草剂油菜新种质M9选育或转育的油菜抗性品种，不能在我国冬油菜主产区推广应用，极大地限制了油菜抗咪唑啉酮性状的应用价值。
事实上以ALS为靶酶研制开发的除草剂目前已有五大类，即磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、磺酰胺类(SCT)、嘧啶水杨酸类(PTB)和三唑嘧啶类(TP)，生产上登记发放的除草剂品种更是不计其数。由于ALS除草剂具有选择性强、杀草谱广、使用剂量低、对哺乳动物毒性小等优点，自上世纪80年代早期开发出来后便得到了广泛应用。但与此同时由于大量连续使用这类除草剂，使得抗该类除草剂的抗性生物型杂草数量急剧增加，目前已超过三氮苯类除草剂，成为抗性杂草最为严重的一类除草剂。据不完全统计，全球30多个国家发现抗乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂的杂草生物型有98种，其中双子叶杂草68种，单子叶杂草30种。研究表明抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型中绝大多数是由靶标位点改变产生的，由5个必需氨基酸中的一个氨基酸被取代所致。122位（以模式植物拟南芥氨基酸位置计算，下同）丙氨酸被缬氨酸所取代，对咪唑啉酮类除草剂产生抗性。197位脯氨酸被组氨酸、或苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、或谷氨酰胺所取代，对磺酰脲类除草剂产生很强的抗性，有些位点也会对三唑嘧啶类除草剂产生交互抗性。205位丙氨酸被缬氨酸所取代，对各类ALS靶酶除草剂都具有一定程度的广谱抗性。574位色氨酸被亮氨酸所取代，对磺酰脲类、咪唑啉酮类和三唑嘧啶类除草剂都具有很强的交互抗性。653位丝氨酸被苏氨酸或天门冬酰胺所取代，对咪唑啉酮类除草剂具有很强的抗性。上述5个必需氨基酸有3个氨基酸(122位丙氨酸，197位脯氨酸，和205位丙氨酸)位于乙酰乳酸合成酶的氨基端，另2个(574位色氨酸和653位丝氨酸)位于酶的羧基端，这5个氨基酸在绝大多数已知植物的乙酰乳酸合成酶序列中的位置相当恒定。另外在ALS基因保守功能域以外的其它区域发生碱基突变也将产生不同方式的ALS抗性，如569位色氨酸被亮氨酸所取代，对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂产生抗性。591位色氨酸被亮氨酸所取代，对所有的ALS除草剂产生很强的广谱抗性。在高等植物中不论是杂草还是作物ALS基因有其共同点，都存在五个不连续的保守功能域，在这些保守功能域上发生点突变将导致基于靶位改变的ALS抗性（任雪玲， 吴超，杨华铮，基因点突变所引发的除草剂的抗性问题，化学通报 2006年，第1期，9-15；张朝贤，倪汉文，魏守辉，黄红娟，刘延，崔海兰，隋标峰，张猛，郭峰，杂草抗药性研究进展，中国农业科学，2009年，42（4）：1274-128）。点突变抗性研究为培育抗性作物提供了理论基础，利用植物ALS基因的高度保守性和靶标位点改变产生抗ALS抑制剂类除草剂的特性，为选育抗该类除草剂的作物品种提供了新途径。据报道应用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变和组织培养育成抗咪唑啉酮类和抗磺酰脲类除草剂的玉米品种，用亚硝基脲乙酯诱变和小孢子培养育成抗咪唑啉酮类除草剂的油菜品种，用EMS诱变育成抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种，用叠氮钠和EMS诱变育成抗咪唑啉酮类除草剂的小麦品种（沈晓霞，倪长春编译，咪唑啉酮类除草剂耐受性作物的过去、现状和未来（上），世界农药，2005年，27（5）：9-13；苏少泉，非草甘膦除草剂抗性作物的新发展，农药，2009年，48（12）：859-863）。另外在向日葵、甜菜、棉花、大豆、番茄、烟草和油菜等作物中均发现抗咪唑啉酮除草剂的天然突变体，人们可以直接从由于核苷酸点突变而对除草剂产生抗性的生物体中筛选和培育抗性品种。
