CN103053511A - 一种角膜中期保存液及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的角膜中期保存液，为添加有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、地塞米松、妥布霉素、Hepes和Y-27632 的MEM细胞培养基。本发明的保存液不仅能维持角膜内皮细胞活性及正常形态，还能增强角膜缘上皮细胞的存活能力，提高角膜缘干细胞的克隆能力，尤其是中长期保存效果更为明显，长期保存未出现对照组角膜内皮细胞变形、细胞融合等现象，与保存4天时的角膜内皮形态一致，细胞仍规则，细胞融合现象少。本发明的保存液能够很好的避免离体角膜材料保存中存在的细胞凋亡现象，增强角膜缘干细胞的活性和克隆形成能力，可使角膜在较长的保存时间内维持透明的特性。

Description

一种角膜中期保存液及其制备和使用方法

技术领域

本发明属于角膜保存液制备技术领域，具体涉及到一种含Rho激酶抑制剂的角膜活性保存液及其制备方法，即一种通过添加小分子化合物Rho激酶抑制剂Y-27632来对新鲜角膜进行保存的保存液。

背景技术

近年来，角膜疾病已成为我国第二大致盲性眼病。但作为一种可治性盲，通过进行板层或穿透性角膜移植手术即可使患者重获光明。由于我国国情所限，可供移植的角膜材料相对匮乏且分配不均，临床上使用的角膜材料相当一部分需要经过不同时间的保存。目前，对于保存后角膜材料的评价，多以角膜内皮细胞活性为主。而角膜上皮作为眼表的重要屏障，其完整性对角膜移植，尤其是角膜缘组织移植的成功与否有着重要影响，长期角膜上皮缺损会引起创口迁延不愈，角膜基质浑浊、瘢痕形成，新生血管形成，最终导致移植失败。因此，有必要提供一种即能延长角膜内皮细胞活性的保存时间，又能够有效维持上皮细胞活性的角膜培养液。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有Rho激酶抑制剂Y-27632的角膜中期保存液，不仅能保护角膜内皮细胞，避免因长时间保存而出现的内皮细胞坏死及融合现象；还能增强角膜缘干细胞的存活率，提高上皮细胞活性，细胞克隆形成能力等，从而更有效地延长角膜保存时间。

本发明的角膜中期保存液，为添加有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、地塞米松、妥布霉素、Hepes和Y-27632 的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20-25g /L、低分子右旋糖酐8-12g/L、L-谷氨酰氨0.375 mg/L、地塞米松0.02g/L、妥布霉素0.01g/L、Hepes9-10g /L、Y-27632 10μM/L。

本发明的角膜中期保存液的制备，包括如下的步骤：

1）取MEM粉末用入注射用水溶解后,进行高压灭菌，制成MEM培养基；

2）取硫酸软骨素用注射用水加热溶解高压灭菌制成硫酸软骨素溶液；低分子右旋糖苷用注射用水溶解高压灭菌，制成低分子右旋糖苷溶液；

3）取无菌容器加入MEM培养基，再加入硫酸软骨素和低分子右旋糖酐溶液，以及地塞米松和妥布霉素混均，制成混合液；

4）用Hepes调整步骤3）制备的混合液的PH值为7.2-7.4，冷藏作为保存液；使用时再加入L-谷氨酰氨和Y-27632。

上述制备的角膜中期保存液用于保存角膜组织。

本发明的保存液不仅能维持角膜内皮细胞活性及正常形态，还能增强角膜缘上皮细胞的存活能力，提高角膜缘干细胞的克隆能力，尤其是中长期保存效果更为明显，长期保存未出现对照组角膜内皮细胞变形、细胞融合等现象，与保存4天时的角膜内皮形态一致，细胞仍规则，细胞融合现象少。本发明的保存液能够很好的避免离体角膜材料保存中存在的细胞凋亡现象，增强角膜缘干细胞的活性和克隆形成能力，可使角膜在较长的保存时间内维持透明的特性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的保存液进行详细的描述。

一、角膜中期保存液的制备

保存液为添加有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、地塞米松、妥布霉素、Hepes和Y-27632 的MEM细胞培养基（美国Gibco公司），其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素25g/L（购自美国Sigma公司）、低分子右旋糖酐10g/L（美国Sigma公司）、L-谷氨酰氨0.375 mg/L（美国Gibco公司）、地塞米松20mg/L、妥布霉素100mg/L、Hepes9.5g/L（美国Sigma公司）、Y-27632 10μM/L（美国Sigma公司）。

其一种制备方法步骤如下：

1）取MEM粉末9.4g加入注射用水500ml,溶解后高压灭菌。

2）取硫酸软骨素25g加入注射用水200ml加热溶解高压灭菌，制成浓度为0.125g/ml的硫酸软骨素溶液；低分子右旋糖苷10g 加入注射用水100ml溶解高压灭菌，制成浓度为0.1g/ml的低分子右旋糖苷溶液；

3）取无菌容器加入MEM培养基500ml, 高压灭菌12.5%硫酸软骨素200ml，10%低分子右旋糖酐100ml，地塞米松注射液0.02g，妥布霉素注射液0.1g，注射用水175ml混匀；

4）Hepes调整PH值为7.2-7.4，检测渗透压300-380mOsm/kgH₂O分装为每10ml一支的安瓶，冷藏，细菌、真菌培养检测备用；使用时另加入L-谷氨酰氨和Y-27632，加入的终浓度为0.375 mg/L和10μM/L。

