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CN103003434A - 用于经改进的生物质研磨的无水氨处理 - Google Patents

用于经改进的生物质研磨的无水氨处理 Download PDF

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CN103003434A CN2011800349943A CN201180034994A CN103003434A CN 103003434 A CN103003434 A CN 103003434A CN 2011800349943 A CN2011800349943 A CN 2011800349943A CN 201180034994 A CN201180034994 A CN 201180034994A CN 103003434 A CN103003434 A CN 103003434A
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CN
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anhydrous ammonia
saccharification
ammonia
hours
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C.E.坎普
J.奇拉科维奇
B.A.迪纳
J.范
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EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

为了使生物质易于糖化，作为预处理对生物质进行机械研磨需要高能量输入。人们发现在机械研磨之前进行无水氨处理极大地减少了用于精细研磨的能量需求，从而提供了一种用于商业用途的更经济的预处理方法。

Description

用于经改进的生物质研磨的无水氨处理
本专利申请要求2010年7月21日提交的美国临时申请61/366231的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本文提供了制备易糖化的木质纤维素生物质的方法。具体地，将生物质用无水氨预处理，紧接着研磨或其他机械破碎方法。无水氨处理降低了研磨的能量，研磨对于提供易糖化的材料和增加预处理和糖化过程的总速率是必需的。
背景技术
木质纤维素的原料和废料，例如农业残留物、木材、林业废弃物、来自造纸的淤渣、和市政及工业的固体垃圾为化学品、塑料、燃油和饲料提供了潜在的很大的可再生原料。包含碳水化合物聚合物、纤维素和半纤维素以及木质素的木质纤维素的原料以及废料一般用多种化学的、机械的和酶的方法进行处理以释放主要为己糖和戊糖的糖，然后这些糖能进行发酵成为有用的产品。
预处理方法用于使木质纤维素生物质的碳水化合物聚合物或多糖更易接近用于糖化的纤维素酶。纤维素酶消化多糖的一个主要障碍是木质素的存在，木质素是限制酶接近它们的底物的障碍，并且木质素提供酶非生产性结合的表面。此外，纤维素微纤维的结晶度限制了酶的进入，造成了糖化的障碍。试图克服这些挑战的预处理方法包括：蒸汽爆破、热水、稀酸、氨纤维爆破、碱解(包括氨回收过滤法)、氧化去木质素、有机溶解和臭氧化。化学品、化学品回收、能源输入和资本设备的成本使得许多方法不适合用于商业生产。
采用少量的含水氨和高固体浓度的生物质预处理公开于普通拥有的专利US 7,932,063中。专利US 20080008783公开了生物质的处理：用液态或蒸汽态的无水氨和/或液态或蒸汽态的浓氨水与水的混合物处理经磨碎的且包含不同含水量的生物质，以获得氨与干生物质的比例介于约0.2∶1至1.2∶1且水与干生物质的比例介于约0.2∶1.0至1.5∶1的混合物。温度被维持在约50℃至140℃，并且通过从容器中释放氨而快速释压以形成已处理的生物质。
研磨(其中生物质被磨碎)已被用作非化学预处理或与臭氧分解联合使用(Kabeya等人(1993)Shikoku Kogyo Gijutsu Shikensho Kenkyu Hokoku24：42-90)。
但仍需要为糖化而制备生物质的可替代的、有效的且低成本的木质纤维素生物质的预处理方法。
发明内容
本发明提供制备生物质的方法，以便可容易地糖化生物质以通过生物催化剂产生可用于发酵的糖。所述方法涉及在为了机械破碎和减小生物质的粒度的目的而应用机械能之前将无水氨应用于生物质上。已出乎意料地发现，这种经无水氨处理后紧接着机械破碎的顺序具有减少粒度减小所需的时间和能量的有益效果，并且导致在糖化中较高的可发酵的糖的生产速率，因此促进整个工序的速率。
相应地，本发明提供生产易糖化的生物质的方法，包括：
a)提供木质纤维素生物质；
b)使(a)的生物质与无水氨接触以产生经氨处理的生物质；以及
c)通过机械破碎方法施加机械能来破碎(b)的经氨处理的生物质以产生易糖化的经预处理的生物质；
其中所述经预处理的生物质包含无定形纤维素组分；并且
其中与未与无水氨接触的并用如(c)中同等水平的机械能破碎的经预处理的生物质中的无定形纤维素组分的百分比相比，所述经预处理的生物质中的无定形纤维素组分的百分比更高。
本发明的经预处理的生物质通常将具有小于约0.1mm的粒度，并且在所述破碎前使用无水氨时引起所述生物质的破碎所需的能量一般小4-10倍。
附图说明
图1显示经不同时间(0小时、24小时、48小时、72小时)的糖化(14％的固体投料量)的样品中单体葡萄糖(G)和木糖(X)的理论产量百分比对研磨所述生物质的时间(0天、1天、2天、3天、6天、10天)作的图，所述生物质用1cm直径的钇掺杂的ZrO2珠研磨，(A)中为用1mm刀研磨的未经处理的玉米棒，并且(B)中为用1mm刀研磨的未经处理的晚冬/早春收获的柳枝稷(swg)。
图2显示在经不同时间(0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时)糖化(14％的固体投料量)的用1mm刀研磨的未经处理的晚冬/早春收获的柳枝稷样品中葡萄糖(G)(A图中)和木糖(X)(B图中)的理论产量百分比对研磨所述生物质的时间(0天、1天、2天、3天、6天、10天)作的图，所述生物质用0.25英寸(0.635cm)的不锈钢珠以200g的珠对5g的生物质的比例进行研磨。每组最后一个柱(为总的可溶糖的产量(单体和低聚物)，(A)图中为葡萄糖并且(B)图中为木糖)以外的所有的柱都是单体糖。
图3显示在图2所述柳枝稷经72小时糖化(14％的固体投料量)时的单体葡萄糖(A)和木糖(B)的理论产量百分比相比生物质的颗粒表面积(m2/g)的图，两者都根据研磨时间。
图4显示在图2所述柳枝稷经72小时糖化(14％的固体投料量)时的单体葡萄糖(A)和木糖(B)的理论产量百分比相比生物质的无定形组分的百分比的图，两者都根据研磨时间。
