CN102946914B - 方法及组合物 - Google Patents

Abstract

提供了用于培养真核细胞的方法和组合物，以及用于制备真核细胞的方法。这些方法包括提供待培养的真核细胞的样品，将所述样品应用到细胞支架材料，和在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料。所述组合物包括真核细胞和细胞支架材料。所述细胞支架材料包含蜘蛛丝蛋白的聚合物。

Description

方法及组合物

发明领域

本发明涉及真核细胞培养和组织工程的领域，并提供了用于真核细胞培养和制备的方法及组合物（combination），其中蜘蛛丝蛋白的聚合物用作细胞支架材料。

背景

蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的组合物而获得了非同寻常的韧性。蜘蛛具有多达七个不同的腺，这些腺产生具有不同机械性质和功能的多种丝类型。由主壶腹腺产生的拖丝(dragline silk)是最坚韧的纤维，且在重量基础上它胜过人造材料，例如高强度钢(tensile steel)。在用于医疗或技术目的的新材料的开发中，拖丝的性质是有吸引力的。

拖丝由两种主要的多肽组成，大多被称为主壶腹腺拖丝蛋白（spidroin）(MaSp)1和2，但在例如，在十字园蛛(Araneus diadematus)中被称为ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200-720kDa范围内的分子量。编码黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)的拖丝蛋白的基因是仅有的已被完全表征的基因，且MaSp1和MaSp2基因分别编码3129和3779个氨基酸(Ayoub NA等人PLoS ONE 2(6):e514,2007)。Huemmerich,D.等人Curr.Biol.14,2070-2074(2004)中讨论了拖丝多肽的性质。

蜘蛛拖丝蛋白质或MaSp具有分成三部分的组成：无重复的N-端结构域、由许多重复的聚Ala/Gly区段构成的中心重复区域和无重复的C-端结构域。通常认为重复区域在丝纤维中形成分子间接触，但不太清楚末端结构域的准确功能。还认为与纤维形成相联系地，重复区域经历从无规卷曲和α-螺旋构象到β-折叠结构的结构转化。拖丝蛋白的C端区域在蜘 蛛种类和丝类型之间通常是保守的。蜘蛛丝的N端结构域是最保守的区域(Rising,A.等人Biomacromolecules 7,3120-3124(2006))。

WO03/057727公开了可溶性重组丝多肽在哺乳动物细胞系和动物中的表达。所获得的丝多肽在含水介质中显示出差的溶解度和/或形成沉淀。因为所获得的丝多肽不自发聚合，所以为获得聚合物或纤维需要离心。

WO07/078239和Stark,M.等人Biomacromolecules 8,1695-1701,(2007)公开了由具有高的Ala和Gly含量的重复片段和蛋白质的C端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配体释放后，自然地获得蜘蛛丝蛋白的纤维。小的融合单元对于纤维形成是充分且必要的。

Hedhammar,M.等人Biochemistry 47,3407-3417,(2008)研究了热、pH和盐对重组的N端和C端拖丝蛋白结构域和包含四个富含聚-Ala和Gly的共嵌段的重复性拖丝蛋白结构域的结构和聚集和/或聚合的影响。

迄今为止关于重组蜘蛛丝的生物相容性的体外研究很少，且所研究的材料在氨基酸序列、产生方式和形式方面变化很大。

发明描述

一方面，本发明提供了用于培养真核细胞的方法，包括：

-提供待培养的真核细胞的样品；

-将所述样品应用到细胞支架材料；以及

-在适合细胞培养的条件下保持具有已对其应用的细胞的所述细胞支架材料。该细胞支架材料包含蜘蛛丝蛋白的聚合物。

第二方面，本发明提供了用于制备真核细胞的方法，包括：

-提供真核细胞样品；

-将所述样品应用到细胞支架材料；

-在适合细胞培养的条件下保持具有已对其应用的细胞的所述细胞支架材料；以及

-由所述细胞支架材料制备细胞样品。该细胞支架材料包含蜘蛛丝蛋白的聚合物。

本发明人已发现包含蜘蛛丝蛋白的聚合物的细胞支架材料提供了对在各种不同条件下培养真核细胞有益的环境。此外，该环境使得能够建立以其他方式建立非常困难、非常昂贵或甚至不可能在实验室中培养的细胞培养物，并且用于建立对组织工程和/或移植有用的包含细胞的材料。

在其某些实施方式中，培养或制备方法可在包括将具有已对其应用的细胞的细胞支架材料保持在无血清培养基中的条件下进行。在无血清培养基中培养细胞的可能性提供对使用含血清培养基和/或含特定生长因子或细胞外基质(ECM)组分的培养基的一种有成本效益的且受控的替代方案。这种类型的培养基通常是非常昂贵的，有时甚至过高地昂贵且是不均质的。

第三方面，本发明提供了真核细胞和包含蜘蛛丝蛋白的聚合物的细胞支架材料的组合物。根据本发明的该组合物可以各种不同的形式呈现，并被调整为适合特定情况的需要。应设想，例如，本发明的组合物作为用于替代受损或患病组织中的细胞的含细胞植入物可能是有用的。

在本文陈述的方法和组合物的某些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在其他实施方式中，真核细胞是非哺乳动物细胞，例如昆虫或酵母细胞。

在下列多级列表中列出了可通过根据本发明的方法培养或制备或被包括在根据本发明的组合物中的哺乳动物细胞的非限制性实例：

皮肤系统的细胞

角化上皮细胞

表皮角质形成细胞(分化的表皮细胞)

表皮基底细胞(干细胞)

指甲和趾甲的角质形成细胞

甲床基底细胞(干细胞)

髓质头发轴细胞

皮质头发轴细胞

表皮的头发轴细胞

表皮的头发轴细胞

赫胥黎层的毛根鞘细胞

亨勒层的毛根鞘细胞

外毛根鞘细胞 

毛发基质细胞(干细胞)

湿分层屏障的上皮细胞

角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的分层鳞状上皮的表面上皮细胞

角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)

泌尿上皮细胞(衬膀胱和输尿管)

腺细胞

外分泌性上皮细胞

唾液腺粘液细胞(富含多糖性分泌)

唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶性分泌)

舌中的冯埃布纳腺细胞(冲洗味蕾)

乳腺细胞(乳汁分泌)

泪腺细胞(泪液分泌)

耳中的耵聍腺细胞(蜡分泌)

外分泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)

外分泌汗腺亮细胞(小分子分泌)

顶分泌汗腺细胞(性激素敏感的气味分泌)

眼睑中的睫毛腺细胞(特化汗腺)

皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)

鼻中的鲍曼腺细胞(冲洗嗅觉上皮)

十二指肠中的布伦纳腺细胞(酶和碱性粘液)

精囊细胞(分泌精液组分，包括精子游动所需的果糖)

前列腺细胞(分泌精液组分)

尿道球腺细胞(粘液分泌)

巴多林腺细胞(阴道润滑剂分泌)

尿道腺细胞(粘液分泌)

子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)

呼吸道和消化道的孤立杯状细胞(粘液分泌)

胃壁粘液细胞(粘液分泌)

胃腺产酶细胞(胃蛋白酶原分泌)

胃腺壁细胞、泌酸细胞(盐酸分泌)

肠嗜铬细胞样(ECL)细胞(释放组胺)

胰腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)

小肠的帕内特细胞(溶菌酶分泌)

肺的II型肺细胞(表面活性物质分泌)

肺的克拉拉细胞

激素分泌细胞

垂体前叶细胞 

生长激素细胞 

催乳素细胞 

促甲状腺素细胞

促性腺素细胞 

促肾上腺皮质素细胞

垂体中叶细胞，分泌黑素细胞刺激性激素

大细胞的神经分泌细胞

分泌催产素 

分泌血管升压素

肠道和呼吸道细胞

包括在朗格汉斯小岛中的细胞

α细胞(产生胰高血糖素)、β细胞(产生胰岛素的细胞)、δ细胞(产生促生长素抑制素的细胞)、pp细胞(产生胰多肽)、ε细胞(产生生长素释放肽)

分泌血清素 

分泌内啡肽 

分泌胃泌素 

分泌促胰液素 

分泌缩胆囊素 

分泌铃蟾肽 

甲状腺细胞 

甲状腺上皮细胞

滤泡旁细胞 

甲状旁腺细胞 

甲状旁腺主细胞

嗜酸性细胞 

肾上腺细胞 

嗜铬细胞

分泌类固醇激素(盐皮质激素、雄性激素和糖皮质激素)

分泌睾酮的睾丸间质细胞

卵泡的分泌雌性激素的卵泡内膜细胞

破裂的卵泡的黄体细胞分泌孕酮

颗粒黄体细胞 

泡膜黄体细胞 

球旁细胞(肾素分泌)

肾的致密斑细胞

肾的极周细胞 

肾的系膜细胞 

代谢和贮藏细胞

肝细胞(肝脏细胞)

白色脂肪细胞(脂肪细胞/胚细胞)

褐色脂肪细胞 

肝脏脂细胞 

屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)

肾

肾小球泌酸细胞

肾小球足细胞 

肾近端小管刷状缘细胞

髓襻细段细胞 

肾远端小管细胞

肾集合管细胞 

其他

I型肺细胞(肺的内衬气室)

胰导管细胞(泡心细胞)

非横纹导管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等的)

主细胞(principal cell)

闰细胞(Intercalated cell)

