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CN102985822A - 用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量的方法和装置 - Google Patents

用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量的方法和装置 Download PDF

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CN102985822A
CN102985822A CN2011800323962A CN201180032396A CN102985822A CN 102985822 A CN102985822 A CN 102985822A CN 2011800323962 A CN2011800323962 A CN 2011800323962A CN 201180032396 A CN201180032396 A CN 201180032396A CN 102985822 A CN102985822 A CN 102985822A
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I.弗里多林
F.尤林
J.杰罗斯卡加
R.坦纳
J.阿伦德
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Tallinn University of Technology
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Abstract

本发明涉及用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的新方法和装置。更具体而言，本发明涉及光学方法，其利用荧光，优选利用用过的透析液的荧光，以及特定模型，包括在某些波长的光学光谱成分的独特集合，以确定，优选在线确定中分子和蛋白结合尿毒症毒素如β2-微球蛋白(B2M)和硫酸吲哚酚(IS)的浓度。

Description

用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量的方法和装置
技术领域
本发明涉及用于生物流体中的化合物的确定和定量浓度测量，如生物流体中的中分子(middle)和蛋白结合尿毒症毒素(protein bound uremic toxin)的新方法和装置。更具体而言，本发明涉及光学方法，其利用荧光，优选利用用过的透析液(spent dialysate)的荧光，以及特定模型，包括在某些波长的光学光谱成分的独特集合，以确定，优选在线(on-line)确定中分子和蛋白结合尿毒症毒素如β2-微球蛋白(B2M)和硫酸吲哚酚(IS)的浓度。
发明背景
尿毒综合征归因于多种化合物的进行性保留，该化合物在正常条件下由健康的肾脏排泄。当它们对生物功能产生不良的相互作用时，这些化合物称为尿毒性保留溶质，或尿毒症毒素。尿毒综合征是废产物保留所致的复杂“中毒”，其导致多因子问题，其中数种代谢功能中的紊乱反映为临床问题。数个器官和器官系统受影响：心血管系统(高血压、心包炎和心力衰竭)，周围神经系统(多神经病)，中枢神经系统(记忆不良、集中力丧失和较迟缓的心智能力)，血液系统(hematology)(贫血、出血倾向)，凝血，免疫状态(免疫抑制)，恶心，呕吐等。
European Society of Artificial Organs(E SAO)和European Uremic ToxinWork Group(EUTox)已进行大量研究，并已在鉴定尿毒症毒素和将尿毒症毒素与肾脏患者的临床状态相关联方面达成了重大成功(Vanholder,De Smet等2003)。
在医学文献中，尿毒症毒素分为三组：1)小分子(MW<500Da)；2)中分子(MW>500Da)；3)蛋白结合溶质。
不同的尿毒症毒素通过许多不同方式和范围对患者起作用，而且，为了对于透析患者确保最佳的存活率，治疗的品质和生活品质，监视数种尿毒症毒素是必需的。
临床上，最常讨论的涉及尿毒症毒性的分子为下述：
小分子量溶质((MW<500g/mol)：尿素、肌酸酐、尿酸、胍-ADMA(不对称二甲基精氨酸)、磷酸盐/酯。
中分子(MW>500g/mol)：β2-微球蛋白、细胞因子(白细胞介素6)、甲状旁腺激素(PTH)—(与此同时属于蛋白结合组)。
蛋白结合溶质：硫酸吲哚酚、高半胱氨酸、对甲酚、AGE产物、马尿酸。
关于小分子量尿毒症毒素更详尽的概述可见于(Vanholder等2003)。可作出重要的结论，即仅通过监视标志物尿素进行的透析治疗评估是不充分的。在该上下文中，用于用过的透析液中水溶性小分子物质如尿素、肌酸酐和尿酸的定量浓度测量的方法和装置描述于更早的文献(WO2009071102A1，04.12.2007，Ivo Fridolin等，以及EE201000049，27.05.2010，Fridolin等)。