图5显示经1mm刀研磨未经处理的秋季收割的柳枝稷(UT4)和用10重量％的无水氨在160℃经1小时处理的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷(JV198)的单体葡萄糖(A)和木糖(B)的理论糖化产量百分比图。如图2，将样品经不同时间(0小时、19小时、43小时、67小时)研磨，之后再将它们糖化0小时、4小时、24小时、48小时、72小时或96小时(14％的固体投料量)。
图6显示经不同过程处理的秋季收割的柳枝稷的单体葡萄糖(G)和木糖(X)的理论糖化产量的百分比图：1)经1mm刀研磨的未经处理的秋季收割的柳枝稷，2)用10重量％无水氨处理的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷，以及3)用20重量％无水氨处理9天然后用1mm刀研磨的经粗研磨的秋季收割的柳枝稷。然后如图2，将样品经不同时间(0小时、19小时、43小时、67小时)研磨，之后糖化72小时(14％的固体投料量)。
图7显示用10重量％的无水氨在160℃经1小时处理的、用0.25英寸(0.635cm)的不锈钢珠(以40磅的钢珠：500g的生物质的比例)超微磨碎不同时间(分钟)以及糖化72小时(在14％的固体投料量时)的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷的单体葡萄糖(A)和木糖(B)的理论糖化产量的百分比；相比经处理的样品中无定形组分的百分比的图。
图8显示用10重量％的无水氨在160℃经1小时处理的、用如图7中的0.25英寸(0.635cm)的不锈钢珠超微磨碎不同时间(分钟)以及糖化72小时(在14％的固体投料量时)的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷的单体葡萄糖(Glu)和木糖(Xyl)的理论糖化产量的百分比；相比经处理的样品的粒度的图。
图9显示在用20重量％的无水氨于室温经9天处理的和用不同尺寸(0.125英寸(0.3175cm)、0.1855英寸(0.471cm)、7/32或0.2188英寸(0.556cm)，1/4或0.250英寸(0.635cm)、5/16或0.3125英寸(0.794cm)和3/8或0.375英寸(0.953cm))的不锈钢珠以200g的钢珠：5g的生物质的比例球磨5小时，然后用14％的固体投料量糖化不同时间(4小时、24小时、48小时、72小时、100小时、124小时)的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷样品中葡萄糖(G)((A)图中)和木糖(X)((B)图中)的理论糖化产量的百分比图。每组最后一个柱(为124小时糖化时总的可溶糖的产量(单体和低聚物)，(A)图中为葡萄糖并且(B)图中为木糖)以外的所有的柱都是单体糖。
图10显示在用10重量％的无水氨在160℃经1小时处理的和用如图9中的不同尺寸(0.125英寸(0.3175cm)、0.1855英寸(0.471cm)、7/32或0.2188英寸(0.556cm)，1/4或0.250英寸(0.635cm)、5/16或0.3125英寸(0.794cm)和3/8或0.375英寸(0.953cm))的不锈钢珠球磨5小时，然后用14％的固体投料量糖化不同时间(4小时、24小时、48小时、72小时、100小时、124小时)的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷样品中葡萄糖(G)((A)图中)和木糖(X)((B)图中)的理论糖化产量的百分比图。每组最后一个柱(为124小时糖化时总的可溶糖的产量(单体和低聚物)，(A)图中为葡萄糖并且(B)图中为木糖)以外的所有的柱都是单体糖。
图11显示在用20重量％的无水氨在室温经9天预处理的和用如图9中的不同尺寸(0.125英寸(0.3175cm)、0.1855英寸(0.471cm)、7/32或0.2188英寸(0.556cm)，1/4或0.250英寸(0.635cm)、5/16或0.3125英寸(0.794cm)和3/8或0.375英寸(0.953cm))的不锈钢珠球磨5小时，然后用25％的固体投料量糖化不同时间(4小时、24小时、48小时、72小时、100小时、124小时)的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷样品中葡萄糖(A)和木糖(B)的理论糖化产量的百分比图。每组最后一个柱(为124小时糖化时总的可溶糖的产量(单体和低聚物))，(A)图中为葡萄糖并且(B)图中为木糖)以外的所有的柱都是单体糖。
图12显示在用10重量％的无水氨在160℃经1小时处理的和如图9中的不同尺寸(0.125英寸(0.3175cm)、0.1855英寸(0.471cm)、7/32或0.2188英寸(0.556cm)，1/4或0.250英寸(0.635cm)、5/16或0.3125英寸(0.794cm)和3/8或0.375英寸(0.953cm))的不锈钢珠球磨5小时，然后用25％的固体投料量糖化不同时间(4小时、24小时、48小时、72小时、100小时、124小时)的经1mm刀研磨的秋季收割的柳枝稷样品中的葡萄糖(A)和木糖(B)的理论产量的百分比图。每组最后一个柱(为124小时糖化时总的可溶糖的产量(单体和低聚物)，(A)图中为葡萄糖和(B)图中为木糖)以外的所有的柱都是单体糖。
图13显示在用10重量％的无水氨在150-160℃经1小时处理并超微磨碎5分钟、然后用不同量的酶以25％的固体投料量糖化120小时的包含8％、18％或28％的水分的经1mm刀研磨的柳枝稷样品中总的可溶葡萄糖和木糖的理论产量的百分比图。
具体实施方式
本发明涉及木质纤维素生物质的预处理以在糖化过程中生产可发酵的糖。所述生物质用机械破碎方法处理，预先用或同时用无水氨处理，所述无水氨处理减少生产易糖化的生物质产品所需的能量。将如本文所公开的从处理生物质产生的糖用于用生物催化剂发酵以产生期望的目标产物。
下述的缩写和定义将用于解释说明书和权利要求。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者其任何其他变型旨在包括非排他的包括。例如，包含元素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，但可以包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，关于元素或组分例证(即出现)的数目，位于本发明的元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本特定发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可发生的用数字表示的量的变化，例如：在真实世界中，通过用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否由术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值10％的范围内，优选地在报告数值5％的范围内。
