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CN103003306A - 抗体 - Google Patents

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CN103003306A CN2011800192631A CN201180019263A CN103003306A CN 103003306 A CN103003306 A CN 103003306A CN 2011800192631 A CN2011800192631 A CN 2011800192631A CN 201180019263 A CN201180019263 A CN 201180019263A CN 103003306 A CN103003306 A CN 103003306A
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Abstract

本发明提供抗体，所述抗体与CXC趋化因子受体4(CXCR4)结合，并且不诱导CXCR4表达细胞的显著细胞凋亡。还提供的尤其是免疫轭合物和包含这种抗体的组合物，以及特别在医疗和诊断领域中涉及这种抗体的方法和用途。

Description

抗体
技术领域
本发明主要涉及抗体、CXCR4生物学及相关治疗的领域。更特别地，它提供了结合到CXCR4的抗体。这种抗-CXCR4抗体用于疾病和与CXCR4有联系的病况的诊断和治疗，例如，癌症和病毒感染(尤其是HIV)的治疗，炎症和免疫疾病的治疗，例如通过肿瘤血管成像来监测或预测肿瘤的生长和进展，抑制或减弱转移的形成和抑制或减少血管再生。本发明的基于抗体的组合物和方法也扩展至对免疫轭合物和其它治疗性制品、试剂盒和方法的使用。
背景技术
拥有大于800个成员，G蛋白偶联受体(GPCRs)代表了涉及信号传送的细胞表面分子最大的家族，占由人类基因编码的总基因的超过2％。GPCR超家族的成员共享一个公共的膜拓扑结构：一个细胞外N端，一个细胞内C端和七个跨膜(TM)螺旋，它们由三个细胞内环和三个细胞外环连接。根据它们共享的拓扑结构，GPCRs也被称为七跨膜(7TM)受体。这些受体控制主要的生理学功能，包括神经传递、从内外分泌腺体释放激素和酶、免疫应答、心肌和平滑肌收缩以及血压调节。它们的机能失调可引起一些最普遍的人类疾病。新兴的实验和临床数据显示，GPCRs在癌症的进展和转移中具有极其重要的作用。因此，一些GPCRs有可能是抗癌药物的适宜靶标。
趋化因子尤其是在各种疾病和病症(包括癌症、病毒感染、哮喘和过敏性疾病，以及自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化)的免疫和炎症应答中起到重要作用。根据它们的结构，将趋化因子分类为C-C趋化因子(包括半胱氨酸-半胱氨酸模序)或C-X-C趋化因子(包括半胱氨酸-X-半胱氨酸模序)。因此将结合这种趋化因子的受体分别分类为CCR或CXCR家族的成员。
CXCR4(又称为融合素，HM89，LESTR，HUMSTR)是对基质细胞衍生因子-1(SDF-1，又称为CXCL12和PBSF)特异性的α-趋化因子受体，所述SDF-1是具有对淋巴细胞具有有力趋化活性的分子。这种受体是HIV分离物可用于感染CD4+T细胞的若干趋化因子之一。若干正常组织表达CXCR4。无论是就mRNA而言还是就功能性蛋白而言，在其中已展示表达的细胞的值得注意的例子，包括：造血细胞/骨髓祖细胞；免疫系统的细胞，例如T细胞、前B细胞、浆细胞、树状突细胞、NK细胞；其它血细胞，例如单核细胞、肥大细胞、血小板；神经系统细胞，例如神经细胞、星形细胞、小神经胶质细胞；其它细胞，例如内皮细胞、血管平滑肌、胃肠道上皮细胞和某些其它细胞。
CXCR4在各种肿瘤中表达且在癌症的病理生理学中，尤其是在癌症转移中起到决定性作用(Dorsam and Gutkind，2007，G-protein-coupled receptors and cancer.NatRev Cancer 7：79-94)。已在几乎所有的被研究肿瘤中发现CXCR4表达。还值得关注是，SDF-1在肝脏、肺脏、骨髓、淋巴结中以及在脑中，，即癌症通常转移到的位置，以特别高的水平表达(在脑中的表达水平稍低)。试剂(例如靶向CXCR4的抗体)的潜在适应症包括癌症(例如转移癌)例如乳腺、前列腺、胰腺、食道、结肠直肠、肝脏和肺脏(SCLC和NSCLC)，还有恶性或者转移黑色素瘤、脑部肿瘤(神经胶质瘤)、头-颈癌、某些白血病、淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤、儿童肿瘤(例如成神经细胞瘤)、肾癌、成血管细胞瘤。过度表达的CXCR4已经在若干癌症中被发现，包括肺脏肿瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、乳头状甲状腺癌、骨肉瘤和其它恶性肿瘤。抗-CXCR4抗体也能用于病毒感染如HIV或其它逆转录病毒感染的治疗，且用于治疗免疫疾病如自身免疫性疾病、炎性疾病，以及抑制血管再生和血管形成。
由于它们复杂的结构，GPCRs被看做是用于产生特异性抗体的“困难靶标”。它们既不能从溶解细胞的膜片段中容易地纯化，也不能在不同的表达系统中作为正确折叠的可溶性蛋白被重组生产。
与产生抗GPCPs抗体有关的困难阐述于Hoogenboom et al.Eur.J.Biochem 260，774-784(1999)中。此外，Sui et al.Eur.J.Biochem 270，4497-4506(2003)说明与试图获得抗GPCPs趋化因子受体CXCR4的人类抗体有关的问题，且报道即使使用结合退后选择的导航方法，也不能鉴别特异性抗体。因此，在GPCPs领域中，产生特异性抗体仍然是主要挑战。
Northwest Biotherapeutics Inc.公司正开发单克隆抗CXCR4抗体，其中一些正处于后期预临床研发阶段。表明CXCR4抗体的潜在功效的数据通过NWB等在动物模型中收集。后续开发可能包括在I期临床试验制备中选择性抗体的人类化和毒性研究。
MDX-1338是来自Medarex的抗人类CXCR4特异性的完全人类单克隆抗体。体外研究显示，MDX-1338以低纳摩尔级的亲和力结合到CXCR4-表达细胞。MDX-1338阻断结合到CXCR4表达细胞的CXCL12配体，且抑制CXCL12诱导迁移和低纳摩尔EC50值的钙通量。MDX-1338是一个IgG4，因此缺乏ADCC和CDC活性。MDX-1338在一系列CXCR4表达细胞系中诱导凋亡，且在多种AML和淋巴瘤异种移植模型中也有抗肿瘤活性。
另外，在靶向CXCR4/SDF-1的不同发展阶段存在大量小分子化合物和多肽。
发明者已经认识到识别CXCR4的附加抗体的鉴别(将有利于扩大治疗性选项的数量。然而，如以上讨论的，GPCPs(如CXCR4)的性质意味着这种抗体的研发面临真实挑战。
特别是，需要在其天然细胞膜结合形式中识别CXCR4的抗CXCR4人类抗体。尽管通常认为人类抗体具有优势，但众所周知的是，具有足够高亲和力和适当功能性以使其成为成功人类治疗的候选者的人类抗体的研发绝非那么简单。对于GPCPs，由于复杂性及其跨膜性质，更是如此。
发明内容
通过提供用于安全和有效治疗肿瘤、病毒感染和其中涉及CXCR4+细胞的其它疾病和病况如炎症或者免疫病症的新治疗组合物和方法，本发明克服了现有技术的某些局限。本发明提供结合到CXCR4的抗体、优选结合到CXCR4的一个或多个胞外域内的表位的抗体，特别是人类抗体。这种抗体可有效治疗肿瘤和病毒感染以及其中涉及CXCR4+细胞的其它疾病和病况如炎症或免疫病症。本发明的组合物和方法也扩展至使用这种特别抗体种类的免疫轭合物和化合物的用途。
本发明抗体一个特别优点是抗体不诱导CXCR4表达细胞的明显调亡。这不同于临床领域的前导抗体(例如，在WO 2008/060367中描述的Medarex抗体)，所述前导抗体诱导这种调亡。由于CXCR4在大量的正常细胞上表达，凋亡诱导的这种缺乏是阻止过多不需要的细胞死亡的真正治疗性优点，因此这种抗体具有有利的安全性。
本文描述的本发明抗体的另外的或替代的优选性质在于该抗体是拮抗性抗体。因此，优选的是不诱导明显凋亡的性质也与抗体为拮抗性抗体的性质相结合，即，它们例如通过阻断或抑制受体-配体相互作用和/或阻断或抑制来自CXCR4受体的下游信号事件，例如阻断或抑制通过CXCR4的配体诱导或介导的信号来阻断或抑制CXCR4的功能。这种性质对治疗中使用抗体很重要，这与它们仅仅用于标记CXCR4表达细胞，例如用于诊断形成对比。
在这点上，众所周知，CXCR4在广范围的健康/正常细胞上表达，且CXCR4和其配体SDF-1在研发中都很重要。然而，如以上讨论的，也显示出CXCR4在几乎所有恶性肿瘤中过度表达，并对它们的生长有所贡献。甚至更重要的或许是，SDF-1通常在最有可能携带转移酶的那些组织中强烈的表达，例如在淋巴结、骨髓、肺脏、肝脏等中，且广泛接受的是肿瘤细胞沿着SDF-1梯度迁移。因此，本发明抗体的主要目的是限制肿瘤生长且通过抑制CXCR4的功能、例如通过阻止或抑制受体-配体相互作用来阻止转移的形成。人们还相信CXCR4涉及血管再生，因此，对CXCR4功能的阻断或抑制也可用于影响血管再生和肿瘤血管形成。
对功能的阻断或抑制，尤其是通过阻断或抑制受体-配体相互作用，在使用本发明抗体来治疗炎症和自身免疫性疾病中也很重要。另外，主要目标不是杀死CXCR4+细胞，而是下调它们的活性(在自身免疫性疾病中)且阻止或降低CXCR4+细胞向炎症的位置的迁移(可用于炎症和自身免疫性疾病)。
拮抗活性(阻断或抑制CXCR4的功能)在使用本发明抗体来治疗感染如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染中也很重要，在所述感染中，CXCR4起到功能性作用。这些病毒感染的例子是逆转录病毒感染，且尤其是HIV感染，其中已经表明一些菌株(CXCR4热带株)用CXCR4受体感染宿主细胞。因此，例如，通过阻断或抑制CXCR4+细胞被HIV感染，阻断或抑制CXCR4受体能限制HIV的传播。
然而，如上所述，认为本发明抗体的作用的主要方式在于，通过它们的拮抗性质(有利地与它们不诱导CXCR4+细胞明显凋亡的能力相结合)，在一些实施方案中本发明抗体能够诱导CXCR4+细胞的选择性消除(杀死)。这种选择性消除可以通过诸如ADCC、CDC、或诱导有丝分裂障碍(尤其在分裂细胞如肿瘤细胞中)的机制来进行，但没有表现涉及诱导明显凋亡。
本发明者已经制备了结合到CXCR4的CXCR4-特异性抗体。
例如，抗体结合到CXCR4+细胞，例如用CXCR4转染的细胞和天然表达CXCR4的细胞。具体而言，所述抗体结合到用CXCR4转染的HEK293T细胞，用CXCR4转染的DT40细胞和天然地表达CXCR4的拉莫斯(Ramos)(B-细胞))、Jurkat(T-细胞白血病)和CCRF-CEM(人类T-细胞白血病)(见实施例2、3和4)。
重要地是，抗体没有明显地结合到CXCR4-细胞，即，不表达CXCR4的细胞。具体而言，抗体没有明显地结合到非-CXCR4-转染细胞，或天然不表达CXCR4的细胞。
抗体也抑制已知将与CXCR4结合的配体的结合，例如，天然配体SDF-1a(这里也称为SDF-1)和/或与CXCR4结合的其它配体(例如非天然配体)，如AMD-3100(对CXCR4具有极高特异性且抑制CXCR4的化合物)(见实施例3)。
因此，本文描述的抗体与CXCR4特异性结合，使它们成为诊断和治疗本文讨论的病况的合适的候选者。
与CXCR4结合的本发明的优选抗体分子的氨基酸和/或DNA序列(其包括互补决定区(CDRs)的VH和VL结构域)在本文所列的不同SEQ ID NO.中说明。
因此，本发明提供了与CXCR4结合的抗体，且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质。优选地，抗体是拮抗性抗体，其阻断或抑制CXCR4的一个或多个功能，例如，阻断或抑制SDF-1(或者其它CXCR4配体，如AMD-3100)与CXCR4结合，响应于SDF-1(或其它CXCR4配体)而阻断或抑制CXCR4+细胞()迁移，阻断或抑制通过向CXCR4+细胞添加SDF-1而诱导的Ca2+通量，或阻断或抑制来源于XCCR4受体的任何其它下游信号事件。
优选地，将抗体分离。另外，优选地，抗体是人类和/或CXCR4优选是人类。优选地，抗体与CXCR4的胞外域中的表位相结合。因此，关于“与CXCR4结合”的任何描述包括“与CXCR4胞外域中的表位的结合”的优选实施方案。本发明抗体的其它优选性质是诱导CXCR4表达细胞的ADCC(CXCR4+细胞)的一种或多种能力，诱导CXCR4表达细胞的CDC的能力以及至少与人类CXCR4相结合，更优选是与人类和猴类CXCR4结合或与人类和小鼠CXCR4结合，更优选是与人类、小鼠和猴类CXCR4结合的能力。当观察交叉物种反应性时，甚至更优选的是抗体以相似的亲和力与人类和猴类或者人类和小鼠CXCR4结合。优选地，本发明抗体显示了抗肿瘤活性，例如，体内肿瘤细胞的生长抑制。
因此，发明优选地提供分离的人类抗体，该抗体与人类CXCR4胞外域中的表位相结合，且优选地具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质。这样，在本文叙述的所有实施方案中，不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质是优选特征。
在一个实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，其包括重链CDR1结构域，该重链CDR1结构域包含SEQ ID NO：1、7、13、或19氨基酸序列、或与这些序列中任何一个大体同源的序列。
替代或另外地，在本发明的一个实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含重链CDR2结构域，该重链CDR2结构域含有SEQ ID NO：2、8、14、或20氨基酸序列、或与这些序列中任何一个大体同源的序列。
替代或另外地，在本发明的一个实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含重链CDR3结构域，该重链CDR3结构域含有SEQ ID NO：3、9、15或21氨基酸序列、或与这些序列中任何一个大体同源的序列。
替代或另外地，在本发明的一个实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含轻链CDR1结构域，该轻链CDR1结构域含有SEQ ID NO：4、10、16、22或88氨基酸序列、或与这些序列中任何一个大体同源的序列。
替代或另外地，在本发明的一个实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含轻链CDR2结构域，该轻链CDR2结构域含有SEQ ID NO：5、11、17、23、或89氨基酸序列、或与这些序列中任何一个大体同源的序列。
替代或另外地，在本发明的一个实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含轻链CDR3结构域，该轻链CDR3结构域含有SEQ ID NO：6、12、18、24或90氨基酸序列、或与这些序列中任何一个大体同源的序列。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，其包含一个或多个重链CDR结构域，其中所述重链CDR结构域选自由：
(a)重链CDR1结构域，该重链CDR1结构域包含SEQ ID NO：1、7、13、或19氨基酸序列、或与其大体同源的序列，
(b)重链CDR2结构域，该重链CDR2结构域包含SEQ ID NO：2、8、14、或20氨基酸序列、或与其大体同源的序列，和
((c)重链CDR3结构域，该重链CDR3结构域包含SEQ ID NO：3、9、15或21氨基酸序列、或与其大体同源的序列，所组成的组。
在某些实施方案中，本发明也提供与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，其包含一个或多个轻链CDR结构域，其中所述轻链CDR结构域选自由：
(a)轻链CDR1结构域，该轻链CDR1结构域包含SEQ ID NO：4、10、16、22或88氨基酸序列、或与其大体同源序列，
(b)轻链CDR2结构域，该轻链CDR2结构域包含SEQ ID NO：5、11、17、23或89氨基酸序列、或与其大体同源的序列，和
(c)轻链CDR3结构域，该轻链CDR3结构域包含SEQ ID NO：6、12、18、24或90氨基酸序列、或与其大体同源序列，所组成的组。
在某些优选实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含以下两者：
(a)包含SEQ ID NO：3氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3，和
(b)包含SEQ ID NO：6氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3。
更优选地，还存在包含SEQ ID NO：1氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：4氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：2氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：5氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR2。
在某些优选实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体包含以下两者：
(a)包含SEQ ID NO：9氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3，和
(b)包含SEQ ID NO：12氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3。
更优选地，还存在包含SEQ ID NO：7氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：10氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：8氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：11氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2。
在某些优选实施方案中，与CXCR4相结合且具有不诱导CXCR4表达的细胞明显凋亡性质的抗体包括以下两者：
(a)包含SEQ ID NO：15氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3
(b)包含SEQ ID NO：18氨基酸序列、或一条与其大体同源的序列的轻链CDR3。
更优选地，还存在包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR2结构域，和/或包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
在某些优选实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡性质的抗体包含以下两者：
(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR3，和
(b)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR3。
更优选地，还存在包含SEQ ID NO：19氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：22氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：20氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR2结构域，和/或包含SEQ ID NO：23氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR2结构域。
在某些优选实施方案中，与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡性质的抗体包含以下两者：
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR3，和
(b)包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR3。
更优选地，还存在包含SEQ ID NO：1氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：88氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR1结构域，和/或包含SEQ ID NO：2氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR2结构域，和/或包含SEQ ID NO：89氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR2结构域。
在一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：1氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：2氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：3氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在又一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：4氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：5氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：6氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在又一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：14的条氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在又一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列、或与其大体同源序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在又一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
在又一个优选实施方案中，单独或组合地存在包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR2，以及包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列、或与其大体同源序列的CDR3。
或者，在某些实施方案中，本发明提供与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域。
所述抗体可选择地进一步包含含有SEQ ID NO：2氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列、或与其大体同源序列的轻链CDR2结构域，和/或还包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：4的基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3。
所述抗体可选择地进一步包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1，和/或含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域。
所述抗体可选择地进一步包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：13氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域。
所述抗体可选择地进一步包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：22的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：88的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
或者，在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：18氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
或者，在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：22的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
或者，在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：88的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
或者，在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合其具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：4氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
所述抗体优选进一步包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
所述抗体优选进一步包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：22氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：24的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR1结构域，和/或含有SEQ ID NO：88的氨基酸序列，或与其大体同源的序列的轻链CDR1结构域。
所述抗体任选进一步包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR3结构域，和/或含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR3结构域，和/或进一步包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的重链CDR2结构域，和/或含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的轻链CDR2结构域。
本发明某些优选的抗体包含一个或多个CDR，所述CDR选自由SEQ ID NO：1，2、3、4、5和6，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列组成的组。
本发明某些优选的抗体包含一个或多个CDR，所述CDR选自由SEQ ID NO：7，8，9，10，11和12，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列组成的组。
本发明某些优选的抗体包含一个或多个CDR，所述CDR选自由SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列组成的组。
本发明某些优选的抗体包含一个或多个CDR，所述CDR选自由SEQ ID NO：19、20、21、22、23和24，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列组成的组。
本发明某些优选的抗体包含一个或多个CDR，所述CDR选自由SEQ ID NO：1、2、3、88、89和90，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列组成的组。
某些优选的抗体包含SEQ ID NO：4、5和6；或10、11和12；或16、17和18；或22、23和24；或88、89和90中的两条或者多条轻链CDR，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列。
尤其优选的结合分子包含SEQ ID NO：4、5和6；或10、11和12；或16、17和18；或22、23和24；或88、89和90中的三条轻链CDR，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列(即，上述每一条轻链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)。
其它某些优选的抗体包括SEQ ID NO：1、2和3；或7、8和9；或13，14和15；或19，20和21中的两条或者多条重链CDR，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列。
尤其优选的结合分子包含SEQ ID NO：1、2和3；或7、8和9；或13、14和15；或19、20和21中的三条重链CDR，或与任何一个前述SEQ ID NO大体同源的序列(即，上述每一条重链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)。
某些更尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：4、5和6中的3条轻链CDR，或与任何一个这些序列大体同源的序列(即，上述每一条轻链CDR1和CDR2和CDR3的一条，或与其大体同源的序列)，且包含SEQ ID NO：1、2和3中的三条重链CDR，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条重链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)。