(精囊、前列腺等的)导管细胞

肠刷状缘细胞(具有绒毛)

外分泌腺分泌管细胞

胆囊上皮细胞 

输出小管的无纤毛细胞

附睾主细胞 

附睾基底细胞 

上皮细胞内衬封闭的内部体腔

微血管内皮细胞

血管和淋巴管内皮有窗细胞

血管和淋巴管内皮连续细胞

血管和淋巴管内皮脾细胞

滑膜细胞(内衬关节腔，盐酸分泌)

浆膜细胞(内衬腹膜腔、胸膜腔和围心腔)

鳞状细胞(耳的内衬外淋巴隙)

鳞状细胞(耳的内衬内淋巴隙)

具有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(耳的内衬内淋巴隙)

无微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(耳的内衬内淋巴隙)

暗细胞(耳的内衬内淋巴隙)

前庭膜细胞(耳的内衬内淋巴隙)

血管纹基底细胞(耳的内衬内淋巴隙)

血管纹缘细胞(耳的内衬内淋巴隙)

克劳迪乌斯细胞(耳的内衬内淋巴隙)

伯特歇尔细胞(耳的内衬内淋巴隙)

脉络丛细胞(脑脊液分泌)

软蛛网膜鳞状细胞

眼睛的色素纤毛上皮细胞

眼睛的无色素纤毛上皮细胞

角膜内皮细胞 

居间细胞(输卵管的)

具有推进功能的有纤毛细胞

呼吸道的有纤毛细胞

输卵管的有纤毛细胞(女性体内)

子宫内膜的有纤毛细胞(女性体内)

睾丸网的有纤毛细胞(男性体内)

输出小管的有纤毛细胞(男性体内)

中枢神经系统的有纤毛室管膜细胞(内衬脑腔)

细胞外基质的分泌细胞

成釉质上皮细胞(牙釉质分泌)

耳前庭器官的半月平面上皮细胞(蛋白聚糖分泌)

柯蒂氏器官的齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)

疏松结缔组织成纤维细胞

角膜成纤维细胞(角膜的角膜细胞)

肌腱成纤维细胞

骨髓网状组织成纤维细胞

其他非上皮成纤维细胞

周细胞

椎间盘的髓核细胞

成牙骨质细胞/牙骨质细胞(牙根骨样牙骨质分泌)

成牙本质细胞/牙本质细胞(牙本质分泌)

透明软骨的软骨细胞

纤维软骨的软骨细胞

弹性软骨的软骨细胞

成骨细胞/骨细胞

骨原细胞(成骨细胞的干细胞)

眼睛玻璃体的玻璃体细胞

耳外淋巴隙的星状细胞

肝的星状细胞(伊藤细胞)

胰的星状细胞 

收缩细胞

骨骼肌细胞 

红色骨骼肌细胞(慢)

白色骨骼肌细胞(快)

中间骨骼肌细胞(快)

肌梭的核袋状细胞

肌梭的核链状细胞

卫星细胞(干细胞)

心肌细胞

普通心肌细胞 

节的心肌细胞 

浦肯野纤维细胞

平滑肌细胞(各种类型)

虹膜的肌上皮细胞

外分泌腺的肌上皮细胞

血液和免疫系统的细胞

巨核细胞(血小板前体)

单核细胞

结缔组织巨噬细胞(各种类型)

表皮朗格汉斯细胞

破骨细胞(骨中)

树突状细胞(淋巴组织中)

小胶质细胞(中枢神经系统中)

中性粒细胞 

嗜酸性粒细胞 

嗜碱性粒细胞 

肥大细胞

辅助型T细胞

抑制型T细胞

细胞毒性T细胞

自然杀伤T细胞

B细胞

自然杀伤细胞 

网织红细胞 

血液和免疫系统的定向祖细胞(各种类型，例如巨核细胞、原粒细胞)

神经系统的细胞

感觉转导细胞

柯蒂氏器官的听觉内部毛细胞

柯蒂氏器官的听觉外部毛细胞

嗅觉上皮的基底细胞(嗅觉神经元的干细胞)

寒冷敏感性初级感觉神经元

热敏感性初级感觉神经元

表皮的梅克尔细胞(触觉传感器)

嗅觉受体神经元

疼痛敏感性初级感觉神经元(各种类型)

眼睛中视网膜的光感受器细胞

光感受器视杆细胞

眼睛的光感受器蓝色敏感性视锥细胞

眼睛的光感受器绿色敏感性视锥细胞

眼睛的光感受器红色敏感性视锥细胞

本体感受性初级感觉神经元(各种类型)

触觉敏感性初级感觉神经元(各种类型)

I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)

II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)

耳前庭器官的I型毛细胞(加速力和重力)

耳前庭器官的II型毛细胞(加速力和重力)

I型味蕾细胞 

自主性神经元细胞

胆碱能神经细胞(各种类型)

肾上腺素神经细胞(各种类型)

肽能神经细胞(各种类型)

感觉器官和外周神经元的支持细胞

柯蒂氏器官的内柱细胞

柯蒂氏器官的外柱细胞

柯蒂氏器官的内指细胞

柯蒂氏器官的外指细胞

柯蒂氏器官的边缘细胞

柯蒂氏器官的汉森细胞

前庭器官的支持细胞

味蕾支持细胞 

嗅觉上皮支持细胞

施万细胞

卫星细胞(围封外周神经细胞体)

肠的神经胶质细胞

中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞

星形胶质细胞(各种类型)

神经元细胞(尚未清楚分类的多样类型)

少突胶质细胞 

纺锤体神经元 

松果体细胞(产生褪黑素)

晶状体细胞

前晶状体上皮细胞

包含晶体蛋白的晶状体纤维细胞

色素细胞

黑素细胞

视网膜色素上皮细胞

生殖细胞

卵原细胞/卵母细胞

精子细胞

精母细胞

精原细胞(精母细胞的干细胞)

精子

滋养细胞

卵泡细胞

赛托利细胞(睾丸中)

胸腺上皮细胞 

干细胞和祖细胞

胚胎干细胞 

成人胚胎干细胞(例如造血干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、神经干细胞、间充质干细胞)

祖细胞(神经祖细胞、淋巴祖细胞、卫星细胞、内皮祖细胞、骨膜祖细胞、胰祖细胞、肌肉内的卫星细胞、造血祖细胞)

羊膜干细胞(多能的并可分化成生脂系、成骨系、生肌系、内皮系、肝系且还有神经元系的细胞)

诱导多能干细胞

在器官中，通常存在主要组织和散发组织。主要组织是特定器官独有的组织。在本发明的一个实施方式中，应设想用于本文公开的方法或组合物的细胞是主要组织细胞，即，促进器官在其天然环境中的功能的细胞。此外，在某个实施方式中，未包括特别是在结缔组织中形成散发组织的细胞，因为结缔组织的作用被认为通过该实施方式中的蜘蛛丝蛋白实现。

例如，心脏的主要组织是心肌，而散发组织是神经、血液、结缔组织等。下文随附了器官系统的非限制性实例列表，其主要组织的细胞在本文公开的方法或组合物中可能是有用的。

循环系统：通过心脏、血液和血管向身体和肺泵送和疏导血液以及泵送和疏导来自身体和肺的血液。

消化系统：通过唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰、肠、直肠和肛门消化和处理食物。

内分泌系统：使用由内分泌腺例如下丘脑、垂体或垂体腺、松果体或松果腺、胰、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺(adrenals)，即，肾上腺(adrenal gland)产生的激素在身体内通讯。

排泄系统：参与流体平衡、电解质平衡和尿液分泌的肾、子宫、膀胱和尿道。

皮肤系统：皮肤、毛发和指甲。

淋巴系统：参与淋巴在组织和血流之间转移的结构，淋巴及运输淋巴的淋巴结和淋巴管，包括内皮。

免疫系统：通过白细胞、扁桃体、腺状体、胸腺和脾防御致病物质。

肌肉系统：通过肌肉运动。

神经系统：通过脑、脊髓、外周神经和神经收集、转移和处理信息。

生殖系统：性器官例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺和阴茎。

呼吸系统：用于呼吸的器官，咽、喉、气管、支气管、肺和隔膜。

骨骼系统：通过骨、软骨、韧带和肌腱的结构支撑和保护。

本文公开的方法或组合物的各种不同的实施方式可采用来自细胞类型和器官及组织系统的上述总列表的任何亚组或子列表的细胞，或甚至单独的细胞类型。

在更具体的实施方式中，所述哺乳动物细胞选自由干细胞和来自朗格汉斯小岛的细胞(例如，β细胞)组成的组。

在更具体的实施方式中，所述细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、羊膜干细胞和祖细胞，且可特别地选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。

在又一个特定的实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞。

在又一个特定的实施方式中，所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组的成体干细胞。

在又一个特定的实施方式中，所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。

在又一个特定的实施方式中，哺乳动物细胞是可以以单一细胞或以至少一个神经球的形式提供的神经干细胞(可互换地称为神经皮质干细胞)。

在又一个特定的实施方式中，哺乳动物细胞是可以以单一细胞或以至少一个朗格汉斯小岛的形式提供的产生胰岛素的β-细胞。

在又一个特定的实施方式中，哺乳动物细胞是例如选自由肝细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞组成的组的体细胞。

