CN102977208B - 鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒。本发明的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）调制抗原液、（2）免疫母鸡、（3）分离、纯化卵黄免疫球蛋白。体内体外实验表明，本发明制备得到的特异性IgY与鲍曼不动杆菌具有特异结合活性，可以有效抑制鲍曼不动杆菌的生长及其产生的毒性效应，可用于鲍曼不动杆菌感染性疾病及其并发症的防治和诊断分析，具有广阔的应用前景。

Description

鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒。

背景技术

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）为非发酵革兰阴性杆菌，是不动杆菌中引起人类感染的主要菌群，主要引起呼吸道感染、菌血症、泌尿系统感染、伤口感染、脑膜炎等，亦可引起腹膜炎、心内膜炎、眼内炎等，最常见的感染部位为肺部，是医院获得性肺炎的重要致病原。

随着临床抗菌药物的大量使用，鲍曼不动杆菌的耐药性也越来越强，已对头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等常用抗菌药物出现多重耐药性，甚至对碳青烯霉类药物包括亚胺培南或美洛培南在内均出现耐药性，这给临床治疗带来极大困难。

卵黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin，IgY）是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中的能与抗原发生特异性反应的一种免疫球蛋白，是禽类在长期进化过程中形成的用于提高抵抗力的物质。IgY除具有特异性强、价廉易得、性质稳定等优点外，与化学药物相比无毒副作用，与抗生素相比不易产生耐药性，因而倍受青睐。美国FDA已将特异性卵黄抗体视为替代抗生素的首要候选药物，日本政府投入巨资扶持“禽源抗体产业”。

目前，多种特异性IgY已经在人类和动物疾病的预防和治疗方面得到了应用。特异性IgY在人类疾病防治中的应用包括婴儿轮状病毒性腹泻、幽门螺杆菌感染、龋齿等，但在鲍曼不动杆菌感染性疾病防治中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白（IgY）的制备方法及应用、以及由该IgY制备得到的药物组合物、制剂和试剂盒。

具体而言，本发明的所述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法包括如下步骤：

（1）调制抗原液

将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37℃培养18-24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至10⁸-10¹⁰cfu/mL，向菌液中加入菌液体积0.5%的甲醛，37℃灭活24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4℃保存；

（2）免疫母鸡

选用140-160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射1点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0mL、1.5mL和2.0mL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4℃分类保存；

（3）分离、纯化卵黄免疫球蛋白

取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6-10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，在4℃下10000rpm离心25min，取上清液，进行盐析后，盐析溶液经超滤、冷冻干燥得冻干粉。

其中，所述鲍曼不动杆菌菌种可以使用市售的鲍曼不动杆菌标准菌，也可以使用医院分离获得的多药耐药性鲍曼不动杆菌。

本发明的所述应用包括上述制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白在制备用于防治鲍曼不动杆菌感染性疾病的药物中的应用和在制备用于分析诊断鲍曼不动杆菌感染性疾病的药物中的应用。

在上述应用中，所述鲍曼不动杆菌感染性疾病一般是指鲍曼不动杆菌感染性的呼吸道感染、菌血症、泌尿系统感染、伤口感染、脑膜炎、腹膜炎、心内膜炎、眼内炎中的一种或两种以上，尤其是指鲍曼不动杆菌感染性肺炎或菌血症。

本发明还提供一种药物组合物及其制剂。所述药物组合物包含上述制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白和药学上可接受的辅料。所述制剂是由上述药物组合物制备得到的制剂，为口服制剂、注射制剂或外用制剂，包括片剂、胶囊剂、微囊剂、注射剂、输液、软膏剂等。

作为片剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白冻干粉与填充剂（如可压性淀粉）、崩解剂（如微晶纤维素）、润滑剂（如微粉硅胶、滑石粉）混合，干法制粒后压片或直接压片，然后根据需要进行包衣。作为胶囊剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白冻干粉与填充剂（如糊精）混合均匀，填入胶囊。作为微囊剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的溶液与囊材（如氰基丙烯酸丁酯单体）按照乳化聚合两步法，以泊洛沙姆188为稳定剂，制成纳米囊或微囊，然后进一步制成其它剂型。作为注射剂，可将一定浓度的上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的溶液与等渗调节剂（如葡萄糖）、稳定剂（如半胱氨酸）混合，0.1μm滤过除菌，根据治疗剂量及效价分装。作为软膏剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白与空白软膏剂基质（如由聚乙二醇4000及聚乙二醇400组成的混合物）及防腐剂（如对羟基苯甲酸乙酯）混合均匀进行制备。