生物学家普遍认为，杂草在其生长过程中如持续存在除草剂选择性压力，会诱发相关靶酶产生点突变，从而使杂草而产生抗性。因此，生产上预防杂草产生抗性的主要措施为降低除草剂选择压力，在农作物生长过程中尽量避免过度依赖化学除草剂，同一地理区域，轮种不同作物，选择具有不同作用靶位的除草剂轮流使用，都有利于降低选择压力，减少抗性杂草出现的可能性。相反在作物育种过程中则可以充分利用这种选择压力，加速抗除草剂品种的培育，而应用化学诱变剂定点诱变相关靶酶产生点突变，再利用除草剂选择压力定向筛选突变位点，则可大大加速作物抗除草剂品种的选育进程（任雪玲， 吴超，杨华铮，基因点突变所引发的除草剂的抗性问题，化学通报 2006年，第1期，9-15）。本发明正是基于上述原理提出的一种培育抗ALS靶酶除草剂油菜的新方法。
发明内容
技术问题
本发明能够弥补已有专利或技术的不足，提供了一种基于ALS靶酶的抗除草剂油菜定向选育方法。
技术方案
一种基于ALS靶酶的抗除草剂油菜定向选育方法，包括步骤：
A、种子EMS处理：对所需进行诱变的油菜种子，用该种子的半致死浓度进行EMS诱变处理；
B、诱变后代扩繁：诱变种子在隔离网室扩繁至M2代，收获足够进行大群体定向筛选的种子，低温保存备用；
C、除草剂压力选择：用以ALS靶酶开发的除草剂对M2代混合群体进行抗除草剂定向筛选，药剂用量为该除草剂防治杂草的推荐使用浓度，并连续喷施2次，第1次在油菜3～4叶期进行，10天后再喷施第2次；
D、对EMS诱变M2代进行抗除草剂定向筛选：喷药后不被除草剂杀死的植株为定向筛选到的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料；
E、抗性材料验证鉴定：对筛选获得的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料单株，花期套袋自交，收获自交种子，进行验证鉴定：待油菜长至3-4叶期，再次喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量90ga.i./hm2，喷药后不被除草剂杀死的植株即为定向筛选到的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料。
上述方法具体应用：
1）选择双低杂交油菜新品种宁杂15号父本N131；
2）用N131的EMS半至死浓度质量比0.4% 对油菜N131种籽进行EMS诱变处理；
3）对诱变后代在隔离网室扩繁至M2代，收获M2种子低温保存备用；
4）种植M2代油菜种子，种植M2代油菜种子，每平方尺留苗密度为50-70株。油菜苗长至3叶1心时喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量90ga.i./hm2，10天后再复喷1次；选择处理油菜苗中存活下来、没有药害症状的单株， 5-6叶期后将菜苗移至油菜育种大田，油菜开花时套袋自交，获得自交种子；
5）抗性材料验证鉴定：种植筛选获得的自交种子，待油菜长至3-4叶期，再次喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量90ga.i./hm2，喷药后不被除草剂杀死的植株即为定向筛选到的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料。
有益效果
本发明通过上述方法，可大大提高获得抗ALS靶酶除草剂油菜的选育效率，为抗除草油菜育种提供了新途径、新方法。
A：虽然EMS对植物后代的性状诱变是随机的，且机率很小。在高等植物中不论是杂草还是作物ALS基因有其共同点，都存在五个不连续的保守功能域，在这些保守功能域上发生点突变将导致基于靶位改变的ALS抗性（任雪玲， 吴超，杨华铮，基因点突变所引发的除草剂的抗性问题，化学通报 2006年，第1期，9-15；张朝贤，倪汉文，魏守辉，黄红娟，刘延，崔海兰，隋标峰，张猛，郭峰，杂草抗药性研究进展，中国农业科学，2009年，42（4）：1274-128）。点突变抗性研究为培育抗性作物提供了理论基础，利用植物ALS基因的高度保守性和靶标位点改变产生抗ALS抑制剂类除草剂的特性，为选育抗该类除草剂的作物品种提供了新途径。