“无水氨”是指干燥的并且不在含水介质中的氨气。
当被用于参照温度时，“室温”和“环境”是指约15℃至约25℃的任何温度。
“可发酵糖”是指主要包括单体糖和一些低聚糖的糖的内容物，在生产目标产物的发酵过程中微生物可利用它们作为碳源。
“单体糖”或“单糖”由单一的戊糖或己糖单元例如葡萄糖组成。
“木质纤维素”是指同时包含木质素和纤维素的材料。木质纤维素材料也可包含半纤维素。“纤维素”是指包含纤维素的组合物。
“生物质干重”是指移除全部的或基本上全部的水分后的生物质的重量。干重通常依照美国材料与试验协会(ASTM)标准E1756-01(生物质中总固体量的标准测试方法)或纸浆与造纸工业技术协会(TAPPI)标准T-412om-02(纸浆、纸和纸板含水量)进行测量。生物质干重与生物质的干物质含量同义。
涉及生物质的“基本上干燥的”是指有至少约85％的干物质含量或约15％或更少的含水量的生物质。
“生物质”和“木质纤维素生物质”将被互换使用并且指任何木质纤维素材料，所述木质纤维素材料包括纤维素的和半纤维素的材料，例如生物能农作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材、林业废弃物、以及它们的组合，并且如下面进一步描述。生物质具有碳水化合物内容物，该内容物包含多糖和低聚糖，也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。
“糖化”和“糖化作用”是指通过酸、碱或水解酶的作用由多糖生产可发酵糖。从经预处理的生物质中生产可发酵糖通过纤维素酶和半纤维素酶的酶解糖化作用发生。
“多糖”是指任何由糖苷键连接在一起的由重复单元形成的碳水化合物类或由糖苷键接合的单体糖的链组成的复合碳水化合物。多糖具有通式Cx(H2O)y。
本文所用的“预处理生物质”或“生物质预处理”是指使天然的或经预加工的生物质经受化学的、物理的、或生物的作用、或它们的任何组合，致使所述生物质在糖化之前更易受酶解糖化或其他水解方法影响。例如，本文受权利要求书保护的方法可被称为预处理方法，该方法有助于使得生物质较易接近水解酶而被糖化。
本文所用的“经精细研磨的材料”是指在粒度上减小的材料，此处粒度小于0.1mm。
术语“机械破碎方法”是指机械破碎生物质的方法学，所述机械破碎导致粒度减小。典型的机械破碎方法将包括但将不限于超微磨碎、锤磨、球磨、珠磨、振动性球磨、振动性棒磨、喷射研磨、芯棒研磨、涡轮研磨、空气分级磨、辊磨和行星式球磨。
当用于经预处理的生物质的上下文时，术语“无定形组分”或“无定形纤维素组分”是指通常可由广角X射线衍射测量结晶度确定的所述生物质的非晶态的纤维素部分。
本文所用的“粗尺寸减小的”是指材料碎块或颗粒减小的尺寸，这些材料碎块或颗粒的尺寸大于0.1mm。
本文所用的“易糖化的生物质”是指在糖化时产生高的糖产量的生物质。糖化之后，至少约70％的葡萄糖的理论产量和至少约60％的木糖的理论产量的高糖产量或更高糖产量表示易糖化的经预处理的生物质。
“水解产物”是指与木质纤维素生物质接触的液体，该液体包含作用于生物质的水解反应的产物(酶解或非酶解)，在该情况下是单体的和低聚的糖。
“酶聚生体”或“糖化酶聚生体”是通常由微生物分泌的酶的集合，在本文的案例中通常将包括纤维素酶、木聚糖酶、糖苷酶、木质素酶和阿魏酰胆碱酯酶中的一个或多个。
本文所用的“重击”是指用力撞击。
术语“目标产物”是指任何由发酵中的微生物生产宿主细胞生成的产物。目标产物可为宿主细胞中遗传工程的酶的途径的产物或可由内源性途径产生。典型的目标产物包括但不限于酸、醇、烷烃、烯烃、芳族化合物、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。
木质纤维素生物质
用于本发明方法的生物质是木质纤维素的，其包含多糖，诸如纤维素、半纤维素和木质素。生物质的多糖也可被称作葡聚糖和木聚糖。可使用的生物质类型包括但不限于生物能农作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业废弃物。生物质的实例包括但不限于玉米棒、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦草、双低油菜秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、细叶芒、大米草、草芦、废纸、蔗渣、高粱渣或秸秆、大豆秸秆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。生物质可包括其他的农作物残余物，林业废弃物如杨木、其他的硬木、软木和锯屑；和消费者用过的纸制品垃圾；和纤维加工残余物，诸如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂残渣和废弃物；以及其他足够丰富的木质纤维素材料。
对本发明尤其有用的生物质包括具有相对高碳水化合物含量的、相对密集的、和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处理的生物质。
木质纤维素生物质可来自于单一来源，或者生物质可包含来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物、或者杆或茎与叶的混合物。
生物质可按从来源所获得的形式直接使用，或者可进行一些预加工，例如可将机械能施加到生物质上以减小尺寸或减少水分。尺寸的减小可采用生产减小的粗尺寸材料的方法(所获得的尺寸大于0.1mm)进行。可使用的方法包括刀研磨、压碎、撕碎、砍剁、圆盘磨浆和粗锤磨。这种类型的尺寸减小可在用无水氨处理之前、期间或之后进行。干燥可以通过任何常规的装置，如用干燥烘箱、旋转干燥器、闪蒸干燥机或过热蒸汽干燥器。此外，空气干燥可足以达到小于约15％，优选介于约7％至10％之间的期望的生物质含水量，如下所述。为可用于本发明方法，希望生物质具有至少约85重量％、90重量％或93重量％的干物质含量。
生物质预处理
木质纤维素生物质通常在糖化前经过处理以将其准备来用于水解。该预处理改进了糖化过程中水解，或糖的释放。由于木质素的存在，从生物质的多糖中释放主要为葡萄糖和木糖的糖是很困难的，木质素构成物理障碍以及也构成供非生产性的糖化酶结合的表面。此外，纤维素微纤维的结晶度和密堆积限制了酶的进入。
球磨可单独用作生物质预处理以改进糖化作用，消除了对于酸的或碱的预处理化学品的使用。然而，为了球磨的生物质在糖化时产生高的糖产量，需要具有高能量输入的球磨应用。在糖化时允许高的单体糖产量的球磨所需的机械能是大量的，使得该预处理方法自身不经济。例如，在5天的研磨后，用于球磨的能量超过了包含在生物质样品中的能量。
