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CN103026218A - 确定慢性肾病分期的方法、其设备和操作所述设备的方法 - Google Patents

确定慢性肾病分期的方法、其设备和操作所述设备的方法 Download PDF

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CN103026218A
CN103026218A CN2011800367301A CN201180036730A CN103026218A CN 103026218 A CN103026218 A CN 103026218A CN 2011800367301 A CN2011800367301 A CN 2011800367301A CN 201180036730 A CN201180036730 A CN 201180036730A CN 103026218 A CN103026218 A CN 103026218A
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CN
China
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accurate mass
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CN2011800367301A
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田仲纪阳
河野雅弘
佐藤惠美子
藤原功一
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Abstract

本发明提供一种确定慢性肾病的分期的方法和设备和操作该设备的方法。本发明涉及用于确定患有肾病的受试者中慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：步骤(A-1)测量获自所述受试者的样品中至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记的量；步骤(B-1)将在步骤(A-1)中测量的在获自所述受试者的所述样品中所述标记的量与已经为各个分期确定的参照含量范围进行比较，确定由每种标记指示的分期，和步骤(C-1)当各标记指示同一分期时，确定所述受试者处于前述慢性肾病分期。

Description

确定慢性肾病分期的方法、其设备和操作所述设备的方法
技术领域
本发明涉及用于确定慢性肾病的分期的方法和设备，以及用于操作所述设备的方法。
背景技术
慢性肾病(CKD)是一种进展的疾病，指示肾损伤的发现或肾功能恶化不进行治疗时长期持续的状态。随着其进展，所述疾病导致晚期肾衰竭，并且如果不进行人工透析或肾脏移植，生存将变得困难。
晚期肾衰竭在全球范围内增长。为了治疗这种疾病，认为早期治疗和早期检测，特别是在疾病是所谓的“隐藏的慢性肾病”时的检测是重要的。
据称日本目前有大约13,300,000名CKD患者。这表示8名成年人中大约有1人就是CKD患者。
在透析患者中最常发生的原发病是糖尿病性肾病，其是三种主要的糖尿病并发症中的一种。由于糖尿病性肾病是CKDs中的一种，因此患有糖尿病的患者可能患有CKD。按照2006年的国家健康和营养检查调查(健康、劳动和福利部(Ministry ofHealth，Labor and Welfare))估计糖尿病患者的人数为8,200,000人，包括潜在的糖尿病患者为18,700,000人。由于假定这些患者中的30％将发展肾衰竭，在将来CKD患者的人数将持续增长。例如，日本每年用于透析治疗的医疗费用约为5,400,000日元/人，总共为1.5万亿日元。由于透析患者的人数增长，透析治疗所需要的医疗费用也在增长。因此，减少这些医疗费用的措施是急需的。由于这一原因，肾损伤的早期检测、防止症状加重的早期治疗、以及最终尽可能减少导入透析的患者人数在全世界认为是重要的。
CKD按照肾小球滤过率(GFR)分期，肾小球滤过率是肾功能的评价指标。即，按照GFR(NPL1)，CKD分成五期。
然而，这样进行的CKD分期的确定是基于血清肌酸酐浓度。由于血清肌酸酐浓度受肌肉量的强影响，因此，存在问题，如排除这样的影响进行准确的确定是困难的。此外，由于直到估算的GFR(eGFR)变为50％以下时才观察到血清肌酸酐浓度的增加，因此难以发现微小的肾损伤。尽管如此，还没有开发出替代前述方法的适当的确定方法。
引用列表
非专利文献
NPL1：2007年5月23日修订的CKD Shinryo Guide[用于慢性肾病的诊断和治疗的临床实践指南(Clinical Practice Guidebook for Diagnosisand Treatment of Chronic Kidney Disease)]的第12-13页，由日本肾脏学会(Japanese Society of Nephrology)编辑，2009年出版。
发明概述
技术问题
本发明的目的在于提供一种用于确定慢性肾病的分期的方法和设备，以及用于操作所述设备的方法。
问题的方案
经过持续的反复试验，本发明人进行了各个分期之间的CKD患者的透析前血浆和透析前尿液的准确比较，并且努力寻找一种低分子量化合物，所述低分子量化合物的含量认为与分期进展有关系。
经过这样持久的努力，本发明人最终发现存在这样一种低分子量化合物，其含量随着分期进展而增加。此外，本发明人发现存在仅在特定的分期中观察到的低分子量化合物。并且，作为广泛研究的结果，本发明人发现这样的特定的低分子量化合物在血浆中的含量可以用作适当确定慢性肾病的分期的指标。
具体地，本发明如下述：
(I)用于确定慢性肾病的分期的方法
[I-1]
一种用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：
(A-1)通过用液相色谱/飞行时间质谱在下文所示的特定条件下处理来自所述受试者的样品，确定至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记的含量，和
(B-1)通过将已经在步骤(A-1)中测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较，而确定由每个标记指示的分期：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱(Pre-column)：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL。