此外，本发明制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白还可以试剂盒的形式提供，所述试剂盒中包括上述制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白，还可以包括酶底物和稳定剂、缓冲剂等其他各种添加剂。

体内体外实验表明，本发明制备得到的特异性IgY与鲍曼不动杆菌具有特异结合活性，可以有效抑制鲍曼不动杆菌的生长及其产生的毒性效应，可用于鲍曼不动杆菌感染性疾病及其并发症的防治和诊断分析，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为M组和Q组各步纯化后的特异性IgY的电泳图。图中的条带：1.M组特异性IgY的超滤组分；2.M组特异性IgY的二次盐析组分；3.IgY标准品；4.M组特异性IgY的一次盐析组分；5.M组特异性IgY的水溶性组分；6.Q组特异性IgY的超滤组分；7.Q组特异性IgY的二次盐析组分；8.Q组特异性IgY的一次盐析组分；9.Q组特异性IgY的水溶性组分。

图2表示用M组特异性IgY免疫后不同时间卵黄水溶性组分的抗体效价。

图3表示用Q组特异性IgY免疫后不同时间卵黄水溶性组分的抗体效价。

图4表示M组特异性IgY对M菌的生长抑制作用。

图5表示Q组特异性IgY对M菌的生长抑制作用。

图6表示M组特异性IgY对Q菌的生长抑制作用。

图7表示Q组特异性IgY对Q菌的生长抑制作用。

具体实施方式

一、IgY的制备

下面的实施例1、2中分别采用两种不同来源的鲍曼不动杆菌作为抗原免疫母鸡，制备两种鲍曼不动杆菌特异性IgY，分别命名为M组和Q组。

实施例1（M组特异性IgY）

（1）调制抗原液

将鲍曼不动杆菌标准菌（ATCC-BAA1605，购自美国标准生物品收藏中心(American type culture collection)，大连辰钰生化试剂公司经销）（简称M菌）接种于TSB液体培养基中，37℃培养20h后，于6000rpm离心15min收集菌体，菌体以生理盐水稀释至10⁹cfu/ml，血球计数板计数。然后向菌液中加入菌液体积0.5%的甲醛，37℃灭活24h，不时摇动。经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4℃保存。注射前疫苗如发生分层现象，则需充分混匀后使用。

（2）免疫母鸡

选用140-160日龄的产蛋母鸡（海蓝蛋鸡，购自大连洪家畜牧有限公司），于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射1点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0mL、1.5mL和2.0mL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4℃分类保存。

（3）分离、纯化卵黄免疫球蛋白

取分类后的免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄。卵黄液加6倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，在4℃下10000rpm离心25min，取上清液即水溶性组分（WSF）。再先后经50%饱和度的硫酸铵溶液、14wt%硫酸钠溶液盐析，盐析溶液经超滤（Vivaflow50超滤系统，截留分子量为100KD）、冷冻干燥得冻干粉。

实施例2（Q组特异性IgY）

将医院分离获得的多药耐药性鲍曼不动杆菌（简称Q菌）按同样方法进行处理，调制抗原液。其他步骤与实施例1同样，制备得到卵黄免疫球蛋白冻干粉。

实施例3（非特异性IgY）

除了将菌液替换为生理盐水外，按与实施例1同样的方法，制备得到卵黄免疫球蛋白冻干粉。

二、纯度检测

采用SDS-PAGE（缓冲液采用Tris-甘氨酸系统，分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为4%），在非还原条件下检测各步纯化后的特异性IgY纯度（如图1所示）。

从图1可以看出，经过水稀释法分离得到卵黄抗体，再经硫酸铵和硫酸钠两次盐析，最后超滤除盐的纯化过程，抗体纯度逐步提高，超滤和二次盐析组分的纯度已超过IgY标准品（购自Promega公司）。