在本发明的方法中，木质纤维素生物质在用机械破碎方法破碎前与无水氨接触以产生精细研磨的材料。任选地，生物质可在用机械破碎的同时与无水氨接触。申请人已发现，在用球磨或超微磨碎以产生精细研磨的材料前，通过用无水氨来处理生物质，极大地减少了对球磨预处理以获得易糖化的经预处理的生物质产品的机械能输入。易糖化的生物质是在糖化时产生高的糖产量的生物质。至少约70％的葡萄糖理论产量和至少约60％的木糖理论产量的高的糖产量，或更高的糖产量，表示易糖化的经预处理的生物质。
当紧接着无水氨处理施加时，需用于精细研磨的机械能至少小约四倍，并且可小约6倍至约10倍以在糖化后产生与未用无水氨处理的经研磨的生物质的糖化中产生等同量的糖。机械能减少的量是变化的并且取决于多种因素，诸如生物质的类型、含水量、无水氨处理的强度(包括如浓度、温度、时间等因素)和机械能施加方法的类型。机械能的减少可为至少约四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、10倍或更多。
一般而言，破碎生物质所需的时间量可与进行破碎工序所需的能量相关。例如，已确定，秋季收割的柳枝稷具有每吨18.5千兆焦(GJ/吨)的能量含量。本文进行的采用常规球磨机的一个典型的研磨实验使用约5克的包含9.25×104焦耳(J)的生物质。对该样品，其中研磨在10天的时间里发生，将消耗大约2.2×105J(传递给经研磨的材料的能量)。因此，例如当研磨在19个小时的时间发生时，消耗了1.74×104J，等于19％的生物质的能量含量。类似地，当研磨在5小时的时间里发生时，消耗了4.58×103J或5％的生物质的能量含量。用氨处理法实现的能量减少的量也可直接测量。例如，用超微磨碎机时研磨可以发生。该研磨机传递约60x的常规球磨机的动力。在0.5kg的生物质上运行超微磨碎机5分钟，马达传送2.14HP(1596W)到研磨机上。因此，在这5分钟时间内，研磨机需要5.18％(1.596kW×0.0833h)/0.5kg＝0.266kW-h/kg)的生物质的能量含量。
生物质的机械破碎增加无定形态(与结晶态相对的)的生物质中纤维素的百分比。本文显示当研磨的时间增加时，生物质样品中无定形组分的百分比增加，并且从糖化而得来的糖产量也增加。在本发明的方法中，使用少于如果没有包括无水氨处理时所需的能量，生物质中无定形纤维素组分是增加的。
在本发明的方法中，使木质纤维素生物质与无水氨接触。无水氨是指干燥的且不在含水介质中的氨气。可加入无水氨以达到相对于生物质干重介于约2重量％和约30重量％的浓度。在一个实施方案中，所述无水氨相对于生物质干重通常介于约10重量％和约25重量％之间。生物质和无水氨可保持在介于约0℃和约200℃之间的温度。介于室温和约160℃之间的温度是期望的，因为这需要更少的能量输入到预处理方法中。如果在储存中应用，用于无水氨处理的时间可以为约三十分钟至约十天或更长以及至多1年。更低温度的使用可与更长处理时间相结合。更低的无水氨浓度还可在更高的温度下使用。例如，如本文实施例3所示，在糖化时，在室温下用20％的氨经九天的生物质处理或在160℃用10％的氨经一小时的生物质处理提供大约同样高的糖产量。用160℃无水氨处理，木糖的产量稍微好一些。本领域的技术人员将能够轻易地确定在这些于特定的所使用的系统中采用本发明方法提供期望的结果的范围内的参数组合。
在另一个实施方案中，当维持贮藏中的生物质很长的时间时，如至多一年，可使用与无水氨接触的生物质。尽管生物质通常可在秋天收割，在直到下一次收割的一段时间内，可贮藏生物质且可使用其一部分。维持与无水氨接触的所贮藏的生物质既可处理生物质以减少研磨时间的需要，如上文所描述的，也可在贮藏时起到保存生物质的作用。在该实施方案中，通常采用无水氨的处理将是在自然温度下，即，没有用于升高或降低温度的能量输入。此外，无水氨的浓度通常将在上文描述的低范围内，例如相对于生物质的干重介于约2重量％和约10重量％之间。
关于无水氨的应用，优选地含水量在某一范围内，该范围可支持无水氨处理的有益效果同时轻易允许降低用于机械破碎的含水量。在一个实施方案中，生物质的含水量为约15％至约30％、或约18％至约28％以最大化无水氨预处理的有益效果，同时允许在氨预处理后闪蒸出氨时含水量降低至约15％或小于15％。如果所述生物质在无水氨处理之前太干，则可降低无水氨预处理的功效。无水氨处理自身将有助于干燥生物质。在长时间贮藏生物质期间，低含水量会降低生物降解。为在机械破碎之前进一步地降低生物质中的水分，可将无水氨在接触生物质之前加热，或者无水氨可伴随有过热蒸汽，两者都能够干燥生物质。
优选地，在用于精细研磨生物质的机械能的施加之前，生物质是基本上干燥的。基本上干燥的生物质具有等于或小于约15％的含水量。介于约7％和约10％之间的含水量被发现对于在振动性的特殊棒磨机的碾磨是最佳的(Kebeya等人(1993)Shikoku Kogyo Gijutsu Shikensho Kenkyu Hokoku24：42-90)，并且是本发明的方法中所期望的。由于干燥显著地有助于所述方法的成本，使用无水氨处理的一个优点是在无水氨处理后减少或消除进一步干燥的必要。
然而，如果无水氨处理后进一步的干燥是期望的，可将生物质干燥以达到至少约80％的干物质含量。优选地，在如下文所描述的机械能的施加期间，干物质含量为至少约85％、90％、93％、96％或更高。干燥可通过任何常规方法，如用干燥烘箱、旋转干燥器、闪蒸干燥机或过热蒸汽干燥器，或空气干燥。
在本发明的方法中，将机械能施加到经无水氨处理的生物质上，或在生物质的无水氨处理期间施加机械能以产生经精细研磨的、无水氨处理的生物质。经精细研磨的材料可通过研磨生产，所述研磨将力(如重击、压碎、剪切或碾磨)施加到生物质上。通常，在研磨处理例如在球磨机或超微磨碎机中重击、压碎、剪切和碾磨时，施加多于一种的这些类型的力的组合。任何机械破碎生物质的装置均可用于本发明，包括但不限于超微磨碎、锤磨、球磨、珠磨、振动性球磨、振动性棒磨、喷射研磨、芯棒研磨、涡轮研磨、空气分级磨、辊磨和行星式球磨。当用于精细研磨时，锤磨为空气分级磨的一个组件，在空气分级磨中通过锤磨机重复地回收较大的颗粒直到颗粒足够小而以特定尺寸离开研磨机。
在常规的球磨中，大的旋转圆柱体包括内部密集的球形球(也被称作珠)，当圆柱体旋转时它们通过力量(或重击)挤压材料而碾碎材料。在超微磨碎时，在固定式的圆柱体内的球形珠(也被称作球)通过固定有垂直方向的臂的纺丝轴进行搅拌。用于研磨的珠或球可为任何类型的密集的球形珠，例如立方体氧化锆珠或不锈钢珠。所用的珠的尺寸可根据不同条件而变化，例如特定的设备(其中使用珠)和被加工的特定的生物质，包括生物质的类型和初始粒度、以及施用到生物质上的特定无水氨处理。球可以是例如0.3175cm、0.471cm、0.556cm、0.635cm、0.794cm、0.953cm或更大。大于0.3175cm的直径的球或珠可提供更有效的研磨。特定生物质的最有效的球尺寸和处理参数的集合可由本领域的技术人员轻易地确定。