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)。
标记
标记(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(5)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.08±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.05±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
标记(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记。
下文中，液相色谱和飞行时间质谱的条件与上述相同，并且，除非另外指明，标记(1)-(16)是由前述保留时间和精确质量指定的那些。
[I-2]
根据I-1项所述的方法，所述方法还包括下述步骤：(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每个标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[I-3]
根据I-1项或I-2项所述的方法，其中步骤(A-1)中测定的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
[I-4]
一种用于确定患有肾病的受试者中慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：
(A-2)通过用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下处理来自所述受试者的样品，测定至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记，和
(B-2)当在步骤(A-2)中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
[I-5]
一种用于确定患有肾病的受试者中慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：
(B-1)通过将至少一种选自由上述标记(1)-(16)组成的组的标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围比较来确定由每种标记指示的分期，所述至少一种标记的含量已经通过液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下测定；和
(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[I-6]
根据I-5项所述的方法，其中步骤(B-1)中的目的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
(II)用于确定慢性肾病的分期的设备和用于操作所述设备的方法。
[II-1]
一种用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括：
(A-1)用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下测定至少一种选自由上文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记在来自所述受试者的样品中的含量的装置，
(B-1)通过将已经通过装置(A-1)测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期的装置，和
(C-1)当已经通过装置(B-1)确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期的装置。
[II-2]
根据II-1项所述的设备，其中通过装置(A-1)测定的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
[II-3]
一种用于确定患有设备的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括：
(A-2)用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下测定至少一种选自由上文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记的装置，和
(B-2)当通过装置(A-2)检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的装置。
[II-4]
一种用于操作II-1项的设备的方法，所述方法包括下述步骤：
(a-1)操作装置(A-1)来测定至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记在提取自受试者的样品中的含量，
(b-1)操作装置(B-1)通过将在步骤(a-1)中测定的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(c-1)操作装置(C-1)，当已经在步骤(b-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[II-5]
一种用于操作II-2项的设备的方法，所述方法包括下述步骤：
(a-1)操作装置(A-1)来测定至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记在提取自受试者的样品中的含量，
(b-1)操作装置(B-1)通过将在步骤(a-1)中测定的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(c-1)操作装置(C-1)，当已经在步骤(b-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[II-6]
一种用于操作II-3项的设备的方法，所述方法包括下述步骤：
(a-2)操作装置(A-2)来测定在提取自受试者的样品中的至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记，和
(b-2)操作装置(B-2)，当在步骤(a-2)中在所述样品中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
(III)用于确定慢性肾病的分期的试剂盒
[III-1]