目前，由于可获得高对流性透析疗法如HDF(其目的为更有效地去除中分子(MM)(MW>500g/mol))，其品质应通过属于MM尿毒症毒素组(例如β2-微球蛋白)，或表现为类似MM(可预期数种蛋白结合尿毒症毒素如此)的标志物分子来进行评估。上述中分子化合物具有病理学作用或为最常见的长期并发症的标志物和HD患者的死亡原因，如透析相关的淀粉样变(dialysis relatedamyloidosis)、心血管疾病、继发性甲状旁腺功能亢进症、炎症和营养不良。这些化合物的累积的减少和较低的长期水平可预防或延缓此类并发症的出现。已经在两个大型回顾性研究中报道了腕管综合征的发病和透析相关的淀粉样变的显著减少为高通量膜以及对流性和混合透析策略诱导降低的慢性β2-微球蛋白水平的结果(Tattersall,Martin-Malo等2007)。
关于在中分子尿毒症毒素和在蛋白结合溶质组中最相关尿毒症毒素的简短描述在下文中给出，着重于监视的相关性和重要性。
β2-微球蛋白(MW 11,818D)是HLA I级复合物的轻链，并如此表达于所有有核细胞上。B2M通常在血浆中以低浓度发现。在末期肾衰竭中，其浓度随着肾清除(renal elimination)的减少继发地显著增加。尿毒症相关淀粉状蛋白在很大程度上由B2M构成，并基本上见于骨关节系统和腕管中。尿毒症相关淀粉样变在数年的慢性肾衰竭和/或在老年人中变得临床上明显。B2M已成为对于中分子的透析去除常用的标志物。然而，在透析过程中B2M的行为并不必然代表其它中分子的行为。用较大孔径的膜的血液透析导致预透析B2M浓度的进行性减少，并导致透析相关的淀粉样变和/或腕管综合征的较低流行。在血液透析(HEMO)研究的亚分析中，血清B2M水平直接相关于患者的结果。European Best Practice Guidelines(EBPG)已指出，尽管尚未鉴定出具有对于MM尿毒症毒素为理想标志物的特征的替代分子，但B2M在其动力学行为方面代表其它类似大小的MM和肽，并可作为此类分子的标志物(ERA-EDTA2002)。
细胞因子是小分子，并与尿毒症-和透析诱导的慢性炎症相关。存在约150个已知的细胞因子，但推定存在约300个细胞因子。尿毒症毒素包括白细胞介素-1-β，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α。TNF-α的累积可导致尿毒症中神经性和血液性并发症的发展。白细胞介素6(MW 24,500D)调节免疫系统，并随着细菌和病毒感染的增加而增加。
高半胱氨酸(Hcy)(MW 135D)，一种含硫氨基酸，通过摄入的甲硫氨酸的去甲基化产生。其保留导致细胞中累积S-腺苷高半胱氨酸，其为极具毒性的化合物，与S-腺苷甲硫氨酸竞争并抑制甲基转移酶。中度高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)对于心血管疾病是独立的风险因子。Hcy增加血管平滑肌细胞的增殖，其为动脉粥样硬化最显著的特征之一。
对甲酚(MW 108D)由肾脏清除，并由肝脏代谢。对甲酚是涉及免疫功能阻抑的尿毒症毒素。其蛋白结合较高，而用透析治疗去除程度较低。
AGE产物(3-脱氧葡糖醛酮，果糖赖氨酸，乙二醛(glyoxal,ethanedial)，丙酮醛，N-epsilon-(羧甲基)赖氨酸，戊糖素(pentosidine)(MW 342D))不仅在肾衰竭中保留，还在糖尿病和衰老中保留，其中它们导致组织损伤和功能紊乱。
马尿酸(MW 179D)可来源于含有奎宁酸的咖啡、果实或蔬菜的摄入。该化合物通过消化道中的细菌活性转化为苯甲酸；该苯甲酸由肝脏与甘氨酸缀合以形成马尿酸。除了马尿酸及其前体的膳食摄入之外，对于马尿酸的患者以苯甲醛的形式接受马尿酸前体进一步的负荷，苯甲醛可在一些肝素溶液和红细胞生成素的多剂量制剂中用作防腐剂。马尿酸可由于对蛋白质结合的竞争而增强药物毒性和其它蛋白结合的尿毒性溶质的毒性(Yavuz等2005)。马尿酸已被提及作为一种适于使用UV吸光度监视的化合物(US6666840,23.12.2003,Falkvall等)。然而，最新的研究已阐明通过上述方法进行的马尿酸监视难以实现(Trifonov 2009)。就此原因，需要新方法。
硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate)(IS)(MW 251 D)由肝脏从吲哚代谢而来，吲哚通过肠道微生物群产生作为色氨酸的代谢物。与正常受试者相比，吲哚在消化道中的产生在尿毒症患者中可能更高，这是因为尿毒性环境可对肠道微生物群的组成有影响。IS是循环的尿毒症毒素，其激发血管小球硬化和间质纤维化，且其通过PD去除或通过口服吸着剂延缓了完整肾单位丧失的进行。硫酸吲哚酚是一种公知的蛋白结合尿毒性保留溶质组的物质，其增加肾衰竭进行的速率。在血浆中，IS是蛋白结合尿毒性溶质，其通过抑制体外迁移和内皮增殖而诱导内皮功能障碍。一些研究表明IS亦涉及氧化应激。在经血液透析的患者中，IS的血清水平与戊糖素(羰基和氧化应激的标志物)的水平相关；在体外，硫酸吲哚酚在肾小管细胞中增加反应性氧物种(reactive oxygenspecies)的产生，并在内皮细胞中增加NAD(P)H氧化酶活性。硫酸吲哚酚损害成骨细胞功能，诱导骨更新的异常，并强烈地减少谷胱甘肽(细胞中最具活性的抗氧化系统之一)的水平(Wishart DS,Knox C等2009)。
吲哚-3-乙酸(I3AA)是色氨酸代谢的降解产物，并通常由哺乳动物消化道中细菌的作用产生。I3AA的一些内源产生亦发生于哺乳动物组织中。其可由色胺的脱羧化或色氨酸的氧化脱氨产生。I3AA常常在尿液中以低水平出现，并已在具有苯丙酮尿症的患者的尿液中以升高的水平发现。使用从人尿提取的材料，Kogl在1933年发现吲哚乙酸亦为重要的植物激素。具体而言，I3AA是称作植物生长素的植物激素的组的成员。一般认为I3AA是最重要的天然植物生长素。植物细胞由色氨酸合成I3AA。I3AA和一些衍生物可由辣根过氧化物酶(HRP)氧化为具细胞毒性的物种。I3AA仅在氧化脱羧之后具有毒性；认为I3AA/HRP的作用是部分由于亚甲基羟吲哚的形成，亚甲基羟吲哚可与DNA碱基和蛋白质硫醇缀合。可将I3AA/HRP用作靶向癌症的基础，其为植物生长素在癌治疗中潜在的新功能(Wishart DS,Knox C等2009)。
β2-微球蛋白主要通过ELISA测定方法确定。尽管该方法作为自动化生物分析仪自动化，ELISA自身的特点在于该方法的大量检测偏差和复杂性。其无法应用于常规或家用检测，因为其需要专业人士操作，价格昂贵，且难以储藏检测剂。已仔细注意以确保该方法的品质和可靠性，然而，由于高水平的干扰因子，在某些情况下可获得不平常的结果。
许多AGE产物可使用液相层析确定，但不利之处在于测量非常复杂。近乎每个AGE需要特殊处理，特殊样品预处理方法，层析，和与任何其它AGE产物的处理不同的检测方法。总体而言，需要大量不同的设施，难以获得的试剂，以及由高资格限定的职业人士进行操作。
其它MM和蛋白结合尿毒症毒素主要通过使用高效反向液相色谱(HPLC)方法确定。举例而言，硫酸吲哚酚已通过荧光检测(激发280nm，发射340nm)确定，且马尿酸已在血清和在用过的透析液中在254nm通过紫外线检测来分析(Dhondt,Vanholder等2003)。该方法的缺点包括：1)由于类似的性质，这些化合物的分离可能是困难的，这影响检测准确性；2)操作复杂，需要大量试剂，并应由职业人士操作；3)样品需要预处理以供去蛋白作用；和4)所需的设备是昂贵的。
另一种用于通过荧光确定药物的方法在WO2005111586,13.05.2004,Babichenko等中提出。该技术利用光谱荧光指纹(spectral fluorescencesignature，SFS)技术以供现场药物检测和定量。该方法适于测量未处理的街头样品(street sample)，假定储藏的已知文库物质的SFS与未处理的街头样品中的化合物相匹配。对于含有许多未知物质的生物流体，这很难实现。同样，对于测量用于与包含储藏的已知文库物质的三维荧光光谱的数据相比较的三维荧光光谱的需要使得该方案对于作为小规模、简单和鲁棒(robust)的实践在技术上是错综和复杂的(complex and complicated)。类似的方法，利用光学多维指纹，描述于US20050079628,09.10.2003,Nekrasov Viktor等，其旨在通过光学方法分析物质和材料，特别是在多组分混合物中。用于测定多组分混合物的描述的方法亦需要具有已知含量的标准样品，这也与前述方法具有类似的缺点。
另一种用于在透析治疗过程中确定透析液体中废产物的含量以控制透析机器从而使透析治疗适合于患者的方法描述于US6666840,23.12.2003,Falkvall等，以及其参考文献(Fridolin,Magnusson等2002)。对在透析治疗中来自从透析仪排出的透析液体的样品连续或定期地测量透析液体中某些物质或物质组合的浓度。该测量通过UV辐照(波长在180-380nm的范围)的方式以分光光度法进行。取决于物质或其组合的浓度的测量，对至少一个透析治疗的参数进行调整。该方法的优点在于其无需血样，无一次性用品或化学品，且迅速。然而，该方法是一般性的，且是并未特定用于排他地测量单个化合物的方法，并仅旨在应用于透析监视。而且，未展示关于浓度测量的结果。使用上述提及的方法对于尿酸和尿素测量的更准确描述在科学论文中给出(Uhlin,Lindberg等2005)，(Uhlin,Fridolin等2005)。
另一种方法涉及使用近红外辐照的透析监视方法和仪器的方法，描述于WO9819592,14.05.1998,RIO GRANDE MEDICAL TECH INC。该方法的优点类似于UV辐照。然而，该方法通过利用具有不同的技术和光学上的考量的近红外辐照光谱测定法测量尿素和肌酸酐。对于近红外辐照光谱测定法，使用校准和预测阶段的主要成分分析描述于US5886347。