某些更尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：10、11和12中的三条轻链CDR，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条轻链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)，且包含SEQ ID NO：7、8和9的三条重链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条重链CDR1和CDR2和CDR3的一条，或与其大体同源的序列)。
某些更尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：16、17和18的三条轻链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条轻链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)，且包含SEQ ID NO：13、14和15的三条重链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条重链CDR1和CDR2和CDR3的一条，或与其大体同源的序列)。
某些更尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：22、23和24的三条轻链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条轻链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)，且包含SEQ ID NO：19、20和21的三条重链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(例如，上述每一条重链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)。
某些更尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：88、89和90的三条轻链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条轻链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)，且包含SEQ ID NO：1、2和3的三条重链，或与这些序列中任何一条大体同源的序列(即，上述每一条重链CDR1和CDR2和CDR3中的一条，或与其大体同源的序列)。
某些尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：1的重链CDR1结构域，SEQ ID NO：2的重链CDR2结构域，和SEQ ID NO：3的重链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列，和/或包含SEQ ID NO：4的轻链CDR1，SEQ ID NO：5的轻链CDR2，以及SEQ ID NO：6的轻链CDR3，或与任何一条上述序列大体同源的序列。
某些尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：7的重链CDR1结构域，SEQ ID NO：8的重链CDR2结构域，和SEQ ID NO：9的重链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列，和/或包含SEQ ID NO：10的轻链CDR1，SEQ ID NO：11的轻链CDR2，和SEQ ID NO：12的轻链CDR3，或与任何一条上述序列大体同源的序列。
某些尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：13的重链CDR1结构域，SEQ ID NO：14的重链CDR2结构域，和SEQ ID NO：15的重链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列，和/或包含SEQ ID NO：16的轻链CDR1，SEQ ID NO：17的轻链CDR2，和SEQ ID NO：18的轻链CDR3，或与任何一条上述序列大体同源的序列。
某些尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：19的重链CDR1结构域，SEQ ID NO：20的重链CDR2结构域，和SEQ ID NO：21的重链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列，和/或包含SEQ ID NO：22的轻链CDR1结构域，SEQ ID NO：23的轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO：24的轻链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列。
某些尤其优选的抗体包含SEQ ID NO：1的重链CDR1结构域，SEQ ID NO：2的重链CDR2结构域，以及SEQ ID NO：3的重链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列，和/或包含SEQ ID NO：88的轻链CDR1结构域，SEQ ID NO：89的轻链CDR2结构域，以及SEQ ID NO：90的轻链CDR3结构域，或与任何一条上述序列大体同源的序列。
在另一实施方案中，发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中，所述重链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变重((VH)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH CDR3。
在本实施方案的一个优选方面，一个或多个上述轻链可变区CDR选自：
(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VL CDR1
(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL CDR3。更优选地，所述轻链可变区CDR的两条或三条选自以上集合。在本实施方案中还提供包含与一个或多个上述序列大体同源的序列的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的可变重((VH)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VH CDR3。
在本实施方案的一个优选方面，一个或多个所述轻链可变区CDR选自：
(i)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VL CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL CDR3。更优选地，所述轻链可变区CDR中的两条或三条选自以上的集合。在本实施方案中还提供含有与一个或多个与上述序列大体同源的序列的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH CDR3。
在本实施方案的一个优选方面，一个或多个所述轻链可变区CDR选自：
(i)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL CDR1
(ii)具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VL CDR3。更优选地，所述轻链可变区CDR的两条或者三条选自集合。在本实施方案中还提供含有与一条或者多条与上述序列大体同源的序列的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH CDR3。
在本实施方案的一个优选方面，一个或多个所述轻链可变区CDR选自：
(i)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL CDR3。更优选地，所述轻链可变区CDR的两条或者三条选自集合。在本实施方案中还提供含有与一条或者多条上述序列大体同源的序列的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH CDR3。
在本实施方案一个优选的方面，一个或多个所述轻链可变区CDR选自：
(i)具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的VL CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的VL CDR3。更优选地，所述轻链可变区CDR的两条或者三条选自集合。在本实施方案中还提供含有与一条或者多条上述序列大体同源的序列的抗体。
本发明某些进一步优选的实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含：含有SEQ ID NO：1、2或3中的一条、两条或者三条重链CDR、或与SEQ ID NO：1、2或3中一条或多条大体同源的序列的VH结构域，和/或含有SEQ ID NO：4、5或6中一条、两条或三条轻链CDR、或与SEQ ID NO：4、5或6中一条或者多条大体同源的序列的VL结构域。
本发明某些进一步优选的实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含：含有SEQ ID NO：7、8或9中一条、两条或者三条重链CDR、或与SEQ ID NO：7、8或9中一条或者多条大体同源的序列的VH结构域，和/或含有SEQ ID NO：10、11或12中一条、两条或者三条轻链CDR、或与SEQ ID NO：10、11或12中一条或者多条大体同源的序列的VL结构域。
本发明某些进一步优选的实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含：含有SEQ ID NO：13、14或15中一个、两个或者三个重链CDR、或与SEQ ID NO：13、14或15中一条或者多条大体同源的序列的VH结构域，和/或含有SEQ ID NO：16、17或18一个、两个或者三个轻链CDR、或与SEQ ID NO：16、17或18中一条或者多条大体同源的序列的VL结构域。
本发明某些进一步优选的实施方案提供了与CXCR4相结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含：含有SEQ ID NO：19、20或21中一个、两个或者三个重链CDR、或与SEQ ID NO：19、20或21中一条或者多条大体同源的序列的VH结构域，和/或含有SEQ ID NO：22、23或24中一个、两个或者三个轻链CDR、或与SEQ ID NO：22、23或24中一条或者多条大体同源的序列的VL结构域。
本发明某些进一步优选的实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含：含有SEQ ID NO：1、2或3中一个、两个或者三个重链CDR、或与SEQ ID NO：1、2或3中一条或者多条大体同源的序列的VH结构域，和/或含有SEQ ID NO：88、89或90中一个、两个或者三个轻链CDR、或与SEQ ID NO：88、89或90中一条或者多条大体同源的序列的VL结构域。
在优选的实施方案中，一个、两个或三个轻链CDR为SEQ ID NO：4、5和6，或者88、89和90所定义，和/或一个、两个或三个重链CDR为SEQ ID NO：1、2和3所定义。
本发明某些进一步优选的实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：69、71、73或75的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VH结构域，和/或具有SEQ ID NO：70、72、74、76或103的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VL结构域。
进一步优选实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：69、71、73或75的氨基酸序列的VH结构域，和含有三个轻链CDR的VL结构域。优选的所述轻链CDR具有SEQID NO 4、5和6；或10、11和12；或16、17和18；或22、23和24；或88、89和90。
进一步优选实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VH结构域，和/或具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VL结构域。
进一步优选实施方案提供了与CXCR4相结合且具有不诱导CXCR4表达细胞明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VH结构域、或与其大体同源的序列，和/或具有SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VL结构域、或与其大体同源的序列。
进一步优选实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：73的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VH结构域，和/或具有SEQ ID NO：74的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VL结构域。
进一步优选实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：75氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VH结构域，和/或一个具有SEQ ID NO：76氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VL结构域。
进一步优选实施方案提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VH结构域，和/或具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VL结构域。
特别优选的抗体包含具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VH结构域，和/或具有SEQ ID NO：103或70的氨基酸序列、或与其大体同源的序列的VL结构域。
在又一优选实施方案中，本发明提供了与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，该抗体包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列(在此也将所述抗体称为C-9P21 scFv)，SEQ ID NO：46的氨基酸序列(在此也将所述抗体称为B-1M22scFv)，SEQ ID NO：57的氨基酸序列(在此也将所述抗体称为C-1I24scFv)，SEQ ID NO：68的氨基酸序列(在此也将所述抗体称为D-1K21scFv)，或SEQID NO：101的氨基酸序列(在此也将所述抗体称为9N10scFv)，或包含与CXCR4结合且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的任何所述序列的片段，或与任何一个以上序列大体同源的序列。
特别优选的是基于C-9P21或C-9N10序列的抗体
本发明通过单克隆抗体C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10来举例说明，它们的单链形式示于表1、2、3、4和5中(分别为SEQ ID NO：35、46、57、68和101)。抗体C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10的全长IgG结构已经制得并且它们的序列分别示于表6、7、8、9和10中。C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10抗体的CDR结构域、VH和VL结构域示于表1到5和图1到5中。本发明的优选方面为包含这些CDR结构域或VH和VL结构域(或与其大体同源的序列)的抗体。特别优选的是基于C-9P21或9N10序列的抗体。
本发明一个优选的实施方案是包含SEQ ID NO：35或由其组成的C-9P21抗体的scFv形式，其优选由SEQ ID NO：34编码。更优选地，该抗体包含图1所示氨基酸序列或由其组成并且该抗体优选由图1所示核酸序列编码。
本发明另一个优选的实施方案是包含SEQ ID NO：46或由其组成的B-1M22抗体的scFv形式，其优选由SEQ ID NO：45编码。更优选地，该抗体包含图2所示氨基酸序列或由其组成，并且该抗体优选由图2所示核酸序列编码。
本发明另一个优选的实施方案是包含SEQ ID NO：57或由其组成的C-1I24抗体的scFv形式，其优选由SEQ ID NO：56编码。更优选地，该抗体包含图3所示氨基酸序列或由其组成，并且该抗体优选由图3所示核酸序列编码。
本发明另一个优选的实施方案是包含SEQ ID NO：68或由其组成的D-1K21抗体的scFv形式，其优选由SEQ ID NO：67编码。更优选地，该抗体包含图4所示氨基酸序列或由其组成，并且该抗体优选由图4所示核酸序列编码。
本发明另一个优选的实施方案是包含SEQ ID NO：101或由其组成的9N10抗体的scFv形式，它优选由SEQ ID NO：100编码。更优选地，该抗体包含图5所示氨基酸序列或由其组成，并且该抗体优选由图5所示核酸序列编码。
其它优选实施方案是C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10抗体的IgG形式，优选为全长IgG形式。最优选的是这些抗体中任何一种的IgG形式。
因此，本发明的另一个优选实施方案是全长IgG抗体，该抗体包含SEQ ID NO：108(氨基酸)的重链和/或SEQ ID NO：109(氨基酸)的轻链。同样优选的是包含由SEQ ID NO：106编码的重链和/或由SEQ ID NO：107编码的轻链的IgG抗体。当然可以理解完整的IgG抗体包含两条大体相同的重链和两条大体相同的轻链。
本发明另一个优选实施方案是含有SEQ ID NO：112(氨基酸)重链和/或SEQ IDNO：113(氨基酸)轻链的全长IgG抗体。同样优选的是含有由SEQ ID NO：110编码的重链和/或由SEQ ID NO：111编码的轻链的IgG抗体。
本发明另一个优选实施方案是含有SEQ ID NO：116(氨基酸)重链和/或SEQ IDNO：117(氨基酸)轻链的全长IgG抗体。同样优选的是含有由SEQ ID NO：114编码的重链和/或由SEQ ID NO：115编码的轻链的IgG抗体。
本发明另一个优选实施方案是含有SEQ ID NO：120(氨基酸)重链和/或SEQ IDNO：121(氨基酸)轻链的全长IgG抗体。同样优选的是含有由SEQ ID NO：118编码的重链和/或由SEQ ID NO：119编码的轻链的IgG抗体。
本发明另一个优选实施方案是含有SEQ ID NO：108(氨基酸)重链和/或SEQ IDNO：125(氨基酸)轻链的全长IgG抗体。同样优选的是含有由SEQ ID NO：106编码的重链和/或由SEQ ID NO：123编码的轻链的IgG抗体
特别优选的是基于C-9P21或9N10序列的抗体。
本发明另一实施方案中，VH CDR1具有或者包含SEQ ID NO：126(S/G Y X3M/I H/S)或SEQ ID NO：127(X1 Y X3 M H)或SEQ ID NO：128(S Y X3 M H)的氨基酸序列。
在这些实施方案中，X1可能是S或G，优选是S。X3可能是任何氨基酸，优选是G或W或Y或A，更优选是W。本实施方案的优选VH CDR1序列是SEQ ID NO：1、7、13或19。特别优选的VH CDR1具有或者包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
本发明另一实施方案中，VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO：129(X1 I X3 X4 DG S X8 X9 X10 Y A D S V K G)的氨基酸序列。在这些实施方案中X1、X3、X4、X8、X9和X10可以是任何氨基酸。优选这些X残基中的一个或多个、最优选全部选自：X1是V或R(优选R)，X3是S或N(优选N)，X4是Y或S(优选S)，X8是N或S(优选S)，X9是K或T(优选T)和X10是Y或S(优选S)。因此，优选的VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO：130(V/R I S/N Y/S D G S N/S K/T Y/S Y A D S V K G)的氨基酸序列。例如，本实施方案优选的VH CDR2具有或包含SEQ ID NO：2或14。SEQID NO：2是特别优选的。
在本发明的另一实施方案中，VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO：131(X1 IX3 P X5 X6 G X8 X9 N Y A Q K F Q G)的氨基酸序列。在这些实施方案中X1、X3、X5、X6、X8和X9可以是任何氨基酸。优选这些X残基中的一个或多个、更优选全部选自：X1是R或G(优选R)，X3是N或I(优选N)，X5是N或I(优选N)，X6是S或F(优选S)，X8是G或T(优选G)以及X9是T或A(优选T)。因此，优选的VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO：132(R/G I N/I P N/I S/F G G/T T/A N Y A Q K F Q G)的氨基酸序列。例如，本实施方案的优选VH CDR2具有或包含SEQ ID NOs：8和20。SEQ ID NO：20是特别优选的。
由于本发明抗体的不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的能力(关于CXCR4抗体前面没有被描述的能力)，认为本发明抗体可以结合到已知抗-CXCR4抗体的不同表位(例如，保护CXCR4+细胞以免凋亡的表位或不参与凋亡机制或不触发凋亡，但仍参与配体对CXCR4结合的表位)。
因此，还提供用于与CXCR4结合的可以与任何本文所述抗体竞争的抗体((例如C-9P21、C1I24、D-1K21、B-1M22或9N10)。
本文所使用的术语“竞争抗体”是指作为“参考抗体”的与几乎、大体上或基本上相同、或甚至相同的表位相结合的抗体。“竞争抗体”包括具有重叠表位特异性的抗体。因此，竞争抗体能够有效地与一个用于结合到CXCR4的参考抗体竞争。优选地，竞争抗体能结合到作为参考抗体的相同表位。或者，竞争抗体优选具有与参考抗体相同的表位特异性。
本文所使用的“参考抗体”是可以结合到人类CXCR4胞外域的表位的抗体，该抗体具有本文定义的一个或多个CDR序列，优选本文定义的VH和VL结构域，更优选本文定义的SEQ ID NO：69的VH和SEQ ID NO：70的VL，或SEQ ID NO：71的VH和SEQ ID NO：72的VL，或SEQ ID NO：73的VH和SEQ ID NO：74的VL，或SEQ ID NO：75的VH和SEQ ID NO：76的VL，或SEQ ID NO：69的VH和SEQ ID NO：103的VL。更优选的参考抗体选自C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10。
因为已经提供了诸如C-9P21、B-1M22，、C-1I24、D-1K21和9N10的参考抗体，所以一个或多个竞争抗体的识别是一个简单明了的技术性问题。由于竞争抗体的识别是通过与参考抗体比较而确定，所以应理解实际上确定任何一个或两个抗体所结合的表位，无论如何对于识别竞争抗体都是不需要的。然而，如果希望，表位作图可用标准技术来进行。
举例而言，此处提及以下识别和定义表位的方法。CXCR4的氨基酸序列是已知的，因此合成肽可以用于表位作图，例如，用Pepscan测定。定向诱变在表位作图中也是一个有力的工具，且能用于评估在免疫复合物形成中单个氨基酸的作用。蛋白质足迹法依赖于表位在作为抗体-抗原复合物被结合时被保护以免分裂的事实。酶联免疫吸附测定(ELISA)和血细胞凝集和狭缝印迹也可以用于表位作图。抗原与抗体的结晶作用可以用于非线性表位作图。这些方法的执行方案被广泛使用，且技术人员意识到其将成为表位作图适宜的替代方法。
利用任何一种能评估抗体竞争的免疫筛选试验都能容易地确定竞争抗体的识别。所有这些实验在本领域是常规的，且在本文进一步详细地描述。美国专利No.6,342,219、No.6,524,583、No.7,056,509、No.6,887,468、No.6,342,221、No.6,676,941、No.6,703,020和No.6,416,758中的每一个均以引用方式并入本文，目的在于包括对关于怎样识别竞争抗体的本教示内容的更进一步补充。
例如，在待检查的测试抗体来自不同来源的动物、或甚至不同的同种型的情况下，可以采用简单竞争试验，其中在参考和测试抗体被混合(或预-吸附)，且应用于含CXCR4组合物，优选应用于表达CXCR4的细胞、展示CXCR4的噬菌体、或含固定化CXCR4的生物芯片。基于ELISA的方法尤其适用于这种简单竞争研究。
在某些实施方案中，可以在应用到抗原组合物之前将参考抗体(例如C-9 P21、C1I24、D1K21、B-1M22或9N10)与不同数量的测试抗体(例如1∶10、1∶100或1∶1000)预混合一段时间。在其它实施方案中，参考抗体和不同数量的测试抗体可以在暴露于抗原组合物期间被简单混合。无论如何，通过使用物种或同种型二级抗体，将仅能够检测结合的参考抗体，其结合将被“竞争”结合的测试抗体的存在所减弱。
在进行参考抗体和任何测试抗体(不考虑物种和同种型)之间的抗体竞争研究中，可以首先用可检测的标记(如生物素或酶的或放射的标记)标记参考物(如C-9P21、C1I24、D1K21、B-1M22或9N10)来实现后续识别。在这些情况下，可将标记的参考抗体与待检测的测试抗体以各种比例(例如1∶10、1∶100或1∶1000)预混合或培育，且然后(任选在一段适当时间之后)分析标记的参考抗体的反应性并将其与对照值(其中在培育中不包括潜在竞争测试抗体)进行比较。
该试验可以是基于抗体结合的一系列免疫检测中的任何一种，且可以通过检测它们的标记来检测参考抗体，例如通过以下方式：在生物素化抗体的情况下使用链霉亲和素，或者将显色底物与酶标记(例如带有过氧化物酶的3，3’5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物)一起使用，或者仅检测放射性标记。与用于结合到CXCR4的参考抗体竞争的抗体将有效或明显降低参考抗体对CXCR4的结合，这由结合标记的减少而证明。
在缺乏完全无关抗体的情况下，(标记的)参考抗体的反应性为对照高值。当竞争出现并减少标记抗体的结合时，可通过培育标记的参考(例如C-9 P21、C1I24、D1K21、B-1M22或9N10)抗体与未标记的完全相同类型的抗体来获得对照低值。在测试试验中，在测试抗体存在下标记抗体反应性明显降低，这表明测试抗体与用于结合到CXCR4的标记抗体竞争。
明显降低是“可重复的”，即，一直认为，在结合中减弱。就本申请而言，“明显降低”定义为在大约1∶10到1∶100之间的任何比例下，至少约20％、更优选至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％、甚至更优选至少约70％、约75％或约80％的可重复的降低(在ELISA或其它适宜试验中，参考抗体对CXCR4的结合)。具有甚至更严格竞争活性的抗体将表现出在约1∶10到1∶100之间的任何比率下，至少约82％、约85％、约88％、约90％、约92％或约95％的可重复的降低(在ELISA或其它适宜试验中，参考抗体对CXCR4的结合)。尽管并不需要实践本发明，但当然不排除完全或几乎完全的竞争，例如表现出参考抗体对CXCR4的结合可重复地降低约99％、约98％、约97％、约96％的。
上述方法仅仅是合适竞争试验的例子。技术人员将认识到其它合适的方法和变型。下面描述替代性竞争试验。
在用流式细胞仪进行替代性竞争试验之前，一定数量的测试抗体应该被标记(例如通过生物素化)。确定生物素化产物的功能性(细胞结合性的保留)以及提供针对固定量CXCR4+细胞的次最大结合的本发明生物素化抗体的最小浓度。总共106个细胞从指数增长培养物中收获，且用各种抗体浓度以适宜的温度培育适宜的时间，如4℃下培育1小时。洗涤细胞且用适宜的检测抗体以适宜的温度培育适宜的时间，例如，再在4℃下培育1小时。洗涤后，用流式细胞仪分析所述细胞。对于每一个测试抗体，从资料中，通过针对抗体浓度绘制中值荧光强度(MFI)，由数据产生饱和曲线。
对于替代性竞争试验，CXCR4+细胞如上制备，且利用固定浓度的标记(生物素化的)抗体(bio-Ab1)和递增浓度的未标记竞争抗体的混合物进行一式两份的处理。固定浓度是针对如上确定的固定量肿瘤细胞产生合理荧光信号的抗体的最小浓度。理论上，固定浓度(nM)应该低于待测试抗体在平衡(KD)下的亲和力。在该情况下，所述方法能用于评估竞争抗体的亲和力(Schodin and Kranz，1993，Binding affinity andinhibitory properties of a single-chain anti-T cell receptor antibody.J Biol Chem 268：25722-7)。抗体混合物用靶标细胞以适宜的温度培育适宜的时间，例如，4℃下培育1小时。洗涤细胞并且通过用FITC-标记链霉亲和素培育来展现生物素化抗体的细胞结合。从每一个测试样品的中值荧光读数减去背景荧光(PBS-5％FCS)后，根据以下公式计算每个Ab2浓度“c”的抑制百分数：
％抑制＝(1-MFIbio-Ab1+Ab2”c”/MFIbio-Ab1)x100
进行计算。
考虑了可与CXCR4结合和可与任何本文所述抗体竞争的任何抗体，但优选抗体在下文陈述。因此，在一些优选实施方案中，提供以下内容：