一种用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下检测至少一种选自由上文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记所需要的材料。
[III-2]
一种用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下检测至少一种选自由上文所示的标记(1)-(9)组成的组的标记所需要的材料。
[III-3]
一种用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下检测至少一种选自由上文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记所需要的材料。
发明的有益效果
按照本发明，应用新标记确保比应用常规方法更适当的确定慢性肾病分期。
特别地，按照本发明，可以以低成本在短时间内容易地确定慢性肾病的分期。
此外，通过应用本发明确定慢性肾病的分期，预计许多患有肾病的患者以及涉及肾病的诊断、治疗等的医疗机构将得到多种益处。
附图简述
[图1]图1显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化(SN＞20)的图表。
[图2]图2显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化(SN＞20)的图表。
[图3]图3显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化(SN＞20)的图表。
[图4]图4显示表明每个分期中每种标记(ESI-负)的成分变化(SN＞20)的图表。
[图5]图5显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化的图表。
[图6]图6显示表明每个分期中每种标记(ESI-负)的成分变化的图表。
实施方案描述
I.用于确定慢性肾病的分期的方法
本发明所述的确定慢性肾病的分期的第一实施方案(方法(1))包括下述步骤：
(A-1)评估至少一种标记在来自受试者的样品中的含量，所述至少一种标记选自由标记(1)-(16)组成的组，其中保留时间和精确质量(m/z)如下文在下述条件下进行的液相色谱/飞行时间质谱测定中定义：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL。
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10to40V，-10to(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)。
(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(5)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.05±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(B-1)通过将已经在步骤(A-1)中测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
本发明所述的确定慢性肾病的分期的第二实施方案(方法(2))包括下述步骤：
(A-2)评估至少一种标记在来自受试者的样品中的含量，所述至少一种标记选自由标记(10)-(16)组成的组，其中保留时间和精确质量(m/z)如下文在下述条件下进行的液相色谱/飞行时间质谱测定中所示：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL。
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)。
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.06±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(B-2)当在步骤(A-2)中证实存在所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的方法(1)和(2)是检验来自受试者的样品来确定每名受试者属于何种分期的方法。
关于分期，例如，可以应用基于肾小球滤过率(GFR)分期，肾小球滤过率(GFR)是肾功能的评价指标。具体地，如表1所示，可以无需修正应用依据GFR量的五个分期(2007年5月23日修订的CKD Shinryo Guide[用于慢性肾病的诊断和治疗的临床实践指南(Clinical Practice Guidebookfor Diagnosis and Treatment of Chronic Kidney Disease)]的第12-13页，由日本肾脏学会(Japanese Society ofNephrology)编辑，2009年出版)。GFR的量可以由估算等式估算，其中基于血清肌酸酐水平。这种估算的GFR的量称为“eGFR”。
表1
对于没有处于透析治疗的患者，导入透析治疗的必要性可以基于由方法(1)或(2)确定的分期来确定，所述方法即本发明用于确定慢性肾病的分期的方法。具体地，当所述疾病处于晚期时，可以认为导入透析治疗是必要的；当所述疾病处于低的分期时，可以认为不需要导入透析治疗。
例如，当以基于作为肾功能的评价指标的肾小球滤过率(GFR)进行分期(表1)将疾病的分期定为4期(GFR高度减少)或5期(肾衰竭)时，可以认为导入透析治疗是必要的；当疾病分期定为1、2或3期时，可以认为不需要导入透析治疗。
本发明所述的确定慢性肾病的分期的方法包括评估标记含量的步骤(步骤(A-1)或步骤(A-2))，确定慢性肾病的分期的步骤((B-1)和(C-1)或(B-2))。下文详细描述本发明的每个步骤。
评估标记含量的步骤
评估标记含量的步骤是评估至少一种选自由(1)-(16)或(10)-(16)组成的组的标记在提取自人的样品中的含量的步骤。
对于样品没有特别的限制，并且可以使用血液来源的样品、尿样品等作为样品。作为血液来源的样品，可以使用全血、血清或血浆。这些中优选血清和血浆。为了缩短分离时间或防止评估目标标记的分解，更优选血浆。另外，为了防止评估目标标记的分解，可以在所述血液来源的样品中加入通过螯合作用表现出抗凝效应的物质。表现出抗凝活性的物质的实例包括EDTA(乙二胺四乙酸)等。同样地，为了相同的目的，可以加入表现出蛋白酶抑制活性的物质。表现出抗凝活性的物质的实例包括抑肽酶等。