在本公开内容的上下文中使用的细胞支架材料包含也称为“拖丝蛋白”的蜘蛛丝蛋白或多肽的聚合物。

在细胞支架材料的一个实施方式中，所述拖丝蛋白由140至160个氨基酸残基组成且包含：

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段； 以及任选地

衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。

拖丝蛋白由140至600个氨基酸残基，优选地280至600个氨基酸残基，例如300至400个氨基酸残基，更优选地340至380个氨基酸残基组成。小尺寸是有利的，因为较长的蜘蛛丝蛋白往往形成无定形的聚集物，这需要使用用于增溶和聚合的苛刻溶剂。蛋白质片段通常通过肽键共价偶联。

在特定的优选实施方式中，用于细胞支架材料中的拖丝蛋白选自由式NT-REP-CT和REP-CT定义的蛋白质的组。

(任选的)NT与蜘蛛丝蛋白的N-端氨基酸序列具有高度的相似性。如图1中所示，该氨基酸序列在各物种和包括MaSp1和MaSp2的蜘蛛丝蛋白中相当保守。还参见以下表1：

表1-拖丝蛋白NT片段

哪一种(如果有的话)特定的NT片段存在于本文公开的细胞支架材料的拖丝蛋白中不是关键的。因此，根据本发明的NT片段可选自图1中所示的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任意一种。各种各样的N端序列可用作本文公开的细胞支架材料中的拖丝蛋白。基于图1的同源序列，下列序列构成共有NT氨基酸序列：QANTPWSSPNLADAFINSF(M/L)SA(A/I)SSSGAFSADQLDDMSTIG(D/N/Q)TLMSAMD(N/S/K)MGRSG(K/R)STKSKLQALNMAFASSMAEIAAAESGG(G/Q)SVGVKTNAISDALSSAFYQTTGSVNPQFV(N/S)EIRSLI(G/N)M(F/L)(A/S)QASANEV(SEQ ID NO 8)。

NT片段的序列与基于图1的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ IDNO 8具有至少50%的同一性，优选地至少60%的同一性。在优选的实施方式中，NT片段的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO 8具有至少65%的同一性，优选地至少70%的同一性。此外，在优选的实施方式中，NT片段与共有氨基酸序列SEQ ID NO 8具有70％，优选80%的相似性。

用于本文公开的细胞支架材料中的蛋白质中的代表性NT片段是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO 6。根据某个实施方式，NT片段与SEQ ID NO 6或图1中的任何单独的氨基酸序列具有至少80%的同一性。例如，NT片段与SEQ ID NO 6或图1中任何单独的氨基酸序列具有至少90%，例如至少95%的同一性。NT片段与SEQ ID NO 6或图1中任何单独的氨基酸序列，特别是与Ea MaSp1相同。

NT片段包含100至160个氨基酸残基。优选NT片段包含至少100，或多于110，优选地多于120个氨基酸残基。还优选NT片段包含至多160，或少于140个氨基酸残基。典型的NT片段包含约130-140个氨基酸残基。

REP片段具有在富含丙氨酸的区段和富含甘氨酸的区段之间交替的重复性特征。如以下将更详细地解释的，REP片段通常包含多于70，例如多于140且少于300，优选地少于240，例如少于200个氨基酸残基，且自身可分成几个L(接头)区段、A(富含丙氨酸)区段和G(富含甘氨酸)区段。通常，所述接头区段是任选的，位于REP片段末端，而剩余的区段依次是富含丙氨酸和富含甘氨酸的。因此，REP片段通常可具有以下结 构中的任何一种，其中n是整数：

L(AG)_nL，例如LA₁G₁A₂G₂A₃G₃A₄G₄A₅G₅L；

L(AG)_nAL，例如LA₁G₁A₂G₂A₃G₃A₄G₄A₅G₅A₆L；

L(GA)_nL，例如LG₁A₁G₂A₂G₃A₃G₄A₄G₅A₅L；或

L(GA)_nGL，例如LG₁A₁G₂A₂G₃A₃G₄A₄G₅A₅G₆L。

其遵循：富含丙氨酸或富含甘氨酸的区段是否与N端或C端接头区段相邻不是关键的。优选n是2至10，优选地2至8，还优选地4至8，更优选地4至6，即n=4、n=5或n=6的整数。

在某些实施方式中，REP片段的丙氨酸含量高于20%，优选地高于25%，更优选地高于30%且低于50%，优选地低于40%，更优选地低于35%。应设想更高的丙氨酸含量提供更硬和/或更强和/或不太可延伸的纤维。

在某些实施方式中，REP片段不含脯氨酸残基，即REP片段中不存在Pro残基。

现在转向构成REP片段的区段，应强调的是每个区段是单独的，即，特定REP片段的任何两个A区段、任何两个G区段或任何两个L区段可以是相同的或可以是不相同的。因此，每种类型的区段在特定REP片段内是相同的不是拖丝蛋白的一般特征。而且，以下公开内容为技术人员提供了如何设计单独的区段并将其聚集成REP片段的指南，该REP片段是用于细胞支架材料的功能性蜘蛛丝蛋白的一部分。

每个单独的A区段是具有8至18个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的A区段包含13至15个氨基酸残基。大多数或多于两个的A区段包含13至15个氨基酸残基，且少数例如一或两个A区段包含8至18个氨基酸残基例如8-12或16-18个氨基酸残基也是可能的。这些氨基酸残基中的绝大多数是丙氨酸残基。更特别地，这些氨基酸残基中的0至3个不是丙氨酸残基，且剩余的氨基酸残基是丙氨酸残基。因此，每个单独的A区段中的所有氨基酸残基毫无例外地或除了一、二或三个氨基酸残基可以是任何氨基酸以外，都是丙氨酸残基。优选取代丙氨酸的氨基 酸是天然氨基酸，优选地单独选自丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的组，更优选地是丝氨酸。当然，A区段中的一个或多个是全丙氨酸区段，而剩余的A区段包含1-3个非丙氨酸的残基，例如丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或甘氨酸是可能的。

在某个实施方式中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括10-15个丙氨酸残基和0-3个上述非丙氨酸的残基。在更优选的实施方式中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括12-15个丙氨酸残基和0-1个上述非丙氨酸的残基。

优选每个单独的A区段与选自SEQ ID NO:10的氨基酸残基7-19、43-56、71-83、107-120、135-147、171-183、198-211、235-248、266-279、294-306、330-342、357-370、394-406、421-434、458-470、489-502、517-529、553-566、581-594、618-630、648-661、676-688、712-725、740-752、776-789、804-816、840-853、868-880、904-917、932-945、969-981、999-1013、1028-1042和1060-1073的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白质的天然存在的序列的区段，该天然存在的序列经过克隆相应的cDNA而推断得来，参见WO 2007/078239。可选择地，每个单独的A区段与选自SEQ ID NO:3的氨基酸残基143-152、174-186、204-218、233-247和265-278的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，这些蛋白具有在合适的条件下形成丝纤维的能力。因此，在拖丝蛋白的某些实施方式中，每个单独的A区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。不期望被任何具体的理论束缚，设想根据本发明的A区段形成螺旋结构或β折叠。

此外，已从实验数据推断出每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的G区段由14至23个氨基酸残基组成。每个G区段的至少40%的氨基酸残基是甘氨酸残基。通常，每个单独的G区段的甘氨酸含量在40-60%的范围内。

优选每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:10的氨基酸残基20-42、 57-70、84-106、121-134、148-170、184-197、212-234、249-265、280-293、307-329、343-356、371-393、407-420、435-457、471-488、503-516、530-552、567-580、595-617、631-647、662-675、689-711、726-739、753-775、790-803、817-839、854-867、881-903、918-931、946-968、982-998、1014-1027、1043-1059和1074-1092的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白质的天然存在的序列的区段，该天然存在的序列从克隆相应的cDNA推断得来，参见WO 2007/078239。可选择地，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:3的氨基酸残基153-173、187-203、219-232、248-264和279-296的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，所述蛋白具有在合适的条件下形成丝纤维的能力。因此，在细胞支架材料中的拖丝蛋白的某些实施方式中，每个单独的G区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。

在某些实施方式中，每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。

存在G区段的三种亚型。该分类基于对Euprosthenops australis MaSp1蛋白质序列的仔细分析(参见WO 2007/078239)，并已在构建新型、非天然蜘蛛丝蛋白中使用并验证了该信息。

G区段的第一种亚型由单字母氨基酸共有序列GQG(G/S)QGG(Q/Y)GG(L/Q)GQGGYGQGAGSS(SEQ ID NO:11)代表。该第一种且通常不是最长的G区段亚型通常包含23个氨基酸残基，但是可包含少至17个氨基酸残基，且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。因此，优选该第一种G区段亚型包含17-23个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或多至30个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成卷曲结构或3₁-螺旋结构。该第一种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基20-42、84-106、148-170、212-234、307-329、371-393、435-457、530-552、595-617、689-711、753-775、817-839、881-903、946-968、1043-1059和1074-1092。在某些实施方式中，根据本发明的该第一种亚型的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。

G区段的第二种亚型由单字母氨基酸共有序列：GQGGQGQG(G/R)YGQG(A/S)G(S/G)S(SEQ ID NO:12)代表。该第二种通常中间尺寸的G区段亚型通常包含17个氨基酸残基且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。优选该第二种G区段亚型包含14-20个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或多至30个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成卷曲结构。该第二种亚型的代表性G区段是SEQ IDNO:10的氨基酸残基249-265、471-488、631-647和982-998；及SEQ IDNO:3的氨基酸残基187-203。