与人类CXCR4的胞外域的表位结合且优选具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述轻链可变区包含
(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的可变轻(VL)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重链可变区包含
(iv)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(v)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
与人类CXCR4的胞外域的表位结合且优选具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的可变轻(VL)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重链可变区包含：
(iv)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(v)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
与人类CXCR4的胞外域的表位结合且优选具有不诱导CXCR4表达细胞明显凋亡的性质的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的可变轻(VL)CDR1
(ii)具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重链可变区包含：
(iv)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(v)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
与人类CXCR4的胞外域的表位结合且优选具有不诱导CXCR4表达细胞明显凋亡的性质的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的可变轻(VL)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重链可变区包含：
(iv)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1，
(v)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
与人类CXCR4的胞外域的表位结合且优选具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：
(i)具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列的可变轻(VL)CDR1，
(ii)具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重链可变区包含：
(iv)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变重(VH)CDR1
(v)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
在一个实施方案中，抗体
(a)具有SEQ ID NO：69的VH结构域和SEQ ID NO：70的VL结构域，或
(b)具是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
在一个实施方案中，抗体
(a)具有SEQ ID NO：71的VH结构域和SEQ ID NO：72的VL结构域，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
在一个实施方案中，抗体
(a)具有SEQ ID NO：73的VH结构域和SEQ ID NO：74的VL结构域，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
在一个实施方案中，抗体
(a)具有SEQ ID NO：75的VH结构域和SEQ ID NO：76的VL结构域，或
(b)是可与用于结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
在一个实施方案中，抗体
(a)具有SEQ ID NO：69的VH结构域和SEQ ID NO：103的VL结构域，或
(b)是可与结合到CXCR4的抗体(a)竞争的抗体。
优选地，抗体(b)具有本为所述的一个或者多个CDR序列、VH结构域和/或VL结构域。
优选地，抗体(b)可结合到与抗体(a)相同的表位。
大体同源的序列的某些例子是指与所公开的氨基酸序列具有至少70％同一性的序列。在某些实施方案中，结合到CXCR4且具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质的本发明抗体包含至少一条轻链可变区，该可变区包括与SEQ ID NO：70、72、74、76或103的氨基酸序列存在至少约75％、更优选至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％或95％且最优选至少约97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；和/或至少一条重链可变区，该可变区包括与SEQ ID NO：69、71、73或75的氨基酸序列存在至少约75％、更优选的至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％或95％、且最优选的至少约97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
大体同源序列的其它优选例子是指含有对所公开氨基酸的保守氨基酸取代的序列。
大体同源序列的其它优选例子是在一个或多个所公开CDR区中含有至多1个、2个、3个或4个、优选至多1个或2个改变的氨基的序列。此类改变可能是保守的或非保守的氨基酸取代，或它们的组合。
在所有此类实施方案中，优选的改变是保守的氨基酸取代。
在所有实施方案中，包含大体同源序列的抗体保留与CXCR4结合的能力，且优选地保留本文所述的一种或多种其它性质中的，例如，不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质和/或拮抗的性质。
本发明的其它实施方案提供结合蛋白，该蛋白与CXCR4结合且优选具有本文所述的一种或多种其它性质，例如，具有不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡的性质和/或拮抗的性质，且包含本发明的抗体，本发明的VH或VL结构域，或本发明的一个或多个CDR。在优选的实施方案中，这种结合蛋白是抗体。
本发明的优选抗体包含至少一条含有三个CDR的重链可变区和至少一条含有三个CDR的轻链可变区。这些CDR的示例性和优选序列在本文描述。
如本文所用，除非另外说明或与科学术语进行区分，否则简明术语“CXCR4”意思是CXC趋化因子受体4(也称为融合素，HM89、LESTR或HUMSTR)。
CXCR4可以是游离CXCR4(如重组或纯化CXCR4)，但优选其为以天然形式存在，例如，存在于细胞表面上。
本发明的抗体或结合蛋白也可与CXCR4片段结合，特别是包含全部或者部分CXCR4的胞外域或由全部或者部分CXCR4的胞外域组成的片段，或可结合到包含CXCR4或CXCR4片段的实体。事实上，本发明抗体的表位位于CXCR4的胞外域。
“CXCR4”也可以指CXCR4的任何形式，特别是当CXCR4在哺乳动物物种间是保守的时。因此，本发明抗体或者抗体片段可以例如与人、猴(例如食蟹猴或普通猕猴/恒河猴)、小鼠(鼠科动物)、牛(牛科动物)、大鼠、仓鼠、雪貂、豚鼠和/或兔CXCR4结合。优选地，本发明抗体或抗体片段将至少与人CXCR4结合。因此，除非另外说明，否则本文引用的任何“CXCR4”表示的意思是“人CXCR4”。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或者抗体片段至少与人和猴(例如食蟹猴或普通猕猴/恒河猴)CXCR4结合。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段将至少与人和小鼠CXCR4结合。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段至少与人、猴和小鼠CXCR4结合。
如本文所用，在本发明抗体或抗体片段的背景下，术语“与CXCR4结合”或“抗-CXCR4”是指具有以下能力中一种或多种、优选具有以下能力中的一种以上，且最优选具有是以下全部能力的抗体或抗体片段：
(a)例如，通过流式细胞仪或者免疫组化评估能够与在细胞(例如，用CXCR4转染的细胞或者天然表达CXCR4的细胞)表面上表达的CXCR4结合；
(b)例如，通过在非还原条件下在蛋白质印迹(Western blot)中与CXCR4结合来评估能够与构像依赖((如非线性)的CXCR4表位结合；
(c)能够至少与人CXCR4结合，更优选与人和猴CXCR4结合或与人和小鼠CXCR4结合，最优选与人、猴和小鼠CXCR4结合；
(d)能够与人和猴CXCR4能够或以相似亲和力与人和小鼠CXCR4结合，例如其中Kd为10nM或更小，优选为5nM或更小，更优选为3nM或更小，或2nM或更小，例如1nM或更小，如本文另外所讨论；
本发明的优选抗体或抗体片段还具有以下功能性质中的一种或多种，优选具有以下功能性质中的一种以上，且最优选具有全部以下功能性质：
(e)不诱导CXCR4表达细胞的明显凋亡；
(f)阻断或抑制CXCR4与其一个或多个配体结合，例如，阻断或抑制CXCR4与至少SDF-1或CXCR4的替代性配体(例如，化合物AMD-3100)结合，且优选地抑制CXCR4与至少SDF-1和AMD-3100两者结合；
(g)阻断或抑制来自CXCR4受体的下游信号事件，例如，抑制对CXCR4配体(如SDF-1)的CXCR4-介导的细胞应答，例如优选地抑制对CXCR4配体(如SDF-1)的钙离子释放应答，或阻断或抑制CXCR4+细胞的配体(例如SDF-1)诱导迁移；
(h)诱导如本文另外所述的CXCR4+细胞的ADCC；
(i)诱导体外抗肿瘤效应；
(j)给药到有肿瘤的动物时对肿瘤定位；
(k)诱导CXCR4+细胞的CDC；
(l)诱导抗病毒效应，尤其是体内或体外抗-HIV效应；
(m)关于CXCR4受体不呈现竞争活性；
在与CXCR4+细胞结合的背景下，应理解本发明抗体可与CXCR4+细胞结合且不明显与CXCR4-细胞结合(如实施例2所示)。
术语“不明显与CXCR4-细胞结合”应理解为抗体与CXCR4-细胞的任何结合不阻止用于诊断或治疗的所述抗体的使用。因此与CXCR4-细胞的“非明显”结合包括这样的情形，即抗体与CXCR4-细胞的结合明显弱于其与一种或多种CXCR4+细胞的结合，或所述结合可以被认为是处于背景)水平，例如，与阴性对照实验中观察到的水平相当或者并无明显不同。
出于治疗或者诊断的目，主要考虑的是抗体与一个或多个类型CXCR4+细胞的结合必须比与任何CXCR4-细胞(抗体可能在治疗和诊断应用期间与其接触)的结合更强。
本发明抗体可以称为“CXCR4-特异性的”。术语“CXCR4-特异性的”应该解释为抗体与CXCR4表达细胞的结合具有足够特异性以允许用于治疗和诊断的所述抗体的使用。如本文所述的CXCR4-特异性抗体具有与CXCR4(如在细胞表面)结合但不与非-CXCR4蛋白明显结合(如不与CXCR4-细胞明显结合)的能力。技术人员可以通过将与靶标CXCR4+细胞(例如，用CXCR4转染且表达CXCR4的细胞，或天然表达CXCR4的细胞，如Ramos细胞、Jurkat细胞、CCRF-CEM细胞、Raji细胞)的结合强度和与一个或多个类型的CXCR4-细胞(如未用CXCR4转化的野生型细胞，如HEK293T细胞或DT40细胞)的结合强度，容易地确定任何给定抗体是否为CXCR4-特异性的。
本领域描述了取决于表达CXCR4的细胞类型，CXCR4具有发展稍微不同的结构的趋势(参见例如Baribaud等人，2001年)。因此，当它们可以与一个或多个用CXCR4转染或天然表达CXCR4的细胞类型结合时，本发明抗体被视为具有与细胞表面上CXCR4结合的能力。优选的抗体具有在多种细胞类型上与CXCR4结合的能力并因此具有结合CXCR4多种结构的能力。例如，本文所述的C-9P21、9N10和C-1124抗体显示了此类能力。
例如，技术人员将了解，用实施例2和3中所述的流式细胞仪和适宜的试验，可以对比CXCR4-细胞评价与CXCR4+细胞的结合。
本领域所熟知的免疫组化技术可用于对抗体与细胞或样品的结合进行评分。这种试验可用于测试具体抗体的特异性，或检测CXCR4在组织样品中的表达。简而言之，例如抗体可例如在一个高密度阵列的人体组织上测试，该组织包括阳性对照物(已知是CXCR4-阳性的细胞)和阴性对照(已知是CXCR4-阴性的细胞)。膜染色强度可以4级标准(0，1，2，3)通过肉眼观察评估。对于CXCR4+组织，优选的抗体得分为微弱或强烈(如0以上的分数)，优选的是强烈免疫组化得分。
如上所述，本发明抗体具有不诱导CXCR4+细胞(CXCR4表达细胞)明显凋亡的性质。所谓术语“不诱导CXCR4+细胞明显凋亡”是指在抗体存在下诱导的凋亡水平与抗体缺乏下诱导的凋亡水平相当或者无明显不同，例如，在生长介质单独存在下处于阴性对照情况或背景水平之下。因此，优选地，本发明抗体不诱导超出凋亡的天然水平、或背景水平、或对照水平的可测量或明显的凋亡增加。这现有技术抗体如WO 2008/060367(如F7)中描述的Medarex抗体形成对比，所述Medarex抗体诱导与在抗体缺乏时观察到的凋亡相比的可测量和明显的凋亡(见本文例10)。优选地，在抗体浓度≥0.4μg/ml时，例如在浓度为或至少0.4μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、75μg/ml以及100μg/ml(优选呈IgG如IgG1形式)时，本发明抗体不诱导明显凋亡。更优选地，当在体外CXCR4+Ramos细胞系上进行评价时(例如利用例10中描述的试验评定)，本发明抗体不诱导明显凋亡。优选地，在浓度≥0.14μg/1x105个细胞时，例如在浓度为或至少0.14μg/1x105细胞、0.25μg/1x105个细胞、0.5μg/1x105个细胞、1μg/1x105个细胞、2μg/1x105个细胞、3μg/1x105个细胞、3.5μg/1x105个细胞、4μg/1x105个细胞、5μg/1x105个细胞、10μg/1x105个细胞、15μg/1x105个细胞、20μg/1x105个细胞、25μg/1x105个细胞、30μg/1x105个细胞和35μg/1x105个细胞时，本发明抗体不诱导明显凋亡，更优选地，细胞为RAMOS细胞。优选地，当以治疗可用浓度使用，例如抗体浓度≥0.4μg/ml，例如浓度为或至少0.4μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml时，本发明抗体不诱导明显凋亡(优选呈IgG，如IgG1形式，优选地，抗体浓度是血清中的抗体浓度)。举例来说，不诱导CXCR4+细胞明显凋亡的抗体是不会导致大于10％的细胞在试验中与抗体一起培育时凋亡的抗体，所述试验将凋亡细胞确定为那些对膜联蛋白V(Annexin V)染色阳性的细胞。优选的试验如实施例10所描述，且涉及使用高达10μg/ml浓度的Ramos细胞和IgG1抗体。或者，不诱导CXCR4+细胞明显凋亡的抗体是这样一种抗体，在该抗体中，高于背景或对照水平的任何凋亡的增加是超过试验中(将调亡细胞定义为那些对膜联蛋白V结合为阳性的细胞)所述背景或对照水平的最大50％的增加。优选试验如例10所述，且涉及使用高达10μg/ml的浓度的Ramos细胞和IgG1抗体。
凋亡的诱导可使用熟知的标准方法来测定，例如测定膜联蛋白V染色(涉及膜联蛋白染色的示例性方法，见实施例10)。简而言之，细胞(如Ramos细胞)可以与抗体(如IgG2形式的抗体)培育适宜的时间，如24小时或48小时，并且，在细胞收获和膜联蛋白V染色之后，可通过FACS分析(如，用EasyCyte)测量效果。膜联蛋白V染色指示凋亡细胞，而死亡细胞可通过例如PI染色进行来识别(并与凋亡细胞区分)。
抗体C-9P21、B-1M22、C-1I24和9N10已经显示能够抑制通过CXCR4的配体诱导信号，例如抑制对CXCR4配体的CXCR4-介导的细胞应答，特别是抑制响应于CXCR4配体如SDF-1的钙离子释放(见实施例6)。因此，本发明抗体优选地能够抑制对CXCR4配体如SDF-1的CXCR4-介导的细胞应答，特别是抑制响应于CXCR4配体如SDF-1的钙离子释放。特别地，抗体优选能够抑制SDF-1诱导的钙通量。适宜的试验方法是已知的并且在例6中公开了一个试验。
对本文所述的各种CXCR4介导的事件例如如来自CXCR4的下游信号事件，通过CXCR4的配体诱导信号，对CXCR4配体的CXCR4介导细胞应答，钙离子释放，配体诱导的迁移等的“阻断”或“抑制”意思是对比在本发明抗体缺乏下，在所述抗体存在下，所讨论的性质以可测量或明显的方式降低。例如，对比在所述抗体缺乏下的结合，在所述抗体存在下，所述性质可以降低至少10％、20％、30％、或40％，更优选至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，甚至更优选至少80％。对于某些性质，预期降低至少85％、90％或95％。
在阻断或抑制钙离子释放(钙通量)的情况下，伴随本发明抗体上升到至少70％、75％、80％或95％抑制，常常发现钙离子释放至少20％或30％的抑制(见实施例6)。用于达到这种抑制的抗体的示例性浓度是4μg/ml、10μg/ml或100μg/ml。在本发明的某些实施方案中，能够导致体外CXCR4+细胞(例如CCRF-CEM细胞)的钙离子释放的50％抑制，的抗体浓度(IC50)优选为至少50nM、40nM、35nM或30nM(或任何30和50之间的整数)、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM或5nM(或任何5和30之间的整数)。例如，已经显示本发明C-9P21抗体具有对CCRF-CEM细胞的29nM的IC50。已经显示9N10抗体具有对CCRF-CEM细胞的3.85nM的IC50。
在某些实施方案中，抗体可以阻断或抑制CXCR4+细胞朝着CXCR4配体(如SDF-1)的迁移或趋化作用(见实施例7)。迁移和趋化作用的抑制可用标准方法例如使用transwell试验来分析，。简而言之，能够趋化且表达CXCR4的细胞在一个腔室内与抗体接触，并且在另一个腔室内，通过具有适宜孔径的过滤膜，将CXCR4的配体例如SDF-1与第一腔室隔开。通过将抗体存在下的趋化作用与抗体缺乏下的趋化作用进行比较，确定抗体在细胞朝着配体迁移中(趋化作用)的作用。适宜的试验在实施例7描述。取决于抗体的浓度，发现迁移的至少50％和高达100％抑制。
在本发明的某些实施方案中，能够导致体外CXCR4+细胞(例如CCRF-CEM细胞)的细胞迁移的50％抑制的抗体浓度(IC50)优选为至少20μg/ml、15μg/ml(或15到20之间的任何整数)、10μg/ml(或10和15之间的任何整数)、5μg/ml(5和10之间的任何整数)、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml或1μg/ml.。例如，本发明的C-9P21抗体显示具有对CCRF-CEM细胞的2.9μg/ml的IC50。在本发明某些实施方案中，抗体能够在体外于5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml或30μg/ml (或6和30μg/ml之间的任何整数)下实现100％抑制。
优选地，本发明的抗体(如C-9P21，C-1I24，D-1K21，B-1M22和9N10)能够抑制CXCR4与一个或多个其配体结合。优选地，至少抑制与SDF-1的结合。更优选地，抑制与SDF-1和AMD-3100的结合。例如，抗体C-9P21、C-1I24、9N10和D-1K21已经显示能够抑制CXCR4与其配体(SDF-1)结合(实施例3)。抗体C-9P21、C-1I24和D-1K21也已经显示能够抑制CXCR4与AMD-310结合(实施例3)。考虑到它们对钙通量的作用，可以认为B-1M22也与用于结合到CXCR4上的配体竞争。
所谓“阻断配体与CXCR结合”或“抑制配体与CXCR结合”是指配体与CXCR4的结合以可测量或明显的方式降低，例如，比较抗体缺乏下的结合，在抗体存在下的结合降低至少0％、20％、30％、或40％，更优选降低至少45％、50％55％60％65％70％或75％，甚至更优选降低至少80％。也考虑了配体与CXCR4的结合降低至少85％、90％或95％的实施方案。或者，当配体首先与CXCR4接触且随后添加抗体时，配体能够抑制抗体与CXCR4结合。
确定抗体是否能抑制配体与CXCR4结合的试验是众所周知的，且对本领域技术人员来说显而易见。适宜的试验在实施例3中描述。简而言之，CXCR4+细胞用SDF-1(或AMD-3100，如果合适)或不用SDF-1(或AMD-3100，如果合适)培育，然后添加抗体并且用标记的抗人类抗体检测所述抗体。对于具有抑制配体与CXCR4结合的能力的抗体，在SDF-1(或AMD-3100，如果合适)存在下预培育导致与CXCR4结合的抗体减少。特别地，抑制抗体与天然表达CXCR4的且与SDF-1或AMD-3100一起预培育的Ramos细胞、Jurkat细胞或CCRF-CEM细胞的结合。或者，同时将被测试抗体作为配体加入到细胞中，或可以首先添加抗体。
用于确定抗体是否能阻断配体与CXCR4结合的替代试验包括使用标记配体，例如放射性标记的配体。
尽管不是本发明抗体主要的作用机制，但本发明抗体优选地具有诱导CXCR4+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。可以使用本领域众所周知的方法在体外测定ADCC。适宜的方法在实施例8中描述，在方法中，CXCR4+细胞，例如CCRF-CEM细胞，用荧光标记进行标记以评价在PBMC存在下的ADCC溶解。或者，例如，可以使用铬-51释放试验。因此，本发明抗体可以例如在体外，例如，在人类PBMC存在时，导致CXCR4+细胞的至少10％、15％、20％、22％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％致死。还包括可诱导100％或激活100％致死的抗体。例如，在一些实验中，B-1M22抗体已经显示能诱导100％(考虑到实验误差，或几乎100％)的致死(见实施例8，其中在人PBMC和B-1M22抗体存在下，诱导CXCR4+细胞系CCRF-CEM的基本100％致死)。另外，在IgG水平下，抗体C-9P21和C-1I24已经显示在人PBMC存在下导致CXCR4+细胞系CCRF-CEM的至少50％、55％或60％致死，抗体D-1K21已显示在人类PBMC存在下导致CXCR4+细胞系CCRF-CEM的15％、20％或25％致死(见实施例8)。
尽管不是本发明抗体的主要作用机制，但ADCC有利于一些应用，特别是一些治疗性应用。因此，在优选的实施方案中，抗体可以在PBMC存在下诱导CXCR4+细胞的ADCC，优选诱导CXCR4+肿瘤细胞。在其它实施方案中，抗体极少诱导ADCC或诱导不明显的ADCC。
就完成这种ADCC水平所需的抗体浓度而言，本发明抗体还优选显示为适当有效力的。另外，适宜的体外测试在实施例8中描述。
因此，用于体外CXCR4+细胞(例如，CCRF-CEM细胞)半数最大细胞溶解(EC50)所需的抗体浓度优选小于2000ng/ml、1500ng/ml、1000ng/ml、700ng/ml、650ng/ml、620ng/ml、600ng/ml、550ng/ml、500ng/ml、450ng/ml、400ng/ml、350ng/ml、300ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、125ng/ml、100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、7ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml或0.25ng/ml。例如，在IgG水平下，本发明的C-9P21抗体已显示对于CCRF-CEM细胞的1852ng/ml的EC50，并且本发明的C1I24抗体已显示对于CCRF-CEM细胞的49.2ng/ml的EC50。本发明抗体D-1K21已显示具有79.9ng/ml的EC50，并且本发明抗体B-1M22已显示具有115.7ng/ml的EC50。
在一些实施方案中，抗体可诱导CXCR4+细胞的补体依赖细胞毒性(CDC)，但在其它一些实施方案中，所述抗体不能诱导CDC。例如，抗体B-1M22和C1I24，特别是C-1I24，已显示出诱导CXCR4+细胞(例如在Ramos细胞中)的CDC的良好能力(见实施例9)。
CDC的诱导可以用众所周知的标准方法测定，例如，通过荧光标记来对CXCR4+细胞如Ramos细胞进行标记以评价在人血清存在下的CDC溶解。适宜的试验在实施例9中描述。
其它优选的性质包括在施用本发明抗体时体内缺乏明显的毒性以及体内缺乏其它明显的副作用。
优选地，当与适当的对照水平相比较时，在可测量或明显的水平上且更优选在统计显著水平上观察到本文所述能力。
一些抗体能够被内化入它们与之结合的细胞中。因此，在本发明的一些实施方案中，抗体能够被内化。因为连接至抗体的任何其它试剂与抗体分子被内化，所以这种性质特别有利于在免疫轭合物中使用。在其它实施方案中，未发现明显的内化。
技术人员将知道测定内化的适宜方法，例如，在流式细胞仪或共聚焦显微镜上使用温度差荧光标记。适宜的测定的例子涉及到pH-敏感染料(如CypHer5E)标记的二级抗体，该pH-敏感染料在碱性pH值下为最小荧光(在细胞外发现)并在酸pH值下为最大荧光(在细胞内发现)。
术语“CXCR4的配体”包括CXCR4的天然配体，如SDF-1，该SDF-1可天然产生、重组表达或在实验室中合成。该术语也包括CXCR4的非天然或者人工设计的配体，如可与CXCR4相结合的AMD-3100。
所谓″CXCR4+细胞″或″CXCR4表达细胞″意为在其表面上表达CXCR4、尤其为至少大体上呈其野生型构象的细胞。CXCR4+细胞可能是天然CXCR4阳性的，或者它们可以是表达重组CXCR4的转化体。
因此，根据本发明，可以制作一系列的抗CXCR4抗体并用于各种实施方案，包括用于治疗本文另外讨论的任一病症，特别是癌症(包括转移癌)，自身免疫病症，炎症病症和感染(，尤其是病毒性感染例如HIV)。
除非在随后特别说明了上限的情况下，否则在整个申请使用的术语“一个(a或an)”用于表示″至少一个″，″至少第一个″，″一个或多个″，或“数个″提及的成分或步骤。因此，本文所用的″抗体″意味着″至少第一个抗体″。可行的限制和参数的组合，如任何单一药剂的用量，将是所属领域的技术人员可以根据本发明了解的。
本发明的优选实施方案是包含本发明的至少一种抗CXCR4抗体、或其抗原结合片段的组合物。
包含编码本文中定义的本发明的抗体或其部分或其片段的核苷酸序列的核酸分子、或与其大体同源的核酸分子形成于本发明的其它方面。优选的核酸分子包含这样的序列，其编码在SEQ ID NO：35(其优选由SEQ ID NO：34编码)、SEQ NO：ID：46(其优选由SEQ ID NO：45编码))、SEQ ID NO：57(其优选由SEQ ID NO：56编码)、SEQ ID NO：68(其优选由SEQ ID NO：67编码)或SEQ ID NO：101(其优选由SEQ ID NO：100编码)中列出的氨基酸序列。其它优选的核酸分子包含编码重链可变区(VH)的序列，所述重链可变区(VH)具有SEQ ID NO：69、71、73或75的氨基酸序列(其优选由SEQ ID NO：77、79、81或者83编码)，和/(或)包含编码轻链可变区(VL)的序列，所述轻链可变区(VL)具有SEQ ID NO：70、72、74、76或103的氨基酸序列(其优选由SEQ ID NO：78、80、82、84或者105编码)。更优选的是编码以下组合的核酸：SEQ ID NO：69和70；或SEQ ID NO：71和72；或SEQ ID NO：73和74；或SEQ ID NO：75和76；或SEQ ID NO：69和103。还优选的核酸分子包含以下组合：SEQ ID NO：77和78；或SEQ ID NO：79和80；或SEQ ID NO：81和82；或SEQ ID NO：83和84；或SEQ ID NO：77和105。
其它优选的核酸分子包含编码本发明抗体的IgG形式(例如实施例4中所述那些)、或鼠嵌合形式的序列。
如上文所述，本发明所涵盖的其它核酸分子是编码本发明的人抗体的部分或片段的那些，例如，编码抗体的重链可变区(VH)的那些(例如，编码SEQ ID NO：69、71、73或75的那些，例如分别为SEQ ID NO：77、79、81或83)或编码抗体的轻链可变区(VL)(例如，那些编码SEQ ID NO：70、72、74、76或103的那些，例如分别为SEQ ID NO：78、80、82、84或105)。其它优选的核酸分子为编码本发明的抗体的重链的那些(例如，编码SEQ ID NO：108、112、116或120的那些，例如分别为SEQ ID NO：106、110、114或118)或编码抗体的轻链的那些(例如，编码SEQID NO：109、113、117、121或125的那些，分别为SEQ ID NO：107、111、115、119或123)。
因此，本文定义的本发明的抗体的片段、或与其大体同源的序列、或者包含编码此类片段的序列的核酸分子形成本发明的另一个方面。
有利地，当呈IgG形式时，本发明的抗体有较高的CXCR4结合亲和力，即其Kd为1×10-8M或1×10-9M或更少。重要的是，具有此类亲和力的抗体处于已证明对治疗有用的确定范畴内。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与人CXCR4和猴CXCR4结合。例如，抗体C-9P21、C1I24、D1K21、9N10和B-1 M 22都有具有此能力。物种之间、特别是人类和通常用作临床前动物模型的物种之间的此类交叉反应性可能是优点，因为它允许从临床前研究到临床使用的更有效变换。例如，具有与所用的具体动物模型中存在的天然CXCR4交叉反应的抗体意味着在此模型中的结果更能反映人类患者的情况，从而允许更加准确评估例如待投入剂量和识别任何潜在的相关或可疑的副作用的增加的可能性。如果抗体对猴和人CXCR4具有类似的亲和力则情况尤其如此。
例如，本发明抗体的结合人CXCR4和猴CXCR4的能力意味着该抗体可以在临床前毒性研究中测试，以评估治疗的不良副作用以及发现合适的耐受剂量。