当样品在提取后以冷冻状态保存时，需要时，可以预先进行预处理步骤，然后进行评估标记含量的方式。预处理步骤的实例是通过离心等去除不需要的物质的步骤。例如，当使用血浆作为血液来源的样品时，其可以在通过离心去除沉淀物后进行所述方式。离心条件的优选实例包括3,000-10,000g，5-10分钟，更优选为10,000g和10分钟。作为预处理步骤，如果需要，可以进行固相提取步骤。例如，可以应用使用疏水性吸附剂的步骤。在这种情形中，固相提取可以通过使用疏水性吸附剂作为固相提取柱进行。作为疏水性吸附剂的固相提取柱，可以使用Sep-Pak LightCartridge C18柱(Japanese Waters，Inc.)。在这种情形中，例如，可以用90％的甲醇进行洗脱。
对于评估至少一种选自由(1)-(16)或(10)-(16)组成的组的标记的含量的步骤没有限制，只要所述步骤能够证实所述标记的存在或不存在，或者所述步骤可以进行定量测定。
通过调节评估方式的检测界限不小于特定标记的参照含量，可以使用所述评估方式来评估所述标记是否以超出所述参照含量的量存在于样品中。在这种情形中，作为证实所述标记的存在或不存在的步骤，可以使用下述步骤：当含量不大于所述评估方式的检测界限时，认为标记不存在，当含量不小于检测界限时，认为标记存在。
在定量测定的步骤中，例如，可以使用液相色谱-飞行时间质谱(LC-TOF MS)、液相色谱-四极质谱(LC-Q MS)、高效液相色谱(HPLC)、分光光度计、化学发光测定仪器等。从再现性或测定准确性观点来看，优选LC-TOF MS。
例如，当在评估步骤中使用LC-TOF MS时，预先向样品中加入两种以上的内标物质，然后进行应用LC-TOF MS的分析。将通过将标记的m/z峰面积除以所述内标物质的m/z峰面积的平均值得到的值确定为相对面积(以下，称为“m/z峰相对面积”)，并且比较不同样品的m/z峰相对面积来评估所述标记含量。
内标物质的实例包括苄氧羰基-L-酪胺酰-谷氨酸(Z-Tyr-Glu)、甲苯磺酰基-L-精氨酸甲基酯单盐酸盐(Tos-Arg-OMe-HCl)等。
用于液相色谱的柱没有特别限制，只要可以分析标记即可。可以使用反相柱和正相柱；并且优选反相柱。对填料没有限制，只要可以分析标记即可。填料的实例包括C18(十八烷基)。可以适当地确定颗粒系统和长度。
当需要更快速或更简单的确定时，优选评估至少一种选自由(1)-(16)或(10)-(16)组成的组的标记的含量。当需要更准确的确定时，优选评估至少两种选自前述组的标记的含量。根据所需要的准确度，可以评估三种标记的含量，并且可以评估四种标记的含量。
GFR常规用作CKD严重性的指标；然而，由于GFR是基于血清肌酸酐浓度计算的，并且血清肌酸酐浓度受肌肉量的强影响，因此去除这样的影响并且进行准确的确定是困难的。此外，由于直到eGFR的值变为50％以下时才观察到血清肌酸酐浓度的增加，因此难以发现微小的肾损伤。另一方面，标记(1)-(16)无一曾被用作标记。通过使用它们作为标记，可以更适当地确定慢性肾病的分期。特别地，由于标记(1)-(9)的含量在较不严重的分期中趋于增加，因此，可以通过使用这些标记来发现较不严重的肾损伤。
确定慢性肾病的分期的步骤
在方法(1)中确定慢性肾病的分期的步骤是这样的步骤：将步骤(A-1)中评估的标记含量与在每个分期中确定的参照含量进行比较；当每种标记含量在同一分期的参照含量范围之内时，认为受试者中的慢性肾病处于所述分期。
在方法(2)中确定慢性肾病的分期的步骤是这样的步骤：当在步骤(A-2)中确认存在至少一种标记时，认为受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
分期法没有限制。例如，可以使用表1所示的分期法。备选地，还可以使用本领域中公认的分期法。
特定标记在特定分期中的参照含量范围没有特别限制；然而，其可以基于在由属于所示特定分期的患者提取的样品中标记含量的平均值或分布确定。
还可以设定一个参照分期，并且将相对于所述参照分期中标记含量的比例确定为参照含量范围。例如，当使用基于GFR的分期法时，可以根据相对于健康个体中的平均含量的比例来确定分期(2期至5期)。在这种情形中的参照含量范围特别称为“在每个分期中的标准浓度范围”。
下文显示每种标记在每个分期中的标准浓度范围的实施方案。每个分期中的标准浓度范围是基于由分别属于每个分期的五名日本患者提取的样品获得的值。然而，在实际操作本发明的确定方法时，参照浓度范围可以根据目的、目标等以适当的方式最新确定。
标记(1)(在阳离子测定[M+H]+中，保留时间为2.03±0.5(min)，精确质量(m/z)为104.10±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：2期患者的标记(1)与健康个体的标记(1)的比例为1.5-3.5，3期为3.5-5.5，4期为5.5以上。
标记(2)(在阳离子测定[M+H]+中，保留时间为3.80±0.5(min)，精确质量(m/z)为257.10±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：3期患者的标记(2)与健康个体的标记(2)的比例为7-9.5，4期为9.5-24，5期为24以上。
标记(3)(在阳离子测定[M+H]+中，保留时间为6.52±0.5(min)，精确质量(m/z)为312.12±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：2期患者的标记(3)与健康个体的标记(3)的比例为2-2.5，3期为2.5-7，4期为7-24，5期为24以上。
标记(4)(在阳离子测定[M+H]+中，保留时间为6.87±0.5(min)，精确质量(m/z)为232.15±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：2期患者的标记(4)与健康个体的标记(4)的比例为1.3-3，3期为3-4.5，4期为4.5-8，5期为8以上。
标记(5)(在阳离子测定[M+H]+中，保留时间为8.32±0.5(min)，精确质量(m/z)为265.12±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：3期患者的标记(5)与健康个体的标记(5)的比例为1.5-15，4期为15-24，5期为24以上。
标记(6)(在阳离子测定[M+H]+中，保留时间为10.54±0.5(min)，精确质量(m/z)为300.22±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：2期患者的标记(6)与健康个体的标记(6)的比例为1.5-6.5，4期为6.5-11，5期为11以上。
