CN102978196B - 一种轮虫总rna和总蛋白提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提取轮虫总RNA和总蛋白的方法。方法包括一种淡水轮虫、轮虫通用培养液、食物微藻及其培养液、微孔筛网，解剖镜、低温冰箱、细胞破碎仪、低温离心机，充气泵、PVP、PBS磷酸缓冲液和RNA提取常规试剂（包括TRIZOL，氯仿，异丙醇，DEPC水，乙醇）。轮虫为单个体克隆培养获得、人工配制液体培养基培养、食物微藻为淡水微绿球藻、PBS磷酸缓冲液PH=7.0。采用恒温、充气、持续光照方法，快速获得大量轮虫，除去微藻，富集活体轮虫进行总RNA和总蛋白的提取。该方法能方便，快速，经济的收集到大量的轮虫，用于分子生物学研究，并能有效的消除微藻的影响，适合实验室研究应用。
Description
技术领域
本发明属于水产学科生物技术领域，具体是涉及一种提取水生浮游动物轮虫总蛋白和总RNA的方法。
背景技术
轮虫（rotifer）是淡水生态系统主要功能群，90%以上鱼类早期开口生物饵料，也是环境污染和环境风险评价受试动物。总蛋白和总RNA的提取是进行分子生物学研究的基础。由于轮虫个体小，游动快速，难以富集足够量的活体轮虫进行分子生物学的研究。本发明具有所需设备简单、操作简便的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取轮虫总RNA和总蛋白的方法。
所提供方法包括轮虫通用培养液配制、饵料微藻培养液配制、活体轮虫富集技术、微藻去除方法、总RNA释放方法、超声破碎方法。
本发明所述轮虫总蛋白和总RNA提取方法，包括以下步骤：
（1）轮虫培养；
（2）微藻去除：将轮虫培养液装入50ml离心管中，4500rpm，4℃离心5分钟，微藻沉在离心管底部，小心倒出含有轮虫的上清，本步骤可重复2-3次直到藻类全部除去；
（3）轮虫富集：将300目的筛网折成漏斗状，架于烧杯上，用胶头滴管吸取去除微藻的轮虫培养液，缓慢的滴入筛网底部，滤去水分，之后用双蒸水冲洗数次，在解剖镜下用10-100ml移液枪将轮虫吸到1.5ml离心管中；
（4）冰冻：在超净台下，将轮虫转移到无RNA酶的离心管中，加1mlTRIZOL，上下颠倒数次，混匀后将离心管放入-20℃冰箱中，使其完全结冰；
（5）总RNA提取：将加TRIZOL的提取液室温融化，12000转4℃离心5min；小心吸取上清移入新的1.5ml离心管中，约750ul，加入150ul的氯仿（上清体积的1/5），用手剧烈的震荡15s，充分乳化后室温静置5min，12000转4℃离心15min；小心从离心机中取出，分三层（无色上清，中间层白色DNA，带颜色的下层是有机相蛋白质），小心吸取上清移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在15-30℃下静置10min（期间配制75%乙醇[焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制]，12000转4℃离心10min，弃上清，缓慢加入75%乙醇1ml，上下颠倒，12000转4℃离心5min，小心去除乙醇，室温干燥2-5min，加入30ulDEPC水，-70℃保存。（以上操作均在无菌操作台中进行，用到的离心管和枪头等均无RNA酶）
（6）细胞破碎：向步骤3离心管中加入3ml1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP K-30）（PBS磷酸缓冲液配制，PH=7.0），震荡混匀，超声破碎10-15次（功率300W，破碎持续时间2S，间隔5S）。以上所有操作均在冰上进行。
（7）总蛋白提取：破碎后8000转，4℃离心10分钟，取上清。
本发明中使用培养基均为常用培养基，其中轮虫通用培养基为轮虫人工配置培养基，每升含有NaHCO36mg、CaSO4.2H2O 60mg、MgSO4.7H2O 123mg、KCl 4mg。根据需要利用HCl和NaOH调节pH值7.5左右。饵料微藻采用BBM培养基，每升含有NaNO3250mg,CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O 75mg,K2HPO475mg,KH2PO4175mg,NaCl 25微量元素和维生素各2mL。
光照采用20-40W日光灯，光照时间24小时，温度控制在25-30℃，每日摇动若干次或者利用旋转培养装置转速10-15转/分钟。
本发明所说筛网是300目的滤网，孔径是54微米，可以滤去多余的水分和残余的微藻，使用时将其折叠成漏斗状（和滤纸使用方法类似，图1）架于烧杯上，将轮虫培养液缓慢的滴入。
本发明采用冰冻是由于轮虫过小，普通研磨棒不能有效的将其破碎，冻融后轮虫虫体会自然裂解，释放出RNA。