G区段的第三种亚型由单字母氨基酸共有序列：G(R/Q)GQG(G/R)YGQG(A/S/V)GGN(SEQ ID NO:13)代表。该第三种G区段亚型通常包含14个氨基酸残基，且通常是G区段亚型中最短的。优选该第三种G区段亚型包含12-17个氨基酸残基，但设想其可包含多至23个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成转角结构。该第三种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基57-70、121-134、184-197、280-293、343-356、407-420、503-516、567-580、662-675、726-739、790-803、854-867、918-931、1014-1027；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基219-232。

因此，在细胞支架材料中的拖丝蛋白的实施方式中，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80%，优选地90%，更优选95%的同一性。

在REP片段的A和G区段的交替序列的某个实施方式中，每隔一个G区段具有第一种亚型，而剩余的G区段具有第三种亚型，例如...A₁G_短A₂G_长A₃G_短A₄G_长A₅G_短...。在REP片段的另一个实施方式中，第二种亚型的一个G区段通过插入而中断G区段的规律性，例如...A₁G_短A₂G_长A₃G _中A₄G_短A₅G_长...。

每个单独的L区段代表可包含0至20个氨基酸残基，例如0至10个氨基酸残基的任选的接头氨基酸序列。虽然该区段是任选的且对于蜘蛛丝蛋白的功能不是关键的，但是其存在仍允许完全功能性的形成纤维（fiber）、膜（film）、泡沫（foam）和其他结构的蜘蛛丝蛋白及其聚合物。 在从Euprosthenops australis的MaSp1蛋白质推断的氨基酸序列的重复部分(SEQ ID NO:10)中也存在接头氨基酸序列。特别地，接头区段的氨基酸序列可能与所描述的A或G区段的任何一种相似，但是通常不足以满足本文对其定义的标准。

如WO 2007/078239中表明的，设置在REP片段的C端部分的接头区段可由富含丙氨酸的单字母氨基酸共有序列ASASAAASAASTVANSVS和ASAASAAA代表。实际上，第二序列可被认为是根据本文的定义的A区段，而第一序列与根据该定义的A区段具有高度的相似性。接头区段的另一实例具有富含甘氨酸的单字母氨基酸序列GSAMGQGS并与根据本文的定义的G区段具有高度的相似性。接头区段的另一实例是SASAG。

代表性L区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基1-6和1093-1110；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基138-142，但是技术人员将易于认识到存在这些区段的许多合适的替代氨基酸序列。在REP片段的一个实施方式中，L区段中的一个包含0个氨基酸，即缺少L区段中的一个。在REP片段的另一个实施方式中，两个L区段都包含0个氨基酸，即不含这两个L区段。因此，根据本发明的REP片段的这些实施方式可示意性地表示如下：(AG)_nL、(AG)_nAL、(GA)_nL、(GA)_nGL；L(AG)_n、L(AG)_nA、L(GA)_n、L(GA)_nG；和(AG)_n、(AG)_nA、(GA)_n、(GA)_nG。这些REP片段中的任何一种适合用于以下定义的任何CT片段。

细胞支架材料中拖丝蛋白的CT片段与蜘蛛丝蛋白的C端氨基酸序列具有高度的相似性。如WO 2007/078239中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSp1和MaSp2之间相当保守。以SEQ ID NO:9提供了MaSp1和MaSp2的C端区域的共有序列。在图2中，比对了以GenBank登记条目(如果可用)表示的下列MaSp蛋白质：

表2-拖丝蛋白CT片段

哪种特定的CT片段存在于细胞支架材料中的蜘蛛丝蛋白中不是关键的。因此，CT片段可选自图2和表2中示出的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种。各种各样的C端序列可用于蜘蛛丝蛋白中。

CT片段的序列与基于图2的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ IDNO:9具有至少50%的同一性，优选地至少60%，更优选地至少65%的同一性，或甚至至少70%的同一性。

代表性的CT片段是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:7。因此，在一个实施方式中，CT片段与SEQ ID NO:7或图2和表2中的任何单独的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，例如至少95%的同一性。例如，CT片段可与SEQ ID NO:7或图2和表2中的任何单独的氨基酸序列相同。

CT片段通常由70至120个氨基酸残基组成。优选CT片段包含至少70，或多于80，优选地多于90个氨基酸残基。还优选CT片段包含至多120，或少于110个氨基酸残基。典型的CT片段包含约100个氨基酸残基。

如下计算如本文所用的术语“%同一性”。使用CLUSTAL W算法(Thompson等人,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))比对查询序列与靶序列。在对应所比对的序列中的最短序列的窗口上进行对比。对比每个位置的氨基酸残基，并将在靶序列中具有相同对应的查询序列中的位置的百分比报告为%同一性。

按以上对“%同一性”所描述的计算如本文所用的术语“%相似性”，但以下除外：疏水残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys是相似的；碱性残基Lys、Arg和His是相似的；酸性残基Glu和Asp是相似的；且亲水性的、不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr是相似的。在该上下文中剩余的天然氨基酸Gly不与任何其他氨基酸相似。

遍布本说明书，根据本发明的替代实施方式满足相应百分比的相似 性，而不是指定百分比的同一性。其他替代实施方式满足指定百分比的同一性以及另一个较高百分比的相似性，选自对于每个序列的优选百分比的同一性的组。例如，某序列可能与另一序列70%相似；或其可能与另一序列70%相同；或其可能与另一序列70%相同且90%相似。

在本文公开的方法或组合物的某些更特定的实施方式中，细胞支架材料的蜘蛛丝蛋白包含选自由以下组成的组的拖丝蛋白：4RepCT、RGD-4RepCT、RGE-4RepCT、IKVAV-4RepCT、YIGSR-4RepCT、NT4RepCTHis、5RepCT、8RepCT、4RepCTMa2、NT8RepCT和NTNT8RepCT(参见以下所附序列的列表)。在甚至更具体的实施方式中，拖丝蛋白是4RepCT(SEQ ID NO:2)。

所附序列的列表

SEQ ID NO:

1     4Rep

2     4RepCT

3     NT4Rep

4     NT5Rep

5     NT4RepCTHis

6     NT

7     CT

8     共有NT序列

9     共有CT序列

10    来自Euprosthenops australis MaSp1的重复序列

11    共有G区段序列1

12    共有G区段序列2

13    共有G区段序列3

14    5RepCT

15    8RepCT

16    4RepCTMa2

17    NT8RepCT

18    NTNT8RepCT

19    RGD-4RepCT

20    RGE-4RepCT

21    IKVA-4RepCT

22    YIGSR-4RepCT

在本文公开的方法或组合物的一个实施方式中，所述蜘蛛丝蛋白包含 细胞结合基序。结合某些情况中某些细胞的培养，已发现细胞结合基序的存在提高或维持细胞存活，且认为将该基序作为蜘蛛丝蛋白的一部分纳入到细胞支架材料中提供另外的益处。

在某些实施方式中，细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。例如，其可被偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端或C端，或蜘蛛丝蛋白的剩余部分的氨基酸序列内的任何位置。关于寡肽细胞结合基序的选择，技术人员知晓几种替代方案。例如，所述多肽可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、RGE、IKVAV(SEQ IDNO:23)、YIGSR(SEQ ID NO:24)、EPDIM(SEQ ID NO:25)和NKDIL(SEQID NO:26)。RGD、IKVAV和YIGSR是常用的细胞结合基序，而EPDIM和NKDIL称为角质形成细胞特异性基序，其在培养角质形成细胞的背景中可能是特别有用的。可由技术人员使用标准的基因工程或化学偶联技术容易地实现寡肽细胞结合基序与蜘蛛丝蛋白的剩余部分的偶联。因此，在某些实施方式中，细胞结合基序通过基因工程引入，即，在编码“野生型”蜘蛛丝蛋白和细胞结合基序的核酸之间形成部分基因融合。作为这些实施方式的一个额外的有益特征，细胞结合基序将与组成细胞支架材料的聚合物中的蜘蛛丝蛋白单体以1:1的比例存在。

用于本文描述的方法或组合物中的细胞支架材料中的聚合物可采取多种物理形态，且特定物理形态的使用可在不同的具体情况中提供另外的优点。例如，在这些方法或组合物的某个实施方式中，所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网（fiber-mesh）组成的组的物理形态。

在本发明的上下文中，术语细胞的“培养”、“细胞培养”等应被广义地理解，使得它们包括例如细胞分裂和/或增殖的情况，细胞被保持在保留了该细胞类型当存在于其天然环境时所显示出的至少一种功能特征的分化状态的情况以及干细胞被保持在未分化状态的情况。

此外，如从上述公开内容中明显的，应设想细胞可以以单一细胞形式提供，或作为细胞结构或“微器官”的一部分提供。细胞结构或“微器官”的形式的细胞的培养可能需要维持与细胞支架材料结合的整个结构。

逐项记录的实施方式列表

1．用于培养真核细胞的方法，包括

-提供待培养的真核细胞的样品；

-将所述样品应用到细胞支架材料；以及

-在适合细胞培养的条件下保持具有已其应用细胞的所述细胞支架材料；

其特征在于： 

所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物：

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地

衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。

2．用于制备真核细胞的方法，包括：

-提供真核细胞样品；

-将所述样品应用到细胞支架材料；

-在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料；以及

-由所述细胞支架材料中制备细胞样品；

其特征在于： 

所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物：

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地

衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片 段。

3．根据第1或第2项的方法，其中所述条件包括将已对其应用细胞的该细胞支架材料保持在无血清培养基中。

4．根据任一前述项的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

5．根据第4项的方法，其中所述哺乳动物细胞来源于器官的主要组织。

6．根据第4或第5项的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由干细胞和包括β-细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组。