本发明对保存液中各组分的浓度进行了长期的优化，从而保证各个药品之间能够发挥协同效应，从而产生本发明保存液的效果。

二、角膜中期保存液的效果检测

角膜片的保存步骤如下： 新西兰大白兔，处死后，取出眼球，含抗生素的无菌生理盐水冲洗浸泡，无菌条件下沿巩膜外1-2mm处剪取完整兔角膜，分别在本发明的角膜保存液和作为对照的角膜活性保存液中4℃保存0天、4天、7天和14天；

离体角膜内皮细胞活性检测：钻取兔角膜中央8mm范围角膜片，4℃分别保存于Rho激酶抑制剂角膜保存液和角膜活性保存液中，于保存0天、4天、7天和14天取出角膜片行锥兰-茜素红内皮染色、计数内皮细胞密度。

离体角膜缘上皮细胞活性率及克隆能力检测：分别将保存0天、4天、7天和14天的环状兔角膜角膜缘组织（>8mm）DispaseⅡ4℃消化过夜后，分离兔角膜缘上皮细胞层，消化制备成单细胞悬液，锥兰染色，血球计数板计数活细胞和死细胞。活细胞率(%)=活细胞总数/细胞总数×100%。将单细胞悬液按每孔1000个细胞接种6孔培养板，角膜缘干细胞培养基培养10-14天至克隆肉眼可见时终止。冰甲醇固定，Giemsa染色后拍照，使用图像分析软件分别计数克隆数量，计算克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆数量/接种细胞量×100%。

结果发现，随着保存时间延长，角膜活性保存液保存的角膜因内皮细胞的变形及融合现象增多，规则的六边形内皮细胞数量明显下降，Rho激酶抑制剂角膜保存液中随保存时间的延长Y-27632的作用充分发挥，可以明显降低内皮细胞的变形及融合。

表1：两种保存液保存角膜内皮细胞计数统计

离体角膜缘干细胞活性率及克隆能力检测：

角膜环浸没于1.2U/ml DispaseⅡ中，4℃过夜后，取出，解剖显微镜下分离兔角膜缘上皮细胞，加入0.25%胰酶-0.02% EDTA，37℃消化15min，1500r/min离心5min，加入角膜缘干细胞培养基制成单细胞悬液，制备单个细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液混匀，3分钟内用血球计数板计数活细胞和死细胞。活细胞率(%)=活细胞总数/细胞总数×100%。

表2：离体角膜缘干细胞活性率统计

离体角膜缘干细胞克隆能力：

将单细胞悬液每孔1000个细胞种于铺有饲养层的6孔板， 37℃、5%CO2静止培养8-10天至克隆肉眼可见时终止。冰甲醇固定，Giemsa染色后拍照，使用图像分析软件分别计数大、中、小克隆的数量，计算克隆形成率及不同直径克隆的比例。

表3：两种保存液保存兔角膜克隆能力率

三、角膜中期保存液的应用

实施例1角膜中期保存液保存人角膜缘干细胞环用于环状干细胞移植

取临床移植后新鲜角膜环保存于本发明的Rho激酶抑制剂角膜保存液中，4℃冷藏保存，可保存2周。待临床有需要做干细胞环状移植病人，常规术前准备，取出保存的角膜环，无菌生理盐水冲洗，剪除病变组织，行环状干细胞移植。术后移植角膜环愈合好，无感染，无充血，角膜环透明。

实施例2 角膜中期保存液保存人角膜缘干细胞用于羊膜培养干细胞移植

取临床移植后新鲜角膜环保存于Rho激酶抑制剂角膜保存液中，4℃冷藏保存，可保存2周。待临床有需要做羊膜培养干细胞病人时，取出角膜环，浸没于1.2U/ml DispaseⅡ中，4℃过夜后，取出，解剖显微镜下分离角膜缘上皮细胞，加入0.25%胰酶-0.02% EDTA，37℃消化15min，1500r/min离心5min，加入角膜缘干细胞培养基制成单细胞悬液，接种于预先制备好的去上皮羊膜套筒上，37℃、5%CO₂培养10天左右，气液培养3天细胞复层，用于移植。病人常规术前准备，剪除原病变组织，将羊膜培养的干细胞膜片缝合角膜基质表面。术后观察羊膜干细胞在位，上皮完整，病人眼表逐渐改善。

Claims (4)

1.一种角膜中期保存液，为添加有硫酸软骨素、低分子右旋糖酐、L-谷氨酰氨、地塞米松、妥布霉素、Hepes和Y-27632 的MEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：硫酸软骨素20-25g /L、低分子右旋糖酐8-12g/L、L-谷氨酰氨0.375 mg/L、地塞米松0.02g/L、妥布霉素0.01g/L、Hepes9-10g /L、Y-27632 10μM/L。

2.如权利要求1所述的角膜中期保存液，其特征在于各组分的浓度如下：硫酸软骨素25g/L、低分子右旋糖酐10g/L、L-谷氨酰氨0.375 mg/L、地塞米松0.02g/L、妥布霉素0.01g/L、Hepes9-10g /L、Y-27632 10μM/L。

3.权利要求1所述的角膜中期保存液的制备方法，包括如下的步骤：

1）取MEM粉末用入注射用水溶解后,进行高压灭菌，制成MEM培养基；

2）取硫酸软骨素用注射用水加热溶解高压灭菌制成硫酸软骨素溶液；低分子右旋糖苷用注射用水溶解高压灭菌，制成低分子右旋糖苷溶液；

3）取无菌容器加入MEM培养基，再加入硫酸软骨素和低分子右旋糖酐溶液，以及地塞米松和妥布霉素混均，制成混合液；

4）用Hepes调整步骤3）制备的混合液的PH值为7.2-7.4，冷藏作为保存液；使用时再加入L-谷氨酰氨和Y-27632。

4.权利要求1或2所述的角膜中期保存液用于保存角膜组织。