标记(7)(在阴离子测定[M-H]-中，保留时间为6.57±0.5(min)，精确质量(m/z)为211.08±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：2期患者的标记(7)与健康个体的标记(7)的比例为3-5，3期为5-10，4期为10以上。
标记(8)(在阴离子测定[M-H]-中，保留时间为7.19±0.5(min)，精确质量(m/z)为411.13±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：3期患者的标记(8)与健康个体的标记(8)的比例为1.5-4，4期为4-15，5期为15以上。
标记(9)(在阴离子测定[M-H]-中，保留时间为8.25±0.5(min)，精确质量(m/z)为263.10±10mDa)的每个分期的标准浓度范围：3期患者的标记(9)与健康个体的标记(9)的比例为2-7，4期为7-18，5期为18以上。
由上文所解释的，由于标记(1)-(9)的含量在较不严重的分期中趋于增加，因此，在使用这些标记的情形中，方法(1)中确定慢性肾病的分期的步骤可以是这样的步骤：将步骤(A-1)中评估的每种标记含量与健康个体的含量进行比较；并且，当所有标记含量都大于健康个体的含量时，认为所述受试者患有至少在早期分期的慢性肾病。这一步骤允许慢性肾病的早期检测，这是常规上不能发现的。此处，“早期分期”是，例如，在基于作为肾功能的评价指标的肾小球滤过率(GFR)的分期法(表1)中的1期(伴随肾损伤的正常或增加的GFR)，2期(伴随肾损伤的轻度GFR减少)和3期(GFR的中度减少)。此外，“早期分期”用在本文中优选是1期和2期，并且更优选是1期。
至于相对于健康个体的标记含量的何种程度的标记含量被认为是处于“早期分期”，可以适当地确定所述程度，因为其随着所用的标记、早期分期的定义、受试者的特质等变化。例如，标准可以是1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍等。
方法(2)中“确定慢性肾病的分期是严重的步骤”可以是这样的步骤：其中在依据作为肾功能的评价指标的肾小球滤过率(GFR)的分期法(表1)中疾病分期为4期(GFR高度减少)或5期(肾衰竭)。
II.用于确定慢性肾病的分期的设备和用于操作所述设备的方法
本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的第一设备(设备1)包括：
(A-1)评估至少一种标记在提取自受试者的样品中的含量的装置，所述至少一种标记选自由标记(1)-(16)组成的组，其中保留时间和精确质量(m/z)如下文在下述条件下进行的液相色谱/飞行时间质谱的测定中所示：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL。
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)。
(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(5)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.06±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(B-1)通过将已经通过装置(A-1)测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期的装置，和
(C-1)当已经通过装置(B-1)确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期的装置。
本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的第二设备(设备(2))包括：
(A-2)评估至少一种标记在提取自人的样品中的含量的装置，所述至少一种标记选自由标记(10)-(16)组成的组，其中保留时间和精确质量(m/z)如下文在下述条件下进行的液相色谱/飞行时间质谱测定中所示：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL。
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)。
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.06±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(B-2)当通过装置(A-2)检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期为严重的装置。
本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的装置(1)和(2)中的每一个都包括评估标记含量的装置(装置(A-1)或(A-2))，和确定慢性肾病的分期的装置(装置(B-1)和(C-1)，或(B-2))。下文详述本发明的装置。
用于评估标记含量的装置
评估标记含量的装置是评估至少一种选自由(1)-(16)或(10)-(16)组成的组的标记在提取自人的样品中的含量的装置。
评估标记含量的装置是执行评估标记含量的步骤的装置，该步骤在本发明的用于确定慢性肾病的分期的方法中进行了解释。此处省去关于评估标记含量的装置的解释，因为其与关于评估标记含量的步骤的解释是相同的。
用于确定慢性肾病的分期的装置
确定慢性肾病的分期的装置是这样的装置：其中将通过装置(A-1)评估的标记含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较；当每种标记含量在同一分期的参照含量范围之内时，认为样品的供体中的慢性肾病处于所述分期。
装置(B-2)是这样的装置：当通过装置(A-2)证实存在至少一种标记时，确定样品的供体中的慢性肾病的分期是严重的。
装置(A-1)是定量评估标记含量的装置。可以使用以与在本发明所述的确定慢性肾病的分期的方法中确定慢性肾病的分期的步骤中所解释的相同的方式确定的参照含量。
将通过装置(A-1)评估的标记含量与参照含量范围进行比较的装置可以是将通过装置(A-1)评估的标记含量与存储器中存储的参照含量范围进行比较的装置。
将通过装置(A-1)评估的标记含量与参照含量范围进行比较的装置可以是允许个体操作设备来比较所述标记含量与所述参照含量范围的装置。例如，所述装置可以包括将通过装置(A-1)评估的标记含量视觉或听觉传递给操作设备的人员的装置。视觉传递的装置的实例包括显示标记含量的显示器。口头传递的装置的实例包括可听得见地发出标记含量的声音发射器。