另一种描述于RU2212029,10.09.2003,VASILEVSKIJ A M等的方法，依赖于Beer-Lambert定律，并利用用过的透析液中组分的毫摩尔消光系数。在该发明中给出的实例描述确定尿素、磷酸酯/盐、肌酸酐和尿酸的浓度。然而，仅对一个透析过程给出了实例，这是严重的限制，且无法应用于一般用途。此外，尿素和磷酸酯/盐并不像该申请不正确地宣称那样吸收UV辐照，因此使用该方法不可能进行尿素和磷酸酯/盐的浓度测量。而且，因为在用过的透析液中几种已知的生色团，Beer-Lambert定律并不适用于肌酸酐的浓度测量。
近来，提出了用于对用过的透析液中的水溶性小分子量物质如尿素、肌酸酐和尿酸进行定量浓度测量的方法和装置(EE201000049,27.05.2010,Fridolin等)。
然而，所有上述提及的方法评估水溶性小分子量化合物，而非在中分子组和在蛋白结合溶质组中的尿毒症毒素。对于后者的实验室和色谱分析较为复杂，且使用一次性用品或化学品，因此并不适于进行在线的、连续的患者或临床治疗(例如透析)监视。
因此，存在对于新方法的需求，该方法可直接和方便地确定生物流体如血清、尿液、唾液，和用过的透析液中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素，其适于监视，并避免由现存的分析方法造成的不利之处。
发明内容
因此，本发明的目标是用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量的新方法和装置。更具体而言，本发明涉及光学方法，其利用生物流体的荧光，优选利用用过的透析液的荧光，以及含有变换函数的浓度计算算法，来确定样品或在线确定物质的浓度，其可直接在床边进行。该方法和装置利用适于指定测量的测量小杯(小室)在体外或在线确定物质浓度。
本发明的另一个目标是提供实用的光学方法和装置定量地确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的浓度或去除。确定的值可直接并方便地在监视器或打印的屏幕上显示。该方法和装置并不需要任何化学丢弃品，也无需昂贵的分离技术，并可容易地制备和大量生产，提供了环保的光学方法。
本发明的仍进一步的目标是提供用于评估常规临床监视的方法，以面对患者中较高的死亡风险(例如在透析中)。
本发明的仍进一步的目标是提供新的、迅速、方便和安全的用于检测液体样品中物质浓度的方法。液体样品可直接滴于检测小杯中以供体外测量，或传送流动的流体流通过流通小室(flow-through cell)以供在线监视。该方法当应用于检测生物流体中物质浓度时，适于家用。
本文中所述的特征和优点并非毫无遗漏，且具体而言，考虑附图、说明书和权利要求，许多其它特征和优点对于本领域一般技术人员是显而易见的。而且，应指出说明书中使用的语言基本上是基于可读性和指导性目的选取的，而不应限制本发明主题的范围。
附图说明
本发明将在下文中参照所附附图而详细描述，其中：
图1显示本发明的一个实施方案的框图，其应用于在透析过程中确定用过的透析液中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量。
图2显示在220-500nm的激发波长范围和250-800nm的发射波长范围获得的荧光谱的实例，其为(A)针对纯的透析液样品；(B)针对在透析过程开始之后10分钟时获取的用过的透析液样品；和(C)针对在透析过程开始之后207分钟时获取的用过的透析液样品。
图3显示在实验室中和通过新方法测得的β2-微球蛋白(B2M)浓度之间的线性关系，其中(A)在实验室中测得的B2M浓度与荧光信号之间的相关系数作为在220-500nm的激发波长(EX)范围和在220-800nm的发射波长(EM)范围的3D图；(B)在实验室中测得的B2M浓度和荧光信号之间的相关系数作为在单个激发波长EX=370nm和在220-700nm的发射波长(EM)范围的2D图；(C)对于通过新方法和在实验室中测得的B2M浓度在固定的发射和激发波长的图(EX=370nm，EM=456nm)。
图4显示通过新方法和在实验室中通过HPLC测得的硫酸吲哚酚(IS)浓度之间的线性关系，其中(A)在实验室中测得的IS浓度和荧光信号之间的相关系数作为在220-500nm的激发波长(EX)范围和在220-800nm的发射波长(EM)范围的3D图；(B)在实验室中测得的IS浓度和荧光信号之间的相关系数作为在单个激发波长EX=300nm和在220-590nm的发射波长(EM)范围的2D图；(C)对于通过新方法和在实验室中测得的IS浓度在固定的发射和激发波长的图(EX=300nm，EM=358nm)。