在无水氨处理之前或同时，机械破碎可在一段介于约数秒至约数天的时间内发生。例如，破碎可运行少于约两天或少于约一天的时间。此外，可使用约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟、5分钟或1分钟或更少的时间。短的应用时间可用来降低能量成本，尽管最大的糖产量在糖化期间可能不会实现。例如，5分钟或10分钟的研磨时间能够产生商业上可接受的糖的水平，但不如更长研磨时间所达到的糖的水平那样高。可调节研磨的能量成本与糖产量之间的平衡以支持最大的商业价值。
可将机械破碎方法应用于批量方法或连续方法。
经预处理的生物质产品
由本发明的方法所得的经预处理的生物质产品是易糖化的，并且糖化生成可发酵的糖，这种糖可用于通过生物催化剂的发酵以生产期望的目标产物。酶解糖化通常利用酶聚生体降解纤维素和半纤维素以产生水解产物，其包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。糖化酶见Lynd，L.R.等人的综述。(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。
使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶聚生体，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于普通组“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(1992年的Enzyme Nomenclature，Academic Press，San Diego，CA，以及增补1(1993)、增补2(1994)、增补3(1995)、增补4(1997)和增补5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996；Eur.J.Biochem.，250：1-6，1997；和Eur.J.Biochem.，264：610-650，1999中])。可用于本发明方法中的糖苷酶可根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶)。此外，将其他活性加入糖化酶聚生体(如肽酶(EC 3.4.xy)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)、和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73))中以帮助从生物质的其他组分中释放多糖是有益的。在本领域为人们所熟知：生产多糖水解酶的微生物常常表现出活性，如纤维素的降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组均可有助于纤维素降解的活性的酶。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂(如纤维素酶)可包括多种酶。
糖化酶可商购获得，如
Figure BDA00002741550000141
CP纤维素酶、
Figure BDA00002741550000142
木聚糖酶、
Figure BDA00002741550000143
1500、以及
Figure BDA00002741550000144
DUET(Danisco U.S.Inc.，GenencorInternational，Rochester，NY)。此外，糖化酶可为未纯化的，并以细胞提取物或完整细胞溶解产物的类型提供。所述的酶可用已经工程化的以表达多个糖化酶的重组微生物制备。
一类糖苷水解酶(如家族GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11)在本发明中有特定的价值。GH是一组水解两个或更多个碳水化合物间的糖苷键或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键的酶。GH家族基于序列类似性进行分类，在碳水化合物-活性酶(CAZy)数据库中可得到的(Cantarel等人(2009)Nucleic Acids Res.37(数据库专刊)：D233-238)。这些酶能作用于许多底物并在糖化过程中有效。配糖水解酶家族3(“GH3”)的酶有许多已知的活性：β-葡糖苷酶(EC：3.2.1.21)；β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)；N-乙酰基β-氨基葡糖苷酶(EC：3.2.1.52)；葡聚糖β-1，3-葡糖苷酶(EC：3.2.1.58)；纤维糊精酶(EC：3.2.1.74)；外切-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC：3.2.1)；以及β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)。配糖水解酶家族39(“GH39”)的酶具有α-L-艾杜糖苷酸酶(EC：3.2.1.76)或β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)的活性。配糖水解酶家族43(“GH43”)的酶具有下面的活性：L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；聚阿拉伯糖内切酶(EC 3.2.1.99)；以及半乳聚糖1，3-β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.145)。配糖水解酶家族51(“GH51”)的酶具有L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)或内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)的活性。配糖水解酶家族10(“GH10”)在Schmidt等人，1999，Biochemistry 38：2403-2412和Lo Leggio等人，2001，FEBS Lett 509：303-308)的文章中有更全面的描述，并且配糖水解酶家族11(“GH11”)在Hakouvainen等人，1996，Biochemistry 35：9617-24的文章中有更全面的描述。
在发酵前糖化混合物可通过蒸发而浓缩，以例如增加可发酵糖的浓度。任选地，在糖化产物中的液体可从分批或连续方法中的固体中分离。任选地，液体或全部糖化产物可在发酵前灭菌。根据发酵中所用的生物催化剂和糖化过程中所用的pH，所述pH可被调整为适宜发酵的pH。
糖化可进行约若干分钟至约200小时的时间，通常约24小时至约72小时。反应时间将取决于酶浓度和比活性，以及所使用的底物和环境条件如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定用特定底物和糖化酶聚生体时使用的温度、pH和时间的最佳条件。