确定慢性肾病的分期的装置还可以包括显示确定结果的装置。尽管显示确定结果的装置没有限制，但是其可以是将确定结果视觉显示在另一个显示器上的装置，口头显示确定结果的装置，或进一步将确定结果传输到外部的装置。
用于操作确定慢性肾病的分期的设备的方法
用于操作确定慢性肾病的分期的设备(1)的方法是包括下述步骤的方法：
(a-1)操作装置(A-1)来测定至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记在提取自受试者的样品中的含量，
(b-1)操作装置(B-1)，以通过将步骤(a-1)中测定的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(c-1)操作装置(C-1)，当已经在步骤(b-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
用于操作确定慢性肾病的分期的设备(2)的方法是包括下述步骤的方法：
(a-2)操作装置(A-2)来测定在提取自受试者的样品中的至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记，和
(b-2)操作装置(B-2)，当在步骤(a-2)中在所述样品中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
此处省去关于样品、标记和评估标记含量的步骤的解释，因为其与本发明用于确定慢性肾病的分期的设备的解释相同。
III.用于确定慢性肾病的分期的试剂盒
本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的试剂盒(1)是包括检测至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记所需要的材料的试剂盒。
本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的试剂盒(2)是包括检测至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记所需要的材料的试剂盒。
标记的解释与在本发明的“用于确定慢性肾病的分期”中的解释相同。
检测至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记所需要的材料不受限制，只要其能够检测所述标记即可。其实例包括与所述标记特异性反应的材料。通过这样的材料与样品反应来检测反应产物的存在或不存在，或检测反应产物的浓度，能够检测标记。与所述标记特异性反应的材料的实例包括特异性使所述标记代谢的酶。例如，当用作酶的水解酶与标记特异性反应产生二氧化碳(CO2)和水(H2O)，由此减少氧(O2)的浓度时，可以通过使用氧电极等检测氧浓度的减少而定量分析标记含量。
实施例
参考实施例进一步详细地描述本发明；然而，本发明的范围不限于这些实施例。使用人血液样品，寻找可以用作慢性肾病的分期的指标的标记。
至于样品，使用血浆样品。样品由表2所示的26名患者提取。表2所示的分期法与表1中分期法相同。
表2
分期 患者人数
健康个体 5
2 6
3 5
4 5
5 5
使用LC-TOF MS作为分析方式。分析以下述方式进行。将血浆样品或尿样品以10,000g离心15分钟，并且去除沉淀。将得到物用固相柱(Sep-Pak Light C18Cartridge；Japanese Waters，Inc.)按照下述步骤进行固相提取。得到物用作进行LC-TOF MS的评估样品。
固相提取条件
1.将固相柱用1mL MetOH处理。
2.将固相柱用1mL超纯水平衡。
3.将500μL血浆样品上样到固相柱上。
4.用2mL超纯水进行洗涤。
5.用300μL90％MetOH进行洗脱。
6.向洗脱的样品中加入苄氧羰基-L-酪胺酰-谷氨酸(Z-Tyr-Glu)和甲苯磺酰基-L-精氨酸甲基酯单盐酸盐(Tos-Arg-OMe-HCl)作为内标物质。
将测定的样品进行LC-TOF MS。在任一种下述条件(n＝3)下进行液相色谱(LC)。
条件1：
LC条件
LC设备：Agilent1100系列(Agilent)
柱：Cadenza C182×150mm；3μm(Imtakt)
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)
移动相A：0.05％甲酸
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL。
飞行时间质谱(TOF MS)的条件如下。
TOF MS条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)。
将两种作为内标物质的氨基酸衍生物与血浆样品混合，并且进行分析。通过[M+H]+(ESI正)离子或[M-H]-(ESI负)离子的峰面积除以内标物质的平均峰面积得到的值进行比较作为相对面积。表3显示标记候选物的保留时间和精确质量。
表3
ESI-正(18)21种成分
Figure BDA00002781404800251
Figure BDA00002781404800261
ESI负(6)
Figure BDA00002781404800262
每个分期中每种标记的变化显示在图1-6中。
因此，关于标记(1)-(9)(P-Nos.14，23，44，54，86和184；以及N-Nos.27，33和49，按此顺序)，随着分期级别增长，观察到相对面积增加的趋势。关于标记(1)-(9)，标记含量增加的程度是基于健康个体检验的(表4和5)。
Figure BDA00002781404800271
关于标记(10)-(16)(P-Nos.16，82，88，97和113；以及N-Nos.18和21，以这样的顺序)，在健康个体和在2期和3期个体中不能确定相对面积；然而，在4期和5期中观察到相对面积增加的趋势。特别地，在健康个体和在2-4期个体中不能确定标记(14)(P-No.113)的相对面积；然而，在5期中观察到相对面积增加的趋势。
结果表明慢性肾病的分期可以通过测定标记(1)-(16)进行预测。特别地，结果表明通过测定标记(1)-(9)可以发现较早分期的慢性肾病。结果还表明在患者样品中检测到标记(10)-(16)的患者可以被预测处于4期或5期；并且特别地，在其样品中检测到标记(14)的患者可以被预测处于5期。

Claims (11)

1.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：