三、效价检测

采用间接ELISA法测定免疫后不同时间卵黄水溶性组分（WSF）中的抗体效价，具体步骤如下：用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释抗原菌（M菌或Q菌）至浓度为10⁹cfu/mL，包被酶标板（每孔100μL），37℃温育2h，洗涤液（0.05%Tween20的PBS溶液）洗板三次；封闭液（1%BSA的PBS溶液）封闭（每孔100μL），37℃温育1h，洗涤液洗板三次；分别加入以稀释液（0.1%BSA的PBS溶液）倍比稀释的特异性IgY或非特异性IgY的WSF（每孔100μL），以未免疫组鸡蛋的WSF为阴性对照、以三次免疫的当日血清（取静脉血，于5000rpm离心10min得到的血清）为阳性对照、以稀释液为空白对照（阴性对照、阳性对照和空白对照分别为每孔100μL），37℃温育2h，洗涤液洗板三次；加入HRP标记兔抗鸡IgG（购自Sigma公司）（每孔100μL），37℃温育1h，洗涤液洗板三次；加入TMB工作液（购自华美生物工程公司）（每孔100μL），阴暗处反应20min；加2M H₂SO₄进行终止（每孔50μL），酶标仪检测OD值（检测波长450nm）。OD值为阴性对照值的2.1倍所对应的最大稀释倍数作为其效价值（M组特异性IgY的结果如图2所示，Q组特异性IgY的结果如图3所示）。

从图2可以看出，M组均从首次免疫后的10天效价开始升高，25天效价达到12800，30~55天达到峰值均为25600，高效价（6400以上）可持续至免疫后120天。由图3可见，Q组也从首次免疫后的10天效价开始升高，25天效价达到12800，40~60天达到峰值均为25600，高效价（6400以上）可持续至免疫后120天。而生理盐水免疫组IgY（即非特异性IgY）的效价一直为200，说明没有特异性IgY产生。

四、抑菌实验

将特异性IgY冻干粉（M组或Q组）溶于TSB液体培养基中至所需浓度：5、10、20mg/mL，此外，将非特异性IgY冻干粉溶于TSB液体培养基中至10mg/mL（阴性对照1），将头孢哌酮舒巴坦钠溶于TSB液体培养基中至0.2mg/mL（阳性对照），另外取TSB液体培养基（阴性对照2），分别将这些溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。将M菌或Q菌分别加入到上述溶液中，使细菌终浓度为10⁷cfu/mL，于37℃、80rpm震荡速度下孵育，每隔2h取样100μL，以TSB液体培养基为测定的空白对照，采用酶标仪测定吸光值（检测波长600nm），结果如图4-7所示。

图4表示M组特异性IgY对M菌的生长抑制作用，图5表示Q组特异性IgY对M菌的生长抑制作用。从图4、5可以看出，M组和Q组的特异性IgY在浓度为5、10和20mg/mL时均能完全抑制M菌的生长，与阳性对照药物抑菌作用基本相同，而非特异性IgY对M菌的生长没有抑制作用。

图6表示M组特异性IgY对Q菌的生长抑制作用，图7表示Q组特异性IgY对Q菌的生长抑制作用。从图6、7可以看出，M组特异性IgY在浓度为5、10和20mg/mL时对Q菌的生长抑制作用呈剂量依赖性；Q组特异性IgY在浓度为5、10和20mg/mL时对Q菌的生长抑制作用也呈剂量依赖性，在浓度为20mg/mL时能完全抑制Q菌的生长。

五、对小鼠肺炎的作用

取昆明种小鼠50只（大连医科大学实验动物中心，许可证号SCXK（辽）2008-0002），随机分成5组，每组10只。4组小鼠经鼻滴入鲍曼不动杆菌（Q菌）（2×10¹¹cfu/mL，50μL/10g体重）建立小鼠肺炎模型；1组作为空白对照组，不感染鲍曼不动杆菌。

头孢哌酮舒巴坦钠、特异性IgY（M组或Q组）分别用生理盐水溶解至所需浓度（头孢哌酮舒巴坦钠20mg/mL，特异性IgY20mg/mL），用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

各组小鼠分别于感染前24h腹腔注射给药一次，每10g体重150μL；并在感染后每隔24h腹腔注射给药一次，连续五天，每10g体重250μL。各组给予的药物如表1所示。

观察各组小鼠的临床表现、体重、体温变化、白细胞（WBC）数变化、死亡率、肺组织细菌培养、肺组织外观及肺病理切片。鲍曼不动杆菌感染后，除空白对照组外，各组小鼠体重、体温、外周血中WBC数均有不同程度的下降，特异性IgY（M组和Q组）治疗组的下降明显低于阴性对照组，与阳性对照组相近；除空白对照组外，其余各组小鼠肺组织细菌培养均呈阳性，特异性IgY（M组和Q组）治疗组和阳性对照组细菌计数低于阴性对照组；除空白对照组外，其余各组小鼠肺组织外观有不同程度的损伤，肺病理切片显示肺泡结构破坏，肺纤维化，但特异性IgY（M组和Q组）治疗组和阳性对照组损伤程度低于阴性对照组；各组小鼠四天的死亡率分别为：空白对照组为0，阴性对照组为90%，阳性对照组和特异性IgY治疗组均为20%。

