CN102977192A - 一种卡贝缩宫素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成卡贝缩宫素的纯化方法，该方法包括了反相离子对液相色谱纯化合成粗肽，通过离子交换树脂将离子对试剂脱除，最终得到纯度为99.5%的卡贝缩宫素精肽。反相离子对液相色谱的运用，大大提高了纯化收率和产品纯度。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的纯化技术领域，尤其涉及卡贝缩宫素的纯化技术。
背景技术
卡贝缩宫素（Carbetocin）是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用，其临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。
不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在两分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约一个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素要长，并且对有出血倾向、需额外使用缩宫素者，卡贝缩宫素耐受性好，与缩宫素一样有效甚至更有效。目前临床常用的促进子宫缩收药物麦角新碱，会导致恶心、呕吐、高血压和冠脉痉挛等。卡贝缩宫素是一种长效的类催产素药物。与麦角新碱相比，使用卡贝缩宫素在预防阴道分娩妇女的产后出血方面同样有效，并且恶心、呕吐、高血压的发生比例显著降低。因此，卡贝缩宫素在临床应用上，具有广阔的市场前景。
卡贝缩宫素常用纯化方法通常包括反相高效液相色谱法、凝胶法、离子交换法等，采用任何一种单一方法，都很难分离得到高纯产品(＜99%），或者收率较低（小于50%）。目前，很少有关于其分离纯化方面的研究报道，程生强，马亚平等在其研究中报道，以磷酸缓冲液作为洗脱液，采用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素，并采用离子交换法转盐，得到醋酸卡贝缩宫素，收率为70%-75%，目的肽纯度为98%。
综合分析国内外关于合成卡贝缩宫素的纯化方法，主要存在两点问题：①采用单一的纯化方法，产品纯度低；②采用多种纯化手段，产品收率低。
发明内容
本发明针对现有工艺的不足，提出一种卡贝缩宫素的分离纯化方法，产品纯度高，纯化收率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：采用反相离子对液相色谱法，将反相色谱和离子色谱的优势结合起来，减少纯化步骤，提高产品纯度，其方法包含以下步骤：
步骤一、采用反相离子对液相色谱法，以反相色谱柱为固定相，一定浓度离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，进行梯度洗脱，洗脱梯度B%为：5-40%，优选25%-35%，分三段收集目的峰，分别为峰前、合格品、峰后，合格品为纯度达到99.5%部分，峰前部分保留时间小于合格品的保留时间，纯度为90.0%-99.5%，峰后部分保留时间大于合格品的保留时间，纯度为90.0%-99.5%。
步骤二、将以上①步得到峰前、峰后部分分别纯化，采用反相离子对液相色谱法，以反相色谱柱为固定相，一定浓度离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，进行梯度洗脱，洗脱梯度B%为：5-40%，优选25%-35%，将得到的合格品合并，得到纯度为99.5%以上的目的肽。
步骤三、将以上得到的合格品，采用反相离子对液相色谱法，以反相色谱柱为固定相，一定浓度的补偿离子水溶液为A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，进行梯度洗脱，洗脱梯度B%为：10-80%，优选30%-70%，将得到的合格品合并，得到纯度为99.5%以上的目的肽。
将洗脱液添加补偿离子，包括醋酸、磷酸、盐酸、三氟乙酸等，得到不同盐形式的卡贝缩宫素。
与已有工艺相比，本发明操作简单，一步纯化达到99.5%的纯度，收率达到70%-75%，具有明显的成本优势。
具体实施方式
本文所述，术语“反相离子对色谱法”指以反相填料为固定相，离子对试剂为流动相的色谱行为，或者是以离子交换填料为固定相，有机溶剂为流动相的色谱行为，目的是结合离子色谱和反相色谱的优势，高效分离纯化合成卡贝缩宫素。
本文所述，术语“离子对试剂”包括R-SO3Na或R-SO4Na，其中R选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基。
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
实施例1：
1、预处理：将待纯化卡贝缩宫素配制成浓度为200-300mg/ml的水
溶液，经孔径为0.45um的微孔滤膜过滤，收集滤液。
反相色谱柱预处理：使用60%的乙腈水溶液冲洗色谱柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。
离子交换色谱柱预处理：浓度为2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用纯水洗至中性。
2、分离纯化：取滤液，注入处理好的色谱柱进行分离纯化，对目的洗脱
液划分峰为前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分纯度90%-99.5%，合格品部分纯度大于99.5%，峰后部分纯度90%-99.5%；分别将峰前、峰后部分洗脱液分离纯化，色谱条件与原始样品的分离纯化相同。合并合格品，备用。
分离纯化色谱条件：色谱柱：以反相C18为固定相的色谱柱，柱子规格为：50mm×250mm；流动相A相：10mmol/L的庚烷磺酸钠，磷酸调pH至2.0 ，流动相B相：乙腈，流速为80ml/min；梯度：以乙腈浓度计，25％-35％，时间为40min；检测波长为220nm；上样量1-1.2g
3、脱盐、干燥：将经分离纯化后卡贝缩宫素合格品注入预处理好的色谱柱，梯度洗脱，收集目的肽；将脱盐后的卡贝缩宫素目的肽浓缩至120-150mg/ml，低温冷冻干燥得到冻干粉。产品纯度为99.7%，收率为72.8%。