此外，结合人CXCR4和小鼠CXCR4的能力意味着本发明的这种抗体在小鼠模型(例如，使用免疫活性小鼠的小鼠同系基因模型)中的结果，有更大可能代表此抗体在人类受试者中的活性。其原因是可与人CXCR4结合但不与小鼠CXCR4结合的抗体将与由小鼠模型内的人肿瘤细胞表达的CXCR4结合但不能与内源性鼠CXCR4结合。这当然不同于人类患者的状况，在后者中可能存在肿瘤表达的CXCR4和内源性CXCR4。
这种状况的潜在缺点在于，与人CXCR4结合但不与小鼠CXCR4结合或以明显更低亲和力与小鼠CXCR4结合的抗体可能在免疫缺陷小鼠(例如裸小鼠或SCID小鼠)中的人肿瘤异种移植模型中表现良好，但这可能并未由其中存在更多CXCR4的人类系统()中的类似表现所反映。换句话说，在具有可与人CXCR4结合但不能与小鼠CXCR4结合的抗体的小鼠异种移植模型中观察到的抗肿瘤效应可能看上去比临床实际情况好。相比之下，当使用可以与人和小鼠CXCR4结合的抗体时，该抗体将与小鼠模型系统内CXCR4的所有形式结合并且它可能要更能代表抗体被放置入人体的情况。如果抗体对小鼠和人CXCR4具有类似亲和力则尤其如此。
在优选的实施方案中，本发明的抗体以类似亲和力与人和猴CXCR4结合、或与人和小鼠CXCR4结合、或与人和猴和小鼠CXCR4结合。
所谓″类似亲和力″也意味着抗体对人CXCR4和对一个或多个其它所关注物种(例如猴或小鼠)的结合亲和力是相当的，例如差异不超过20倍。更优选地，结合亲和力之间的差异小于15倍，更优选的是小于10倍，更加优选的是少于5、4、3或2倍。结合亲和力的比较可以通过任何适当的方法进行。对于细胞表面配体例如CXCR4，流式细胞分析方法例如FACS提供一种便捷的比较方法，其中结合曲线和(例如)中位值可以在相同实验中比较。实施例5描述一种适当的方法。
然而，在其它实施方案中，本发明的抗体可能不与猴CXCR4结合和/或它们可能不与小鼠CXCR4结合。
在以下根据本发明的组合物、免疫轭合物、药物、组合、混合药剂、试剂盒、第一和第二个医疗用途和所有方法的描述中，除非另有明确说明或从科学术语中明确表明，否则术语″抗体″和″单克隆抗体″或抗原结合区或其片段是指一系列的抗CXCR4抗体以及特异性C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10抗体。
如本文所用，术语″抗体″和″免疫球蛋白″泛指任何组成人类抗原结合域的免疫结合试剂或分子，其包括多克隆和单克隆抗体。根据重链中的恒定域的类型，所有抗体被指定为五个主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且本发明的抗体可能是这些类别中的任何一个。其中的几个进一步分为亚类或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。对应于不同类别的免疫球蛋白重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构造是众所周知的。
一般来说，当本发明使用整个抗体而不是抗原结合区域时，IgG和/或IgM是优选地，因为它们是生理状况中最常见的抗体并且因为它们最容易在实验室设置中制备。特别优选的是IgG1抗体。
哺乳动物抗体的″轻链″，根据其恒定区的氨基酸序列和其可变结构域的框架区中的一些氨基酸，被指定为两个完全不同类型之一：κ(kappa)和λ(lambda)。本发明的抗体中对κ或λ轻链恒定区的使用并无优选。
如所属领域的技术人员应理解的，术语″抗体″包括的免疫结合试剂扩展到所有抗体和其抗原结合片段，包括整个抗体、二聚、三聚和多聚抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；重组和工程抗体，和其片段。
术语″抗体″因此用于指任何具有抗原结合区的抗体类分子，并且该术语包括组成抗原结合域的抗体片段，例如Fab’，Fab，F(ab′)2，单域抗体(DAB)，TandAbs二聚体、Fv，scFv(单链Fv)，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，微型抗体(minibodies)，二价抗体(diabodies)，双特异性抗体片段，二抗体(bibody)，三抗体(tribody)(scFv-Fab融合，分别为双特异性或三特异性)；sc-二价抗体(sc-diabody)；κ(λ)抗体(kappa(lamda)bodies)(scFv-CL融合)；双特异性T细胞衔接器(Engager(BiTE))(scFv串联以吸引T细胞)；双可变区(DVD)-Ig(双特异性格式)；小的免疫蛋白(SIP)(一类微型抗体)；SMIP(“小模块化免疫药物”scFV-Fc二聚体；DART(双链稳定二价抗体″双亲和力再靶向″)；包含一个或多个CDR的小抗体拟似物等等。
制备和使用各种基于抗体的构造和碎片的技术在本领域中技术是众所周知的(见Kabat et al，1991，其特别以引用方式引入本文)。具体而言，二价抗体在EP404,097和WO 93/11161中进一步描述，而线性抗体则在Zapata et al(1995)中进一步描述。
抗体可以使用常规技术片段化。例如，可以通过胃蛋白酶处理抗体生成F(ab′)2片段。由此产生的F(ab′)2片段可以被处理来降低二硫键从而生产Fab′的碎片。木瓜蛋白酶消化可导致fab片段的形成。Fab，Fab′和F(ab′)，scFv，Fv，dsFv，Fd，dAbs，TandAbs，ds-scFv，二聚体，微型抗体，二价抗体，双特异性抗体片段和其它片段也可以由重组技术合成或可以化学合成。生产抗体片段的技术在该领域是被众所周知和描述的。例如，Beckman et al.，2006；Holliger&Hudson，2005；Le Gall et al.，2004；Reff&Heard，2001；Reiter et al.，1996；and Young et al.，1995中的每一个都进一步描述并使有效抗体片段的生产成为可能。
抗体或抗体片段可以天然生成或可全部或部分合成生产。因此抗体可能来自任何适当的来源，例如重组来源，和/或在转基因动物或转基因植物中生产，或在使用IgY技术的鸡蛋中生产。因此，抗体分子可以在体外或体内生产。
优选地，抗体或抗体片段包括抗体轻链可变区(VL)(包括三个CDR域)和一个抗体重链可变区(VH)(包括三个CDR域)。所述VL和VH一般形成抗原结合位点。
″Fv″片段是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域具有紧密非共价结合的一个重链和一个轻链的可变结构域的二聚体。在这个构象中每一个可变结构域的三个高可变区(CDR)相互作用从而确立VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。综上所述，这六个高变区(CDR)赋予抗原与抗体结合的特异性。
然而，本领域清楚地记录轻链可变结构域的三个CDR和重链可变结构域的三个CDR的存在不是抗原结合所必需的。因此，小于上述经典抗体片段的结构已知是有效的。
例如，骆驼科抗体(Hamers-Casterman et al.，1993；Arbabi Ghahroudi et al.，1997)有广泛的抗原结合能力但不结合轻链。此外，不含仅VH结构域(Ward et al.，1989；Davies and Riechmann，1995)或仅VL区(van den Beucken et al.，2001)的单结构域抗体的结果表明这些结构域能以可接受的高亲和力结合抗原。因此，三个CDR可以有效地结合抗原。
亦知，单个CDR或两个CDR可以有效地结合抗原。第一个例子是，单个CDR可以插入外源蛋白并赋予外源蛋白抗原结合能力，例如插入外源蛋白(如，GFP)的VH CDR3区，赋予外源蛋白抗原结合能力(Kiss et al.，2006；Nicaise et al.，2004)。
进一步已知的，两个CDR可以有效地结合抗原，并且甚至赋予比父本抗体更优越的性能。例如，(Qiu et al.，2007)已经表明来自父本抗体(VH CDR1和VL CDR3区)的两个CDR保留父本分子的抗原识别属性，但拥有穿透肿瘤的卓越能力。通过将这些CDR与适当的链接序列(例如，来自VH FR2)联合以用类似天然父本抗体的方式来定向这些CDR，这产生更好的抗原识别。因此，本领域已知的是有可能构建这样的抗原结合抗体拟似物，其包含两个CDR结构域(优选一个来自VH结构域且一个来自VL结构域，更优选两个CDR结构域中的一个为CDR3)，所述CDR结构域通过适合的框架区定向以保持父本抗体内所发现构象。
因此，虽然本发明的优选抗体可能包含六个CDR区(三个来自轻链且三个来自重链)，但拥有少于六个CDR区和少至一或两个CDR区的抗体也被包括在本发明中。此外，还涵盖具有仅来自重链或轻链的CDR的抗体。
结合到CXCR4的本发明优选抗体包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(a)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其大体同源的序列，
(b)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其大体同源的序列，和
(c)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与其大体同源的序列；或
(d)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其大体同源的序列，
(e)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其大体同源的序列，和
(f)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其大体同源的序列；或
(g)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与其大体同源序列，
(h)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与其大体同源的序列，和
(i)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列或与其大体同源的序列；或
(j)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列或与其大体同源的序列，
(k)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列或与其大体同源的序列，和
(l)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与其大体同源的序列；或
用于与指定重链CDR区联合使用的优选轻链CDR区在本文中另外描述。然而，还涵盖用于与指定重链CDR区联合使用的包含三个CDR的其它轻链可变区。可以与本发明的重链可变区组合使用并可以生成结合CXCR4的抗体的适合的轻链可变区可以容易地被所属领域的技术人员识别。
例如，本发明的重链可变区可以与单个轻链可变区或轻链可变区的所有组成成分组合并且所得抗体用于测试对CXCR4的结合。可以预期的是本发明的重链可变区与不同轻链可变区的合理数量的此类组合将会保留结合CXCR4的能力。的确，抗体9N10拥有与C-9P21相同的重链可变区但具有不同的轻链可变区。
类似的方法可以被用来识别替代性重链可变区，后者用于与本发明优选的轻链可变区的组合使用。
在某些实施方案中，抗体或抗体片段包括所有或部分重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或其部分。此外，抗体或抗体片段可以包含所有或部分κ轻链恒定区或λ轻链恒定区，或它们的部分。这些恒定区的全部或者部分可天然生成或为全部或部分合成的。这些恒定区的适合的序列是众所周知的并且在该领域中记录在案。当轻链和重链恒定区的完整补体被包括在本发明的抗体中时，这种抗体在此通常被称为″完整长度″抗体或″整个″抗体。
包含Fc区域的抗体是某些用途、特别是体内治疗用途优选的，其中Fc区域调节效应子功能如ADCC。合适的Fc区为该领域内的技术人员所熟知并因此可以进行选择。
此处和氨基酸或者核酸序列联合使用的术语″大体同源″包括相对氨基酸或者核酸序列具有至少70％或75％、优选至少80％、且甚至更优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。因此本发明的大体同源序列包括对本发明的序列的单个或多个碱基或氨基酸变换(添加、替换、插入或删除)。在氨基酸水平上，在构成本发明的一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中，优选大体同源序列包含仅至多1个、2个、3个、4个或5个、优选至多1个、2个或3个、更优选至多1个或2个变换的氨基酸。所述变换可以是保守或非保守的氨基酸。优选地，所述变换是保守氨基酸的取代。
大体同源核酸序列还包括杂交到所公开的核酸序列(或其互补序列)的核苷酸序列，例如所述核苷酸序列在至少适度严格杂交条件下，杂交到编码一个或多个本发明的轻链或者重链CDR的核酸序列，本发明的轻或者重链可变区，或者本发明的抗体(或杂交到其互补序列)。
术语″大体同源″还包括用大体相同的方式和本发明的蛋白或者核酸分子执行大体相同的功能的本发明氨基酸和核酸序列的改型或化学等价物。例如，任何大体同源的抗体(或对它进行编码的大体同源核酸)应当保留如上文所述的结合CXCR4的能力。优选的是，任何大体同源抗体应当保留一个或多个抗体的功能性能力，如本文另外所定义的。优选地，任何大体同源的抗体应保留特异性结合到该抗体所识别的CXCR4的相同抗原表位，例如，如本文所述由本发明的CDR或者VH和VL识别的相同抗原表位。与同一个抗原表位/抗原的结合可以容易由众所周知的且本领域所述的方法测试，例如，使用结合试验，例如竞争试验。其它功能特性的保留也可容易通过众所周知且本该领域所述的方法测试。对本发明的抗体来说，特别优选的是保留拮抗性和/或非诱导细胞凋亡性。
因此，所属领域的技术人员应理解，结合试验可以用于测试“大体同源”抗体是否拥有和本发明的抗体或者抗体片段相同的结合特异性，例如，结合测试如流式细胞计量术、ELISA试验或BIAcore试验测验可以容易用于确定这种″大体同源″的抗体是否可以结合到CXCR4。流式细胞计量术是用于分析与细胞表面受体如CXCR4的结合最简便试验。如上文所述，竞争结合试验可以用于测试″大体同源″抗体是否保留特异性结合到由本发明的抗体所识别的相同CXCR4抗原表位的能力。上文所述的方法仅是合适竞争检测试验的一个例子。技术人员会熟知其它适当的方法和其变型。
本发明的蛋白质的大体同源序列包括(但不限于)保守氨基酸取代，或例如不影响抗体的VH域、VL域或CDR域的变换，例如包括使用不同的连接序列的scFv抗体或添加了标记序列或其它组件但不影响抗原结合的抗体，将一种类型或格式的抗体分子或片段转换为另一种类型或格式的抗体分子或片段(例如从Fab转换成scFv，或反之)的变换，或从抗体分子到具体类别或亚类的抗体分子的转换(例如，从抗体分子到IgG或其亚类如IgG1或IgG3的转换)。
如本文所用，″保守氨基酸取代″是将一个氨基酸残基被替换为另一个具有类似侧链的氨基酸残基的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族在所属领域中已有定义，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天门冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
同源性可由任何简便方法进行评估。然而，为了确定序列之间的同源程度，进行多次序匹对比的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson et al.，1994)。如果需要，则将Clustal W算法可与BLOSUM 62计分矩阵(Henikoff and Henikoff，1992)以及空位开放罚10分和空位延伸罚0.1分一起使用，从而在两个序列中获得最高位匹配，其中一个序列的至少50％的总长度被用于对比。其它可用于对比序列的方法是Needleman和Wunsch方法(1970)，经Smith和Waterman(1981)修订，从而在两个序列直接获得最高位匹配并且确定两个序列之间相同的氨基酸的数目。计算两个氨基酸序列之间的百分比一致性的其它方法在所属领域内被普遍承认并且包括(例如)被Carillo和Lipton(1988)描述的那些和在Computational MolecularBiology，Lesk，e.d.Oxford University Press，New York，1988，Biocomputing：Informaticsand Genomics Projects中描述那些。
通常情况下，将采用计算机程序来用于这类计算。程序比较并对比序列，如ALIGN(Myers and Miller，1988)，FASTA(Pearson and Lipman，1988；Pearson，1990)和有间隙BLAST(Altschul et al.，1997)，BLASTP，BLASTN，或GCG(Devereux et al.，1984)对此用途也很有用。此外，欧洲生物信息学研究所的Deli服务器提供基于结构的蛋白质序列的对比(Holm，1993；1995；1998)。
通过提供一个参考点，可以使用ALIGN程序以默认参数(例如可得自在互连网上GENESTREAM网络服务器，IGH，Montpellier，France)，测定具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性和一致性等的本发明序列。
所谓″至少适度严格杂交条件″是指促进溶液中两个互补核酸分子之间的选择性杂交的所选条件。杂交可能会发生于全部或部分的核酸序列分子。杂交部分通常至少为15(例如，20、25、30、40或50)个核苷酸长。所属领域的技术人员将会认识到核酸双连体或杂交体的稳定性由Tm确定，后者在含钠缓冲液中是有关钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/l)，或类似的公式)。因此，决定杂交稳定性的洗涤条件参数是钠离子浓度和温度。为了识别与已知的核酸分子类似但不完全相同的分子，1％的错配可以被假设为导致Tm下降约1℃的跌幅。例如，如果发现核酸分子具有＞95％的一致性，则最终洗涤温度将下降约5℃。基于这些考虑，所属领域的技术人员将能够容易选择适当的杂交技术条件。在优选的实施方案中，选择严格杂交条件。举例来说，下列条件可能被用来实现严格杂交：基于上述公式，在Tm-5℃下以5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5xDenhardt’s溶液/1.0％SDS杂交，然后在60℃下洗涤0.2x SSC/0.1％SDS。适度严格杂交条件包括在42℃下于3x SSC中的洗涤步骤。进一步举例，″杂交″的序列是在非严格条件(例如在室温下的6x SSC，50％甲酰胺)下结合(杂交)的序列，和在不严格的情况(例如2xSSC，室温，更优选是2x SSC，42℃)或更严格的条件(如2XSSC，65℃)(其中SSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.2)下洗涤的序列。
然而，可以理解的，等效的严格条件可以通过使用替代性缓冲液、盐和温度实现。关于杂交条件额外指导意见可见于：Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6和Sambrook et al.，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Vol.3。
一般来说，优选的是高度严格条件下杂交的序列，如若非因为密码简并，序列将在高度严格条件下杂交。
在其它优选的实施方案中，提供与原始的抗CXCR4抗体相比具有增强或优良的性质的第二代抗体，如C-9P21，B-1M22，C-1I24，D-1K21或9N10。例如，第二代抗体可能有对CXCR4的更强结合亲和力，优良交叉反应性分布，诱使更低水平的CXCR4+细胞凋亡，优良的对CXCR4+细胞(特别是肿瘤细胞)的靶向能力，例如，改善的抑制肿瘤细胞生长的能力，改善的拮抗能力，例如改善的阻止由于SDF-1结合到CXCR4引起的Ca通量，改善的对配体诱导的迁移的阻断，或者改善的诱导ADCC或CDC的能力，或者改善的本文另外讨论的病症的治疗。
识别有效第二代抗体的比较是容易进行和量化的，例如，使用一个或多个本文详细描述或所属领域描述的各种测试方法。本发明包括这样的第二代抗体，其与本发明的抗-CXCR4抗体(如C-9P21，B-1M22，C-1I24，D-1K21抗体)比较，具有有增强的至少约2倍、5倍、10倍、20倍、且优选至少约50倍的生物学性质或活性。特别优选的第二代抗体包含与VL链(或替代性VL CDR)组合的本发明抗体的VH链、或其VH CDR。
本发明的抗体、结合蛋白和核酸分子一般是“分离的”或者“纯化的”分子，只要它们不同于在人或动物体内或源自人或动物体的组织样品内原位存在的任何此类成分。然而，这些序列与从人或动物体内发现的序列对应或大体同源。因此，当本文结合核酸分子或序列和蛋白或多肽(例如，抗体)使用时，术语“分离的”或“纯化的”是指从天然环境中分离、纯化、或大体不存在于其天然环境(例如，分离自或纯化自人或动物体(如果它们确实天然产生))的分子，或者是指通过技术工艺生产的分子，即，包括重组子和合成生产的分子。
因此，当与核酸分子联合使用时，这些术语可能是指大体不含与其天然结合的材料如其它核酸/基因或多肽的核酸。此术语也可能指大体不含细胞材料或培养基(当使用DNA重组技术生产时)，或大体不含化学前体，或其它化学成分(当化学合成时)的核酸。分离或纯化的核酸也可能大体不含由其衍生该核酸的天然位于该核酸侧翼的序列(即，位于核酸5′和3′端的序列)，或者例如通过基因工程制使其位于该核酸的序列侧翼的序列(例如，无治疗价值的标记序列或者其它序列)。
由此，当和蛋白或多肽分子例如轻链CDR1、2和3，重链CDR1、2和3，轻链可变区，重链可变区，以及本发明的结合蛋白或抗体(包括全长抗体)联合使用时，术语“分离的”或者“纯化的”一般指一种蛋白，其大体不含来自其衍生来源的细胞物质或其它蛋白。在某些实施方案，特别是在所述蛋白将施用至人或动物的情况下，这种分离或纯化的蛋白大体不含培养基(当通过重组技术生产)，或者化学前体或其它化学成分(当被化学合成)。这种分离或纯化的蛋白也可能不含侧翼序列，例如上文针对分离核酸分子描述那些。
如文本所用，术语“核酸序列”或者“核酸分子”指由天然形成的碱基、糖和糖间(主链)键组成的核酸或者核苷酸单体的序列。此术语也包括含有非天然生成的单体的经修饰或经取代序列或其部分。本发明的核酸序列可能是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列并且可以包括天然生成的碱基，所述碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。该序列也可能含有修饰碱基。这些修饰碱基的例子包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。该核酸分子可能是双链或者单链。该核酸分子可能是完全或者部分合成的或者重组的。
在优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体，更优选是完整的人抗体。在这方面，人抗体在人类治疗使用中往往有至少三个潜在的优势。第一，人免疫系统不会将此抗体识别为外来物。第二，在人体循环中的半衰期将会类似于天然产生的人抗体，允许给于较小和较低频率的剂量。第三，因为效应子部分是人，所以在涉及杀死靶标细胞的作用的实施方案中，它将更好地和人免疫系统的其它部分相互作用，例如通过补体依赖细胞毒性(CDC)或抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)来更高效地摧毁靶标细胞。
然而，虽然一般认为人抗体显示这些优势，但已知的是具有足够亲和力和适合的功能特性来使其成为成功的人类治疗的候选者的人抗体的开发绝不简单。因此所属领域仍缺乏用于人类的安全和有效治疗的抗-CXCR4，并且对此类药剂的发展构成挑战。
如文本中与抗体分子和结合蛋白联合所用，术语″人″首先指分离或衍生自人类所有组成成分或衍生自或对应于在人或人类所有组成成分(如人类生殖或体细胞)中发现的序列的、具有可变区(例如VH、VL、CDR或FR)和任选恒定抗体区的抗体和结合蛋白。本发明的C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10抗体是这种人抗体分子的例子，其中所述可变区已从人类所有组成成分分离。
本发明的″人″抗体和结合蛋白的还包括不通过人序列(例如，通过随机突变诱导的突变或体外定点突变，例如通过体外克隆或PCR诱导的突变)编码的氨基酸残基。这种突变的具体例子是这样的突变，其涉及在抗体或结合蛋白的少量残基中的保守取代或其它突变，例如，在抗体或结合蛋白的制作5个、4个、3个、2个或1个残基中，优选在构成抗体或结合蛋白的一个或多个CDR的至多5个、4个、3个、2个或1个残基中。这种″人″抗体的某些例子包括已经受标准修饰技术以减少潜在免疫原性位点数量的抗体和可变区。
因此，本发明的″人″抗体包括衍生自并涉及在人类中发现的序列的序列，但它们可能不天然存在于人体内的抗体胚系所有组成成分中。此外，本发明的人抗体和结合蛋白包括含有从人序列或与其大体同源的序列中识别的人共有序列的蛋白。
此外，本发明的人抗体和结合蛋白不限于本身在人抗体分子组合中发现的VH、VL、CDR或FR的组合。因此，本发明的人抗体和结合蛋白可以包括或对应于不一定天然存在于人类中的这种区域的组合。
在优选的实施方案中，人抗体将会是完整人抗体。如本文所用，″完整人″抗体是包含如上文定义的″人″可变区结构域和/或CDR而没有实质非人抗体序列或无任何非人抗体序列的抗体。例如，包含人类可变区结构域和/或CDR而″没有实质非人抗体序列″的抗体是这样的抗体、结构域和/或CDR，其中仅至多5个、4个、3个、2个或1个氨基酸是不由人抗体序列编码的氨基酸。因此，″完整人″抗体而有别于″人源化″抗体，后者基于实质非人类可变区结构域，例如小鼠可变区，其中某些氨基酸已经被更改从而更好地与通常存在于人抗体中的氨基酸对应。
本发明的″完整人″抗体可以是没有有任何其它实质性的抗体序列(例如单链抗体)的人类可变区结构域和/或CDR。或者，本发明的″完整人″抗体可能是与一个或多个人抗体恒定区整合或操作性连接的人类可变区结构域和/或CDR。某些优选的完整人抗体是具有IgG恒定区的完整补体的IgG抗体。
在其它的实施方案中，本发明的″人″抗体将是部分人嵌合抗体。此处使用的″部分人嵌合″抗体是包含操作性连接到、或接枝到非人物种(例如大鼠或小鼠)的恒定区的″人类″可变区结构域和/或CDR的抗体。此部分人嵌合抗体可以用于例如临床前研究，其中所述恒定区将优选属于用于临床前测试的相同物种。这些部分人嵌合抗体也可用于例如体外诊断，其中非人物种的恒定区可提供抗体检测的额外选择。
如本文所用，术语″片断″指具有生物相关性的片断，例如，有利于抗原结合(例如，形成抗原结合位点的一部分)，和/或有利于抑制或减少CXCR4抗原功能的片断。某些优选的片段包含本发明的抗体的重链可变区(VH结构域)和/或轻链可变区(VL结构域)。其它优选的片段包含本发明的抗体的一个或多个重链CDR(或本发明的VH结构域)，或本发明的抗体的一个或多个轻链CDR(或本发明的VL结构域)。某些优选片段的长度至少为5个氨基酸并包括至少一个CDR区，优选的是CDR3区，更优选的是重链CDR3区。
在其中本发明的抗体包含任何已定义序列的片段(例如包含SEQ ID NO：35，46，57，68或101的片断)的实施方案中，例如，所述抗体是包含本发明的VH和/或VL区的抗体，或是包含一个或多个本发明CDR的抗体或结合蛋白，然后这些区域/结构域通常可以在抗体或结合蛋白内被分隔以便每个区域/结构域可以执行其生物功能并且以便保留对抗原结合的有利性。因此，VH和VL结构域优选通过适合的骨架序列/链接序列分隔，并且CDR优选通过适合的框架区(例如在天然生成的抗体中发现的或有效工程抗体中发现那些)分隔。因此，本发明的VH、VL和各个CDR序列优选被提供在或掺入适当的框架或骨架以实现抗原结合。这种框架序列或区域可能对应于天然产生的框架区(在适当的情况下为FR1、FR2、FR3和FR4)以形成适当的骨架，或可能对应于共有的框架区域(例如通过比较各种天然产生的结构域来识别的)。或者，可以使用非抗体骨架或框架，例如，T细胞受体框架。
可以被用作框架区的适当序列是众所周知且被所属领域记载的，并且它们中的任何一个都可被使用。用于框架的优选序列为构成本发明的VH和/或VL结构域的一个或多个(即一个、两个、三个或四个)框架区，即，公开于表1、2、3、4或5中的一个或多个框架区，或与其大体同源的框架区，以及特别是那些允许维持抗原特异性的框架区，例如导致所述抗体大体相同或3D结构相同的框架区。
在某些优选的实施方案中，在本发明的抗体中发现所有四个可变轻链(SEQ IDNO：30、31、32和33)和/或可变重链(SEQ ID NO：25、26、27和28)，在适当的情况下为SEQ ID NO：35的FR区(同时见表1)，或者与其大体同源的FR区。
在某些优选的实施方案中，在本发明的抗体中发现所有四个可变轻链(SEQ IDNO：41、42、43和44)和/或可变重链(SEQ ID NO：36、37、38和39)，在适当的情况下为SEQ ID NO：46的FR区(同时见表2)，或者与其大体同源的FR区。
在某些优选的实施方案中，在本发明的抗体中发现所有四个可变轻链(SEQ IDNO：52、53、54和55)和/或可变重链(SEQ ID NO：47、48、49和50)，在适当的情况下为SEQ ID NO：57的FR区(也示于表3)，或者与其大体同源的FR区。
在某些优选的实施方案中，在本发明的抗体中发现所有四个可变轻链(SEQ IDNO：63，64，65和66)和/或可变重链(SEQ ID NO：58，59，60和61)，在适当的情况为SEQ ID NO：68的FR区(同时见表4)，或者与其大体同源的FR区。
在某些优选的实施方案中，在本发明的抗体中发现所有四个可变轻链(SEQ IDNO：96，97，98和33)和/或可变重链(SEQ ID NO：25、26、27和28)，在适当的情况下为SEQ ID NO：101的FR区(也示于表5)，或者与其大体同源的FR区。
此外，虽然本发明的优选抗体包括本发明的VH、VL或者CDR，应当注意本发明的抗体还包括和与其它不属于本发明的VH、VL或CDR结合的一个或多个本发明的VH、VL或CDR，前提是文中列出的本发明的抗体的CXCR4结合性质或抗CXCR4性质仍然存在。