据报道应用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变和组织培养育成抗咪唑啉酮类和抗磺酰脲类除草剂的玉米品种，用亚硝基脲乙酯诱变和小孢子培养育成抗咪唑啉酮类除草剂的油菜品种，用EMS诱变育成抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种，用叠氮钠和EMS诱变育成抗咪唑啉酮类除草剂的小麦品种（沈晓霞，倪长春编译，咪唑啉酮类除草剂耐受性作物的过去、现状和未来（上），世界农药，2005年，27（5）：9-13；苏少泉，非草甘膦除草剂抗性作物的新发展，农药，2009年，48（12）：859-863）。但本发明针对油菜种子籽粒小、繁殖系数高的特点，选择在油菜幼苗期对诱变后代进行大群体定向筛选，直到获得需要的抗性性状为止，该方法简便易行、高效实用，本方法将大大加快抗除草剂油菜的选育进程。
B：试验证明，本发明N131的EMS半至死浓度为质量比0.4%处理油菜N131种籽，种植6000克M2种子（约100万株苗），处理菜苗中有5株存活，虽然生长变慢，但心叶青绿，没有药害症状。5-6叶期后将菜苗移至油菜育种大田，获得自交种子，经抗性验证鉴定，共获得4个抗性株系。
C：油菜种子籽粒较小，千粒重一般为4克左右，而繁殖系数高达1000多倍，一个6×50m的隔离大棚可保纯扩繁30～50公斤种子，籽粒总数高达800～1200多万粒，足够进行大群体定向筛选。在油菜3～4叶期进行除草剂抗性筛选，由于菜苗较小，且2次喷药，可在较高密度下进行筛选。如每年用1～2亩地进行定向筛选，每平方尺留苗密度为60株，1年可定向筛选36～72万苗，如连续进行5年或5平方尺土地？则可定向筛选的诱变苗可达到180～360万株，这样大群体的定向筛选可大大增加获得突变性状的概率，是选育抗除草剂油菜切实可行的方法。
具体实施方式
实施例：抗磺酰脲类除草剂苯磺隆油菜的选育。
A：EMS浓度梯度试验：2007年秋，选择双低杂交油菜新品种宁杂15号父本N131为材料（浦惠明等，甘蓝型油菜(B．napus)油蔬两用新品种宁杂15号的选育，江苏农业学报，2010，26(6)：1432～1434），用pH为7.0、0.1M的磷酸缓冲液配制0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%共5个浓度的EMS溶液，以清水为对照，进行EMS浓度梯度试验。试验种子先用清水浸泡12h，吸水纸吸干种子表面水分，进行EMS浸种处理， 处理8h后将种子用流水冲洗4h，处理好的种子整齐排列于铺有滤纸的培养皿中，每皿100粒，重复3次，置于人工气候培养箱内，25度光照发芽，3天后统计发芽率。随着EMS浓度增加种子发率相应下降，其中0.4%EMS浓度处理的发芽率为53.13%，接近半至死浓度，确明N131的EMS半至死浓度为质量比0.4%（表1）。
表1 油菜种子在EMS不同浓度（质量比）处理下的发芽率
| EMS | 0% | 0.2% | 0.4% | 0.6% | 0.8% | 1.0% |
| 发芽率 | 100% | 72.95% | 53.13% | 42.97% | 6.64% | 0.0% |
B：N131的EMS诱变处理：油菜播种前1天进行EMS诱变处理，将250克N131种子装入尼龙网袋，放入盛满清水的容器中浸泡12h，将尼龙网袋挂于高处待水份基本沥干后，置于用pH为7.0、0.1M磷酸缓冲液配制的0.4%EMS溶液中处理8h，将处理种子用流水冲洗4h后，再次将尼龙网袋挂于高处将水沥干后，即时将全部种子撒播种于具有隔离条件的6×25m隔离大棚内。由于此时种子已处于萌发期，部分种子已露芽，播种时应轻拿轻撒，播后要及时浇灌，以防回芽，确保一次齐苗。
C、诱变后代的扩繁：2008年春油菜开花后用尼龙网罩隔离保纯，由于诱变当代（M0）种子量较小，种子收获后需要进行再次扩繁，随机抽取一定量的M1种子，采用集团混合法于2008年秋播种于具有隔离条件的6×50m隔离大棚内，2009年春油菜开花后用尼龙网罩隔离保纯，2009年夏收M2代种子60多斤，保存于低温库备用。