糖化能在单批、分批中或以连续方法进行。糖化也能一步或多步进行。例如，糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。可用酶在某个温度和pH下进行初级处理，随后使用不同的酶在不同温度和/或pH下进行二级或三级(或更多的)处理。此外，用不同酶在连续步骤中的处理可在相同pH和/或温度下进行，或在不同pH和温度下进行，例如使用在较高pH和温度下稳定的和更高活性的半纤维素酶处理，随后用在较低pH和温度下有活性的纤维素酶处理。
糖化过程中固体的百分比可变化。希望保持相对高的用于糖化的固体的百分比以获得含有高浓度的可发酵糖的水解产物。通常，固体介于约10％和60％之间，其中更典型地固体介于约10％和约25％之间。
糖化后来自生物质的糖的溶解度可通过测量单体糖和低聚糖的释放进行监控。测量单体糖和低聚糖的方法在本领域中为人们所熟知。除了单体糖之外，还产生可在发酵时使用生物催化剂转化成单体的可溶低聚糖。
包含可发酵糖的生物质水解产物通常以培养基的百分比包括在发酵培养基中，从而提供所有或部分用于生物催化剂生长和产物生产的碳源。发酵培养基中的水解产物通常为约40％至90％的发酵培养基。在以引用方式并入本文的专利US 20070031918A1中的实施例9给出了用作40％或80％发酵培养基的水解产物的实例。根据所述水解产物中可发酵糖的浓度，可将附加的糖加入到培养基中。例如，当含约80g/L的葡萄糖和约50g/L的木糖的水解产物被包括在40％的发酵液中，可添加附加的葡萄糖和木糖至期望的终糖浓度。如本领域技术人员所熟知，除了水解产物之外，发酵液还可包含其它营养物、盐和因子，这些物质是通过用于生产产物的特异性生物催化剂用于生长和生产所必需的。补充剂可包括例如酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐和痕量元素。也可包括通过特异性生物催化剂产生的特定产品的生产所需的组分，例如用于维持质粒的抗生素或酶催化反应中所需的辅因子。
作为制备水解产物的另外一种选择，将水解产物加入到发酵培养基，然后进行发酵，同步糖化和发酵(SSF)方法可用于生产生物质水解产物发酵液。在该方法中，当它们通过生产生物催化剂代谢时，糖是由生物质生产的。
生物催化剂发酵和目标产物
发酵培养基中的可发酵糖是通过合适的生物催化剂进行代谢以生产目标产物。所述糖分在发酵过程中与生物催化剂接触，该过程中生物催化剂在通过生物催化剂生产目标产物的条件下生长。根据对使用的特定生物催化剂有用的条件，针对发酵可将温度和/或顶空气相进行调整。发酵可以是有氧的或厌氧的。针对使用的特定生物催化剂，调整这些和包括温度和pH的其他条件进行。
由生物催化剂生产的目标产物的实例包括1，3-丙二醇、丁醇(异丁醇、2-丁醇和1-丁醇)以及乙醇。生产1，3-丙二醇的重组微生物体公开于专利US 7504250中。通过经基因修饰的酵母生产丁醇公开于例如专利US20070092957A1中。基因修饰的大肠杆菌(E.coli)菌株也已被用作乙醇生产的生物催化剂。(Underwood等人，(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：6263-6272)。乙醇由经基因修饰的发酵单胞菌属在木质纤维素生物质水解产物发酵培养基(专利US 20070031918A1)中产生。具有增加乙醇产量的经基因修饰的运动发酵单胞菌的菌株在专利US 2003/0162271A1和US 2009/0246846A1中有描述。
实施例
使用以下缩写：
“HPLC”是高效液相色谱，“C”是摄氏，“m”是米，“mm”是毫米，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“N”是正常的，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔，“cm”是厘米，“g”是克，“mg”是毫克，“kg”是千克，“wt”是重量，“h”或“hr”是小时，“d”是天，“RT”是室温，“DM”是干物质，“DWB”是生物质的干物质，“ASME”是美国机械工程师学会(American Society of MechanicalEngineers)，“s.s”是不锈钢，“in”或“″”是英寸，“rpm”是转每分钟，“OD”是光密度，“r”是半径，“d50”是样品的中值粒度。
一般方法
生物质的表征
生物质的干物质含量使用在105℃运行的Denver Instruments IR-120水分分析仪或在102℃通过在真空炉中通氮气(相当于～12英寸的汞(柱))加热过夜来确认。
生物质组合物通过任何一种在本领域中为人们所熟知的标准方法进行测量，如ASTM E1758-01“用HPLC测定碳水化合物的标准方法”。
氨处理系统(P5L反应器)
氨处理实验使用以下系统进行，所述系统由5L水平圆柱状压力容器(Littleford Day，Fluorence，NY)组成，所述压力容器经过改进以包括在反应器顶部的一个1.5英寸(3.8cm)的球形阀，所述球形阀可移开以添加生物质。将反应器配备有两个位于顶部空间的孔、位于底部的1.5英寸的球形阀、多个热电偶、安全阀、压力计和压力换能器。所述反应器包含所谓的“热传递”型叶轮，其包含四个叶片以用于垂直和水平混合固体。对于所有实验，使叶轮以大约40rpm的转速旋转。
通过在电子天平上放置装有无水氨的2磅的气缸然后称量气缸的重量减少以获得反应器中每(单位)干物质的氨的目标量，将无水氨定量加入P5L反应器。
使用连接顶部凸缘的针型阀来控制加压闪蒸和减压闪蒸。使闪蒸蒸汽通过套管式换热器，该换热器使用家用冷水。然后将蒸汽/冷凝物收集在带湿冰夹套的2L圆柱形容器中。在加压闪蒸之前，将不凝物排出2L圆柱形容器。然后破坏真空并收集冷凝物。然后使用相同系统来收集减压闪蒸冷凝物。
酶源
Figure BDA00002741550000181
CP、
Figure BDA00002741550000182
木聚糖酶和
Figure BDA00002741550000183
1500获自Danisco U.S.Inc.，Genencor，International(Rochester，NY)。
Novozyme 188获自Novozymes(2880Bagsvaerd，Denmark)。
实施例1(比较)
球磨玉米棒或柳枝稷生物质作为唯一的预处理
作为用来准备用于糖化的玉米棒和晚冬/早春收割的柳枝稷木质纤维素生物质的非化学方法来检查球磨。将五克经刀研磨的(通过一个1mm的筛子)玉米棒(94％DM)和柳枝稷各放在具有226g的1em的尺寸的Y2O3掺杂的ZrO2珠(立方体的氧化锆珠；Norstone；Wyncote，PA)的125mL的塑料瓶中。所用瓶子在室温下以每分钟83个循环的速率翻滚1-10天。每隔一定时间将部分样品取出并用于酶解糖化。在包含两个5mm玻璃珠的6mL玻璃瓶中，在4.7-4.8的pH和47℃的温度下用旋转振荡器以250rpm的转速将大约370μL的14％固体的悬浮液在包含6.68：3.34：1.67mg/g(固体)比例的Spezyme CP：
Figure BDA00002741550000184