(A-1)通过用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下处理来自所述受试者的样品，测定至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记的含量：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL；
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)；
标记
(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(5)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.08±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.05±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(B-1)通过将已经在步骤(A-1)中测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较，而确定由每个标记指示的分期；和
(C-1)当已经在步骤(A-1)中测定的每个标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(A-1)中测定的所述标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
3.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：
(B-1)通过将至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记的含量与在每个分期中确定的参照含量范围比较来确定由每种标记指示的分期，所述至少一种标记的含量已经通过用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下处理来自所述受试者的样品而测定：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL；
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)；
标记
(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(5)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.08±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.05±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(B-1)中的目的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
5.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤：
(A-2)通过用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下处理来自所述受试者的样品而测定至少一种选自由下文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记的存在：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL；
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)；
标记
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.26±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.28±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.24±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.14±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.28±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(B-2)当在步骤(A-2)中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
6.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括：
(A-1)应用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下测定至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记在来自所述受试者的样品中的含量的装置：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL；
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)；
标记
(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(5)：在阳离子测定[M±H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.05±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(B-1)通过将已经通过装置(A-1)测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较而确定由每种标记指示的分期的装置，和
(C-1)当已经通过装置(B-1)确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期的装置。
7.根据权利要求6所述的设备，其中通过装置(A-1)测定的所述标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
8.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括：