如本文所用，术语″重链互补性决定区域″(″重链CDR″)指在抗体分子的重链可变区(VH区)内的具有超强可变性的区域。重链可变区有三个CDR，从氨基末端到碳基末端，被称为重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。重链可变区也具有四个框架区(从氨基末端到碳基末端，FR1、FR2、FR3和FR4)。这些框架区分隔CDR。
如本文所用，术语″重链可变区″(VH区)指的抗体分子重链的可变区。
如本文所用，术语″轻链互补性决定区域″(″轻链CDR″)指在抗体分子的轻链可变区(VL区)内的具有超强可变性的区域。轻链可变区有三个CDR，从氨基末端到碳基末端，被称为轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。轻链可变区也有四个结构域(从氨基末端到碳基末端，FR1、FR2、FR3和FR4)。这些框架区分隔CDR。
如本文所用，术语″轻链可变区″(VL区)指抗体分子轻链的可变区。
应该注意，在必要时，本文遵循Kabat命名法来定义CDR的位置(Kabat et al1991，特别以引入方式并入本文)。
所属领域内的专业人员应了解，可以通过任何众所周知和所属领域内的已知方法来制备本发明的蛋白质与多肽，如轻和重CDR，轻和重链可变区，抗体，抗体片段和免疫交联剂，但优选使用重组方法来制备。
编码本发明的抗体的轻或重链可变区的核酸片断可以通过任何适当的方法(例如通过克隆或合成)来衍生或制备。例如，这种序列可以通过以下方式制备，克隆例如来自人类生殖系基因的适当序列，然后通过使用众所周知和所属领域内的已知方法对生殖系基因序列进行必要修饰以以获得本发明的序列。替代性和更高效方法将是合成适当的轻或重链可变区序列作为重叠的引物，并且使用引物扩展以获取完整序列。然后，此完整序列可以通过与包含适当限制性位点的引物的PCR扩增以便进一步克隆和操纵，例如克隆入合适的表达载体中。每个可变区五到七个重叠引物一般是足够的，从而这使得该技术非常有效和精确。
一旦获得编码本发明的抗体的轻或重链可变区的核酸片断，则可以通过标准DNA重组技术进一步操作，例如将可变区片断转化成为拥有合适的恒定区结构域的全长抗体分子，或成为本文另外所述的抗体片段的特定格式，如Fab、scFv片段等。通常，或作为此进一步的操作程序的一部分，编码本发明的抗体的核酸片断一般被掺入合适的表达载体以促进本发明的抗体的生产。
只要该载体与所用宿主细胞相容，则可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒、或经修饰病毒(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。表达载体″适于转变宿主细胞″，其意义是表达载体含有本发明的核酸分子和基于用于表达的宿主细胞选择的调控序列，后者操作性联接到该核酸分子。操作性联接旨在以允许核酸表达的方式将核酸联接到调控序列。
因此，本发明涵盖一种重组表达载体，其含有本发明的核酸分子或其片段，和用于转录和翻译由本发明核酸分子编码的蛋白所必需的调控序列。
适宜的调控序列可来源于不同来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物，或昆虫基因(例如，见Goeddel，1990所述的调控序列)。合适的调控序列的选择取决于按下文所述选定的宿主细胞，并且本领域的技术人员容易完成。这种调控序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译启动信号。此外，根据所选定的宿主细胞和所用的载体，其它序列，例如复制起点、额外的DNA限制性位点、增强子和赋予转录诱发能力的序列可以被掺入表达载体中。
本发明的重组表达载体还可能包含选择性标记基因，其促进对用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞的选择。选择性标记基因的例子是编码例如以下蛋白的基因：新霉素和潮霉素(提供对特定药物的抗药性))、β乳糖、氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫荧光素酶、或免疫球蛋白或其部分(如免疫球蛋白(优选IgG)的Fc部分)。选择性标记基因的转录通过选择性标记蛋白(如β乳糖、氯霉素乙酰基转移酶或萤火虫荧光素酶)的浓度变化来监测。如果选择性标记基因编码赋予抗生素抗性如新霉素抗性的蛋白，则转化的细胞可以用G418来选择。已整合选择性标记基因的细胞将存活下去，同时其它细胞死亡。这使得有可能目测和测定本发明的重组表达载体的表达并且特别是确定突变体对表达和表型的效果。应了解，选择性标记可以从目的核酸中引入到单独的载体上。
重组表达载体还可含有编码融合部分的基因，该融合部分提供了重组蛋白的增强的表达，重组蛋白的增强的稳定性；和通过作为亲和纯化的配体()帮助靶标重组蛋白的纯化(例如，可以提供使纯化和识别成为可能的合适的“标签”，如His标签或者myc标签)。例如，可以在靶标重组蛋白中加入蛋白水解裂解位点以允许在融合蛋白纯化之后从融合部分中分离重组蛋白。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad公司(Corp.)，墨尔本，澳大利亚)、pMal(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，贝弗利(Beverly)，MA)和pRIT5(法玛斯亚(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A融合入重组蛋白中。
重组表达载体可以被引入到宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语″用…转化″，″用…转染″、″转化″和″转染″旨在包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如，载体)引入细胞。如本文所用，术语“转化的宿主细胞”也旨在包括能够进行糖基化的细胞，其已用本发明的重组表达载体进行了转化。原核细胞可以通过例如电穿孔或氯化钙介导转化用核酸来转化。例如，可以通过常规技术(如钙磷或氯化钙共沉淀、EDEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔或显微注射)将核酸引入到哺乳动物细胞中。转化和转染宿主细胞的适合方法可以从Sambrook et al.，1989和其它实验室教科书中找到。
适宜的宿主细胞包括各种真核生物宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白质可在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞可在Goeddel，1990中找到。此外，本发明的蛋白可以在原核细胞如大肠杆菌(Zhang et al.，2004)中表达。
适于实施本发明的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母属(genera Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和曲霉的各个种。用于在酵母酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari.et al.，1987)、pMFa(Kurjan and Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultzet al.，1987)和pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation)，圣迭戈(San Diego)，加利福尼亚(CA))。转化酵母和真菌的方法为本领域的技术人员所熟识(见Hinnen etal.，1978；Ito et al.，1983，和Cullen et al.，1987)。
适于实施本发明的哺乳动物细胞包括但不限于：COS(例如，ATCC No.CRL1650or 1651)、BHK(例如，ATCC No.CRL 6281)、CHO(ATCC No.CCL 61)、HeLa(例如，ATCC No.CCL 2)、293(ATCC No.1573)、NS-1细胞、NS0(ATCCCRL-11177)和Per.C6
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(库塞尔(Crucell)，莱顿(Leiden)，荷兰(Netherlands))。用于在哺乳动物细胞内直接表达的合适表达载体一般包括启动子(例如，来自病毒材料如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猴病毒40)以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.，1987)和pMT2PC(Kaufman et al.，1987)。
考虑到本文提供的教示，也可容易地实现启动子、终止子和引入适当类型的表达载体进入植物、鸟类和昆虫细胞的方法。例如，在一个实施方案中，本发明的蛋白可以由植物细胞表达(见Sinkar等，1987，其评价发根农杆菌载体的使用；另见Zambryski等，1984，其描述用于植物细胞表达载体的使用，所述载体包括但不限定于PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034)。
适合实施本发明的昆虫细胞包括来自家蚕(Bombyx)、粉纹夜蛾(Trichoplusia)或灰翅夜蛾物种的细胞和细胞系。在昆虫细胞(SF 9细胞)中的表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，1983)和pVL系列(Luckow and Summers1989)。PCT/US/02442描述了适合表达本发明的重组蛋白的昆虫杆状病毒细胞表达系统。
或者，本发明的蛋白也可能在非人类转基因动物如大鼠、兔、羊、猪中表达(Hammer等.1985；Palmiter et al.1983；Brinster et al.1985；Palmiter和Brinster 1985，以及美国专利号码No.4,736,866)。
本发明的蛋白质也可以通过使用众所周知的蛋白化学技术例如固相合成(Merrifield(1964)；Frische et al.(1996))的化学合成或同质溶液中的合成(Houbenweyl，1987))来制备。
包含轭合至其它分子(如蛋白质)的本发明抗体和蛋白的N端或C端融合蛋白可能通过重组技术融合来制备。所得融合蛋白含有融合到所选择的蛋白或者标记蛋白(marker protein)，或者如本文所述的标签蛋白(tag protein)的本发明的抗体或蛋白。本发明的抗体和蛋白液可能通过已知技术轭合至其它蛋白。例如，可使用如WO 90/10457所述异双功能含硫接头、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫-丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺基-5硫代乙酸酯来连接蛋白。可用于制备融合蛋白或轭合物的蛋白的例子包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白，激素，生长因子，凝集素，胰岛素，低密度脂蛋白，胰高血糖素，脑内啡，转铁蛋白，蛙皮素，脱唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，血凝素(HA)和截短myc。
不论制备第一抗-CXCR4抗体的核酸节段的方式，更加适合的抗体核酸节段可容易通过标准的分子生物学技术来制备。为了确认任何变体、突变或第二代抗-CXCR4抗体核酸节段适用于本发明，将测试核酸节段以确认对应本发明的抗-CXCR4抗体的表达。优选地，还测试变体、突变或第二代核酸节段在标准条件(优选是标准严格杂交条件)下的杂交。示例性的合适杂交条件包括在约50℃下在约7％十二烷基硫酸钠(SDS)、约0.5M NaPO4、约1mM EDTA中杂交，并使用约1％SDS在约42℃下洗涤。
由于各种抗体可容易地制备，本发明的治疗方法可以通过向动物或患者提供至少第一核酸节段或分子来执行，所述第一核酸节段或分子在患者中表达生物有效量的本发明第一抗-CXCR4抗体。″表达抗-CXCR4抗体的核酸节段或分子″将一般呈至少表达构造或载体形式，并且可能呈包含在病毒或重组宿主细胞内的表达构造或载体形式。本发明的优选基因治疗载体将一般是例如包含于重组逆转录病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、巨细胞病毒(CMV)等等中的病毒载体。
另一方面提供了构成一个或多个本发明的核酸节段或分子的表达构造或者表达载体。优选表达式构造或载体是重组体。优选地，所述构造或载体进一步包含用于转录和转译由本发明的核酸分子编码的蛋白序列所必需的调控序列。
另一个方面提供了包括一个或者多个本发明的表达构造或者表达载体的宿主细胞或病毒。还提供了包含一个或多个本发明的核酸分子的宿主细胞或病毒。表达本发明的抗体的宿主细胞或病毒形成另一个方面。
本发明的另一个方面提供生产本发明的抗体的方法，其包含培养本发明的宿主细胞的步骤。优选方法包含以下步骤：(i)在适合表达编码的抗体或者蛋白的条件下，培养包含一个或多个的重组表达载体或一个或多个本发明的核酸序列的宿主细胞；和任选地(ii)从宿主细胞或从生长介质/上清液中分离或获取抗体或蛋白。这种生产方法还可能包含以下步骤：纯化抗体或蛋白产品和/或将抗体或产品配制成包括至少一个额外成分(例如药学上可接受的载运体或赋形剂)的组合物。
在实施方案中，当本发明的抗体或蛋白质由多于一个肽链(例如，某些片段如fab片段)组成时，所有多肽优选在相同或不同的表达载体的宿主细胞内表达，从而完整的蛋白质(例如，本发明的结合蛋白)可以在宿主细胞中装配并从其中分离或纯化。
本发明的抗体还可以用于产生其它与CXCR4结合的抗体。这类用途涉及例如在父本抗体的氨基酸序列中添加、删除、取代或插入一或者多个氨基酸从而形成一个新的抗体，其中所述父本抗体是本文另外定义的本发明的抗体中的一个；以及测试形成的新抗体以确认与CXCR4结合并具有一个或多个其它如本文所述优选功能特性抗体。这种方法可以被用来形成多个新抗体，测试所述新抗体与CXCR4结合的能力和其它功能性质。优选地，所述添加、删除、取代或插入一个或多个氨基酸发生于一个或者多个CDR结构域中。
这种父本抗体的修改或突变可以使用众所周知和所述领域有记录的技术(例如通过进行随机或定向诱变方法)以任何适当的方式来执行。如果将使用定向诱变技术，则一种识别突变的合适残基的策略利用结合蛋白抗原复合物(如，Ab-Ag复合物)的晶体结构的分辨率来识别抗原结合所涉及的关键残基(Davies和Cohen，1996)。随后，所述残基可以被突变从而强化相互作用。或者，为了定向诱变可以仅靶向一个或多个氨基酸残基，并评价对结合CXCR4的影响。
随机突变可以任何适当的方式进行，例如通过易错PCR，链改组或增变株大肠杆菌菌株。
因此，一个或多个本发明的VH结构域可以和单个VL结构域或来自任何适当来源的VL结构域的所有组成成分组合，并且所得新抗体被测试以确定针对CXCR4的抗体特异性。这是优选的。相反地，一个或多个本发明的VL结构域可以和单个VH结构域或来自任何适当来源的VH结构域的所有组成成分组合，并且所得新抗体被测试以识别与CXCR4结合的抗体。
类似地，如果适当，本发明的一个或多个、或优选所有三个VH结构域和/或VL结构域的CDR可以被接枝入单个VH结构域和/或者VL结构域或VH结构域和/或者VL结构域的所有组成成分，并且所得新抗体被测试以识别与CXCR4结合的抗体。
CDR、尤其是轻和/或重链的CDR3的靶向突变已表明是增加抗体亲和力的有效技术并且是优选的。优选地，称为″热点″的特异性区域或CDR3的的3到4个氨基酸的嵌段被靶向用于突变。
″热点″是发生体内体细胞超强突变的序列(此处和下文，Neuberger and Milstein，1995)。热点序列可以被定义为某些密码子中的共有核苷酸序列。所述共有序列是四核苷酸(RGYW)，其中R可以为A或G，Y可以为C或T，并且W可以为A或T(Neuberger and Milstein，1995)。此外，相比由对应于潜在热点序列的TCN编码的那些，由核苷酸AGY编码的丝氨酸残基压倒性地存在于可变结构域的CDR区中(Wagner et al.，1995)。
因此，可以针对热点序列和AGY密码子的存在，扫描本发明的每个抗体的重和轻链CDR的核苷酸序列。轻和重链的CDR区的经识别热点随后任选地通过国际免疫遗传学数据库(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)(Davies et al.，1990)与重和轻链的原始序列加以比较。与生殖种系相同的序列表明没有发生体细胞突变；因此可以引入随机突变，模仿发生在体内的体细胞事件，或者，可在例如热点和/或AGY密码子出进行定向诱变。相反地，不同的序列表明已经发生了一些体细胞突变。仍将确定体内的体细胞突变是否是最佳的。
突变的优选热点是暴露的氨基酸的密码，并且优选的是编码形成抗原结合位点的氨基酸。其它的优选突变的热点是编码非保守氨基酸的那些。编码CDR内的嵌入或保守氨基酸的热点优选不要突变。这些残基是通常是总体结构的关键，并且因为它们是嵌入的，所以不太可能与抗原互相反应。
进行氨基酸和蛋白质域的上述操纵的方法是所属领域技术人员熟知的。例如，所述操纵可以方便地通过核酸水平的遗传工程进行，其中编码适合的结合蛋白和其结构域的核酸分子被修饰，使得所得的表达蛋白的氨基酸序列接着以适当方式被修饰。
一个或多个抗体特异性结合CXCR4的能力的测试可以通过任何众所周知的和所属领域描述的适当方法进行。CXCR4+细胞株可以从细胞培养物保藏中获得，或者它们可能通过用允许表达重组CXCR4的构造转化CXCR4-阴性细胞来制备。这种细胞可容易用于测定结合，例如通过常规方法例如ELISA、BIACore、FACS等。
通过这些方法生产的新抗体优选地具有改善的功能特性，如相对父本抗体的对CXCR4的更高或者加强的亲和力(或至少相当的亲和力)，可以通过与本文另外描述的本发明的抗体相同的方式进行处理或使用(例如，用于治疗，诊断，作为组合物的一部分等)。或者，或另外，新抗体将会拥有一个或多个如同本文另外描述的其它改善的功能特性。
通过这些方法生产、获取或可获得的新抗体形成本发明的另一个方面。
这项发明进一步提供包含至少一个本发明的抗体或抗体片段(任选包括稀释剂)的组合物。这种组合物可能是药学上可接受的组合物或在实验室研究中使用的组合物。就药学组合物而言，它们优选被配制用于肠胃外、静脉内或甚至皮下给药。
本发明提供本发明的人类抗体和抗体片段的许多方法和用途。除非特别指出，在所有方法中，术语“一个”(″a″和an″)用于指所例举方法中的″至少一个″，″至少第一个″，″一个或多个″，“数个″步骤。这对治疗方法中的给药步骤尤其相关。因此，本发明不仅可以采用不同的剂量，也可以使用不同次数的剂量，例如，注射中可以使用多达和包括多次注射。在抗CXCR4治疗抗体的给药之前或之后或在其期间，可以使用、施用组合疗法。
提供了本发明的抗体或免疫轭合物的各种有用的体外方法和用途，所述方法和用途具有重要生物学意义。首先提供的是结合CXCR4的方法和用途，其一般包含：使包含CXCR4的组合物与本发明的至少第一抗-CXCR4抗体或其抗原结合片段有效地接触。本发明的抗体或其免疫轭合物由此可以在结合试验中使用。适当有用的结合试验包括所属领域中通常采用的那些，如在免疫印迹、蛋白印迹、RIAs、ELISAs、免疫组化、荧光活化的细胞分选(FACS)、免疫沉淀、亲和层析等等中采用那些。
提供了检测CXCR4和方法和用途，其一般包含：在有效允许CXCR4/抗体复合物形成并且检测所形成的复合物的条件下，使疑似含有CXCR4的组合物与本发明的至少第一抗体或免疫轭合物或其抗原结合片段接触。检测方法和用途可与生物样品(例如，在肿瘤诊断中)联合使用，并且还提供了基于该检测方法和用途的诊断试剂盒。此外有认为CXCR4的检测对一些病症可以是预后性的，因此在相关的情况下，本文的对诊断的提及包括预后诊断。特别地，以指示CXCR4具有转移复发和存活、胶质瘤和一些儿童癌症的预后性价值。
本发明的抗体或结合蛋白可以用于体内或体外检测CXCR4，尤其是用于检测CXCR4+细胞。例如，因为CXCR4在某些肿瘤细胞上过表达，本发明的抗体或结合蛋白可用于体内或体外检测肿瘤细胞。此外，抗体定位CXCR4+细胞的能力意味着本发明的抗体可以靶向有CXCR4+细胞存在的身体部位，因此所述抗体可以作用于靶位。特别地，抗体定位CXCR4+肿瘤细胞的能力意味着本发明的抗体可以靶向有CXCR4+肿瘤细胞存在的身体部位，因此所述抗体可以作用于靶位。
本发明的方法和用途特别用于动物和患者中，所述动物和患者具有与CXCR4表达或活性相关的或CXCR4在其中起到生物学作用的疾病或病状，或有发展所述疾病或病状的风险。这种疾病或病状包括由CXCR4阳性细胞、典型的是免疫调节CXCR4+T细胞介导的疾病，其在配体结合CXCR4时可能参与将导致或促成病症或疾病的信号传导通路)。它们还包括由表达CXCR4的细胞的异常增殖导致的疾病。这种异常增殖细胞可能天然为CXCR4+，或者它们可能被突变/转化而表达CXCR4。如上文所述，CXCR4的表达可能帮助癌症细胞沿着SDF-1浓度梯度转移。还包括特征为在本身就是CXCR4+的细胞上过表达CXCR4的疾病。此外，HIV的CXCR4热带株利用CXCR4进入宿主细胞，因此阻断该受体可限制这种疾病的扩散。
因此，提供一种治疗由CXCR4介导和/或特征为CXCR4阳性细胞异常增殖和/或特征为在本身为CXCR4阳性的细胞上过表达CXCR4的疾病或病症的方法。
从另一个角度看来，提供可受益于以下一个或多个的病状治疗：
(i)对CXCR4与其配体的结合的抑制。
(ii)对针对CXCR4配体的CXCR4介导细胞应答的抑制，特别是对例如与癌转移/器官入侵或炎症应答、或增加的细胞内钙离子浓度(细胞活化)相结合的趋化或迁移的抑制。
(iii)选择性消除CXCR4+细胞。
(iv)对CXCR4+造血干细胞的迁移的活化和诱导，因为这些细胞由其CXCR4与骨髓基质中产生的SDF-1的相互作用而在骨髓内保持非活性状态。
(v)阻断HIV的X 4株对CXCR4的感染，在感染期间将CXCR4用作共受体。
优选地，CXCR4配体是SDF-1。
所属领域的技术人员熟知因为CXCR4涉及广泛的疾病和病症，给定的抗CXCR4治疗一旦显示在任何可接受模型中有效，则可以用于治疗与CXCR4表达有关的全部疾病和病症。
在一个实施方案中，CXCR4介导的病况是癌症，且特别是由CXCR4和它与它的配体相互作用来介导或支持的扩散、转移形成、器官入侵和/或肿瘤生长。
CXCR4在各种肿瘤中表达，目前大量的文档记录了该表达在癌症病理生理学特别是癌症转移中起决定性的作用。若干证据导致了目前广为接受的理念，即CXCR4的表达使恶性细胞能够利用用于转移性迁移的SDF-1基梯度。CXCR4是迄今为止在癌症细胞中最常表达的趋化因子受体。在几乎所有的肿瘤研究中均发现表达。还有益的是SDF-1(CXCL12)在肝、肺、骨髓、淋巴结和大脑(以相对低的水平)，即，癌症通常转移到的或者血液系统肿瘤侵入的位置中，以特别高水平表达。大量证据表明阻断SDF-1产生的CXCR4信号能够在小鼠模型中减少或防止形成转移。此信号抑制可以通过抗体(Muller et al，2001和其它)、CXCR4的siRNA(Lianget al，2007)和肽(Kim et al，2008)实现。
阻断CXCR4也被描述成对血管生成具有影响，例如抑制(抗血管生成作用)。因此，在另一个实施方案中本发明的抗体可以用来影响血管生成(例如具有抗血管生成作用)。在另一个实施方案中，本发明的拮抗抗体可以与所属领域中所述的任何抗血管生成药剂一起使用。特别地，本发明的抗体可用于与阿瓦斯汀(Avastin)联合使用来治疗癌症，或当肿瘤获得阿瓦斯汀抗性时作为患者的第二线治疗方案。
Xu等，2009的研究显示肿瘤细胞的CXCR4通过用阿瓦斯汀治疗而被上行调节。这将使肿瘤细胞对用靶向CXCR4的抗体治疗更加敏感。这对于对阿瓦斯汀治疗已经产生抗性的患者特别有益。或者，可以一起给予所述两种药物。
此外，据称具有抗转移作用的阻断CXCR4信号的许多化合物也已知抑制肿瘤生长。虽然通过阻断CXCR4受体限制肿瘤生长的确切作用还未充分了解，越来越多的证据表明赘生性细胞与周围基质的相互作用是至关重要的。一项研究显示，虽然用抗CXCR4的siRNA转染胰腺和结肠癌细胞在体外对细胞生长造成极小的影响，但源自这些细胞的肿瘤的体内生长被明显压制(Guleng et al，2005)。此外，其表明癌相关的成纤维细胞与少量的肌纤维母细胞一起刺激混合的乳腺癌细胞的生长(明显多于相同患者的正常的乳腺成纤维细胞)，并且通过聚集血管内皮祖细胞促进血管的生成(Orimo et al，2005)。这些作用是通过肿瘤成纤维细胞/成纤维细胞分泌的SFD-1介导的。抗SDFD-1抗体或抗CXCR4的siRNA抑制肿瘤生长。因此，这些研究一并显示肿瘤微环境对于癌症的行为的重要性，并且通过体内靶向SDF-1/CXCR4相互作用获得的显著的肿瘤生长抑制。因此，本发明的抗体可以用于抑制CXCR4+细胞对肿瘤基质的吸引，和/或抑制所述细胞的活化以创造有利于肿瘤的微环境。
在另一个实施方案中，治疗的CXCR4介导病状是表达CXCR4的转化细胞的存在。
如上文已述，CXCR4在许多肿瘤中大量表达。这可以用于通过诱导细胞凋亡、ADCC或CDC来杀死那些细胞。当然，因为CXCR4也在各种健康细胞中表达，所以安全性方面和副作用是需要考虑的理由。对CXCR4的小分子拮抗剂的有限数量的可用I期研究显示一些副作用，所述副作用大多是次要问题。然而，靶向CXCR4的药物的长期使用方面没有任何数据。此外，取决于所用药物，可能存在一些变化；诱导细胞凋亡的抗体如MDX-1338)可能具有与不诱导细胞凋亡抗体非常不同的安全特性。此外，最近证明肽派生药物CTCE 9908通过诱导多核生成、G2-M停滞和异常有丝分裂(有丝分裂障碍)造成卵巢癌细胞死亡(Kwong et al，2009)。可以推测，相比几乎从不进行有丝分裂的完全分化CXCR4+神经细胞，这种作用模式(例如有丝分裂障碍)在易于细胞分裂的CXCR4+肿瘤细胞中更有效。因此，在一些实施方案中，杀伤CXCR4+细胞是本发明的抗体另一个作用模式，但这种杀伤优选是由除诱导细胞凋亡之外的机制诱导的。
在另一个的实施方案中，治疗的CXCR4介导病状是骨髓支持细胞到肿瘤位点的迁移。
开始在肝细胞癌中的II期临床试验，其研究CTCE-9908(阻断CXCR4信号的二聚肽)和经动脉化疗栓塞术的联合使用。假设CTCE 9908除了阻断转移过程，将在经动脉化疗栓塞术后阻断肿瘤对骨髓来源的支持细胞的补充。
在另一个实施方案中，待治疗的CXCR4介导的病状是CXCR4+细胞到炎症部位的迁移。
已知CXCR4在炎症反应中发挥作用。如同其它细胞因子，SFD-1通过将免疫系统的CXCR4+细胞吸引至炎症部位来促成炎症。阻断该相互作用可能有益于各种炎症和自身免疫性病症，如类风湿性关节炎。小分子药物候选者AMD3465(CXCR4拮抗剂)表现了在血吸虫病抗原引起的肺肉芽肿形成模型中废止Th2介导的炎症应答(Hu et al.，2006)。
在另一个实施方案中，待治疗的CXCR4介导的病状是病毒性传染病，特别是逆转录病毒感染如HIV感染，或任何其它病毒性感染，其中所述病毒使用CXCR4作为受体。
很大一部分HIV菌株在感染期间使用CXCR4作为复合受体(X 4HIV菌株)。阻断CXCR4受体已表明非常有效地阻断感染。AMD3100已表明在人类临床测试中能同时在体外和体内高效地阻断X 4 HIV菌株进入CXCR4株。这种化合物的具有加强的生物利用度的衍生物(AMD070)目前正处于针对HIV治疗的II期临床测试中。几种CXCR4的其它拮抗剂处于用该目的的不同发展阶段中。
在另一个实施方案中，待治疗的CXCR4介导的病状是需要动员保留在骨髓中的干细胞的病状。这种干细胞动员可以通过阻断CXCR4/SDF-1相互作用来实现，并且这允许例如免疫系统的恢复，例如全身辐射或骨髓移植或血癌如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)或多发性骨髓瘤之后所需的免疫系统恢复。这种方法可用于这些病状和其它需要或可受益于造血干细胞移植的任何疾病。
2009年1月，健赞(Genzyme)公司收到美国食品药品管理局的获准以商品名MozobilTM出售一种小分子CXCR4抑制剂普乐沙福(plerixafor(前AMD3100))，其为注射性药物针对罹患非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤，需要造血干细胞移植的患者。此产品意在与G-CSF联合使用来动员自体造血干细胞。阻断CXCR4和SDF-1之间的相互作用已表明在外周血液中同时显著增加白细胞计数和cd34+细胞数量，因为由骨髓基质分泌的SDF-1在这种情况下有助于保持干细胞在骨髓中处于活化形式。几种其它CXCR4拮抗剂处于针对此指示的研发中。
在另一个实施方案中，阻断CXCR4受体介导信号使肿瘤细胞对其它化合物的治疗如化疗药物敏化。因此，特别优选的是与化疗药物一起的联合疗法。这种实施方案在血液癌症治疗中尤其有用。
在2009年12月，健赞公司宣布I/II期临床试验提供了早期临床数据，其显示与化疗结合使用的Mozobil(普乐沙福注射剂)可对在骨髓中受到保护的白血病细胞提供治疗性影响。在临床试验中，在针对复发或者难以治疗的急性骨髓性白血病(AML)患者的化疗(MEC方案：米托蒽醌、依托泊苷和阿糖胞苷)之前，将Mozobil作为预调理策略提供。不少临床试验参与者在之前的治疗后无应答或者具有短期缓解。在可用于第一次后续评估的患者中，研究人员观察到50％的患者完全缓解(CR或CRi)。已针对其它血液癌症开始类似试验。
上文所述的实施方案可以用于各种疾病的治疗。
已显示有增加的CXCR4表达的肿瘤类型的例子为乳腺癌，前列腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，恶性或转移性恶性黑色素瘤，头部及颈部癌症(包括但不限于口腔鳞状细胞癌和鼻咽癌)，食管癌，脑肿瘤(包括但不限于胶质瘤和脑膜瘤)，白血病，淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤，神经母细胞瘤和其它儿童癌症，肾癌，成血管细胞瘤，希林二氏病(von Hippel-Lindau disease)，肺肿瘤(SCLC和NSCLC)，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，乳头状甲状腺癌和骨肉瘤。特别优选的是对转移性癌的治疗或对肿瘤细胞侵入的抑制作用。
CXCR4介导的疾病或病症也可能是疾病或与炎症或自身免疫性疾病相关的病状。优选的疾病或病症包括：