图5显示对于8个患者对于估计的参数eKt/V_B2M的Bland-Altman图，其中在偏差校正之后，将eKt/Vb_B2M和eKt/Vf_B2M(HDF过程数N=19)之间的差异针对平均_eKt/V(b&f)_B2M作图。
图6图示了将来自光学方法在用过的透析液中测得的B2M的透析剂量作为eKt/Vf_B2M针对使用血样样品的eKt/Vb_B2M(HDF过程数N=19)作图。亦显示了作为虚线的统一线(line of unity)。
图7显示了对于8个患者的估计的参数TR_IS的Bland-Altman图，其中在校正偏差之后，将TRd_IS和TRf_IS(HDF过程数N=20)之间的差异针对平均TR(d&f)_IS作图。
图8图示了将来自光学方法的IS的透析剂量作为TRf_IS针对来自实验室使用用过的透析液样品估计的TRd_IS(HDF过程数N=20)作图。亦显示了作为虚线的统一线。
图9表示了用过的透析液样品的HPLC概貌，其中：(A)在254nm的波长测得的吸光度，和(B)在两个固定的发射和激发波长测得的荧光(EX=370nm,EM=456nm，以及EX=280nm,EM=360nm)。可观察到多个较多出现的峰，其代表在透析过程中去除的生色团-荧光团。鉴定了一些HPLC峰，如肌酸酐(Cr)、尿酸(UA)、马尿酸(HA)、色氨酸(Trp)、硫酸吲哚酚(IS)、吲哚-3-乙酸(I3AA)。三个多见但未鉴定的峰—峰A、峰B和峰C—在不同波长检测出。
发明详述
用于在生物流体1中确定中分子和蛋白结合尿毒症毒素5(例如B2M)的含量的装置(参见图1)包含：
光学模块2，其包含荧光测定系统，其包含光源和光检测器，和测量的荧光测定小杯以供容纳生物流体1的样品，从而使得可将光引至样品，并可从样品检测荧光信号；和
信号处理模块3，其包括(consisting of)数据获取模块和信号处理模块，该信号处理模块并入具有变换函数的浓度或去除计算算法，以及
数据展示模块4。
光源可为宽带光源或窄带光源。如果使用宽带光源，可使用宽带检测器和滤光片，或可使用窄带检测器。根据一个实施方案，光源在特定光学区域操作(190-890nm的波长范围)。
根据一个实施方案，荧光光检测器在190-900nm的波长范围操作。可检测的荧光可由生物流体中可测量的物质直接发射或该发射可由一些其它天然地或有意添加的生物流体的成分介导，该介导是通过所考虑的流体中分子之间的某些能量转移机理进行的。
测量小杯可例如针对体外测量调适，或针对在线测量设计。
根据一个实施方案，将光谱处理模块调适为执行浓度或去除计算算法，该算法包含变换函数(transforming function)，其计算生物流体中某些物质的浓度。
变换函数是基于回归分析以将荧光信号F(无量纲)变换为一定尿毒症毒素浓度[mg/L]。在线性关系的存在下，该变换函数具有下述形式：“尿毒症毒素浓度[mg/L]=F*斜率+截距”。
将数据呈现模块调适为执行用于数据呈现的程序，并包含或连接至数据可视化模块，例如监视器、显示器或打印装置。
实施例
对用过的透析液中特定物质，即中分子β2-微球蛋白(B2M)和蛋白结合尿毒症毒素硫酸吲哚酚(IS)的浓度测量作为本发明的实施例给出。
受试者：本研究包括八位尿毒症患者，一位女性和七位男性。将所有患者在Department of Nephrology,University Hospital of
Figure BDA00002674143500091
Sweden进行长期的每三周一次的在线HemDiaFiltration(ol-HDF)。使用的透析机器为Fresenius 5008(Fresenius Medical Care,Germany)。在所有治疗中使用的透析仪是FX 800(Fresenius Medical Care,Germany)，其具有1.8m2的有效膜面积，具有63ml/h mmHg的超滤系数。ol-HDF治疗的持续时间在180至270分钟变动，透析液流速为500mL/分钟，血流在280-350mL/分钟变动。所有患者通过动脉-静脉瘘管使用“双针(two-needle)系统“进行透析。用于计算在线制备的取代体积的auto sub系统模式在每过程12.2至29.7升之间变动。
取样：来自排液管的样品在9、30、60、120、180(分钟)和ol-HDF过程结束时(如果长于180分钟)获取。一个样品在仔细搅拌之后取自透析液/超滤液收集罐，并进行称重。如果透析机器的自检在计划的取样时间内发生，则当UV吸光曲线重新达到基线时(其在2-3分钟内发生)取样。当透析机器准备起动且电导率稳定时，在透析过程起动之前收集纯透析液，将其用作参照溶液。
用过的透析液/超滤液中B2M的浓度的确定在Chemical Laboratory,University Hospital in
Figure BDA00002674143500101
进行。IS的浓度在Tallinn Technical University，Technomedicum,Department of Biomedical Engineering在HPLC分析过程中通过荧光信号确定。