脱盐色谱条件：色谱柱：阳离子交换树脂：普尔树脂 D201，柱子直径和长度：50mm×400mm;流动相A相：0.1%的醋酸水溶液，流动相B相：乙醇；洗脱梯度：以乙醇浓度计，30-70%，时间为70min;检测波长为220nm；上样量4.5-5.0g。
实施例2：
1、预处理：将待纯化卡贝缩宫素配制成浓度为200-300mg/ml的水
溶液，经孔径为0.45um的微孔滤膜过滤，收集滤液。
反相色谱柱预处理：使用60%的乙腈水溶液冲洗色谱柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。
离子交换色谱柱预处理：浓度为2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用纯水洗至中性。
2、分离纯化：取滤液，注入处理好的色谱柱进行分离纯化，对目的洗脱
液划分峰为前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分纯度90%-99.5%，合格品部分纯度大于99.5%，峰后部分纯度90%-99.5%；分别将峰前、峰后部分洗脱液分离纯化，色谱条件与原始样品的分离纯化相同。合并合格品，备用。
分离纯化色谱条件：色谱柱：以反相C18为固定相的色谱柱，柱子规格为：50mm×250mm；流动相A相：10mmol/L的十二烷基磺酸钠，磷酸调pH至2.0 ，流动相B相：乙腈，流速为80ml/min；梯度：以乙腈浓度计，25％-35％，时间为40min；检测波长为220nm；上样量1-1.2g
3、脱盐、干燥：将经分离纯化后卡贝缩宫素合格品注入预处理好的色谱柱，梯度洗脱，收集目的肽；将脱盐后的卡贝缩宫素目的肽浓缩至120-150mg/ml，低温冷冻干燥得到冻干粉。产品纯度为99.7%，收率为75.1%。
脱盐色谱条件：色谱柱：阳离子交换树脂：普尔树脂 D201，柱子直径和长度：50mm×400mm;流动相A相：0.1%的醋酸水溶液，流动相B相：乙醇；洗脱梯度：以乙醇浓度计，30-70%，时间为70min;检测波长为220nm；上样量4.5-5.0g。
实施例3：
1、预处理：将待纯化卡贝缩宫素配制成浓度为200-300mg/ml的水
溶液，经孔径为0.45um的微孔滤膜过滤，收集滤液。
反相色谱柱预处理：使用60%的乙腈水溶液冲洗色谱柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。
离子交换色谱柱预处理：浓度为2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用纯水洗至中性。
2、分离纯化：取滤液，注入处理好的色谱柱进行分离纯化，对目的洗脱
液划分峰为前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分纯度90%-99.5%，合格品部分纯度大于99.5%，峰后部分纯度90%-99.5%；分别将峰前、峰后部分洗脱液分离纯化，色谱条件与原始样品的分离纯化相同。合并合格品，备用。
分离纯化色谱条件：色谱柱：以反相C18为固定相的色谱柱，柱子规格为：50mm×250mm；流动相A相：10mmol/L的庚烷磺酸钠，磷酸调pH至7.0 ，流动相B相：乙腈，流速为80ml/min；梯度：以乙腈浓度计，26％-36％，时间为40min；检测波长为220nm；上样量1-1.2g
3、脱盐、干燥：将经分离纯化后卡贝缩宫素合格品注入预处理好的色谱柱，梯度洗脱，收集目的肽；将脱盐后的卡贝缩宫素目的肽浓缩至120-150mg/ml，低温冷冻干燥得到冻干粉。产品纯度为99.7%，收率为71.6%。
脱盐色谱条件：色谱柱：阳离子交换树脂：普尔树脂 D301，柱子直径和长度：50mm×400mm;流动相A相：0.1%的醋酸水溶液，流动相B相：乙醇；洗脱梯度：以乙醇浓度计，30-70%，时间为70min;检测波长为220nm；上样量4.5-5.0g。
综上，反相离子对液相色谱法分离纯化合成卡贝缩宫素，产品纯度高，收率高，适合合成多肽的分离纯化。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤：
①、采用反相离子对液相色谱法分离纯化卡贝缩宫素粗肽：以反相色谱填料为固定相，一定浓度的离子对试剂水溶液为流动相A相，甲醇或乙腈或乙醇为流动相B相，纯化后得到纯度为99.5%以上的精肽；②、采用离子交换色谱法脱除精肽中离子对试剂及其它盐：将精肽溶液调至合适pH，使得卡贝缩宫素结合在离子交换树脂上，用纯水冲洗除去无机盐和大部分离子对试剂，再使用一定比例的乙醇水溶液梯度洗脱，将离子对试剂和卡贝缩宫素分开，得到无盐卡贝缩宫素乙醇水溶液。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于：所述反相色谱填料包括C18、C8、C4，但不仅限于C18、C8、C4。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于：所述离子对试剂包括R-SO3Na或R-SO4Na，其中R选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基。
4.如权利要求1或3所述方法，其特征在于：离子对试剂水溶液浓度为0.002-0.100mol/L，流动相A相pH值为1.5-8.0。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于：离子交换树脂包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
6.如权利要求1或5所述方法，其特征在于：当采用阳离子交换树脂时，精肽溶液pH值调至1.0-3.5；当采用阴离子交换树脂时，精肽溶液pH值调至5.0-10.0。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于：精肽溶液上离子交换柱后，采用梯度洗脱的方法，洗脱相A相为醋酸水溶液，盐酸水溶液，三氟醋酸水溶液，磷酸水溶液，洗脱相B相为甲醇，乙醇。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于：收取卡贝缩宫素目的峰，得到卡贝缩宫素。
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