7．根据第6项的方法，其中所述细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、羊膜干细胞和祖细胞，特别地选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的干细胞。

8．根据第7项的方法，其中所述细胞是胚胎干细胞。

9．根据第7项的方法，其中所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。

10．根据第7项的方法，所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组的成体干细胞。

11．根据第6项的方法，其中所述细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞，例如β-细胞。

12．根据任一前述项的方法，其中所述真核细胞以单一细胞提供。

13．根据第10项的方法，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个神经球提供的神经干细胞。

14．根据第11项的方法，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。

15．根据第1-5项中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是例如选自由肝细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞组成的组的体细胞。

16．根据任一前述项的方法，其中所述细胞是人细胞。

17.根据任一前述项的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中

NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段；

REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L(AG)_nL、L(AG)_nAL、L(GA)_nL和L(GA)_nGL组成的组，其中

n是2至10的整数；

每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala；

每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly；且

每个单独的L区段是0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；且

CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。

18．根据第17项的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由4RepCT、NT4RepCTHis、5RepCT、8RepCT、4RepCTMa2、NT8RepCT和NTNT8RepCT组成的组。

19．根据任一前述项的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白包含细胞结合基序。

20．根据第19项的方法，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。

21．根据第20项的方法，其中所述寡肽被偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。

22．根据第20-21项中任一项的方法，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、RGE、IKVAV、YIGSR、EPDIM和NKDIL。

23．根据任一前述项的方法，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、 泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。

24．下列的组合物：

-真核细胞；和 

-细胞支架材料；

其特征在于： 

所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物：

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地

衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。

25．根据第24项的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

26．根据第25项的组合物，其中所述哺乳动物细胞来源于器官的主要组织。

27．根据第25或第26项的组合物，其中所述哺乳动物细胞选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组。

28．根据第27项的组合物，其中所述细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、羊膜干细胞和祖细胞，特别地选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的干细胞。

29．根据第28项的组合物，其中所述细胞是胚胎干细胞。

30．根据第28项的组合物，其中所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。

31．根据第28项的组合物，其中所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞 组成的组的成体干细胞。

32．根据第27项的组合物，其中所述细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞，例如β细胞。

33．根据任一前述项的组合物，其中所述真核细胞以单一细胞提供。

34．根据第31项的组合物，其中所述哺乳动物细胞以至少一个神经球提供的神经干细胞。

35．根据第30项的组合物，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。

36．根据第24-26项中任一项的组合物，其中所述哺乳动物细胞是例如选自由肝细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞组成的组的体细胞。

37．根据第24-36项任一项的组合物，其中所述细胞是人细胞。

38．根据第24-37项中任一项的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中

NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段；

REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L(AG)_nL、L(AG)_nAL、L(GA)_nL和L(GA)_nGL组成的组，其中

n是2至10的整数；

每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala；

每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly；且

每个单独的L区段是0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；且

CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。

39．根据第38项的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由4RepCT、NT4RepCTHis、5RepCT、8RepCT、4RepCTMa2、NT8RepCT和NTNT8RepCT组成的组。

40．根据第24-39项中任一项的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白包含细胞结合基序。

41．根据第40项的组合物，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。

42．根据第41项的组合物，其中所述寡肽被偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。

43．根据第41-42项中任一项的组合物，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、RGE、IKVAV、YIGSR、EPDIM和NKDIL。

44．根据第24-43项中任一项的组合物，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。

45．根据任一前述项的方法或组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由4RepCT、NT4RepCTHis、RGD-4RepCT、RGE-4RepCT、IKVAV-4RepCT和YIGSR-4RepCT组成的组。

附图简述

图1示出了拖丝蛋白N端结构域的序列比对。

图2示出了拖丝蛋白C端结构域的序列比对。

图3是示出了在4RepCT纤维上培养的鼠间充质干细胞的一系列照片。

图4是示出了在4RepCT纤维上培养的人间充质干细胞的一系列照片。

图5是示出了在4RepCT支架上培养的人间充质干细胞的分化的一系列照片。

图6是示出了关于在4RepCT支架上培养的人间充质干细胞的成脂分化的实验结果的一系列照片。

图7A-B是示出了关于在4RepCT支架上培养的人间充质干细胞的成骨分化的实验结果的系列照片。

图8是在实施例2中描述的实验之前在A)4x和B)10x放大率下的RCM-1hESC细胞的一对照片。

图9是示出了在A)CELLstart^TM CTS^TM和B)RGD-4RepCT上培养48小时后的RCM-1 hESC培养物的在10x放大率下的一对照片。

图10是示出了在A)CELLstart^TM CTS^TM和B)RGD-4RepCT上培养144小时后的RCM-1 hESC培养物的在10x放大率下的一对照片。

图11是示出了对A)CELLstart^TM CTS^TM和B)RGD-4RepCT上的RCM-1 hESC培养物进行碱性磷酸酶染色的结果的在10x放大率下的一对照片，如实施例2中所述。

图12是示出了A)在RGD-4RepCT上培养240小时之后的RCM-1hESC，和B)在RGD-4RepCT上培养240小时之后的RCM-1hESC的碱性磷酸酶染色的在10x放大率下的一对照片。

图13是示出了在所示4RepCT(WT)泡沫和纤维网、RGD-4RepCT(RGD)泡沫和纤维网上，在MEF(对照)或明胶上培养三代的R1mESC一系列成对照片。

图14示出了在如所示4RepCT膜和对照(PORN)上培养的保持未分化（上箭头）和进行神经元分化(下箭头)的NSC。用巢蛋白（上箭头）和TuJ1(下箭头)对细胞染色。

图15示出了在如所示4RepCT膜和对照(PORN)上培养的保持未分化和进行少突胶质细胞（上箭头）和星形胶质细胞(下箭头)分化的NSC。用MBP（上箭头）和GFAP(下箭头)对细胞染色。另外，示出了在4RepCT泡沫上保持未分化的NSC和进行星形胶质细胞分化的NSC的外观。

图16示出了来自生长在4RepCT膜上的NSC(在接种后48h)的EdU- 测定的结果，如实施例4中所述。

图17示出了生长在左侧的4RepCT膜（在接种后72h）和右侧的PORN(接种后48h时)上的NSC的存活/死亡染色。每一列的图片表示相同的区域，分别示出了活细胞和死细胞。

图18是示出了分别粘附到4RepCT纤维、泡沫和膜的培养5-7天后的人(A)和小鼠(B)的朗格汉斯小岛的一系列照片。

图19是表明了与相应的纤维和泡沫及对照相比，小鼠胰岛在所有时间点都表现出明显更高的对4RepCT泡沫结构的粘附的示意图(n＝16，***P=0.001)。

图20是示出了培养1-5天后粘附到不含(WT)和含有如所示不同肽基序的4RepCT的泡沫上的人胰岛的数量的示意图(n＝3±SEM；对于RGE，n＝2±标准差)。

图21是示出了胰岛对不同支架的粘附的一对示意图；A：培养1-5天后小鼠胰岛对不含(WT)和含有所示不同肽基序的4RepCT泡沫的粘附(n=4，±SEM，*=p<0.05，**=＝p<0.01，***=＝p<0.001)；B：与RGD-4RepCT和对照相比，培养2天后小鼠胰岛对NT4RepCT泡沫的粘附(n＝1，实验一式三份地进行，±SEM)

图22是示出了在具有不含(WT)和含有所示不同肽基序的4RepCT的孔中培养5天的胰岛经葡萄糖刺激后的胰岛素释放的一系列示意图；A：来自用不含(WT)和含有所示不同肽基序的4RepCT培养5天的所有小鼠胰岛的胰岛素释放；B：用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的小鼠胰岛的刺激指数；C：来自用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的粘附的小鼠胰岛的胰岛素释放（n=2，实验一式两份地进行）；D：来自用NT4RepCT支架(NT)培养2天的粘附的小鼠胰岛的胰岛素释放；E：来自用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的所有人胰岛的胰岛素释放；F：来自用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的粘附的人胰岛的胰岛素释放（n＝1，实验一式三份地进行）。

图23是示出了在高浓度葡萄糖和KCl刺激RGD-4RepCT上培养1天的一个胰岛后的[Ca²⁺]_i反应的示意图。

图24是一对照片，其中人胰岛存活的形态分析展示了对照组(A)中与RGD-4RepCT泡沫(B)上更完好地粘附的胰岛相比更为分散的胰岛。

图25是使得能够对在RGD-4RepCT上长期培养(30天)后的人胰岛进行形态分析的照片。可以看到星号上方的胰岛。

图26是示出了用不含(WT)和含有所示不同肽基序的4RepCT长期培养人胰岛后每个胰岛的胰岛素释放的一对示意图。第5天(A)和4周后(B)的胰岛素释放(pmol/l)。低浓度葡萄糖(3mM)刺激提供胰岛素释放的基础水平(白色)，而高浓度葡萄糖(16.7mM)提供受刺激的胰岛素释放(黑色)(n＝1；实验一式三份地进行)。