使用荧光分光光度计(SHIMADZU RF-5301)进行荧光测量。荧光分析在220-900nm(优选220-500nm)的激发波长范围，220-890nm(优选220-800nm)的发射波长范围，和以10nm的激发间隔进行。使用具有0.4和1cm光程长度的光学小杯。通过软件Panorama fluorescence处理和呈现获得的萤光值，且最终的数据处理在EXCEL(Microsoft Office Excel 2003)中进行。
基于所述结果，确定了线性相关系数(R)和R平方值(R2)。使用得自实验室的浓度作为参照计算新方法的准确度(BIAS)和精密度(SE)。
结果：图2图示了在240-500nm的激发波长范围和250-800nm的发射波长范围获得的3D荧光光谱的实例，其为(A)针对纯的透析液样品；(B)针对在透析过程开始之后10分钟时获取的用过的透析液样品；和(C)针对在透析过程开始之后240分钟时获取的用过的透析液样品。可明显地发现在特定区域的一些不同的荧光最大值。而且，荧光振幅与用过的透析液中消除的尿毒症毒素的含量成比例，在荧光谱的特定区域，其在透析治疗开始时(10分钟)较高，而在透析终止时(207分钟)较低。
利用来自新方法的萤光值和来自实验室的浓度，对于B2M和IS的线性关系分析获得了图3A-B和4A-B中所示的相关图。这导致特定模型，其使得能够将光学测量变换为浓度值。
通过该新方法由特定模型确定的B2M和IS浓度的值，包括在某些波长的光学光谱成分的独特集合，与在实验室通过生化方法或HPLC在用过的透析液中测得的值的比较，在图3C和4C中展示。
对于新方法的准确度(BIAS)计算为
BIAS = &Sigma; i = 1 N e i N - - - ( 1
其中ei是第i残差，而N是观察次数。第i残差作为对于第i次测量中实验室和光学确定的浓度值的差异获得。
对于新方法的精密度(SE)计算为
SE = &Sigma; i = 1 N ( e i - BIAS ) 2 N - - - ( 2
表1总结了有关B2M和IS浓度作为来自标准化方法(Lab)和新方法(F)的平均值和标准偏差值(平均值+/-SD)的所有结果。还给出了来自光学方法的尿毒症毒素浓度和在实验室测得的浓度之间的线性相关系数(R)和R平方值(R2)，对于不同方法测量B2M和IS的准确度(BIAS)和精密度(SE)。
表1：有关来自标准化方法(Lab)和新方法(F)的浓度平均值和标准偏差值(平均值+/-SD)，来自光学方法的尿毒症毒素浓度和在实验室测得的浓度之间的线性相关系数(R)和R平方值(R2)，不同方法测量B2M和IS浓度的准确度(BIAS)和精密度(SE)的总结结果。
B2M mg/L IS mg/L
N 68 68
Lab(平均值+/-SD) 1.69+/-0.94 1.22+/-0.77
F(平均值+/-SD) 1.71+/-0.86 1.24+/-0.69
R 0.96 0.90
R2 0.91 0.81
BIAS[mg/L] 0.02 0.02
SE[mg/L] 0.28 0.34
如根据表1可见，应用新方法，B2M和IS浓度的确定可以以令人满意的准确度和精密度来进行。
作为临床应用的实例，在下文中利用来自光学测量的B2M的浓度来计算对于B2M的透析剂量，其在动力学行为方面代表类似大小的其它MM和肽。
来自血的B2M的透析剂量：spKt/Vb_B2M和eKt/Vb_B2M可使用透析前和透析后的血B2M浓度(C0和Ct)进行计算。根据Casino等2010提出的下述公式计算单个汇集体积(pool volume)Kt/V，spKt/Vb B2M：
spKt / Vb _ B 2 M = 6.12 UF W [ 1 - ln C t C 0 / ln ( 1 + 6.12 UF W ) ] - - - ( 3
其中UF是以kg计的总超滤物，而W是以kg计的患者身体干重。
根据Tattersall等2007提出的下述公式获得了平衡的Kt/V、eKt/Vb_B2M，考虑透析后B2M的反弹：
eKt/Vb_B2M=spKt/Vβ2m*Td/(Td+110)       (4
其中Td是透析过程(dialysis session)的长度。
为了确定来自光学方法的B2M的透析剂量，利用了在透析开始时的荧光值F0(10分钟透析液样品)和在透析结束时的荧光值Ft，替代透析之前和之后的血B2M浓度。来自荧光测量的单个汇集体积Kt/V，spKt/Vf_B2M计算如下：
spKt / Vf _ B 2 M = 6.12 UF W [ 1 - ln F t F 0 / ln ( 1 + 6.12 UF W ) ] - - - ( 5
来自荧光测量的平衡的Kt/V，eKt/Vf_B2M根据方程4计算。