D、大群体定向筛选：2009年和2010年秋连续2年对M2种子用磺酰脲类除草剂苯磺隆进行抗性性状的鉴定筛选。2009年秋播种1500克M2种子，种植1.2亩，出苗后调查密度，40.5株/平方尺，群体总苗数为29.17万株。2010年秋播种4500克M2种子，种植1.5亩，出苗后调查密度，84.5株/平方尺，群体总苗数为76.09万株。油菜苗长至3叶1心时喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量90ga.i./hm2。由于种植密度较高，为了防止漏喷，同时增加除草剂选择压力，10天后再复喷1次。2009年29.17万株处理菜苗均被苯磺隆除草剂杀灭，未能筛选到抗性植株。2010年在76.09万株处理菜苗中有5株存活，虽然生长变慢，但心叶青绿，没有药害症状。5-6叶期后将菜苗移至油菜育种大田，2011年春油菜开花时套袋自交，夏收获得自交种子。
E、抗性材料的验证鉴定：2011年秋播，对筛选鉴定获得的5株自交种子，以原始亲本N131为对照，种成6个株系，每个株系种2行，每行20-30苗，待油菜长至3-4叶期，再次喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量15g a.i./hm2。从喷药后第7天开始，每个星期观察药害反应，其中有1个株系和对照在喷药后7天就有药害反应，菜苗心叶开始变黄，并渐渐腐烂，最后死亡，这株苗应为高密度种植条件下药剂漏喷所致。1个株系表现出一定程度的抗性，药效反应缓慢，最后菜苗能够存活，但菜苗畸形，形成丛生的多头苗，当年编号为M343。3个株系表现出较强抗性，在苯磺隆除草剂杂草防治的推荐使用浓度下，喷药后叶色变深，无任何药害症状，仍能正常生长，当年编号分别为M339、M341和M342。2012年秋播，再次对M339、M341、M342 和M343四个株系进行抗性鉴定，结果与上年度高度一致，其中M342生长势强、丰产性好，具有实用价值。
Claims (3)
1.一种基于ALS靶酶的抗除草剂油菜定向选育方法，包括步骤：
A、种子EMS处理：对所需进行诱变的油菜种子，用该种子的半致死浓度进行EMS诱变处理；
B、诱变后代扩繁：诱变种子在隔离网室扩繁至M2代，收获足够进行大群体定向筛选的种子，低温保存备用；
C、除草剂压力选择：用以ALS靶酶开发的除草剂对M2代混合群体进行抗除草剂定向筛选，药剂用量为该除草剂防治杂草的推荐使用浓度，并连续喷施2次，第1次在油菜3～4叶期进行，10天后再喷施第2次；
D、对EMS诱变M2代进行抗除草剂定向筛选：喷药后不被除草剂杀死的植株为定向筛选到的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料；
E、抗性材料验证鉴定：对筛选获得的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料单株，花期套袋自交，收获自交种子，进行验证鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
1）选择双低杂交油菜新品种宁杂15号父本N131；
2）用N131的EMS半至死浓度质量比0.4% 对油菜N131种籽进行EMS诱变处理；
3）对诱变后代在隔离网室扩繁至M2代，收获M2种子低温保存备用；
4）种植M2代油菜种子，油菜苗长至3叶1心时喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量90ga.i./hm2，10天后再复喷1次；选择处理油菜苗中存活下来、没有药害症状的单株， 5-6叶期后将菜苗移至油菜育种大田，油菜开花时套袋自交，获得自交种子；
5）抗性材料验证鉴定：种植筛选获得的自交种子，待油菜长至3-4叶期，再次喷施苯磺隆除草剂，药剂用量为苯磺隆防治杂草的推荐使用浓度，有效剂量90ga.i./hm2，喷药后不被除草剂杀死的植株即为定向筛选到的以ALS为靶酶的抗除草剂油菜新材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
种植M2代油菜种子，每平方尺留苗密度为50-70株。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130501 |