图27是处于所指示的放大率下的一对照片，示出了在RGD-4RepCT泡沫(浅灰色)上长期培养(78天)后人胰岛和胰岛样簇中产生胰岛素的细胞的阳性染色(由箭头指出的白色部分)。

图28是示出了在对照组织培养板(A)和RGD-4RepCT(B)上培养单个胰岛细胞（小鼠）后的簇形成的一系列照片。C：与支架紧密接触的4RepCT(左)、RGD-4RepCT(中)和IKVAV-4RepCT(右)的泡沫中的胰岛素阳性簇(明亮部分；通过箭头指出)的放大图(63x)。

图29是处于所指示的放大率下的一对照片，示出了间充质干细胞(MSC)在所示泡沫支架4RepCT(WT)和RGD-4RepCT(RGD)上的粘附和生长。MSC(灰色)可容易地粘附到该泡沫结构(通过箭头例示的浅灰色部分)并随时间推移继续在其上增殖(第7天，n=2)。

图30是示出了通过细胞示踪染料观察到的胰岛β细胞(islet beta cells)、内皮细胞(endothelial cells)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells)(“BEM”)的共培养（β细胞：亮白色；内皮细胞：浅灰色；间充质细胞：灰色）的一对照片。共培养的BEM在4RepCT泡沫上形成簇。发现BEM簇粘附到4RepCT泡沫(左)和RGD-4RepCT泡沫(右，n=2，实验一式两份地进行)上。

图31A-E是示出了培养在膜或泡沫形态的具有不同的细胞结合基序的不同4RepCT支架和对照平板(细胞培养玻璃)上的内皮细胞的照片；A：膜，左图4RepCT(野生型)，右图RGD-4RepCT；B：膜，左图IKVAV-4RepCT，右图YIGSR-4RepCT；C：泡沫，左图4RepCT(野生型)，右图RGD-4RepCT；D：泡沫，左图IKVAV-4RepCT，右图YIGSR-4RepCT；E：对照。

图32是示出了在涂覆了具有所示不同细胞结合基序的4RepCT支架的96孔培养板内分析的总区域的内皮细胞密度比的示意图。

图33是由4RepCT制备的细胞支架材料的一系列照片。上图示出了在约25x放大率下的96孔板中的孔。下图示出了在200x放大率下的倒置光学显微镜下观察到的支架。

图34和35示出了通过阿尔玛蓝存活测定测量的成纤维细胞在如所示4RepCT支架和对照上的生长的示意图。误差棒表明一式六份的标准差。

图36是以15000细胞/cm²的接种密度在如所示4RepCT支架和对照上培养4天并经用于检测活细胞和死细胞的存活/死亡染色的HDFn的一系列照片。

图37示出了在无血清条件下在4RepCT膜上的SF-HDF生长的示意图。接种密度(细胞/cm²)为如所示。第6天后，细胞数量继续增加，从而超出最高标准并妨碍用于绘制曲线的数据的重新计算。活细胞的数量通过阿尔玛蓝测量。误差棒表明一式六份的标准差。

图38示出了通过用AlexaFlour488-鬼笔环肽将丝状肌动蛋白染成绿色(在照片中呈现为灰色线)观察到的附着到4RepCT纤维(左图)和膜(右图)的HDFn的照片。核被EthD-1染成红色（呈现为亮白色）

图39A-D示出了生长在如所示不同的4RepCT支架上的细胞的I型胶原的产生。A是示出了最初的5天培养期间分泌到细胞培养基中的C肽的浓度（未积累）的示意图。B是示出了同一培养时间段内所分泌的C肽的量/生长在不同支架上的细胞的量的示意图。C肽浓度通过EIA测定。误差棒表明一式两份的标准差。C和D是示出了经免疫荧光染色的存在 于生长在膜(C)和纤维网(D)上的细胞中的细胞内I型胶原（呈现为白色的点）的照片。核呈现为浅灰色。

图40示出了在如所示不同4RepCT支架上培养14天的成纤维细胞的胶原产生和分泌并然后将其重新接种到组织培养处理(TCT)平板或腔式载玻片上以分别分析I型前胶原C肽(上图)和细胞内I型胶原的产生(下图)。

图41A-C是示出了生长在含有或不含如所示整联蛋白结合基序RGD的4RepCT的纤维网(A)和膜(B-C)支架上的存活HDFn的数量的示意图。通过阿尔玛蓝测定。误差棒表明一式六份的标准差。

图42是示出了第3天时生长在野生型4RepCT(wt，空心柱)或RGD-4RepCT(实心柱)膜上的SF-HDF的数量的示意图。接种密度以细胞/cm²提供。活细胞的数量通过阿尔玛蓝测量。误差棒表明一式六份的标准差。

图43是示出了生长在具有如所示各种细胞结合基序的4RepCT膜上的成纤维细胞的一系列照片。仅3h后成纤维细胞就在所有的膜变体上显示出黏着斑，指示整联蛋白介导的对该材料的粘附。黏着斑呈现为明亮的长形点。在无任何血清加入下培养细胞。WT：4RepCT；NRC：NT4RepCTHis。

图44是示出了人原代角质形成细胞在含有或不含所示不同细胞结合基序的4RepCT膜上和在NT4RepCTHis(NRC)上的生长的示意图。所使用的对照是未处理的细胞塑料(HP)和Pluronic-涂覆的细胞塑料(以防止粘附)。在接种后的第1天和第4天通过阿尔玛蓝检测活细胞。

图45是示出了在具有所示各种细胞结合基序的4RepCT膜上培养3天后的第4代人原代角质形成细胞的一系列照片。WT：4RepCT；NRC：NT4RepCTHis；CTRL：细胞培养玻璃。

图46是示出了在所示材料上接种后第4天的角质形成细胞的一系列照片。对细胞进行黏着斑蛋白染色以观察黏着斑，黏着斑被示为靠近细胞膜的明亮长形点并通过白色箭头指示。WT：4RepCT，RGD：RGD-4RepCT， IKVAV：IKVAV-4RepCT，CTRL：细胞培养玻璃。

图47是示出了肝细胞对4RepCT膜和纤维（分别是图A和B）的粘附的一组照片。在C和D中可看到肝细胞和纤维之间的密切的相互作用（n＝1，实验一式六份地进行）。

图48是示出了在RGD-4RepCT膜(RGD)上生长16天的hESC(左)和在对照涂层(Cellstart)上生长192小时的hESC(右)的外观的一对照片。这些细胞处于实施例12中所描述的实验的第一次传代。

图49是示出了在实施例12中描述的实验的第二次传代时接种后24小时的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左：Cellstart涂层(对照)；右：RGD-4RepCT膜(RGD)。

图50是示出了在实施例12中描述的实验的第三次传代时接种后24小时的AP染色的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左：Cellstart涂层(对照)；右：YIGSR-4RepCT膜(Y)。阳性AP染色以棕色呈现（图中为深灰色）。

图51是示出了在实施例12中描述的实验的第三次传代时接种后24小时的AP染色的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左：生长在RGD-4repCT膜(RGD)上的细胞；右：生长在RGE-4RepCT膜(RGE)上的细胞。阳性AP染色以棕色呈现（图中为深灰色）。

图52是示出了在实施例12中描述的实验的第三次传代时接种后24小时的AP染色的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左：生长在IKVAV-4repCT膜(IKVAV)上的细胞；右：生长在NT4RepCTHis膜(NRC)上的细胞。阳性AP染色以棕色呈现（图中为深灰色）。

实施例

实施例1

重组蜘蛛丝上的造血干细胞和间充质干细胞

在包含上述4RepCT的重组蜘蛛丝基质上培养已知对来自其直接微 环境的不利影响极为敏感的造血干细胞(HSC)和已被表明在各种可生物降解的天然和合成支架上粘附并生长的间充质干细胞(MSC)。当与培养在Falcon 1008塑料和retronectin涂覆的平板上的HSC比较时，HSC可在4RepCT泡沫上培养并保持其分化能力以及其表型。当生长在4RepCT纤维上时，MSC表现出与对照相比相似的细胞计数和分化且当生长在4RepCT膜和泡沫上时保持其分化成中胚层谱系的细胞，例如骨、软骨和脂肪细胞的能力。

材料和方法

重组蜘蛛丝蛋白的表达

如前所述地制备重组蜘蛛丝蛋白4RepCT(SEQ ID NO:2)(Hedhammar等人(2008)，同上)。简单地说，使具有用于4RepCT表达的载体的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞(Merck Biosciences)在30℃下的含有卡那霉素的LB培养基中生长至OD₆₀₀为0.8-1并然后用异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导并进一步在室温孵育多达3h。此后，收集细胞并重悬在补充有溶菌酶和DNA酶I的20mM Tris-HCl(pH 8.0)中。完全裂解后，将来自15,000g下离心的上清液上样到装载有Ni琼脂糖的柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上。在用300mM咪唑洗脱结合的蛋白质之前充分洗涤柱。汇集包含靶蛋白的级分并针对20mM Tris-HCl(pH 8.0)透析。通过使用1:1000(w/w)的凝血酶:融合蛋白比在室温下蛋白酶裂解1-2h而从标签上释放4RepCT。为去除释放的HisTrxHis标签，将裂解混合物上样到第二个Ni琼脂糖柱上并收集流出液。从280nm下的吸光度确定蛋白质含量。