(A-2)应用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下测定至少一种选自由下文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记的装置：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL；
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)；
标记
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.06±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(B-2)当在步骤(A-2)中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的装置。
9.用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括应用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下检测至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记所需要的材料：
液相色谱条件
液相色谱设备：Agilent1100系列(Agilent)；
柱：Cadenza C182x150mm，3μm(Imtakt)；
前置柱：TCI OPTI-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A：0.05％甲酸；
移动相B：乙腈；
对于梯度洗脱：
0-15min：移动相A中5％至95％的移动相B的线性梯度，
15-20min：移动相A中95％至100％的移动相B的线性梯度，和
20-35min：保持100％的移动相B；
流速：0.2mL/min；和
测量样品容量：5μL；
飞行时间质谱条件
测量范围：m/z70至1,000；
Orifice1电压：10至40V，-10至(-40)V扫描；
离子导向电压：500至2,500V扫描；
检测器：2,800V；和
测量设备：Accu TOF JMS-T100LC(JEOL)；
标记
(1)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(2)：在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0.5(min)的保留时间和257.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(3)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5(min)的保留时间和312.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4)：在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5(min)的保留时间和232.15±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(5)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和265.12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(6)：在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0.5(min)的保留时间和300.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(7)：在阴离子测定[M-H]-中具有6.57±0.5(min)的保留时间和211.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(8)：在阴离子测定[M-H]-中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(9)：在阴离子测定[M-H]-中具有8.25±0.5(min)的保留时间和263.10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(10)：在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0.5(min)的保留时间和286.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(11)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0.5(min)的保留时间和495.23±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(12)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5(min)的保留时间和529.22±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(13)：在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0.5(min)的保留时间和304.13±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(14)：在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0.5(min)的保留时间和389.21±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(15)：在阴离子测定[M-H]-中具有3.93±0.5(min)的保留时间和197.05±10mDa的精确质量(m/z)的标记；和
(16)：在阴离子测定[M-H]-中具有5.55±0.5(min)的保留时间和327.09±10mDa的精确质量(m/z)的标记。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述标记是至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记。
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