木聚糖酶：Novozyme 188的50mM柠檬酸钠溶液中糖化。每隔一定时间将部分样品取出并用HPX-87H色谱柱(BioRad)在60℃用0.01N H2SO4作为流动相以0.6mL/min流速对所取样品进行HPLC分析。经糖化不同时间(0小时、24小时、48小时、72小时)的以及研磨不同时间(0天、1天、2天、3天、6天、10天)的样品中的葡萄糖和木糖的理论产量百分比显示于图1中，其中玉米棒为(A)并且柳枝稷为(B)。
用Y2O3掺杂的ZrO2珠研磨对这些没有附加的化学预处理或木质素移除的原料的糖化具有主要的影响。对于玉米棒和柳枝稷这两者，增加的研磨时间都产生了增加的葡萄糖和木糖产量。通过3天的研磨，柳枝稷的产量低于玉米棒。经过6天的研磨和72小时的糖化，玉米棒和柳枝稷的产量都达到了对于葡萄糖约65％和对于木糖约40％。在10天的研磨后，玉米产量稍微地升高了，并且柳枝稷的产量升高至对于葡萄糖约70％或对于木糖约45％。
实施例2(比较)
糖化产量与在球磨之后的柳枝稷生物质的无定形结构相关联
不锈钢具有高于ZrO2的密度(分别为7.7g/cm3和6.0g/cm3)，并且不锈钢珠被用作替代的研磨材料。
将五克的经刀研磨(通过一个1mm的筛子)的晚冬/早春收割的柳枝稷(91.3％DM)放置于盛有200g 1/4英寸(0.63cm)的不锈钢珠的125mL的塑料瓶中。将瓶子在室温下按每分钟83个循环的速率翻滚以进行1-10天的研磨。每隔一段时间将部分样品取出并用于酶解糖化、粒度确认、表面积测量和广角X光衍射以测量结晶度。酶解糖化在50mM的柠檬酸钠、pH 4.9、14％的固体投料量、25mg/g葡聚糖和在16.6mg/g木聚糖时的半纤维素(Xyn3，Fv3A，Fv51A及FV43D)的混合物中使用
Figure BDA00002741550000191
1500(Genencor)进行。在包含两个5mm玻璃珠的6mL玻璃小瓶中，在47℃用旋转振荡器以250rpm的转速将大约370μL的悬浮液糖化。如实施例1中所述，每隔一段时间将部分样品取出并进行HPLC分析。
图2显示在不同的研磨和糖化时间获得的单体葡萄糖和木糖的产量(分别为图2A和B)。针对每段研磨时间，也显示了由经120小时糖化后的过滤(以除去不溶的生物质)、接着在121℃有4％H2SO4存在时加热1小时并HPLC糖分析确定的总的溶解糖(单体的加上低聚的葡萄糖和木糖)。
葡萄糖和木糖的产量随着增加的研磨时间而增加，在开始六天的研磨时两种糖都显示了s-形动力学(分别为图3A和B)。s-形形状可能反映了生物质增量的破裂所需的能量降低，因为生物质是越来越分散的。颗粒的表面积(图3A和B)用氮气吸附测量。表面积从0至3-4天的研磨增加，之后表面积降低，这可能是由于随着进一步的研磨一些结构性因素的崩溃。除了在早期阶段的研磨，糖化产量意外地没有跟踪壳体表面积，这显示除了表面积之外还有决定糖化速率和产量的因素。另一个起作用的因素可为纤维素结晶度的降低。所述生物质的结晶度可用广角X射线散射根据研磨时间估计并与葡萄糖和木糖的产量作图(分别为图4A和B)。结晶度数据也以数字形式显示在表2中。糖化产量紧密地跟踪生物质中无定形组分的百分度，这显示结晶度或涉及结晶度的因素(如聚合度)有助于增加多聚糖到糖化酶的可接触性。
图1和2的比较显示10天的球磨后，用1/4英寸的不锈钢珠的糖化产量高于用1cm的Y2O3掺杂的ZrO2珠。
柳枝稷的钢球磨极大地加快了酶解糖化(在4小时中释放了≥50％的最终糖产量)，在10天的研磨后产生了对于葡萄糖＞80％的和对于木糖～60％的最终的单体糖产量。
表2：用广角X射线散射确定对于柳枝稷的根据研磨时间的结晶度百 分比。
样品 ％无定形的 ％结晶的
未经研磨的柳枝稷 66 34
经研磨1天的柳枝稷 66 34
经研磨2天的柳枝稷 75 25
经研磨3天的柳枝稷 79 21
经研磨4天的柳枝稷 88 12
经研磨6天的柳枝稷 100 0
经研磨10天的柳枝稷 100 0
实施例3
用无水氨处理和球磨的效果
秋季收割的柳枝稷(92.5％DM)完全未经处理(UT4un)或用按生物质干重计20％的无水氨在室温(RT)经9天或按生物质干重计10％的无水氨在160℃经1小时(JV198)处理。对于160℃的处理，将柳枝稷置于“一般方法”中描述的P5L反应器中。并且将反应器的夹套加热。从无水氨的气缸中加入氨。
将经室温处理的生物质在氨处理后通过1mm的筛网进行刀磨，而将经160℃处理的生物质在氨处理前通过1mm的筛网进行刀磨。将氨闪蒸出，然后用如实施例2所述的1/4英寸(0.635cm)的不锈钢珠将样品研磨0小时、19小时、43小时和67小时。然后用实施例2中的同样条件将生物质糖化。如实施例1所述分析糖产量。
图5A和B分别显示具有不同球磨时间的以生物质重量计10％的无水氨在160℃处理1小时(JV198)的样品经不同时间糖化的葡萄糖和木糖的产量。也显示了经球磨的而未经无水氨处理的未经处理的对照物(UT4un)的产量。结果显示在每个研磨时间点时用无水氨和球磨的组合比仅用研磨所获得的葡萄糖和木糖产量更高。对于木糖，糖化产量的增加尤其高，木糖在经19小时研磨的样品中增加了超过2倍。
室温时用按生物质重量计20％的无水氨经9天处理的样品给出了类似的结果。具有糖化72小时的无水氨处理和仅球磨(未经处理的)的对照物所产生的结果在图6中显示为理论单体糖化产量的百分比对球磨时间的指数图。表3提供源自图6的曲线的指数拟合的发泡时间的计算。发泡曲线用单指数拟合。发泡时间(tau)是1/e值的指数发泡所需的时间(其中e＝2.7183，63％弛豫)。所述结果显示对于两个氨预处理，具有研磨时间的糖化产量的增加速率比未经处理的样品快6-10倍。
表3：图6中的木糖或葡萄糖产量图的发泡时间
无水氨处理 糖 发泡时间(τ)
未经处理的 葡萄糖 54.4小时
未经处理的 木糖 65.3小时
10％，160℃，1小时 葡萄糖 8.92小时
10％，160℃，1小时 木糖 6.22小时
20％，室温，9天 葡萄糖 6.54小时
20％，室温，9天 木糖 6.55小时
实施例4
相对于粒度和无定形组分的经无水氨处理的和经超微磨碎的柳枝稷糖 化的比较
五百克的经刀磨的(通过一个1mm的筛网)秋季收割的柳枝稷如实施例5中所述在160℃用无水氨处理。然后将所述柳枝稷的样品在UnionProcess SD-1超微磨碎机中用40磅的1/4英寸的不锈钢珠以516rpm超微磨碎0至60分钟。将每个样品提交以用广角X射线散射进行结晶度分析。表4显示源自每个样品的衍射模式的无定形组分的百分比以及微米为单位的粒度d50。20分钟研磨后，粒度达到最小，然后随着研磨时间增加而增加，如早期对于未经处理的柳枝稷的颗粒表面积时发现的(实施例2)，然而无定形组分的百分比继续增加。如实施例2中所述，将样品糖化并如实施例1中所述分析糖产量。图7A和B显示在经72小时糖化时无定形组分的百分比和理论产量的百分比的比较。如先前未用无水氨预处理的经研磨的柳枝稷时所见(实施例2)，葡萄糖的糖化产量(图7A)相当紧密地跟踪无定形组分的百分比，在两种情况下都显示适度的s-形形状。木糖的糖化产量(图7B)比无定形组分的百分比稍微更具指数性。