(1)过敏性疾病，如全身过敏反应或超敏性反应，药物过敏，过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)，昆虫叮过敏和食物过敏，(2)炎症性肠疾病，如克罗恩病(Crohn′sdisease)，溃疡性结肠炎，回肠炎和肠炎，(3)阴道炎，(4)牛皮癣和炎症性皮肤病，如皮炎，湿疹，特应性皮炎，过敏性接触性皮，荨麻疹和瘙痒，(5)血管炎，(6)脊柱关节病，(7)硬皮病，(8)哮喘和呼吸道过敏性疾病等，如过敏性哮喘，过敏性鼻炎，慢性阻塞性肺疾病，过敏症肺疾病等，(9)自身免疫性疾病，如关节炎(包括风湿性和牛皮癣性)，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，I型糖尿病，肾小球肾炎等等，(10)移植排斥反应(包括同种异体移植排斥反应和移植物宿主疾病)以及(11)其中将要抑制不希望的炎症的其它疾病，如动脉粥样硬化，肌炎，T细胞介导的神经变性疾病，多发性硬化症，脑炎，脑膜炎，肝炎，肾炎，脓毒症，结节病、过敏性结膜炎，耳炎，卡斯尔曼氏病(Castleman′s disease)，鼻窦炎，LPS诱发的内毒素休克，白塞氏综合征(Behcet′s syndrome)和痛风。类风湿性关节炎和Th2介导的炎症是特别优选的用本发明的抗体治疗的疾病。
如本文所用，术语″异常增殖″指偏离正常的、适当的或预期的过程的细胞增殖。例如，异常细胞增殖可能包括其DNA或细胞成分已受损或有缺陷的细胞的不适当增殖。
异常细胞增殖可能包括特征是与由不恰当的高水平细胞分裂、不恰当的低水平的细胞凋亡或这两者引起、调节或导致所述不恰当的高水平细胞分裂、不恰当的低水平的细胞凋亡或这两者的适应症相联系的细胞增殖。此类适应症的特征可能为例如癌性或非癌性、良性或恶性的细胞、细胞群、或组织的单个或多个局部异常增殖，。
本文中任何对″肿瘤”的引用也指″癌症″或″癌″。转移性癌症也可以被治疗，如可以减少原发性肿瘤的转移。手术后患者体内的所谓轻微后遗症(MRD)可能通过抗CXCR4抗体的免疫疗法来控制。
因此，本发明进一步提供了治疗如上所述的疾病的方法和用途，所述方法和用途包含对罹患这种疾病的动物或患者施用治疗有效量的本发明的抗CXCR4抗体、或抗CXCR4抗体的抗原结合片段或免疫轭合物。
本发明的另一个方面提供了本发明抗体或所述抗体的抗原结合片段或免疫轭合物在生产用于治疗、造影或诊断的成分或药剂中的用途。
本发明的另一个方面提供了用于治疗、诊断或造影的本发明抗体或所述抗体的抗原结合片段或免疫轭合物。
此外，本发明提供了组合物，其包含本发明抗体或所述抗体的抗原结合片段或免疫轭合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲剂或稳定剂。
如本文所述的体内的方法一般在哺乳动物内进行。可以治疗任何哺乳动物，如人类和任何牲畜、家养或实验室动物。具体的例子包括小鼠，大鼠，猪，猫，狗，羊，兔，牛和猴。但是，优选该哺乳动物是人。
因此，如本文中所用，术语″患者″或″动物″包括任何哺乳动物，例如人类和任何禽畜，家养或实验动物。具体的例子包括小鼠，大鼠，猪，猫，狗，羊，兔，牛和猴。但是，优选该动物或患者是人类受试者。
本发明联合两种方法，一种是使用未轭合的或裸的抗体和其片段治疗上文所述病症的方法，另一种是使用免疫轭合物(其中本发明的抗体或者其抗原结合片段操作性连接到治疗性或诊断性药剂上)的CXCR4+细胞(优选是CXCR4+肿瘤细胞或免疫系统的CXCR4+细胞，如可以由HIV的CXCR4热带株感染的细胞)靶向方法。除非另有明确说明或用科学术语清楚表明，否则本文使用的术语″抗体和其片段″因此是指″未轭合的或裸的″抗体或片段，其连接至另一药剂，尤其是治疗性或诊断性药剂。这些定义不排除对抗体的修改，例如仅举例而言，用于提高抗体、或具有其它效应子与抗体组合的生物半衰期、亲和力、活动性或其它属性的修改。
本发明的治疗方法和用途还包括未轭合的或裸的抗体及免疫轭合物的用途。在基于免疫轭合物的治疗方法中，本发明的抗体或其抗原结合片段优选操作性连接到第二治疗性药剂上(第一治疗性药剂是抗-CXCR4抗体)。
合适的治疗剂可以根据待治疗疾病或病状和/或治疗作用的所需模式来选择。
例如，当作用的所需模式是拮抗性的，例如调节靶CXCR4+细胞的细胞信号，例如调节靶细胞内的信号或调节靶细胞对其它细胞的信号，或下调或抑制CXCR4+细胞的功能/信号，如肿瘤细胞或参与炎症或自身免疫应答的免疫系统的细胞或容易受到病毒如HIV感染的细胞，则适当的药剂可能是免疫调节治疗药剂例如抗炎药，如皮质类固醇(优选糖皮质激素)或非类固醇抗炎药(NSAID)如COX-2抑制剂、磺苯胺、力克飞龙(licofelone)和Ω-3脂肪酸、类固醇拮抗剂、细胞因子或趋化因子拮抗剂、或细胞因子或趋化因子表达的抑制剂。替代性药剂可以是血管生长抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)，内皮他丁(endostatin)，任何一种血管形成素(angiopoietins)，血管抑制素(vasculostatin)，血管生成抑制因子(canstatin)或抑癌基因(maspin)。替代性药剂可以是额外的信号通路抑制剂，例如生长因子受体(例如，EGFR IGF受体如IGF-1受体(IGF-1R)、IGF-2R、IGF结合蛋白(IGFBP-3)和FGFR)的抑制剂。
当抑制CXCR4+细胞的生长是所需的作用模式(如在癌症治疗中)时，则可以选择具有生长抑制作用的合适药剂，例如治疗性的抑制细胞生长药剂如类固醇受体(如雌激素受体)。
当细胞杀伤是所需作用模式时，则可以选择合适的细胞毒性药剂例如放疗药剂或ATP酶(ATPase)抑制剂。
对于癌症治疗，还可使用适当的抗癌药物。
或者，在抗病毒的应用中，例如HIV治疗中，合适的抗病毒药剂可被用作额外的治疗手段。
重点要注意的是多种作用模式可能适合于某些疾病或疾病的阶段，并且若如此，则可以使用多种额外治疗手段。同样重点要注意的是许多药剂具有多重效果或根据所处环境产生不同的效果。阻断的信号通路可对肿瘤细胞的迁移以及肿瘤的生长产生作用。许多化疗药物也具有一个以上的功能。与抗炎应用相比，趋化因子及其拮抗剂可在癌症方面具有不同效果。然而，根据疾病、疾病的阶段和所需的作用模式来选择适当的额外治疗药剂是在所属领域的技术人员的能力之内。
额外的治疗剂可能以免疫轭合物形式提供，也可替代性地以组合疗法提供，例如，如果更合适的话，当不同的药剂被一起(例如作为混合物)、分别或随后地施用时。
前述的多个治疗方法和用途一般将涉及向动物或患者全身性地施用药学有效组合物，如通过经皮注射、肌内注射、静脉注射等。然而，可以接受允许治疗药剂定位肿瘤位点或者其它适合的位点(例如发炎或者病毒感染的位点)的任何施用途径。因此，递送的其它适合途径包括口服递送，鼻部递送或呼吸递送和局部递送。
如本文所用，″施用″意义为以有效发挥疗效(例如抗肿瘤、抗炎或抗病毒效果)的一个或多个量和一段时间来提供或递送抗CXCR4抗体治疗剂。蛋白质治疗剂的被动施用一般来说是优选的，部分是因为它的简单性和可重复性。
然而，术语″施用″在本文用于指将本发明的抗CXCR4抗体递送或提供到靶位的任何和所有方式。″施用″因此包括以有效导致递送到靶位的方式来提供生产本发明的抗CXCR4抗体的细胞。在这种实施方案中，可能需要配制或包装这细胞在选择性透膜、结构或可植入器件(通常可以移除从而停止治疗)内。本发明的外源性抗CXCR4抗体一般仍将是优选的，因为这代表着允许剂量被密切监测和控制的非侵入性方法。
本发明的治疗方法和用途还扩展至以有效导致它们表达在肿瘤附近或者它们定位爱在靶位的方式，提供编码本发明的抗CXCR4抗体的核酸。可以使用任何基因治疗技术，如裸DNA递送，重组基因和载体，基于细胞的递送，包括患者细胞的体外操作等等。
本发明的抗-CXCR4抗体还可以用于向靶位递送其它治疗性的或诊断性的药剂。在这种实施方案中，其它治疗性的或诊断性的药剂一般操作性附着至本发明的抗CXCR4抗体。
本发明中使用的″治疗有效量″是本发明的CXCR4抗体或其免疫轭合物的量，该量可有效抑制CXCR4配体到CXCR4的结合；抑制对CXCR4配体的CXCR4-介导细胞应答，优选的是抑制在应答于CXCR4配体的钙离子释放或抑制CXCR4+细胞迁移；减轻炎症反应；抑制转移的形成；抑制肿瘤细胞侵入；抑制肿瘤生长；抑制肿瘤血管生成；在施用罹患CXCR4+肿瘤的动物或者患者药物后诱导肿瘤退化或缓和；限制CXCR4HIV热带株的传播和/或，当作用机制涉及细胞杀伤时，特异性地杀死至少一部分靶标CXCR4细胞。优选地实现此类效果并同时表现对正常细胞、健康组织的极少结合或不结合，或极少杀死正常细胞、健康组织以及对动物或患者的正常、健康组织施加可忽视或可控制的不良副作用。
所谓″靶位″是指CXCR4+细胞的位置，其介导病症或其以导致或加剧病症的异常方式增殖。靶位可能因此，例如是肿瘤或CXCR4-介导的炎症位点。″靶标细胞″是介导病症或其以导致或加剧病症的的异常方式增殖的CXCR4+细胞。因此，靶标细胞可以例如包括CXCR4+肿瘤细胞，免疫系统细胞如CXCR4+白细胞(用于抗炎/抗自身免疫的应用)或被CXCR4HIV热带株靶向标的CXCR4+免疫细胞。
如本文中在杀死CXCR4+细胞例如CXCR4+肿瘤细胞、CXCR4+白细胞(用于抗炎/抗自身免疫的应用)或减少炎症或诱导肿瘤退化或缓和的背景中所用，术语″优先地″和″特有地″因此意味着本发明的抗CXCR4抗体或其免疫轭合物作用为实现CXCR4+靶标细胞破坏(肿瘤细胞破坏)的功能，例如肿瘤细胞的破坏，所述破坏大体局限于靶位并且大体不扩展以致造成动物或受试者的正常、健康的组织破坏。
本发明的抗CXCR4抗体或治疗性轭合物优选被联接到一种或多种放射治疗剂、化疗药剂、抗血管生成药剂、凋亡诱导药剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒性药剂、细胞因子或趋化因子拮抗剂、细胞因子或趋化因子表达的抑制剂、ATP酶抑制剂、抗炎药、其它抗体(例如作为双特异抗体)或凝血剂(凝血因子)或抗炎剂如皮质类固醇，优选的是糖皮质素、或非类固醇抗炎药(NSAID)。
本发明因此提供一系列的轭合抗体和其片段，其中抗CXCR4抗体操作性附着到至少一种其它治疗性或诊断性药剂。术语″免疫轭合物″宽泛地用来定义抗体与另一有效药剂的操作性缔合并且无意仅仅指任何类型的操作性缔合，并且特别不限定于化学″轭合″。特别考虑了重组融合蛋白。只要递送或靶向药剂能够结合到靶标并且该治疗性或诊断性药剂在递送时具有充分功能性，则附着的模式将是适合的。
药剂通过抗体上的碳水化合物部分附着也在设想中。在O-联和N-联的糖基化都在抗体中自然发生。如果需要的话，重组抗体可以被修饰以重新创建或创建额外的糖基化位点，这简单地通过在抗体的原始序列中工程设计合适的氨基酸序列(例如Asn-X-Ser，Asn-X-Thr，Ser或Thr，其中X是除Pro之外的任何氨基酸)来实现。
在本发明的抗CXCR4抗体或治疗性轭合物以及相关方法和用途中使用的目前优选的药剂是补充或强化抗体的效果的那些药剂和/或针对具体病症类型(肿瘤类型)或患者选择的那些药剂。
″补充或强化抗体效果的治疗剂″包括放射治疗药剂，化疗药剂，抗血管生成药剂，凋亡诱导药剂，抗微管蛋白药剂，抗细胞或细胞毒药剂，凝血剂，细胞因子或趋化因子拮抗剂、细胞因子的或趋化因子的表达抑制剂，ATP酶抑制剂，抗炎药如皮质类固醇激素，优选的是糖皮质激素或非类固醇抗炎药(NSAID)，其它抗体(例如作为双特异抗体)，优选在此处使用它们中的任何一个或多个。
目前优选的抗癌、尤其是抗白血病药剂包括蒽环类药物，如柔红霉素，阿霉素，阿糖胞苷，6-硫代鸟嘌呤，米托蒽醌、白消安(Myleran)，达沙替尼(SprycelTM)，强的松、硫酸长春新碱(Oncovin
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)，苯丁酸氮芥，氟达拉滨，喷妥司汀和克拉屈滨。
目前优选的抗血管生成药剂包括血管他丁，内皮他丁，任何一种血管生成素，血管抑制素()，血管生成抑制因子()和乳腺丝抑蛋白。
如本文所用，″抗微管蛋白药物”指任何药剂、药物、前体药物或它们的组合，其优选地通过直接或间接抑制细胞有丝分裂、优选是微管蛋白聚合或解聚所必需的微管蛋白的活性来抑制细胞有丝分裂。目前优选的抗微管蛋白药物包括秋水仙素，紫杉醇，长春花碱，长春新碱、去乙酰长春酰胺和一种或多种考布他汀(combretastatin)。
目前优选的NSAID包括COX-2抑制剂，磺苯胺，力克飞龙和ω-3脂肪酸。
优选药剂与本发明的抗CXCR4抗体的附着或缔合产生“免疫轭合物″，其中这种免疫轭合物往往具有强化的，甚至协调治疗性质，例如抗肿瘤或抗炎的性质。
抗细胞和细胞毒剂的使用(当合适时)导致本发明的抗CXCR4抗体″免疫毒素″，而凝血因子的使用导致本发明的抗CXCR4抗体″凝血配体(coaguligands)″。
也考虑了至少两种治疗剂的使用，例如一种或多种上述药剂的组合。
在某些应用中，本发明的抗CXCR4抗体治疗剂将操作性附着到细胞毒性、细胞生长抑制性或其它抗细胞药剂，其具有杀死或者抑制细胞生长或者细胞分裂的能力。适合的抗细胞药剂包括化疗药物和细胞毒剂以及细胞生长抑制剂。细胞生长抑制剂一般是扰乱靶标细胞的自然细胞周期以优选使得细胞脱离细胞周期的那些。
示例性化疗药物包括：激素，如类固醇；抗代谢产物(anti-metabolites)，如阿糖胞苷，氟尿嘧啶，氨甲蝶呤或氨喋呤；蒽环类；丝裂霉素C；长春花生物碱；抗生素；秋水仙胺(demecolcine)；依托泊苷；光神霉素(mithramycin)和抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或马法兰。某些优选的抗细胞药剂是DNA合成抑制剂，如柔红霉素，亚德里亚霉素/阿霉素(doxorubicin/adriamycin)等等。总体而言，紫杉酚/紫杉醇，多西紫杉醇，顺铂，吉西他，考布他汀(combretastatin)和亚德里亚霉素/阿霉素是目前优选的抗癌药剂。
V-型ATP酶抑制剂也是目前优选的，如salicylihalamide、刀球肮霉素(concanamycin)或巴佛洛霉素(bafilomycin)，还优选的是蛋白质合成抑制剂，如(psymberin)、青腰虫素(pederin)、irciniastatin A.
在某些治疗性应用中，毒素部分将是优选的，这是因为相比其它潜在药剂，大多数毒素有更强的递送细胞杀伤效果的能力。因此，本发明的抗CXCR4抗体构造的某些优选抗细胞药剂是从植物源、真菌源或细菌源的毒素。示例性毒素包括表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)；细菌性内毒素或细菌性内毒素的脂质A部分；核糖体失活蛋白，如皂素或白树毒素；a-八叠球菌(a-sarcin)；麦霉素；局限曲菌素；核糖核酸酶，如胎盘核糖核酸酶；白喉毒素和假单胞菌外毒素。目前优选的例子是蓖麻毒素，白树毒素，相思豆毒素，白喉，假单胞菌和百日咳毒素。
某些优选的毒素是A链毒素，如蓖麻毒素A链。最优选的毒素部分往往是经过处理，修改或删除碳水化合物基的蓖麻毒素A链，所以叫″去糖基化A链″(dgA)。去糖基化蓖麻毒素A链是优选的，因为其极高的潜能、更长的半衰期，并且因为以临床等级和规模生产它是经济可行的。也可以使用重组和/或截短的蓖麻毒素A链。
本发明的抗-CXCR4抗体治疗剂可包含能够促进凝血的成分(即，凝血剂)。在此，靶向抗体可直接或间接地例如通过另一种抗体而联接到直接或间接刺激凝血的因子。
针对此用途的优选凝血因子是组织因子(TF)和TF衍生物，例如截短TF(tTF)、二聚、三聚、聚合/多聚TF和活化因子VII的能力缺陷的变种TF。其它合适的凝血因子包括维生素K依赖性凝血剂，例如因子II/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa；缺乏Gla修饰的维生素K依赖性凝血因子；罗素(Russell′s)蝮蛇蛇毒因子X活化剂；小板活化化合物，如血栓素A2和血栓素A2合酶；和纤溶抑制剂，如α2-抗血浆素。总体而言，截短的组织因子(tTF)是目前优选的。
免疫轭合物和免疫毒素的制备一般在本领域内众所周知(参见例如美国专利号4,340,535)。以下各专利进一步以引用方式并入本文，目的是在免疫毒素的生成、纯化和使用方面更进一步补充本教示：美国专利号6,004,554；5,855,866；5,965,132；5,776,427；5,863,538；5,660,827和6,051,230。
各种各样的化疗剂和其它药理剂也可以成功地与本发明的CXCR4抗体治疗剂轭合。已与抗体轭合的示例性抗肿瘤药剂包括阿霉素、柔红霉素、氨甲蝶呤和长春花碱。此外，其它药剂的附着，如新制癌菌素，大分子霉素，三亚胺醌(trenimon)和α-鹅膏菌素(α-amanitin)已被描述(见美国专利号5,660,827；5,855,866；和5,965,132；全部并入本文)。
凝血配体的制备也可以容易地进行。一个或多个凝血因子与本发明抗CXCR4抗体的操作性缔合可能是一种直接链接，例如上文针对免疫毒素所述那些。或者，该操作性缔合可能是一种间接附着，例如在抗体操作性附着到第二结合区(优选是抗体或抗体的抗原结合区)的情况下，所述结合区结合到凝血因子。特别在用共价键来接合分子的情况下，凝血因子应该在不同于其功能性混凝位点处结合到本发明的抗CXCR4抗体上。
在本发明的方法中也可采用双特异或三特异抗体。在这种抗体中，一个臂结合到CXCR4并且是本发明的抗体。制备双特异抗体的方法众所周知并且在本领域中有所描述。
在免疫轭合物、免疫毒素和凝血配体的制备过程中，可以采用重组表达。编码本发明的所选抗CXCR4抗体以及治疗剂、毒素或凝血剂的核酸序列在框架内附着至表达载体。因此，重组表达导致核酸的翻译从而生成所需的免疫轭合物。化学交联剂和抗生物素蛋白：生物素桥也可以将治疗剂与本发明的抗CXCR4抗体结合。
本发明的组合物和方法可以用于其它治疗剂和诊断剂的组合中。就生物药剂、优选诊断剂或治疗剂来说，对于与根据本发明的抗CXCR4抗体“联合”使用，简洁地用术语″联合″来涵盖实施方案的范围。除非另有明确说明或用科学术语清楚表明，否则术语″联合″适用于组合的组合物、药品、混合药剂、试剂盒、方法和第一和第二的医疗用途的各种形式。
本发明的″组合的”实施方案因此包括例如这样的情况，本发明的抗CXCR4是裸抗体并且与未操作性结合至其的药剂或治疗剂联合使用。在这种情况下，此药剂或治疗剂可以非靶向或靶向形式来使用。在“非靶向形式”中，药剂、特别是治疗剂一般将根据它们在本领域中的标准用途使用。在″靶向形式″中，药剂一般将操作性附着于不同抗体或靶向区，所述靶向区将药剂或者治疗剂递送到达靶标疾病位点。生物药剂(诊断剂和治疗剂)的这种靶向形式的使用在本领域中也是相当标准的。
在本发明的其它“组合的”实施方案中，本发明的抗CXCR4抗体是一种免疫轭合物，其中抗本身与药剂或者治疗剂操作性缔合或组合。操作性附着包括如本文所述和本领域内已知的直接或间接的所有附着形式。
″组合的″使用，特别对于本发明的抗CXCR4抗体和治疗剂的组合，还包括组合的组合物，药品，混合药剂，试剂盒，方法，和第一和第二医疗用途，其中治疗剂以药物前体的形式出现。在这种实施方案中，能够将药物前体转化为药物的功能性形式的活化成分可能再次与本发明的抗CXCR4抗体操作性缔合。
在某些优选的实施方案中，治疗性的组合物，组合，药物，混合药剂，试剂盒，方法和第一和第二医疗用途将会是″药物前体组合″。如本领域技术人员将理解，除非另有说明，否则术语″药物前体组合″是指本发明的抗体操作性附着到能够将药物前体转化为药物的组合物，而不是抗体附着到药物前体本身。然而，没有要求本发明的药物前体必需作为药物前体组合来使用。因此，药物前体可以按它们在本领域内使用的任何方式来使用，包括ADEPT和其它形式。
因此，当描述组合的组合物、药品、混合药剂、试剂盒、方法和第一和第二医疗用途时，优选对于诊断性的药剂，并且更优选治疗剂，所述组合包括其为裸抗体和免疫轭合物的抗CXCR4抗体的组合，而且其中本发明的体内实施方案的实践涉及在先、同时或随后施用裸抗体或免疫轭合物和生物药剂、诊断剂或治疗剂；只要以某种轭合或非轭合形式，实现某种形式的抗体和某种形式的生物药剂、诊断剂或治疗剂的全部提供。
本发明对肿瘤的效果的上述和其它解释为了简明解释操作、附着药剂等等的组合模式。此说明性方法不应视为对本发明的抗-CXCR4抗体的有益性质的保守描述或过分简化。因此应理解，这种抗体本身具有抗-CXCR4性质并且这种抗体的免疫轭合物将保持这些性质并将它们与所附着药剂的性质组合；此外，抗体和任何附着药剂的组合效果通常将会被增强或/和放大。
本发明因此提供组合物、药品组合物、治疗性试剂盒和药用混合药剂，其任选在至少第一组合物或容器中包含生物有效量的本发明的至少第一抗-CXCR4抗体、或此抗-CXCR4抗体的抗原结合片段或免疫轭合物；以及生物有效量的至少第二生物药剂、成分或系统。
″至少第二生物药剂、成分或系统″将往往是治疗性或诊断性的药剂、成分或系统，但非必需如此。例如，至少第二生物药剂、成分或系统可包含用于修饰抗体和/或用于将其它药剂附着至抗体的成分。某些优选的第二生物药剂、成分或系统是用于制作和使用药物前体的药物前体和成分，(其包括用于制作药物前体本身的成分和用于使本发明的抗体适于在此类药物前体或ADEPT实施方案中发挥作用的成分)。
当治疗剂或诊断剂作为至少第二生物药剂、成分或系统被包括时，这种治疗剂或诊断剂将通常是与一个或多个上文定义的疾病的治疗或诊断联合使用的那些。
因此，在某些实施方案中″至少第二治疗剂″将包括治疗性的试剂盒或者混合药剂。这个术语是根据本发明的抗CXCR4抗体为第一治疗剂。与本发明相对应的合适成为″至少第二治疗剂″的治疗性地药剂在上文与免疫轭合物联系着被讨论。
对于本发明的组合物、试剂盒和/或药物而言，治疗剂的组合的有效数量可能被包含在单个容器或容纳方式中，或被包含在不同的容器或容纳方式内。混合药剂通常被混合在一起以便组合使用。配制用于静脉注射施用的药剂通常是优选的。成像成分也可被包括在内。该试剂盒还可包含对使用至少第一抗体和包括在内的一个或多个其它生物药剂的说明书。
总体而言，至少第二治疗剂可与本发明的抗-CXCR4抗体大体同时地施用于动物或患者；例如从单一药物组合物或从一起施用的两种药物组合物。
或者，至少第二治疗剂可以在施用本发明的抗C X C R4抗体之后随即地施用于动物或患者。如本文所用，“之后随即地”指″错开″，使得至少第二治疗剂对动物或者患者的施用在时间上不同于本发明的抗C X C R 4抗体的施用。一般来说，这两个药剂以有效间隔的时间施用，从而发挥两个药剂各自的治疗效果，即，它们以″生物有效时间间隔″来施用。至少第二治疗剂可以在生物有效时间上早于本发明的抗C X C R 4抗体、或在生物有效时间上顺序于该治疗剂来被施用于动物或患者。
因此，本发明提供治疗罹患肿瘤的动物或患者的方法，所述方法包括：
(a)使动物或患者经受显著降低肿瘤负荷的第一治疗；和
(b)随后施用本发明的至少第一抗-CXCR4抗体、或其抗原结合片段；任选地，其中抗体或片段与第二治疗剂操作性缔合。
优选的第一治疗包括手术切除和化疗干预。
在其它实施方案中，本发明提供治疗罹患CXCR4-介导病症的动物或患者的方法，所述方法包括：
(a)使动物或患者经受显著降低CXCR4介导的负荷如炎症的第一治疗；和
(b)随后施用本发明的至少第一抗-CXCR4抗体、或其抗原结合片段；任选地，其中抗体或片段与第二治疗剂操作性缔合。
在某些其它实施方案中，本发明的抗体和免疫轭合物可与一个或多个诊断剂(通常是用于与上文定义的病症的诊断联合使用的诊断剂)组合。因此一系列诊断性组合物、试剂盒和方法被包括在本发明中。
其它方面是对受试者诊断或成像的方法，所述方法包含将适当量的本文定义的本发明抗体或其它蛋白施用于受试者，和检测受试者中本发明的抗体或其它蛋白的存在和/或量和/或位置。
在一个实施方案中，本发明提供减轻动物体内与CXCR4表达相关的免疫抑制的方法，所述方法包含以在所述动物体内有效形成所述抗体和CXCR4的复合物的量向所述动物施用本发明的抗体、或其免疫轭合物，从而减轻动物体内与CXCR4表达相关的免疫抑制。
将根据上述使用和方法来成像或诊断的合适的疾病包括如本文另外所述的与CXCR4相关的任何疾病，并且优选是如本文另外所述的任何癌症。
在一个实施方案中，本发明提供诊断动物中的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使取自所述动物的测试样品与本发明的抗体或其免疫轭合物接触。
在另一个实施方案中，本发明提供诊断动物中的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使取自所述动物的测试样品与本发明的抗体或其免疫轭合物接触；
(b)测量或检测在该测试样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量和/或位置；任选地，
(c)与对照组比较抗体-抗原复合物的存在和/或量。
在上述方法中，所述接触步骤是在允许形成抗体-抗原复合物的条件下进行。适当的条件可容易地由所述领域的技术人员确定。
在以上方法中，可以使用任何适当的测试样品，例如活检细胞，疑似被疾病影响的组织或器官，或组织切片。
在某些上述方法中，测试样品中任何量的抗体-抗原复合物的存在将指示疾病的存在。优选地，对于待进行的积极诊断，测试样品中抗体-抗原复合物的量多于、优选显著多于合适的对照样品中的量。更优选地，显著更大水平是统计上显著的，优选的是概率值＜0.05。确定统计显著性的适当方法众所周知并在本领域中有所记录，并且可以使用它们中的任何一种。
本领域的技术人员可以容易地选择合适的对照样品，例如，在诊断特定疾病的情况下，合适的对照样品将是来自没有罹患该疾病的受试者的样品。例如，通过引用本领域中已知的正常受试者的范围，合适的对照″数值″也可被容易地确定，而不需每个测试中都操作对照″样品″，。
为了在诊断或成像应用中使用，本发明的抗体可用可检测标记标签(，例如辐射不透过标签或放射性同位素，如3H，14C，32P，35S，123I，125I，131I；放射性发射体(例如，α、β或γ发射体)；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，如异硫氰酸荧光素，罗丹明或荧光素；酶，如碱性磷酸酶，β半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子；或化学部分，如生物素，其可以通过与特异性同源可检测部分(例如被标记的抗生物素蛋白/链霉亲和素)结合而被检测)进行标签。将标签附着于结合蛋白(例如，抗体或者抗体片段)的方法是本领域中已知的。这种可检测的标记允许检测测试样品中结合蛋白-抗原复合物的存在，数量或位置。
体内使用的优选可检测标记包括可X射线检测的化合物，例如铋(III)、金(III)、镧(III)或铅(II)；放射性离子，例如铜67、镓67、镓68、铟111、铟113、碘123、碘125、碘131、汞197、汞203、铼186、铼188、铷97、铷103、锝99或钇90；核磁自旋共振同位素，例如钴(II)，铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、镁(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或镱(III)；或罗丹明或荧光素。
本发明还包括诊断剂或成像剂，其包含附着到标签从而直接或间接产生检测信号的本发明的抗体。合适的标签本文另有描述。
本发明进一步包括试剂盒，其包含一种或多种本发明的抗体、免疫轭合物或组合物或编码本发明的抗体的一种或多种核酸分子，或包含本发明的核酸序列的一种或多种重组表达载体，或包含重组表达载体或本发明的核酸序列的一种或多种宿主细胞或病毒。优选的所述试剂盒是用于本文所述的方法和用途，如本文所述的治疗、诊断性或成像的方法，或用于本文所述体外试验或方法。此类试剂盒中的抗体优选是如本文另外所述的抗体轭合物，例如，可能轭合到可检测性基团或可能是免疫轭合物。优选地，所述试剂盒包含针对例如在诊断中使用试剂盒组件，的说明书。优选地，所述试剂盒是用于诊断或治疗本文另外所述的疾病，并且任选地包含针对使用试剂盒成分来诊断或治疗这种疾病的说明书。
本文所定义的本发明的抗体还可能用作体外或体内应用和试验的分子工具。由于抗体拥有抗原结合位点，这些抗体可以充当特异性结合对的成员并且这些分子可以用于需要特定结合对成员的任何试验中。
因此，本发明的其它方面提供包含本文所述的本发明抗体的试剂和这种抗体作为分子工具例如在体外或体内试验中的用途。
癌症治疗也可以通过以下进行：
(a)通过以下方式形成肿瘤的图像：向罹患肿瘤的动物或患者施用诊断量的本发明至少一种可检测-标签的抗-CXCR4抗体，包含操作性附着到本发明的抗-CXCR4抗体的诊断剂，从而形成可检测的肿瘤图像；和，
(b)随后向同一动物或患者施用治疗优化量的本发明至少第一裸抗-CXCR4抗体或使用该抗体的治疗剂-抗体构造，从而导致抗肿瘤效果。
现将结合各表和附图在以下非限制性实例中更详细描述本发明，其中：
表1列出本文公开的涉及抗体C-9P21的一些序列，
表2列出本文公开的涉及抗体B-1 M 22的一些序列，
表3列出本文公开的涉及抗体C-1I24的一些序列，
表4列出本文公开的涉及抗体D-1K21的一些序列，
表5列出本文公开的涉及抗体9N10的一些序列，
表6列出本文公开的涉及IgG形式的抗体C-9P21的一些序列。可变区带有下划线。
表7列出本文公开的涉及IgG形式的抗体B-1M22的一些序列。可变区带有下划线。
表8列出本文公开的涉及IgG形式的抗体C-1I24的一些序列。可变区带有下划线。
表9列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体D-1K21的一些序列。可变区带有下划线。
表10列出本文公开的涉及IgG形式的抗体9N10的一些序列。可变区带有下划线。
表11列出了本文公开的涉及其它本发明的的抗体的一些序列。
附图说明
图1显示无性系C-9P21的尤其重和轻链的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通过NcoI/NotI位点克隆到pHOG21。用于初始克隆的限制性位点(NcoI、HindIII、MluI和NotI)是斜体并带有下划线。VH和VL之间的链接序列是斜体。c-myc抗原表位和6-His分别带有下划线和双下划线。
图2显示无性系B-1M22的尤其重和轻链的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通过NcoI/NotI位点克隆到pHOG21中。用于初始克隆的限制性位点(NcoI、HindIII、MluI和NotI)是斜体并带有下划线。VH和VL之间的链接序列是斜体。c-myc抗原表位和6-His分别带有下划线和双下划线。
图3显示无性系C-1I24的尤其重和轻链的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通过NcoI/NotI位点克隆到pHOG21中。用于初始克隆的限制性位点(NcoI、HindIII、MluI和NotI)是斜体并带有下划线。VH和VL之间的链接序列是斜体。c-myc抗原表位和6-His分别带有下划线和双下划线。