支架制备

如Stark等人(2007)，同上所述，允许纯化的4RepCT蛋白质自我组装成纤维。然后在用于在无组织培养物处理的Falcon平皿(Falcon 1008)中培养之前将纤维切割成更小的片。通过用0.5-2.0ml的蛋白质溶液涂覆Falcon 1008平皿并空气干燥以允许在平皿底部形成薄层来制备膜。另外，用剧烈混合蛋白质溶液后获得的泡沫涂覆某些Falcon 1008平皿并允许空气干燥24小时以在平皿底部形成3D基质。通过暴露于由¹³⁷Cs源 (Gammacell，Atomic Energy of Canada，Ottawa，Canada)释放的280Gy的γ-辐射对具有纤维、膜或泡沫的平皿灭菌。

造血干细胞的分离和培养

处死健康的Balb/c小鼠并取出股骨。用经10mM HEPES缓冲液(HH；GIBCO)平衡的Hanks'平衡盐溶液从股骨中冲洗出骨髓(BM)细胞。BM细胞被直接使用或在根据厂家说明用谱系细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec)去除谱系之后使用并分别以3x10⁵和5x10⁴细胞/平皿在补充有鼠干细胞因子(mSCF，100ng/ml；Immunex,Seattle,WA)和mIL-3(30ng/ml；Genentech,San Francisco,CA)的无血清DMEM(Wognum等人(2000),Hum Gene Ther11:2129-2141)中培养4天。

表面抗原的测量

在4RepCT存在下培养之前和之后收集鼠的骨髓细胞用于表型分析。简单地说，用包含0.5%(vol/vol)牛血清白蛋白(BSA；Sigma，StLouis，MO)、0.05%(wt/vol)叠氮化钠和0.45%(wt/vol)葡萄糖(Merck，Darmstadt，Germany)(HBN)的Hanks’缓冲的HEPES溶液(HHBS)洗涤细胞两次，并重悬在包含2%(vol/vol)正常的、热失活的小鼠血清的50μl HBN中以防止单克隆抗体(MoAb)的非特异性结合并随后用针对以下表面标志：c-kit、sca-1、CD4、CD8、CD11b和B220产生的MoAb(BD Biosciences，San Jose，CA)孵育30分钟。在HBN中洗涤细胞两次并从基于碘化丙啶(PI，Sigma)染色的分析中排除死细胞。使用FACSCalibur流式细胞仪测量细胞样品并收集10,000条模式事件并使用Cellquest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)分析。

体外产克隆祖细胞测定

将5x10⁴鼠BM细胞或1x10³谱系去除的BM细胞(lin^-/-)平铺到Falcon1008(35mm直径)陪替式培养皿中的1ml包含0.8%(wt/vol)的溶于丰富型DMEM的甲基纤维素(Methocel A4M高级，Dow Chemical Co，Barendrecht，The Netherlands)、1%(wt/vol)BSA、0.3mg/ml人转铁蛋白、0.1μmol/l亚硒酸钠、1mg/l核苷(胞苷、腺苷、尿苷、鸟苷、2’-脱氧胞苷、 2’-脱氧腺苷、胸苷和2’-脱氧鸟苷；Sigma)、0.1mmol/lβ-巯基乙醇、15μmol/l亚油酸、15μmol/l胆固醇、10μg/ml胰岛素、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清半固体甲基纤维素培养基中。通过添加10ng/ml的mIL-3、100ng/ml的mSCF和20ng/ml的GM-CSF刺激粒细胞/巨噬细胞集落形成(CFU-GM)并在培养的第8-10天打分。通过100ng/ml的mSCF和4U/ml的人红细胞生成素(hEPO；Behringwerke，Marburg，Germany)诱导爆发集落形成红细胞(BFU-E)生长并在8-10天后计数，而用单独的hEPO刺激集落形成单位红细胞(CFU-E)生长并在2天后计数。在补充有100ng/ml的mSCF、10ng/ml的mIL-3m和10ng/ml的mTPO(Genentech，SanFrancisco，CA)的0.275%琼脂培养物中刺激巨核细胞祖细胞(CFU-Meg)。10天后干燥集落并对乙酰胆碱酯酶阳性细胞染色并计算。

间充质干细胞的分离和培养

从Lonza(Verviers，Belgium)购买人间充质干细胞(hMSC)。将细胞培养在由54%的DMEM-LG、36%的MCDB-201、10%FCS、1mM的L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素组成的完全培养基-1(CM-1)(Reyes等人(2001),Blood 98:2615-2625)中。当汇合达到80-90%时用胰酶消化细胞并亚培养，并每3-4天更新培养基。

通过用HH冲洗Balb/c小鼠的股骨获得鼠间充质干细胞(mMSC)。在补充有10%的FCS、1mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM-LG(CM-2)的存在下培养全部的BM细胞。亚培养贴壁的细胞并每周传代一次。每3-4天更换培养基。

分化测定

对于成脂分化，在由DMEM-LG、10%FCS、1μM地塞米松、60μM吲哚美辛、500μM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和5μg/ml胰岛素(Sigma，St.Louis，USA)组成的成脂培养基的存在下培养MSC 21天并用油红O(Sigma，StLouis，USA)染色。对于成骨分化，将MSC保持在由DMEM-LG、10% FCS、100nM地塞米松、10mM β-甘油磷酸酯和0.2mM抗坏血酸(Sigma，St.Louis，USA)组成的成骨培养基中21天。用茜素红S(Sigma，St.Louis，USA)对细胞染色以确认磷酸钙沉积物的存在。对于 软骨分化，将2.5x10⁵细胞离心到15ml聚丙烯管中并在由具有100nM的地塞米松的DMEM-HG(Gibco)、10ng/ml TGFβ3(Peprotech，USA)、50μg/ml抗坏血酸、50mg/ml ITS+Premix(Becton Dickinson，USA)组成的软骨培养基中培养自发形成的三维沉淀21天。制备沉淀切片用于组织学研究并用爱茜蓝染色以确认软骨谱系。

结果

4RepCT纤维存在下干细胞的扩增和分化

在一式两份地进行的三个单独的实验中，研究了4RepCT小片存在或不存在下的鼠骨髓细胞的扩增。表3中展示了结果，其表明在4RepCT存在下培养4天对鼠骨髓(BM)细胞在补充有100ng/ml的mSCF和30ng/ml的mIL-3的无血清培养基中扩增的影响。所计数的细胞是集落形成单位红细胞(CFU-E)；爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)；集落形成单位粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)；以及集落形成单位巨核细胞(CFU-Meg)。与对照孔相比，未发现在4RepCT纤维存在下培养四天后细胞数量和所形成的集落量之间的差异。

结果被表示为三个单独的实验的平均值±标准差。所有实验都一式两份地进行。

¹集落每1x10⁵BM细胞

²细胞x10⁵

S.I.：与第0天的值相比的刺激指数。

将鼠MSC保持在培养基中直到亚汇合并然后用胰酶消化。将1x10⁵mMSC培养在存在或不存在4RepCT纤维的1cm片的6-孔板中7天并然 后胰酶消化并计数。对照孔在7天后表现出5.7倍的扩增，而在4RepCT存在下培养的细胞扩增4.0倍。然而，只有保留在培养皿中的细胞被胰酶消化，而生长在纤维上的细胞未被包括在总的细胞计数中，从而导致对存在于每个孔中的细胞实际数量的低估。为防止由密集近汇合的培养物中的接触抑制引起的抑制信号的分泌，在7天、14天和21天后从培养皿中小心地去除纤维，用PBS冲洗一次并转移到只包含培养基的新鲜的孔中。因此这些培养皿中出现的细胞都来源于单一的源，即重组的蜘蛛丝线(图3)。

在与mMSC相似的条件下将人MSC保持在培养基中。每周一次地将纤维转移到新鲜的培养皿中（图4）。在培养的第21天，去除4RepCT纤维。胰酶消化覆盖培养孔的表面并来源于重组蜘蛛丝纤维的剩余的hMSC并测试其分化为成脂、成骨和软骨谱系的能力(图5)。所有实验都一式三份地进行。与来自同一代的在无4RepCT存在下培养的hMSC相比，从4RepCT纤维获得的细胞展现出与其相当的分化能力。

4RepCT-涂覆的组织培养板上的扩增和分化

对鼠的骨髓细胞进行谱系去除(lin^-/-)并培养在覆盖有4RepCT泡沫的培养皿中的包含mSCF和mIL-3的无血清培养基中。将培养4天后lin^-/-BM细胞的扩增和集落形成单位的数量与培养在无组织培养物处理的平皿(35mm，Falcon 1008)和涂覆有浓度为10μg/cm²的重组纤连蛋白片段CH-296(Retronectin:RN；Takara Shuzo，Otzu，Japan)的Falcon 1008平皿上的谱系阴性细胞的培养物进行比较。表4中示出了对于体外爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)、集落形成单位粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)和集落形成单位巨核细胞(CFU-Meg)的数量的结果。