最初，糖化产量显示与粒度的逆相关性(图8)，因为产量首先增加而粒度降低，然后在后期产量继续增加同时粒度增加。
表4：经不同时间研磨的经无水氨处理的柳枝稷样品的粒度和无定形组 分。
无水氨 研磨时间 d50(μm) 无定形组分％
无 0 ～600 59.1
是 0 ～600 46.5
是 5分钟 30.20 66.3
是 10分钟 19.03 69.5
是 15分钟 17.89 71.3
是 20分钟 13.55 79.6
是 30分钟 16.38 83.1
是 60分钟 18.91 90.2
实施例5
糖化中研磨珠的尺寸和固体投料量对用无水氨预处理并经5小时球磨 的生物质的糖产量的作用
如实施例3所描述，用于实施例3中的同一批的秋季收割的柳枝稷用无水氨在室温或160℃处理。然后，将经处理的生物质用下面尺寸的不锈钢珠球磨5小时：1/8或0.125英寸(0.3175cm)，0.1855英寸(0.471cm)，7/32或0.2188英寸(0.556cm)，1/4或0.250英寸(0.635cm)，5/16或0.3125英寸(0.794cm)和3/8或0.375英寸(0.953cm)。在125mL的塑料瓶中，将五克的生物质用200g的不锈钢珠以83rpm的转速研磨5小时。研磨之后，如实施例2中所述，将所述样品单批模式地糖化，不同的是在糖化时固体投料量为14％(图9、10)或25％(图11，12)。如实施例1中所述，对于葡萄糖和木糖进行样品分析。此外，在124小时的糖化后，将样品过滤(0.2μm)以除去固体，并且将滤液在有4％的硫酸存在下于121℃加热1小时。将葡萄糖和木糖的对照样品用于校正加热时的任何糖降解，同时总的可溶糖含量如实施例2中所述确定。
在所用的研磨条件下，对于经无水氨于160℃处理的柳枝稷，0.1855英寸至0.250英寸(0.471cm-0.635cm)直径的珠提供了最高产量，而0.1855英寸(0.471cm)和0.375英寸(0.953cm)的珠似乎赋予经室温下的无水氨处理的柳枝稷很小的优点。
一般来讲，用14％的固体投料时的产量高于用25％的固体投料量。一般来讲，经160℃氨处理的柳枝稷具有比经室温处理的柳枝稷稍微更好的产量，尤其是对于木糖。在糖化最后时的酸水解显示显著量的可溶低聚糖的存在，可将其转化为单体并用于发酵。
实施例6
生物质含水量对超微磨碎之前的无水氨处理的功效的影响
将经1mm刀研磨的柳枝稷样品的含水量调节至8％(92％DM)，18％(82％DM)或28％(72％DM)的含水量并在150-160℃进行1小时的10％无水氨处理。在无水氨处理的最后闪蒸出氨以后，所述样品分别具有约98％、97％和96％的干物质含量。将所述样品在实施例4的Union Process超微磨碎机中超微磨碎5分钟的等同时间。然后将所述样品在47℃、含25％的固体投料量和7、14及28mg的葡聚糖酶+木聚糖酶/g葡聚糖+木聚糖的加酶量时糖化120小时。总的可溶葡萄糖和木糖(包括单体和低聚体)的产量显示于图13中。相对于8％的含水量，对于在18％的水分时经氨处理的样品，所述7和14mg加酶量分别显示出12％和11％的溶解的木糖产量的绝对增加。对于同样的样品，所述溶解的葡萄糖产量的绝对增加为5.5％和8％。18％和28％的含水量的样品产生类似的葡萄糖和木糖的糖化产量。因此，使至少18％的含水量进入无水氨处理有显著的优点。

Claims (16)

1.生产易糖化的生物质的方法，包括：
a)提供木质纤维素生物质；
b)使(a)的生物质与无水氨接触以产生经氨处理的生物质；以及
c)通过机械破碎方法施加机械能来破碎(b)的经氨处理的生物质以产生易糖化的经预处理的生物质；
其中所述经预处理的生物质包含无定形纤维素组分；并且
其中与未与无水氨接触的并用如(c)中同等水平的机械能破碎的经预处理的生物质中的无定形纤维素组分的百分比相比，所述经预处理的生物质中的无定形纤维素组分的百分比更高。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的经预处理的生物质具有小于约0.1mm的粒度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的机械破碎所需的能量比未与无水氨接触的木质纤维素生物质的机械破碎所需的能量小约4至约10倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在糖化时，与未与无水氨接触的并如(c)中被破碎的经预处理的生物质相比，步骤(c)的经预处理的生物质以更高的速率生产可发酵糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述经氨处理的生物质在氨预处理后是基本上干燥的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述机械破碎方法选自用于下列的方法：重击、碾磨、剪切、压碎、以及它们的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述机械破碎方法是选自下列的方法：超微磨碎、锤磨、球磨、珠磨、振动性球磨、振动性棒磨、喷射研磨、芯棒研磨、涡轮研磨、空气分级磨、辊磨和行星式球磨。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述破碎发生小于2天的时间。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述破碎发生小于60分钟的时间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的无水氨的浓度相对于木质纤维素生物质的干重介于约2和约30重量％之间。
12.根据权利要求11所述的方法，其中无水氨的浓度相对于木质纤维素生物质的干重介于约10和约25重量％之间。
13.根据权利要求1所述的方法，其中使步骤(b)的木质纤维素生物质与无水氨接触约三十分钟至约一年的时间。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的木质纤维素生物质在施加机械能之前达到约15％和约30％的含水量。
15.根据权利要求1所述的方法，其中使步骤(b)的木质纤维素生物质与无水氨在介于约0℃和约200℃的温度下接触。
16.根据权利要求1所述的方法，其中(a)的木质纤维素生物质选自：玉米棒、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱渣或秸秆、大豆秸秆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木、灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的组合。
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