图4显示无性系D-1K21的尤其重和轻链的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通过NcoI/NotI位点克隆到pHOG21中。用于初始克隆的限制性位点(NcoI、HindIII、MluI和NotI)是斜体并带有下划线。VH和VL之间的链接序列是斜体。c-myc抗原表位和6-His分别带有下划线和双下划线。
图5显示无性系9N10的尤其重和轻链的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通过NcoI/NotI位点克隆到pHOG21中。用于初始克隆的限制性位点(NcoI、HindIII、MluI和NotI)是斜体并带有下划线。VH和VL之间的链接序列是斜体。c-myc抗原表位和6-His分别带有下划线和双下划线。
图6A显示EasyCyte染色，其证明B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21scFv无性系与CXCR4转染和非转染的HEK293细胞系的结合。图6B显示EasyCyte染色，其证明B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21scFv无性系与CXCR4转染和非转染的DT40细胞系的结合。图6C显示EasyCyte染色，其证明C-9P21、9N10和F7IgG无性系与Ramos和CCRF-CEM细胞系的结合。
图7A显示在有和没有配体和AMD-3100竞争的情况下分别使用0.5μgB-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21scFv无性系的105Jurkat细胞的EasyCyte染色。图7B显示在有和没有配体和AMD-3100竞争的情况下分别使用0.5μg B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21scFv无性系的105Ramos细胞的EasyCyte染色。图7C显示在有和没有竞争的情况下分别使用0.1μg C-9P21、9N10和F7IgG无性系的105CCRF-CEM细胞的EasyCyte染色。
图8A显示使用0.5μg C1I24(虚线)、B-1M22(深色实线)和F7(浅色实线)对比PBS(深色阴影)的105CCRF-CEM细胞的EasyCyte染色。图8B显示使用0.5μgD-1K21(虚线)、C-9P21(深色实线)和F7(浅色实线)对比PBS(深色阴影)的105CCRF-CEM细胞的EasyCyte染色。所有的抗体为IgG1格式并且通过山羊抗人IgGrPE二级抗体检测结合。
图9显示B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21与瞬时表达小鼠CXCR4的HEK293T/17细胞的结合。标记为“福吉因(Fugene)”的各列为用不含DNA的转染试剂处理的细胞。该列用作阴性对照物。
图10显示EasyCyte实验，其中B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21的scFv无性系被滴定于CCRF-CEM细胞上以确定用于Ca++通量试验的最佳浓度。
图11A、图11B、图11C和图11D和图11E显示CCER-CEM细胞上(标记为Fluo-4)Ca++通量试验的结果。抗体B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21在scFv水平(图11A)和IgG水平(图11B，图11C和图11D)上测试，无性系9N10在IgG水平上测试(图11E)。在添加CXCR4特异性配体SDF-1α之前，用4μg/ml scFvs(图11A)或10μg/ml和100μg/ml IgGs(图11B，图11C和图11D)，或者1μg/ml和10μg/mlIgGs(图11E)将细胞预培育15分钟。信号记录开始于添加配体约10秒之后。曲线下的面积(AUC)被积分并绘制为针对仅SDF-1α的最大刺激的AUC百分比。
图12A和图12B显示CCER-CEM细胞中(标记为Fluo-4)Ca++通量试验的结果。抗体C-9P21和9N10在IgG水平上测试。在添加CXCR4特异性配体SDF-1α之前，用不同浓度的抗体将细胞预培育15分钟。信号记录开始于在添加配体约10秒之后。图12A显示一系列浓度下的信号衰减。图12B显示原始数据。
图13显示抗-CXCR4scFv C-9P21对配体(SDF-1α)诱导的细胞迁移的抑制。用BATDA标记的人类T细胞白血病CCRF-CEM细胞在博伊登(Boyden)室内被诱导而迁移，其中SDF-1配体置于下室并且细胞与仅作为对照物的抗体或培养基在上室中共培育。在Triton X-100诱导的细胞溶解之后，通过荧光强度来检测迁移到下室的细胞。绘制三次重复试验的平均值和SD值。
图14A、图14B和图14C显示通过抗-CXCR4抗体B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21的ADCC诱导。针对C-9P21和D-1K21(a)的scFv，和C-9P21和D-1K21(b)的IgG，和B-1M22和C-1I24的IgG示出CCRF-CEM细胞的剂量响应杀伤。
图15A和图15B显示测试抗体B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21诱导CDC的能力的试验结果。针对B-1M22和C-1I24的IgG示出了在人血清存在下Ramos细胞的剂量响应杀伤(图15A)。C-9P21和D-1K21不诱导CDC(图15B)。作为对照，使用IgG形式的抗体F7。
图16A显示用膜联蛋白V进行的抗-CXCR4抗体B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21的凋亡活性分析。作为对照，使用抗体F7和星形孢菌素(Staurosporin)(S；25nM)。没有抗体和星形孢菌素加入的阴性对照(背景水平)显示于列0中。浅灰色阴影：死亡细胞总量，对膜联蛋白V和PI均为阳性，深灰色阴影：定义为对膜联蛋白V阳性但对PI阴性的凋亡细胞。图16B显示用膜联蛋白V进行的抗-CXCR4抗体C-9P21和9N10的凋亡活性分析。作为对照，使用抗体F7。轻浅灰色阴影：死亡细胞总量，对膜联蛋白V和PI均为阳性，深灰色阴影：定义为对膜联蛋白V阳性但对PI阴性的凋亡细胞。
具体实施方式
实施例1：新型抗体
五个可以特异性地结合到CXCR4的人抗体被确定。所述抗体的单链形式被克隆进入其中含有c-myc和6xHis标记抗原表位的pHOG21质粒(Kipriyanov et al.，1997)。TG1细菌被转化，并在IPTG诱导后表达单链抗体。纯化抗体的结合通过EasyCyte确认。
产生无性系的抗体的重和轻链的核苷酸序列被测序。抗体被指定为C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10。C-9P21的核苷酸序列和轻，重链的氨基酸序列示于图1。C-9P21的轻、重链的CDR区域示于表1。B-1M22的核苷酸序列和轻、重链的氨基酸序列示于图2。B-1M22的轻、重链的CDR区域示于表2。C-1I24的核苷酸序列和轻，重链的氨基酸序列示于图3。C-1I24的轻、重链的CDR区域示于表3。D-1K21的核苷酸序列和轻，重链的氨基酸序列示于图4。D-1K21的轻、重链的CDR区域示于表4。9N10的核苷酸序列和轻，重链的氨基酸序列示于图5。9N10的轻、重链的CDR区域示于表5。
还制备了抗体C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10的IgG格式。IgG形式是IgG1同种型，并且它包含两个重链和两个轻链。各重链包含VH域：SEQ ID NO：69(对应C-9P21)，SEQ ID NO：71(对应B-1M22)，SEQ ID NO：73(对应C-1I24)，SEQ ID NO：75(对应D-1K21)或SEQ ID NO：69(对应9N10)和人IgG1恒定区。各轻链包含VL域：SEQ ID NO：70(对应C-9P21)，SEQ ID NO：72(对应B-1M22)，SEQ IDNO：74(对应C-1I24)，SEQ ID NO：76(对应D-1K21)或SEQ ID NO：103(对应9N10)和人λ轻链恒定区(对应B-1M22和C1I24)或人类κ轻链恒定区(对应C-9P21，D-1K21和9N10)。C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21的9N10的全长IgG序列的分别示于表6、7、8、9和10。
细胞和细胞培养
CCRF-CEM(急性淋巴细胞白血病，ATCC号码CCL 119)、HEK293T/17(人肾，ATCC号码CRL 11268、Ramos(伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s leukemia)，ATCC号码CRL-1596)、Jurkat 6E-1(人体T细胞白血病，ATCC ECACC)和DT40(鸡淋巴瘤，ATCC号码CRL-2111)细胞系得自美国典型组织培养库(American Type CultureCollection)(ATCC，罗克维尔市，马里兰州(Rockville，MD))。CCRF-CEM、Ramos、Jurkat和DT40细胞被维持于RPMI-1640培养基中，并且HEK293T细胞被维持于达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM))培养基中。所有细胞均用胎牛血清维持，对DT40和HEK293T细胞，浓度为10％，并且对CCRF-CEM细胞、Jurkat和Ramos细胞，浓度为20％。所有培养基都用青霉素和链霉素补充。
Ramos和Jurkat细胞每周分裂三次，经48小时生长达到3x105细胞/毫升并且在周末达到2x105细胞/毫升。
CCRF-CEM细胞每周分裂三次，经48小时生长达到3x105细胞/毫升并在周末达到2x105细胞/毫升。
HEK293Y/17细胞每周分裂二至三次，经48小时生长达到3.2x105细胞/毫升并在周末达到2.7x105细胞/毫升。
为瞬时转染，HEK293T/17细胞以每个T75烧瓶中2x106细胞接种。接种48小时后，所述细胞用Fugene(罗氏(Roche))转染。每个T75使用40μl Fugene和16μgDNA。转染48小时后使用细胞进行分析。
实施例2：抗体无性系与CXCR4表达细胞结合的特异性
四个抗体B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21，在scFv水平上通过它们结合CXCR4表达细胞的能力来测试它们的CXCR4特异性。转化的细胞与它们未转化的同类仅仅区别在CXCR4的表达。
材料和方法
DT40和HEK293T/17细胞如上文所述那样维持。
从培养瓶中收集DT40+CXCR4、HEK293T/17+CXCR4、DT40和HEK293T/17细胞，用PBS洗涤2遍(400xg，5min，4℃)并且再悬浮于含0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS中。1x105细胞/孔被等分装入V-型96孔板(葛来娜第一生化(Greiner Bio-One)，Frikenhausen，德国)。细胞经离心(400x g，5min，4℃)并且再悬浮于50μl ScFvs(10μg/ml)的PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)。培育1小时(4℃)后，所述细胞用100μlPBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)洗涤3遍并且用自制哺乳动物抗c-Myc抗体(2.5μg/ml)来染色。培育1小时(4℃)后，细胞用100μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)洗涤3遍并且在4℃下用在PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)中稀释至5μg/ml的RPE轭合山羊抗小鼠IgG(F0479，Dako，丹麦)培育30分钟。细胞被洗涤，再悬浮于200μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)，并且转移至一个U-型96孔板(Costar，康宁(Corning)，Schiphol-Rijik，荷兰)以便使用Easy Cyte装置(Guava科技，海沃德(Hayward)，加利福尼亚(CA)，美国)进行流式细胞计量。
结果
除转化的HEK细胞上的B-1M22外，所有四个无性系显示对转染细胞系的特异性结合(见图6A和6B)，(但B-1M22抗体显示对DT40转染细胞的特异性结合)。应当注意指出的是已知CXCR4根据表达它的细胞系而具有发展稍有不同的构象的趋势(Baribaud等，2001)。这一事实很可能在不同的细胞系中造成不同的结果。在这些实验中，无性系C-9P21一般是最佳结合者。
此外，如下文所述，无性系9N10、C-9P21和F7在LgG水平上测试它们结合天然表达CXCR4的细胞(Ramos，CCRF-CEM)的能力。
材料和方法
Ramos和CCRF-CEM细胞在上文所述条件下培养。
从培养瓶中收获细胞，用PBS洗涤2遍(350xg，5min，4℃)并且再悬浮于含0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS中。1x105细胞/孔被等分装入V-型96孔板(葛来娜第一生化(Greiner Bio-One)，Frikenhausen，德国)。细胞经离心(350x g，5min，4℃)并且再悬浮于50μl LgG(50μg/ml)的PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)。以12个点和3倍稀释液进行滴定。培育1小时(4℃)后，细胞用PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)洗涤3遍并且在4℃下用在PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)中稀释至2.5μg/ml的RPE轭合山羊抗小鼠IgG(F0479，Dako，丹麦)培育30分钟。细胞被洗涤，再悬浮于200μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)，并且转移至U-型96孔板(Costar，康宁(Coming)，Schiphol-Rijik，荷兰)以便Easy Cyte仪器(Guava科技，海沃德(Hayward)，加利福尼亚(CA)，美国)进行流式细胞计量。
结果
在这个实验中，所有3个无性系以剂量依赖方式识别所述细胞系(见图6C)。当与9N10和C-9P21相比时，F7表现略微更佳地结合两个细胞系。
实施例3：抗CXCR4抗体干扰配体结合
四个抗体B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21在scFv水平上在存在和缺乏特异性结合到CXCR4的两种分子的情况下，通过它们结合到CXCR4转染细胞和组成型表达CXCR4的类淋巴母细胞的能力来测试它们的CXCR4特异性。一种分子是SDF-1，CXCR4的天然配体，另一种是AMD3100，对SDF-1α与CXCR4结合的高度特异性竞争性抑制剂。
材料和方法：
Jurkat和Ramos细胞如上文所述那样维持。
scFv无性系大规模表达并通过SEC分馏纯化为单体部分。从培养瓶中收获天然CXCR4+表示细胞系Jurkat和Ramos，用PBS(用0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)洗涤2遍并且以1x105细胞/孔被等分装入V-型96孔板(葛来娜第一生化(Greiner Bio-One)，Frikenhausen，德国)。细胞通过离心(400x g，5min)沉淀然后在4℃下在PBS(用0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)中用稀释至10μg/ml的1μgSDF-1α(PeproTech EC，伦敦，英国)和50μl scFv培养60分钟，SDF-1α和scFv两者被同时加入细胞。没有配体的样品或157μgAMD3100作为CXCR4特异性的对照，因为AMD3100仅结合到这种受体。AMD3100和scFv同时被加入细胞。在400g离心步骤5分钟之后吸走上清液，并且细胞用100μl PBS(用0.2％BSA和0.09％NaN3补充)再洗涤两遍并进行离心步骤(400g，5分钟)，然后在4℃下用在PBS(含用0.2％BSA和0.09％NaN3补充)中稀释至2.5μg/ml的50μl自制抗c-Myc培育1小时。在用PBS(用0.2％BSA和0.09％NaN3补充)洗涤3遍之后，细胞用在PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)中稀释至5μg/ml的rPE轭合山羊抗小鼠IgG(BD生物科学(Biosciences))染色并且在4℃下培育30分钟。细胞被再次洗涤并且用200μlPBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)再悬浮，并且被转移至U-型96孔板(Costar，康宁(Corning)，Schiphol-Rijik，荷兰)以便使用Easy Cyte仪器(Guava科技，海沃德(Hayward)，加利福尼亚(CA)，美国)进行流式细胞计量。
结果：
四个无性系中的三个(除B-1M22外)显示与两个细胞系的特异性结合。所有三个结合克隆还同时被SDF-1和AMD3100抑制，但竞争程度不同(见图7A(Jurkat细胞)和图7B(Ramos细胞))。这表明所述无性系结合到作为天然配体的大致相同结合位点，并且可能具有生物效应。对于B-1M22，结合水平太低以致不需对结合或竞争进行说明。然而，如以下的实例所示，B-1M22是本文所述的在CCRF-CEM细胞上结合CXCR4方面最佳的结合者之一(见实施例4和图8A)。此外，认为CXCR4根据表达它的细胞系有发展稍微不同的构象的趋势是对由B-1M22所得数据的解释。可以注意到C-9P21和C-1I24很好地结合到所有被测试的细胞种类，表明它们具有结合到多种构象的CXCR4的能力，这可能是非常有利的。
在另一个的实验中，如下文所述，三种抗体9N10、C-9P21和F7在IgG水平上，在存在和缺乏SDF-1(特异性结合到CXCR4的分子)的情况下，通过它们结合天然表达CXCR4的CCRF-CEM细胞的能力来测试它们的CXCR4特异性。
材料和方法：
CCRF-CEM细胞如上文所述那样维持。
从培养瓶中收获天然表达CXCR4+的CCRF-CEM细胞系，用PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)洗涤2遍并且以1x105细胞/孔被等分装入V-型96孔板(葛来娜第一生化(Greiner Bio-One)，Frikenhausen，德国)。细胞通过离心(350g，5min)沉淀然后在4℃下用在PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)中稀释至2μg/ml的4μg、1μg、0.5μg SDF-1α(PeproTech EC，伦敦，英国)和50μl IgG培育60分钟，SDF-1α和IgG两者被同时加入细胞。无配体样品作为对照。在350g离心步骤5分钟之后吸走上清液，并且细胞用150μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)再洗涤两遍，离心步骤(400g，5分钟)，然后在4℃下用在PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3补充)中稀释至2.5μg/ml的RPE轭合山羊抗人IgG(AbD seroTec#204009)染色，并培育30分钟。细胞被再次洗涤并且再悬浮于200μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)，并且被转移至U-型96孔板(Costar，康宁(Corning)，Schiphol-Rijik，荷兰)以便使用Easy Cyte仪器(Guava科技，海沃德(Hayward)，加利福尼亚(CA)，美国)进行流式细胞计量。
结果：
两种无性系C-9P21和9N10显示与CCRF-CEM细胞系的特异性结合。这两种无性系也被SDF-1抑制(见图7C)。应当注意的是在这个实验中，通过最高的绝对信号判断，F7显示与细胞的最佳结合。
实施例4：将抗体候选者转化为IgG格式
为了比较已识别抗CXCR4抗体的生物活性，B-1M22、C-1I24、C-9P21和D-1K21和9N10被转化成全长IgG1抗体格式。作为对照，产生抗体F7。F7抗体被描述为与CXCR4结合(见WO2008/060367，Medarex)。F7抗体的VH和VL链的序列被提供在WO2008/060367的SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：29中。为了产生IgG1格式的这种抗体，从F7抗体的氨基酸序列反推出优化的核苷酸序列，如专利WO2008/060367所述(VH：SEQ ID NO：25和VL：SEQ ID NO：29)。然后合成此序列，克隆成人IgG1/κ格式，如Norderhaug et al所述(JIM 204：27-87，1997年)，在HEK293细胞中表达并且随后通过蛋白A来纯化。为了确认IgG保留其与CXCR4阳性细胞结合的能力，都在天然表达CXCR4的CCRF-CEM细胞上评估所有IgG。
材料和方法：
编码对应的可变结构域的基因被克隆进入哺乳动物表达载体pLNO，所述pLNO包含用于人恒定结构域的基因(Norderhaug等，上文)。
抗体在细胞工厂中表达，并且第一收获物在蛋白A柱上纯化并且通过体积排阻色谱分级为单体。
从培养瓶中收获天然CXCR4+表达细胞系CCRF-CEM，用PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)洗涤2遍并且以1x105细胞/孔被等分装入V-型96孔板(葛来娜第一生化(Greiner Bio-One)，Frikenhausen，德国)。细胞通过离心(400g，5min)沉淀，然后在4℃下用在PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)中稀释至10μg/ml的50μl IgG培育60分钟。在400g离心5分钟之后吸走上清液，并且细胞用150μlPBS(用0.2％BSA和0.09％NaN3补充)再洗涤2遍，每次洗涤后都进行离心步骤(400g，5分钟)。然后在4℃下用在PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3补充)中稀释至2.5μg/ml的RPE轭合山羊抗人IgG(AbD seroTec)染色，并在4℃下培育30分钟。细胞被再次洗涤并且再悬浮于200μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)，并且被转移至U-型96孔板(Costar，康宁(Coming)，Schiphol-Rijik，荷兰)以便使用Easy Cyte仪器(Guava科技，海沃德(Hayward)，加利福尼亚(CA)，美国)进行流式细胞计量。
结果：
所有被测试的克隆都保留它们与CXCR4阳性细胞结合的能力(C-1124和B-1M22见图8A；C-1124和B-1M22见图8B，D-1K21和C-9P21；9N10的数据没有显示)。从图8的EasyCyte曲线中应当注意的是在这些实验中，相比F7抗体，本文所述的无性系显示与CXCR4表达CCRF-CEM细胞显著更佳结合(中间值48.11(F7)，179.03(D-1K21)，626.43(C-9P21)，910.58(C-1I24)和1077.33(B-1H22)对比3.11(PBS阴性对照)。
实施例5：物种交叉反应性
抗体候选者在scFv水平上测试它们与来自猴和小鼠的CXCR4交叉反应的能力。
材料和方法：
HEK293T/17细胞在上文所述条件下培育。
使用经编码小鼠(基因库(Gene bank)收录号BC031665)或者猴(猕猴)(NCBI收录号NP_001036110)CXCE4的染质粒瞬时转染的HEK-293细胞来进行FACS-结合分析(EasyCyte)。进行两个实验，一个使用α-cMyc和PE-标记的山羊抗小鼠IgG抗体，第二个使用用于检测的直接轭合的RPE-c-Myc抗体。此外，分析IgG水平上的交叉反应性。在后一种情况下，用PE-轭合山羊抗人IgG抗体来检测抗体结合。
结果：
D-1K21显示与小鼠和猴CXCR4的良好交叉反应性。scFv变种B-1M22、C-9P21和C-1I24也显示与猴抗原的良好交叉反应性，但与小鼠CXCR4的反应性为低(B-1M22)到中等(C-1I24，C-9P21)。(见图9)。还测试9N10，并且显示具有与C-9P21相同的交叉反应性模式，和略微高的结合的绝对值。
实施例6：通过CXCR4对配体-诱导信号的抑制
抗CXCR4抗体B-1M22、C-1I24、C-9P21和D-1K21均在scFv和LgG水平上测试它们影响SDF-1α配体诱导Ca++通量的能力。9N10仅在IgG水平上测试。该实验使用天然CXCR4+阳性CCRF-CEM细胞系来进行。
在第一个步骤中，最佳抗体浓度通过在CCRF-CEM细胞上滴定抗体来确定。
材料和方法：
CCRF-CEM细胞如上文所述那样维持。
从培育瓶中收获天然CXCR4+表达CCRF-CEM细胞系，用PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)洗涤2遍并且以1x105细胞/孔被等分装入V-型96孔板(葛来娜第一生化(Greiner Bio-One)，Frikenhausen，德国)。细胞通过离心(400g，5min)沉淀然后在PBS缓冲液(由0.2％BSA和0.09％NaN3缓冲液补充)中用稀释至10μg/ml起始浓度并进一步用2倍稀释液滴定11遍的50μl IgG在4℃下培育60分钟。在400g离心步骤5分钟之后，吸走上清液，并且细胞用100μl PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3补充)再洗涤2遍，每次洗涤后进行离心步骤(400g，5分钟)。然后细胞在PBS(由0.2％BSA和0.09％NaN3补充)中用稀释至5μg/ml的rPE轭合山羊抗人IgG(AbD seroTec)染色，并在4℃下培育30分钟。细胞被再次洗涤并再悬浮于200μl PBS(含0.2％BSA和0.09％NaN3)中，并且被转移至一个U-型96孔板(Costar，康宁)以便使用Easy Cyte仪器(Guava科技，海沃德(Hayward)，加利福尼亚，美国)进行流式细胞计量。
结果：
因此，确认用于竞争实验的抗体浓度是10μg/ml或100μg/ml的IgG(9N10除外，这种情况下浓度是1μg/ml或10μg/ml)(数据未显示)和4μg/ml的scFv(见图10)。
在识别正确浓度后，进行实际竞争试验。
材料和方法：
CCRF-CEM靶标细胞通过离心收获，并且用RPMI-1640培养基洗涤2遍。将1ml 2.5×106个或细胞(对应IgG)10ml 2.5×107细胞(对应scFv)与Fluo-4-AM(醋酸基甲基酯；英杰公司(Invitrogen))、普郎尼克(Pluronic)F-127(英杰公司)和丙磺舒(Probenecid)分别混合为最终浓度1μM，0.02％和1mM。细胞在垂直转轮(7转/分钟)上于37℃下培育60分钟。所有随后步骤在1mM二丙苯磺胺的存在下进行。细胞在含10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640中洗涤2遍，一次在分析缓冲液(145mM NaCl，4mM KCl，1mM NaH2PO4，0.8mM MgCl2，25mM Hepes，22mM，22mM葡萄糖)中，并且随后再悬浮至最终浓度(4x106细胞/毫升)。混合相同体积的细胞、有和没有抗体和配体(SDF-1α)的分析缓冲液。前两个成分(细胞和抗体)预-培育15分钟，然后添加配体SDF-1α(最终浓度50ng/ml)。抗体的最终浓度是10μg/ml或100μg/ml的IgG以及4μg/ml的scFv。立即使用FACSCantII(BD生物科学)的515-545nm带通滤波器进行分析样品。曲线下面积(AUC)使用Prism软件(GraphPad)来积分和并且绘制为针对仅SDF-1α的最大刺激的AUC百分比。
结果：
在scFv水平上，变体C-9P21和D-1K21表现强烈拮抗活性。C-1I24也显示一些拮抗作用。B-1M22没有表现活性(图11A)。
在IgG水平上，五个被测试抗体中的四个(B-1M22，C-1I24，C-9P21和9N10)表现出对SDF-1-诱导信号传导的抑制(图11B、C、D和E)。由于未知原因，变体D-1K21在IgG格式中似乎仅在高浓度下有轻微抑制。
此外，没有一个抗体可以自身诱导信号传导，即抗体没有显示拮抗活性(数据未显示)。
总的来说，表明所有抗体显示对SDF1α结合到CXCR4所诱导的Ca++信号传导的拮抗作用。C-9P21和9N10具有最突出的效果。
在另一个实验中，与C-9P21相比，在IgG水平上测定9N10减少配体诱导的钙通量的能力。
材料和方法：
实验如上文所述那样进行，但是以浓度为100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.064和0.00128μg/ml滴定系列使用所述抗体。
结果：
结果表明，相比于C-9P21的29的IC50(nM)，9N10在钙通量抑制上的效率为约8倍，IC50(nM)为3.85(见图12A和图12B)。
实施例7：对配体诱导细胞迁移的抑制
scFv C-9P21降低配体诱导的细胞迁移的能力在CXCR4+的CCRF-CEM细胞系中评估。抗-GFP scFv片段用作阴性对照并且抗-cMyc抗体被用来交联两种scFv以模仿IgG格式抗体的效果。
材料和方法：
CCRF-CEM细胞如上文所述那样维持。