表1

组别	小鼠	给予的药物
			空白对照组	未感染肺炎	生理盐水
阴性对照组	肺炎模型	生理盐水
			阳性对照组	肺炎模型	头孢哌酮舒巴坦钠
特异性IgY治疗组1	肺炎模型	M组特异性IgY
			特异性IgY治疗组2	肺炎模型	Q组特异性IgY

六、制剂实例

①片剂：将特异性IgY（M组或Q组）冻干粉10g与可压性淀粉375g、微晶纤维素100g、微粉硅胶15g混合均匀，干法制粒后压片，共制1000片。

②胶囊剂：将特异性IgY（M组或Q组）冻干粉10g与糊精490g混合均匀，填入胶囊，共制1000粒。

③微囊剂：将特异性IgY（M组或Q组）溶液40mL（25mg/mL）与氰基丙烯酸丁酯单体10g按照乳化聚合两步法，以泊洛沙姆188为稳定剂，制成微囊。

④软膏剂：将25g聚乙二醇4000与64.9g聚乙二醇400加热熔融，加入0.1g对羟基苯甲酸乙酯使其溶解，然后在搅拌下迅速冷却至35℃左右，加入10ml特异性IgY（M组或Q组）溶液（100mg/ml），搅拌均匀即得。

⑤注射剂：将乳糖1g、葡萄糖4.5g、半胱氨酸0.05g溶于少量水中，加入特异性IgY（M组或Q组）溶液40ml（25mg/ml），加水定容至100ml，0.1μm微孔滤膜过滤后分装于安瓿，每瓶1ml，冷冻干燥后封口并检漏。

Claims (4)

1.鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白在制备用于防治或分析诊断鲍曼不动杆菌感染性疾病的药物中的应用；

所述鲍曼不动杆菌感染性疾病为鲍曼不动杆菌感染性肺炎或菌血症；

所述鲍曼不动杆菌菌种为市售的鲍曼不动杆菌标准菌或医院分离获得的多药耐药性鲍曼不动杆菌；

所述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)调制抗原液

将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37℃培养18-24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至10⁸-10¹⁰cfu/mL，向菌液中加入菌液体积0.5％的甲醛，37℃灭活24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4℃保存；

(2)免疫母鸡

选用140-160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射1点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0mL、1.5mL和2.0mL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4℃分类保存；

(3)分离、纯化卵黄免疫球蛋白

取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6-10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，在4℃下10000rpm离心25min，取上清液，进行盐析后，盐析溶液经超滤、冷冻干燥得冻干粉。

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白和药学上可接受的辅料；

所述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)调制抗原液

将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37℃培养18-24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至10⁸-10¹⁰cfu/mL，向菌液中加入菌液体积0.5％的甲醛，37℃灭活24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4℃保存；

(2)免疫母鸡

选用140-160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射1点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0mL、1.5mL和2.0mL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4℃分类保存；

(3)分离、纯化卵黄免疫球蛋白

取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6-10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，在4℃下10000rpm离心25min，取上清液，进行盐析后，盐析溶液经超滤、冷冻干燥得冻干粉；

所述鲍曼不动杆菌菌种为市售的鲍曼不动杆菌标准菌或医院分离获得的多药耐药性鲍曼不动杆菌。

3.一种由权利要求2所述的药物组合物制备得到的制剂，其特征在于，所述制剂为口服制剂、注射制剂或外用制剂。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白；

所述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)调制抗原液

将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37℃培养18-24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至10⁸-10¹⁰cfu/mL，向菌液中加入菌液体积0.5％的甲醛，37℃灭活24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4℃保存；

(2)免疫母鸡

选用140-160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射1点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0mL、1.5mL和2.0mL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4℃分类保存；

(3)分离、纯化卵黄免疫球蛋白

取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6-10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，在4℃下10000rpm离心25min，取上清液，进行盐析后，盐析溶液经超滤、冷冻干燥得冻干粉；

所述鲍曼不动杆菌菌种为市售的鲍曼不动杆菌标准菌或医院分离获得的多药耐药性鲍曼不动杆菌。