表2总结了有关使用来自总共19个HDF过程透析之前和之后的血B2M浓度和荧光值来计算B2M的透析剂量作为spKt/V_B2M和eKt/V_B2M的所有结果。给出了来自血液浓度的对于B2M的透析剂量和来自光学方法的B2M的透析剂量之间的线性相关系数(R)和R平方(R2)。在偏差校正之后，使用来自血的B2M的透析剂量计算对于光学方法的准确度(BIAS)和精密度(SE)。
表2：使用透析之前和之后的血B2M浓度(Blood)和荧光值(F)计算的作为spKt/V_B2M和eKt/V_B2M的透析剂量，来自血液浓度的B2M的透析剂量和来自光学方法的B2M的透析剂量之间的线性相关系数(R)和R平方(R2)，光学方法的准确度(BIAS)和精密度(SE)的总结。
spKt/V_B2M eKt/V_B2M
N(HDF过程) 19 19
血(平均值+/-SD) 1.63+/-0.18 1.11+/-0.13
F(平均值+/-SD) 1.63+/-0.21 1.11+/-0.14
R 0.74 0.73
R2 0.55 0.53
BIAS 0.00 0.00
SE 0.15 0.10
图5呈现了显示对于全部8个患者对于估计的参数eKt/V_B2M的Bland-Altman图的比较，其中在偏差校正之后，将eKt/Vb_B2M和eKt/Vf_B2M(HDF过程数N=19)之间的差异针对平均_eKt/V(b&f)_B2M作图。图6图示了将来自光学方法在用过的透析液中测得的B2M的透析剂量作为eKt/Vf_B2M针对使用血样样品(HDF过程数N=19)的eKt/Vb_B2M作图。亦显示了作为虚线的统一线。
结果显示对于来自血样的和通过荧光来自用过的透析液样品的B2M估计的透析剂量良好吻合。
作为临床应用的下一个实例，在下文中利用来自光学测量的IS浓度以计算在单个HDF过程中对于蛋白结合尿毒症毒素IS的透析剂量，其中1)IS的去除速率(RR_IS)，和2)IS的总去除量(TR_IS)。使用基于在用过的透析液中而非在血中的IS的浓度的IS去除速率(RRd_IS)和IS的总去除量(TRd_IS)作为对应于通过光学方法估计的相应参数(RRf_IS和TRf_IS)的参照，这是因为对于血的值的消除速率可能由于蛋白结合尿毒症毒素的特定动力学行为而为令人误导的。
在用过的透析液中IS的去除速率(RRd_IS)计算为：
RRd _ IS = C 0 - C t C 0 * 100 % - - - ( 6
其中C0和Ct是分别是在透析开始(10分钟透析液样品)和终止时来自实验室的用过的透析液IS浓度。
为了确定来自光学方法的IS的透析剂量，利用了来自荧光测量的相应值F0(10分钟透析液样品)和在透析结束时的荧光值Ft，替代来自实验室的用过的透析IS浓度。
利用来自总透析液收集的IS的浓度，以mg/L计的Dtotal，和以kg计的收集的透析液的总量Wtotal由下式给出以mg计的总去除的IS(TRd_IS)：
TRd_IS=Dtotal*Wtotal        (7
假定对于用过的透析液，1kg=1L。为了确定从光学方法总去除的IS(TRf_IS)，利用通过荧光测量估计的针对Dtotal以mg/L计的相应值。
表3总结了有关使用来自实验室在透析开始(10分钟透析液样品)和透析终止时的用过的透析IS浓度作为RR_IS和TR_IS计算的IS的透析剂量，以及来自荧光测量的相应值的所有结果。给出了来自光学方法的IS的透析剂量和来自血浓度的IS的透析剂量之间的线性相关系数(R)和R平方(R2)。在偏差校正之后，使用来自血的IS的透析剂量计算光学方法的准确度(BIAS)和精密度(SE)。
表3：使用来自实验室在透析开始(10分钟透析液样品)和透析终止时的用过的透析IS浓度作为RR_IS和TR_IS计算的IS的透析剂量，以及来自荧光测量的相应值(F)，来自光学方法的IS的透析剂量和来自用过的透析液浓度的IS的透析剂量之间的线性相关系数(R)和R平方(R2)，光学方法的准确度(BIAS)和精密度(SE)的总结。
RR_IS,% TR_IS,mg
N(HDF过程) 19 20
透析液(平均值+/-SD) 51.4+/-11.8 163+/-90
F(平均值+/-SD) 51.4+/-10.6 163+/-90
R 0.92 0.93
R2 0.85 0.87
BIAS 0.00 0.00
SE 4.60 33.3
图7呈现了对于全部8个患者的估计的参数TR_IS的Bland-Altman图的比较，其中在校正偏差之后，将TRd_IS和TRf_IS(HDF过程数N=20)之间的差异针对平均_TR(d&f)_IS作图。图8图示了将来自光学方法的IS的透析剂量作为TRf_IS针对来自实验室使用用过的透析液估计的TRd_IS(HDF过程数N=20)作图。亦显示了作为虚线的统一线。
结果显示对于通过实验室方法来自用过的透析液样品和通过荧光来自用过的透析液样品的IS估计的透析剂量良好吻合。