CCRF-CEM靶标细胞通过离心沉淀，并且用不含FCS的RPMI-1640培养基洗涤2遍。细胞密度随后被调整至1x106细胞/毫升并且将60ml的悬浮液与38μl的BATDA[双(醋酸基甲基)2，2’:6’，2”-三联吡啶-6，6”-二羧酸酯)](Perkin Elmer，Ealtham，MA)混合。细胞在BATDA中于37℃被培育20分钟，并且通过每10分钟温和地倒置容器来混合。细胞含20％FCS的RPMI-1640中洗涤3遍。并且随后再悬浮于RPMI-1640/20％FCS达到2X107细胞/毫升的最终浓度。将标记的细胞与同样体积的含10％FCS培养基、抗c-Myc抗体(克隆9E10)和scFv C-9P21的系列1/2稀释液混合，从而导致分别为浓度20μg/ml和32μg/ml到16ng/ml的抗-cMyc LgG和scFv C-9P21。32μg/ml的抗-GFP scFv作为阴性对照与20μg/ml的抗-cMyc抗体组合使用。同时，将含0.15nM SDF-1α配体的30μlRPMI加入ChemoTX 96孔博伊登(Boyden)腔板(Neuro Probe，盖色斯堡(Gaithersburg)，马里兰(MD))的下隔间。50μl抗体-包裹的BATDA-标记的细胞随后加入ChemoTX 96孔博伊登腔板的上隔间并且在这个状态下于37℃培育2.5个小时。滤纸上的细胞随后被移除并且滤纸用PBS洗涤，接着所述板以收集下室的所有细胞，然后移除所述滤纸。该板随后倒置于V-形板的顶部，然后离心。V-形板中的细胞用100μl PBS洗涤，通过离心沉淀并且再悬浮于含1.3％Triton X-100的35μl PBS中。所述样品转移至黑色96孔微量滴定板，与200μl铕溶液(Europium Solution)(Perkin Elmer)混合，并且使用TECAN M200读板器分析荧光(在340nm处激发，在613nm处放射，滞后时间0.4ms并且积分时间0.4ms)。对各抗体浓度，计算在存在/缺乏scFv的条件下的信号与迁移抑制作用的百分比的比率。数据通过使用Prism软件(GraphPad)“log(抑制剂)对比响应”模式的非线性回归曲线拟合进行制图和分析。
结果：
数据证明在抗CXCR4scFv C-9P21存在下对CCRF-CEM细胞的SDF-1诱导趋化作用的抑制(见图13)。在这些条件下，IC50值(导致50％细胞迁移抑制的抗体浓度)被计算为2.9μg/ml，并且在scFv浓度20μg/ml下达到100％抑制。抗-GFP scFv片段(阴性对照)显示无细胞迁移抑制(数据未显示)。
因此，scFv格式的C-9P21抗体抑制CXCR4+CCRF-CEM细胞的配体诱导迁移(IC50值为2.9μg/ml(约100nM))，并且当20μg/ml(0.7μM)时表现100％抑制。
实施例8：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的诱导
如果杀死靶标细胞是优选的作用模式，则抗体可以治疗性使用的潜在机制是介导CXCR4表达靶标细胞的ADCC的能力。这通过使用源自T细胞淋巴瘤并且具有CXCR4的组成型表达的CCRF-CEM细胞进行测试。将所选抗体作为与抗-cMyc抗体交联的scFv片断和作为全人IgG1抗体进行测试。
材料和方法：
CCRF-CEM细胞如上文所述那样维持。
CCRF-CEM靶标细胞通过离心沉淀，并且用RPMI-1640培养基洗涤2遍。将2.5×106细胞/毫升与钙黄绿素-AM(Calcein-AM)(英杰公司)混合至最终浓度10μM并且在37℃下培育30分钟。细胞在由10％FCS补充的RPMI-1640中洗涤3遍并且细胞密度被调整至3×105细胞/毫升。从新鲜捐献者血液通过人淋巴细胞分离液(Axis-Shield，利物浦，英国)密度梯度离心制备人PBMC，在RPMI-1640/10％FCS中洗涤并且在RPMI(含10％FCS和10％DMSO)中以3×107的密度于液氮中冷冻保存。效应细胞在实验当天解冻，在含10％FCS的RPMI-1640中洗涤，并且以6×106细胞/毫升的密度再悬浮。50μl的各靶标和效应细胞在96孔微量滴定板的同一个孔中混合，从而提供20∶1的效应物-对-靶标(E∶T)细胞比率。将体积为100μl的IgG1各种的抗体加入同一个孔中，导致0.8至1000ng/ml的浓度范围。相应地，在之前和过量的(20μg/ml)抗-cMyc嵌合(小鼠可变/人恒定)IgG1抗体(衍生自杂种瘤9E10)预先混合之后，加入体积为20μl的scFv片断达到2.5至5×104ng/ml的最终浓度。微量滴定板于37℃下培育4小时。3小时45分钟的培育之后，将20μl 0.9％Triton-X100加入对照孔以实现靶标细胞的完全裂解(最大裂解)。100μl各样品上清液随后转移入黑色微量滴定板中，并且使用TECAN M200读板器进行记录荧光(在488nm处激发，在518nm处发射)。每个实验重复4遍。无抗体的样品的荧光强度被作为背景除去，并且计算带有抗体的样品的特异性裂解的百分数。剂量响应曲线通过非线性回归分析和使用Prism软件(GraphPad)的三参数拟合模型进行运算。
结果：
图14中所示结果证明所有测试抗CXCR4抗体都能在人PBMC存在下并且作为scFv和全长IgG1诱导ADCC并且最大杀伤率接近100％。被测试scFv和IgG可以根据它们的最大杀伤率排名如下：C-9P21＞D-1K21(scFv)；和B-1M22＞C-1I24～C-9P21＞D-1K21(IgG)(又见表A)。
表A：被测试抗CXCR4抗体的比较性ADCC活性
Figure BPA00001624424300781
ND，未完成。
因此，所有被测试抗CXCR4抗体表现针对CCRF-CEM细胞的ADCC活性，并且B-1M22和C-9P21表现最高的最大细胞杀害。
实施例9：补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导
为了测试本文所述的抗CXCR4IgG是否能介导补体依赖性细胞毒性，已使用源自Burkitt’s淋巴瘤并且具有CXCR4的组成型表达的Ramos细胞进行CDC实验。
材料和方法：
Ramos细胞如上文所述那样维持。
B-1M22、C-1I24、C-9P21和D-1K21的IgG诱导CDC的能力在天然CXCR4+Ramos细胞系上评估。Ramos细胞通过离心沉淀，并且用RPMI-1640培养基洗涤2遍。2.5×106细胞/毫升与钙黄绿素-AM(英杰公司)混合至最终浓度10μM并且随后于37℃下培育30分钟。细胞在含10％FCS的RPMI-1640中洗涤3遍并且细胞密度调整至4×105细胞/毫升。被标记靶标细胞的25μl等分和25μl人血清在96孔板的孔中混合。体积为50μl的抗体(全部为IgG格式)的稀释液被加入同一孔中由此导致5×10-5至5×104ng/ml的最终抗体浓度范围。20μl 0.9％Triton-X100被加入对照孔以实现靶标细胞的完全裂解(最大裂解)。微量滴定板于37℃下培育1小时。100μlRPMI-1640(10％FCS)被加入所有的孔中，紧接着离心和转移每个样品的100μl上清液至黑色微量滴定板中。使用TECAN M200读板器记录荧光(在488nm处激发，在518nm处发射)。每个实验重复4遍。无抗体的样品的荧光强度被作为背景除去，并且计算带有抗体的样品的特异性裂解的百分数。剂量依赖曲线通过非线性回归分析和使用Prism软件(GraphPad)的三参数拟合模型进行运算。
结果：
图15A和图15B所示结果表明抗体C-1I24能够在人血清存在下诱导CDC。C-1I24显示0.7μg/mL的EC50值和100％的最大杀伤率。还针对变体B-1M22观察到一些CDC活性，但是，仅在非常高的浓度下(100μg/ml)。F7用作阳性对照抗体。
因此，本文所述的抗体中的两种抗体C-1I24和B-1M22表现出对Ramos细胞的CDC活性。C-1I24表现更高的CDC活性。
实施例10：细胞凋亡的诱导
抗CXCR4抗体诱导细胞凋亡的能力在CXCR4+Ramos细胞上进行评估。
材料和方法：
Ramos细胞在上文所述条件下被培育。
Ramos细胞通过离心收获，用含10％FCS的RPMI-1640培养基洗涤2遍并且再悬浮于含10％FCS的RPMI-1640培养基中达到3×105细胞/ml的密度。细胞悬浮液(250μl)在24孔板的孔中与同样体积的稀释液中的待测试抗体(最终浓度0.08至10μg/ml)或星形孢菌素(25nM)混合，并且在37℃下培育48小时。细胞通过离心收集并且在膜联蛋白V结合缓冲液(10mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)，140mM NaCl，2.5mM CaCl2，0.2％BSA，pH 7.4)中洗涤。细胞被再次收获并且再悬浮于300μl膜联蛋白V结合缓冲液。FITC-轭合膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)与240μl细胞悬浮液混合，产生0.2μg/ml的PI的最终浓度。样品在加入配体之后立即使用FACSanto II流式细胞仪(BD生物科学)上的515-545nm和610/20带通滤波器进行分析。凋亡的细胞被定义为膜联蛋白V阳性/PI阴性并且死亡细胞被定义为PI阳性。
结果：
图16A中所示结果(B-1M22，C-1I24，C-9P21和D-1K21)证明在抗体B-1M22、C-1I24、C-9P21和D-1K21存在下，没有细胞凋亡被诱导高于在图16A中标记为0的背景水平(阴性对照水平)。相反，对照IgG1F7在测试中使用的所有浓度下诱导细胞凋亡。图16B中所示结果证明抗体C-9P21和9N10不会诱导显著的细胞凋亡。
因此，这些结果证明本文所述抗体不会诱导CXCR4-阳性细胞的细胞凋亡，相比F7，其可提供潜在更优越的副作用特征。
表1
Figure BPA00001624424300801
Figure BPA00001624424300811
表2
Figure BPA00001624424300831
表3
Figure BPA00001624424300851
表4
Figure BPA00001624424300861
Figure BPA00001624424300871
表5
Figure BPA00001624424300881
Figure BPA00001624424300891
SEQ ID NO：91与SEQ ID NO：25相同，
SEQ ID NO：85与SEQ ID NO：1相同，
SEQ ID NO：92与SEQ ID NO：26相同，
SEQ ID NO：86与SEQ ID NO：2相同，
SEQ ID NO：93与SEQ ID NO：27相同，
SEQ ID NO：87与SEQ ID NO：3相同，
SEQ ID NO：94与SEQ ID NO：28相同，
SEQ ID NO：99与SEQ ID NO：33相同，
SEQ ID NO：102与SEQ ID NO：69相同，
SEQ ID NO：104与SEQ ID NO：77相同。
表6C-9P21的IgG序列
Figure BPA00001624424300901
表7B-1M22的IgG序列
Figure BPA00001624424300921
Figure BPA00001624424300931
表8C-1I24的IgG序列
Figure BPA00001624424300941
Figure BPA00001624424300951
表9D-1K21的IgG序列
Figure BPA00001624424300961
Figure BPA00001624424300971
表109N10的IgG序列
Figure BPA00001624424300981
Figure BPA00001624424300991
表11
 SEQ ID NO   描述   序列
 126   VH CDR1   S/G Y X3 M/I H/S
 127   VH CDR1   X1 Y X3 M H
 128   VH CDR1   S Y X3 M H
 129   VH CDR2   X1 I X3 X4 D G S X8 X9 X10 Y A D S V K G
 130   VH CDR2   V/R I S/N Y/S D G S N/S K/T Y/S YA D S V K G
 131   VH CDR2   X1 I X3 P X5 X6 G X8 X9 N YA Q K F Q G
 132   VH CDR2   R/G I N/I P N/I S/F G G/T T/A N Y A Q K F Q G
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Claims (56)

1.一种分离抗体，其结合到CXC趋化因子受体4(CXCR4)并且不诱导CXCR4表达细胞的显著细胞凋亡。
2.如权利要求1所述的抗体，其中如果使用小于或等于0.4μg/ml的浓度的所述抗体，则所述抗体不导致CXCR4表达细胞的显著细胞凋亡。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体能抑制配体与CXCR4的结合，或能抑制CXCR4表达细胞的配体诱导迁移，或能抑制CXCR4表达细胞中的配体诱导的钙通量。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有S/G Y X3 M/I H/S(SEQ ID NO：126)、或X1 Y X3 MH(SEQ ID NO：127)或S Y X3 M H(SEQ ID NO：128)的氨基酸序列；
其中X1可以是S或G，优选的是S；
X3可以是任何氨基酸，优选的是G或W或Y或A，更优选的是W；
(ii)具有X1I X3 X4 D G S X8 X9 X10 Y A D S V K G(SEQ ID NO：129)的氨基酸序列的VH CDR2；
其中X1可以是任何氨基酸，优选的是V或R，更优选的是R；
X3可以是任何氨基酸，优选的是S或N，更优选的是N；
X4可以是任何氨基酸，优选的是Y或S，更优选的是S；
X8可以是任何氨基酸，优选的是N或S，更优选的是S；
X9可以是任何氨基酸，优选的是K或T，更优选的是T；和
X10可以是任何氨基酸，优选的是Y或S，更优选的是S；
或具有X1 I X3 P X5 X6 G X8 X9 N Y A Q K F Q G(SEQ ID NO：131)的氨基酸序列的VH CDR2；
其中X1，可以是任何氨基酸，优选的是R或G，更优选的是R；
X3可以是任何氨基酸、优选的是N或I，更优选的是N；
X5可以是任何氨基酸、优选的是N或I，更优选的是N；
X6可以是任何氨基酸，优选的是S或F，更优选的是S；
X8可以是任何氨基酸，优选的是G或T，更优选的是G；和
X9可以是任何氨基酸，优选的是T或A，更优选的是T；和
(iii)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：s 3，9，15或21的氨基酸序列或其大体同源的序列，
其中所述大体同源的序列是与给定的CDR序列相比含1个、2个、或3个氨基酸取代的序列，或其中所述大体同源的序列是含有给定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包括：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(iii)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其大体同源的序列；和/或其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(vi)VL CDR3，其具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其大体同源的序列；
其中所述大体同源的序列是与给定的CDR序列相比含1个、2个、或3个氨基酸取代的序列，或其中所述大体同源的序列是含有给定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
6.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(iii)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或其大体同源的序列；和/或其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(vi)VL CDR3，其具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列或其大体同源的序列；
其中所述大体同源的序列是与给定的CDR序列相比含1个、2个、或3个氨基酸取代的序列，或其中所述大体同源的序列是含有给定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
7.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(iii)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列或其大体同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(vi)VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列或其大体同源的序列；
其中所述大体同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1个、2个、或3个氨基酸取代的序列，或其中所述大体同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
8.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体
(a)包括至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(iii)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列或其大体同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(vi)VL CDR3，其具有SEQ ID NO：24的所述氨基酸序列或其大体同源的序列；
其中所述大体同源的序列是与给定的CDR序列相比含1个、2个、或3个氨基酸取代的序列，或其中所述大体同源的序列是含有给定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
9.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体
(a)包含至少一个含有三个CDR的重链可变区和至少一个含有三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(iii)VH CDR3，其具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其大体同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列或其大体同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列或其大体同源的序列；和
(vi)VL CDR3，其具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列或其大体同源的序列；
其中所述大体同源的序列是与给定的CDR序列相比含1个、2个、或3个氨基酸取代的的序列，或其中所述大体同源的序列是含有给定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
10.如权利要求5至9中任一项所述的抗体，其包含所述VH CDR结构域(i)、(ii)和(iii)中的一个，和所述VL CDR结构域(iv)、(v)和(vi)中的一个。
11.如权利要求1或5所述的抗体，其中所述抗体(a)具有SEQ ID NO：69的VH结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO：70的VL结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
12.如权利要求1或6所述的抗体，其中所述抗体
(a)具有SEQ ID NO：71的VH结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO：72的VL结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
13.如权利要求1或7所述的抗体，其中所述抗体
(a)具有SEQ ID NO：73的VH结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO：74的VL结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
14.如权利要求1或8所述的抗体，其中所述抗体
(a)具有SEQ ID NO：75的VH结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO：76的VL结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
15.如权利要求1或9所述的抗体，其中所述抗体
(a)具有SEQ ID NO：69的VH结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO：103的VL结构域或具有与其至少80％序列一致性的序列；或
(b)是可以与抗体(a)竞争结合CXCR4的抗体。
16.如权利要求5至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体(b)可以结合到与所述抗体(a)大体相同的表位。
17.如权利要求1至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体，优选是全人抗体。
18.如权利要求1至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
19.如权利要求18所述的抗体，其中所述抗体是IgG抗体，优选是IgG1抗体。
20.如权利要求18或19所述的抗体，其中所述抗体包含：含有SEQ ID NO：108的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的重链，和/或含有SEQ ID NO：109的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的轻链。
21.如权利要求18或19所述的抗体，其中所述抗体包含：含有SEQ ID NO：112的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的重链，和/或含有SEQ ID NO：113的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的轻链。
22.如权利要求18或19所述的抗体，其中所述抗体包含：含有SEQ ID NO：116的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的重链，和/或含有SEQ ID NO：117的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的轻链。
23.如权利要求18或19所述的抗体，其中所述抗体包含：含有SEQ ID NO：120的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的重链，和/或含有SEQ ID NO：121的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的轻链。
24.如权利要求18或19所述的抗体，其中所述抗体包含：含有SEQ ID NO：124的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的重链，和/或含有SEQ ID NO：125的氨基酸序列或具有与其至少80％序列一致性的序列的轻链。
25.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗体的抗原结合片断。
26.如权利要求25所述的抗体，其中所述抗体的所述抗原结合片断是Fab’、Fab、F(ab’)2、单域抗体、TandAbs双聚体、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线型抗体、微型抗体、二价抗体、双特异抗体片断、二抗体、三抗体、sc-二价抗体、κ(λ)抗体、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或包含一个或多个CDR的小抗体拟似物。
27.如权利要求1-26中任一项所述的抗体，其中所述抗体被附着到至少第二诊断剂或治疗剂。
28.如权利要求27所述的抗体，其中所述抗体被附着到至少放疗药剂、化疗药剂、抗-血管生成药剂、细胞凋亡-诱导药剂、抗-微管蛋白药剂、抗-细胞或者细胞毒性药剂、类固醇、细胞因子拮抗剂、细胞因子表达抑制剂、趋化因子拮抗剂、趋化因子表达抑制剂、三磷酸腺苷酶抑制剂、抗炎药剂、信号传导途径抑制剂、抗-癌症药剂、其它抗体、凝血剂或抗病毒剂，其中所述抗-病毒剂优选地选自由核苷、核苷逆转录酶抑制剂、非-核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组成的组。
29.一种免疫轭合物，其包含如权利要求1-28中任一项所述的抗体，所述免疫轭合物附着到至少第二治疗剂或诊断剂。
30.一种组合物，包含如权利要求1-28中任一项所述的至少第一抗体或其免疫轭合物，其中所述组合物优选是药学上可接受的组合物。
31.如权利要求30的所述的组合物，其中所述组合物进一步包括至少第二治疗剂。
32.一种核酸分子，包含编码权利要求1-28中任一项所述的抗体的核苷酸序列区。
33.如权利要求32所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列区具有SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：100的核苷酸序列，或具有与其至少80％序列一致性的序列。
34.一种表达载体，其包含权利要求32或33的所述核酸分子。
35.一种宿主细胞，其包含权利要求32或33的所述核酸分子或权利要求34的所述表达载体。
36.一种病毒，其包含权利要求32或33的所述核酸分子或权利要求34的所述表达载体。
37.一种试剂盒，在至少第一容器中，包含：
(a)权利要求1至28中任一项的所述抗体；
(b)权利要求29的所述免疫轭合物；
(c)权利要求30-31中任一项的所述组合物；
(d)权利要求32或33的所述核酸分子；
(e)权利要求34的所述表达载体；
(f)权利要求35的所述宿主细胞；或
(g)权利要求36的所述病毒。
38.一种生产抗体的方法，其包含：
(a)在有效表达编码抗体的条件下培养包含权利要求34的所述表达载体的宿主细胞；和
(b)从所述宿主细胞获得表达的抗体。
39.一种结合CXCR4的方法，其包含：使含有CXCR4的组合物与权利要求1-28中任一项的所述抗体、或其免疫轭合物接触。
40.一种检测CXCR4的方法，其包含：在有效的允许形成所述CXCR4和所述抗体之间的复合物并检测由此形成的所述复合物的条件下，使疑似含有CXCR4的组合物与权利要求1-28中任一项的所述抗体、或其免疫轭合物接触。
41.一种诊断与在动物体内CXCR4表达有关的疾病的方法，其包含以下步骤：
(a)使取自所述动物的测试样品与权利要求1-28中任一项的所述抗体或其免疫轭合物接触；任选地，
(b)测量或检测所示测试样品中抗体-抗原复合体的存在和/或数量和/或位置；和，任选地，
(c)将所述测试样品中抗体-抗原复合体的存在和/或数量与对照物进行比较。
42.如权利要求41所述的方法，其中将所述测试样品从所述动物中分离并且在体外与所述抗体或免疫轭合物接触。
43.如权利要求41所述的方法，其中将所述抗体或免疫轭合物施用给所述动物，从而在体内接触所述测试样品。
44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中与CXCR4表达相关的所述疾病是通过CXCR4介导的疾病，或特征为CXCR4+细胞异常增殖的疾病，或特征为CXCR4过量表达的疾病。
45.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症，转移性癌症，癌症细胞对器官的入侵，血管生成相关的疾病，炎性或免疫性疾病，自身免疫性病症如类风湿性关节炎，病毒感染如HIV感染，或需要从骨髓动员干细胞以恢复免疫系统的病状。
46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，其中在所述测试样品中的CXCR4增加量对所述疾病是诊断性的。
47.一种用于治疗与动物体内CXCR4表达或活性相关的疾病的方法，其包含向罹患所述疾病的动物施用治疗有效量的权利要求1-28中任一项的所述抗体、或其免疫轭合物。
48.如权利要求47所示的方法，其中与CXCR4表达或活性相关的所述疾病是由CXCR4介导的疾病，或特征为CXCR4+细胞异常增殖的疾病，或特征为CXCR4过量表达的疾病。
49.如权利要求47至48中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症，转移性癌症，癌症细胞对器官的入侵，血管生成相关的疾病，炎性或免疫性疾病，自身免疫性病症如类风湿性关节炎，病毒感染如HIV感染，或需要从骨髓动员干细胞以恢复免疫系统的病状。
50.如权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述抗体或其免疫轭合物造成以下一项或多项：
(a)抑制CXCR4对至少SDF-1结合；
(b)抑制CXCR4-介导细胞对CXCR4配体的应答，优选抑制响应于CXCR4配体的钙离子释放，或抑制CXCR4表达细胞的配体诱导的迁移；
(c)诱导CXCR4+细胞的ADCC；
(d)诱导体内抗肿瘤效应；
(e)诱导CXCR4+细胞的CDC；
(f)抑制现存癌症引起的转移形成；
(g)抑制癌症细胞入侵新器官；
(h)抑制肿瘤基质对CXCR4+细胞的吸引，和/或有利于肿瘤微环境的细胞的活化；
(i)敏感化肿瘤细胞以便用其它治疗有效的化合物来治疗。
51.如权利要求47-50中任一项所述的方法，进一步包含对所述动物施用第二治疗剂。
52.如权利要求41-51中任一项所述的方法，其中所述抗体是二价或多价的抗体，其包含所述抗体的至少两个抗原结合片断。
53.如权利要求41-52中任一项所述的方法，其中所述动物是人受试者。
54.如权利要求1-28中任一项所述的抗体、或其免疫轭合物，用于治疗、成像和诊断。
55.如权利要求54所述的抗体或免疫轭合物，用于治疗、成像或诊断与CXCR4表达或活性相关的病状。
56.如权利要求55所述的抗体或免疫轭合物，其中所述疾病如权利要求48或49中定义。
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