本发明采用超声破碎能够有效的破碎轮虫细胞，释放出胞内复合物，包括总蛋白。
本发明所说的聚乙烯吡咯烷酮（PVP K-30）的浓度是1%，由PH=7.0的PBS磷酸缓冲液现配现用。
本发明的原理为：
a.藻类去除原理：轮虫能够快速游动，离心后轮虫能迅速游动到上清液中，从而能有效的分离出微藻；
b.活体富集原理：微孔筛网的过滤能够去除多余的水分和残存的藻类；
c.RNA释放原理：加TRIZOL后，冰冻能够破裂虫体释放RNA；
d.细胞破碎原理：超声破碎能很好的破坏虫体，释放出胞内蛋白。该方法操作简便，快速，经济，便于应用。
附图说明
图1是筛网使用示意图。
图2是富集后高密度的轮虫。
图3是微藻去除前后对比图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：饵料藻类的去除
（1）轮虫培养
利用13号浮游物网从养殖池塘表层捞取活体样本200mL。带回实验室。挑选1个携带非混交雌体，移入微孔细胞培养板中。微孔加入微绿球藻浓度3×106ind/mL的轮虫混合悬液。在20-40W日光灯下连续光照培养、温度25-28°C、连续充气培养。2天后挑选50个携带非混交卵的个体移入100mL微绿球藻浓度3×106ind/mL的轮虫培养悬液。
（2）藻类去除
将轮虫培养液装入50ml离心管中，4500rpm，4℃离心5分钟，微藻沉在离心管底部，小心倒出含有轮虫的上清，本步骤可重复2-3次直到藻类全部除去。
实施例2：活体轮虫的富集
将300目的筛网折成漏斗状，架于烧杯上（图1），用胶头滴管吸取去除微藻的轮虫培养液，缓慢的滴入筛网底部，滤去水分，之后用双蒸水冲洗数次，在解剖镜下用10-100ml移液枪将轮虫吸到1.5ml离心管中。
实施例3：总RNA提取
传统研磨和冰冻破碎总RNA提取效率比较
藻类去除后，轮虫破碎处理采用下列方式：处理一：将其转移到预先准备好的研磨棒中，加1mlTRIZOL，研磨数次；处理二：将轮虫转移到无RNA酶离心管中，加入1mlTRIZOL，放入低温冰箱中冰冻（约30min），然后取出冰上融化：对照：轮虫转移到无RNA酶离心管中后，加1mlTRIZOL，上下震荡10S。RNA提取后续操作步骤相同。RNA提取结果如表1所示，冰冻能高效的提取轮虫总RNA，其他操作均会降低RNA提取效率。
表1轮虫总RNA浓度值测定
实施例4：总蛋白的提取
细胞破碎：向步骤3离心管中加入3ml、质量分数为1%PVP K-30（PBS磷酸缓冲液配制，PH=7.0），震荡混匀，超声破碎10-15次（功率300W，破碎持续时间2S，间隔5S）。以上所有操作均在冰上进行。
总蛋白提取：破碎后8000转，4℃离心10分钟，取上清。
最佳超生破碎次数的确定：
超声破碎次数分别是20次，15次，10次，5次。最终提取的蛋白量如表2所示，破碎次数在10-20次时蛋白浓度最高，过的超声会破坏蛋白的结构，使其失去其生理活性，超声次数过少，虫体破碎不充分，不利于蛋白的充分释放。
表2.不同超生破碎次数对总蛋白浓度的影响
Claims (1)
1.一种轮虫总RNA和总蛋白提取的方法，其特征包括以下步骤：
（1）轮虫培养
（2）微藻去除：将轮虫培养液装入50ml离心管中，4500rpm，4℃离心5分钟，微藻沉积在离心管底部，倒出含有轮虫的上清，本步骤重复2-3次直到藻类全部除去；
（3）轮虫富集：将300目的筛网折成漏斗状，架于烧杯上，用胶头滴管吸取去除微藻的轮虫培养液，滴入筛网底部，滤去水分，之后用双蒸水冲洗数次，在解剖镜下用10-100微升移液枪将轮虫吸到1.5ml离心管中；
（3）冰冻：在超净台下，将轮虫转移到无RNA酶的离心管中，加1mlTRIZOL，上下颠倒数次，混匀后将离心管放入-80℃冰箱中，使其完全结冰；
（4）总RNA提取：将加TRIZOL的提取液室温融化，12000转4℃离心5min；吸取上清移入新的1.5ml离心管中，加入氯仿，剧烈震荡15s，充分乳化后室温静置5min，12000转4℃离心15min；从离心机中取出，离心管中分三层，吸取上清移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在15-30℃下静置10min，12000转4℃离心10min，弃上清，缓慢加入75%乙醇1ml，上下颠倒，12000转4℃离心5min，去除乙醇，室温干燥2-5min，加入26μlDEPC水，-70℃保存；
（5）细胞破碎：向步骤3离心管中加入3ml质量分数为1%的、由PH=7.0的PBS磷酸缓冲液配制的PVP K-30，震荡混匀，超声破碎10-15次，功率300W，破碎持续时间2S，间隔5S；该步骤操作均在冰上进行；
（6）总蛋白提取：破碎后4000转，4℃离心10分钟，取上清。
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