分析了用过的透析液样品的HPLC概貌以鉴定测量的光学信号的来源。图9呈现了用过的渗透液样品的HPLC概貌，其中：(A)在254nm的波长测得的吸光度，和(B)在两个固定的发射和激发波长测得的荧光(EX=370nm,EM=456nm，以及EX=280nm,EM=360nm)。可观察到多个较多出现的峰，其代表在透析过程中去除的生色团-荧光团。鉴定了一些HPLC峰，如肌酸酐(Cr)、尿酸(UA)、马尿酸(HA)、色氨酸(Trp)、硫酸吲哚酚(IS)、吲哚-3-乙酸(I3AA)。三个多见但未鉴定的峰—峰A、峰B和峰C—在不同波长检测出。用过的透析液样品的HPLC概貌阐明了不同溶质在不同波长的选择性。通过这样的方法，对于光学方法合适的波长选择使得能够确定具体的尿毒症毒素。
尽管本发明参照一组方面和实施方案描述，但对其的修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。前述本发明实施方案的描述是就说明和描述的目的呈现。并非旨在毫无遗漏或将本发明限制为所公开的完全相同形式。根据本公开，可进行许多修饰和变化。并不意欲本发明的范围受该具体描述的限制，而是由所附权利要求所限定。
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Claims (28)

1.一种用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量的方法，其包括：
a.将生物流体的样品导入荧光测定小杯；
b.将具有预设波长的光施于样品，并记录样品的荧光信号；和
c.根据变换函数计算样品中物质的浓度。
2.权利要求1的方法，其包括将生物流体的流动流导入通过荧光测定流动小杯。
3.权利要求1的方法，其包括将物质的浓度输出至显示设备或打印机。
4.权利要求1的方法，其中来自光源的激发波长在190-890nm的波长范围。
5.权利要求1的方法，其中由光检测器检测的发射波长在190-900nm的波长范围操作。
6.权利要求1的方法，其中所述物质是β2-微球蛋白。
7.权利要求1的方法，其中所述光源在360-380nm的波长范围操作，而所述荧光检测器在440-470nm的波长范围操作，适于β2-微球蛋白的测量。
8.权利要求1的方法，其中所述物质是硫酸吲哚酚。
9.权利要求1的方法，其中所述光源在290-310nm的波长范围操作，而所述荧光检测器在340-370nm的波长范围操作，适于硫酸吲哚酚的测量。
10.权利要求1的方法，其中计算浓度包括执行下式的变换函数：“尿毒症毒素浓度[mg/L]=F*斜率+截距”，其中F代表荧光信号。
11.权利要求1的方法，其包括将生物流体的样品滴于体外小杯上。
12.权利要求1的方法，其包括在家用条件下获得样品并将样品导入小杯。
13.一种通过监视患者的生物流体中的物质的浓度来临床监视患者的方法，其包括：
a.将生物流体的样品导入荧光测定小杯；
b.将具有预设波长的光施于样品，并记录样品的荧光信号；和
c.根据变换函数计算样品中物质的浓度。
14.权利要求13的方法，其包括将物质浓度记录于存储装置中。
15.权利要求13的方法，其包括将流体中的物质浓度水平与浓度的预设限值相比较，如果浓度并不落在预设的限值之间，则生成警告信号。
16.一种用于确定生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的含量的装置，其包括：
a.光学模块，其包含荧光测定系统，其包含光源和荧光检测器；和测量的荧光测定小杯以供容纳生物流体的样品，从而使得可将光引至样品，并可从样品检测荧光信号；和
b.光谱处理模块，其包括数据获取模块和信号处理模块，所述信号处理模块并入具有变换函数的浓度或去除计算算法，以及数据展示模块。
17.权利要求16的装置，其中所述光源在190-890nm的波长范围中操作。
18.权利要求16的装置，其中所述荧光检测器在190-900nm的波长范围中操作。
19.权利要求16的装置，其中所述光源在360-380nm的波长范围操作，而所述光检测器在440-470nm的波长范围操作，适于β2-微球蛋白的测量。
20.权利要求16的装置，其中所述光源在290-310nm的波长范围操作，而所述荧光检测器在340-370nm的波长范围操作，适于硫酸吲哚酚的测量。
21.权利要求16的装置，其中将所述光谱处理模块调适为执行浓度或去除计算，其含有变换函数，所述变换函数计算生物流体中的中分子和蛋白结合尿毒症毒素的浓度或去除。
22.权利要求16的装置，其中所述光学模块包含宽带光源和滤光片。
23.权利要求16的装置，其中所述光学模块包含滤光片和宽带检测器。
24.权利要求16的装置，其中所述光学模块包含窄带检测器。
25.权利要求16的装置，其中所述光学模块包含一组窄带光源和宽带检测器。
26.权利要求16的装置，其中所述荧光测定小杯是流动小杯以供接受生物流体的流动流。
27.权利要求16的装置，其中将所述荧光测定小杯调适用于测量样品。
28.权利要求16的装置，其中所述小杯是一次性用品。
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