示出了一式两份地进行的一个实验的结果。

¹集落每1x10⁵BM细胞

²细胞x10⁵

S.I.：与第0天的值相比的刺激指数。

另外，在区别地涂覆的平皿上培养之前和之后测量细胞表面标志的表达（表5）。

示出了一式两份地进行的一个实验的结果。数据被表示为绝对细胞数量x10⁵。

S.I.：与第0天的值相比的刺激指数。

将1x10⁵衰老的hMSC平铺到无组织培养物处理的平皿(35mm，Falcon1008)、组织培养物处理的平皿(35mm，Falcon 3001)、组织培养物处理的6孔板(Falcon)和涂覆有4RepCT膜或泡沫的平皿(35mm，Falcon 1008)上并培养至几乎汇合。然后将细胞保持在对照培养基、成脂分化培养基或成骨分化培养基中21天。图6和7中分别展现了对于成脂分化和成骨分化的结果。独立于平皿的涂层，在成脂培养基存在下培养的细胞表现出相似程度的成脂分化，具有在平皿表面上对等分的包含多个脂囊泡的圆形细胞。相比之下，当在任何一种对照条件下培养时，尽管规律性用成骨分化培养基更换培养基，衰老的hMSC不能再分化成成骨谱系(图7A)，但有趣的是在膜和纤维涂覆的平板中表现出一些片状的茜素红S染色(图7B， 分别为左上和右上)。该染色不可归因于4RepCT本身的染色，因为不含细胞的涂覆有4RepCT膜或泡沫的平板未表现出任何阳性茜素红S区域（图7B，分别是左下和右下）。

实施例2

重组蜘蛛丝上的人胚胎干细胞

该实验表明了在重组蜘蛛丝材料上培养人胚胎干细胞的可行性。

材料和方法

准备标准的六孔组织培养板。在这些平板中，三个孔包含RGD-4RepCT膜而剩余的三个孔是空的。基本按实施例1中所述制备具有细胞结合基序RGD的4RepCT膜。在室温下保持组织培养板干燥直到进一步使用。

在对实验的准备中，在II类微生物安全箱中UV辐射组织培养板30分钟。然后按照厂家说明用CELLstart^TM CTS^TM(Invitrogen；目录号A10142-01)涂覆每个平板中的三个空的孔。

按照厂家说明，将人胚胎干细胞(RCM-1，DeSousa等人，Stem Cell Res2:188-197；Roslin Cells,Edinburgh,UK)培养在具有血清和无饲养层培养基 hESC SFM-人胚胎干细胞培养基(Invitrogen；目录号A1000701)的CELLstart^TM上。按照厂家说明使用 EZPassage^TM-一次性干细胞传代工具(Invitrogen；目录号23181-010)以1:6的比例对来自90%汇合的孔中的细胞传代。

在细胞接种之前，用PBS洗涤孔，并将培养基放入所有的孔中并预孵育。以推荐密度将第64代的细胞接种到所有平板的所有孔内，加小心不要破坏接种后的细胞。按照厂家说明用 hESC SFM培养所有孔。在37℃下、空气中5%CO₂、95%的湿度下的标准培养孵箱中进行孵育。每天观察细胞并每48小时更换100%培养基。在更换养料之前将所有培养基预平衡至孵箱条件，持续两小时。

研究结束时，按照厂家说明用Sigma-Aldrich：碱性磷酸酶(AP)、白细胞(Sigma-Aldrich；Ref 86R-1KT，Lot 019K4349)对各个孔染色。

结果

来自细胞培养实验的选定图像被呈现为图8-12。

所有对照孔都显示出该hESC细胞系在所采用的对照培养条件下将被预料到的特征和形态。

RGD-4RepCT膜在维持细胞粘附和扩增方面是成功的。即使生长比对照孔中所看到的生长慢得多，应认为这是细胞系适应新的基质的结果。细胞在最初平铺时表现出对基质的一定程度的粘附，但是未粘附的细胞呈现出当将hESC放入到非粘附性平板或低簇集平板以专门获得用于谱系和分化分析的拟胚体(EB)结构时观察到的EB结构的外观。但是，这些EB样的细胞团最后的确粘附到基质上，并从这些“丛状物”中看到细胞生长和扩增，表明对新基质的适应。

该研究的细胞被继续培养和喂养并被期待继续扩增。另外期望这些细胞将能够传代和扩增并然后可随后评价其多能性和分化状态。阳性碱性磷酸酶染色表明这些细胞仍显示出未分化的干细胞的特征。

实施例3

重组蜘蛛丝上的小鼠胚胎干细胞

背景

小鼠胚胎干细胞(mESC)可能是饲养层依赖性的(即，其需要被培养在一层小鼠胚胎成纤维细胞，MEF上)或是饲养层独立性的（通常培养在明胶上）。mESC需要在培养基中存在LIF(白血病抑制因子)下培养以保持未分化。其分化状态（或“干细胞性”的保持）可通过碱性磷酸酶活性(AP)染色测定，因为多能细胞表达AP且因此染色阳性，或通过一组分化标志（基因）的转录测定。

步骤

解冻处于第17代的饲养层依赖性的mESC(R1)并将其平铺到60mm陪替式培养皿中的补充有20%热失活的、ES-细胞合格的FBS(Invitrogen，目录号16141-079)和5x10⁵单位/ml的LIF(Chemicon，ESG1107)的具有 glutamax(Invitrogen，目录号31966-021)的DMEM中的一层MEF(被辐射的，培养1天)上。2天后，收集细胞并接种到12孔板中的按本文实施例中所述制备的不同4RepCT支架（4RepCT的泡沫和纤维网和RGD-4RepCT的泡沫和纤维网）以及对照（MEF或明胶）上。分传比为1:7。每天更换培养基，并每隔一天（MEF或明胶）或每隔三天（4RepCT支架）分传细胞。对于生长在支架上的细胞使用更长的分传间隔，因为它们增殖较慢。为评价细胞是否保持多能性，在每一代末期（p19、p20和p21）或对于第21代的支架上的细胞为3天后（对于明胶或MEF上的细胞为2天后）用4%低聚甲醛固定细胞1分钟，并然后对碱性磷酸酶活性(来自VECTOR Laboratories的试剂盒)染色。因此，保持在支架上的细胞在p21的末期已被培养总共4+4+3=11天，而保持在明胶或MEF上的细胞在p21的末期已被培养总共2+2+2=6天。在倒置显微镜中拍摄显微照片。

结果

生长在明胶上的mESC开始分化并失去形态，而生长在MEF上的细胞在3次传代后还表现出维持的圆形集落形态和干细胞性。如通过与MEF相比所有支架类型上更低数量的集落表明的，与结合MEF相比，mESC显示出更低程度地结合泡沫和纤维网。生长在支架上的集落的数量与生长在明胶上的集落数量大致相同。

一旦与支架材料结合，细胞在泡沫和纤维网上生长并形成集落，但是与MEF相比，某些集落往往显示出不太光滑的形状。这些集落看起来与明胶上的集落相似。未经在泡沫和纤维网上分传4天后，这些集落非常大且已开始部分地分化（即，丧失其AP阳性）。在第三次传代（p21）中，允许细胞在各个支架材料上生长3天。这些集落在泡沫上维持其AP阳性，但在纤维网上显示出分化的征兆。与在RGD-4RepCT泡沫上相比，在4RepCT泡沫上，集落数量更多且更大（图13）。

参考图13，对各种基质上第3次传代(细胞代数21)的第3天（泡沫和网）和第2天(对照和明胶)，细胞具有AP活性染色。通过与针对MEF上的mESC（对照）所看到的AP染色相似的AP染色（深灰色集落）表 明，生长在4RepCT(WT)泡沫上的细胞表现出保持的干细胞性。相反地，生长在纤维网上的mESC显示出更弱的染色，这是分化的征兆。RGD4RepCT泡沫上的集落更小但为AP阳性的，指示增殖更少但干细胞性被保持。

在无分传地培养4天后，在泡沫和纤维网上的集落中看到的分化可能是集落过度生长且太大的结果，但是还可能是由于缺乏细胞为保持其多能性所依赖的由MEF分泌的因子。观察到保持在无MEF的明胶上的细胞也开始分化（2天后就已经开始）支持了这一点。在纤维网上，细胞在3天后开始分化，此时集落仍具有与2天后的MEF上的集落相当的尺寸。

结论

mESC在4RepCT和RGD-4RepCT泡沫和纤维网上表现出结合和增殖。4天后，可能是由于大的集落尺寸，4RepCT和RGD4RepCT泡沫和纤维网上的mESC开始分化。但是，当这些细胞被重新接种到新制备的支架上并培养3天时，它们在4RepCT和RGD-4RepCT泡沫上保持干细胞性，且集落的尺寸与两天后在MEF上看到的尺寸相似。在RGD-4RepCT泡沫上观察到与4RepCT泡沫相比更慢的生长。保持在明胶上2天的细胞开始分化且由于大（过度生长）的集落，MEF上的mESC也将在4天后开始分化。与明胶相比，在4RepCT泡沫上，粘附、生长和保持的干细胞性得到提高。

这些结果是令人惊奇的，因为mESC通常依赖于由MEF提供的因子来保持其干细胞性。

实施例4

重组蜘蛛丝上的神经干细胞(NSC)

材料和方法

包含支架的孔和阳性对照孔的准备

与Hedhammar等人(2008)，同上中的描述相似，重组制备并纯化4RepCT、IKVAV-4RepCT和RGD-4RepCT。如Hedhammar等人(2010),Biomacromolecules 11:953959中描述的，从脂多糖(lps)中纯化所获得的 蛋白质溶液的一个级分。在被用来制备如实施例1中所述的支架（膜、泡沫或纤维）之前，无菌过滤这些蛋白质溶液(0.22μm)。一半的支架由去除了脂多糖的蛋白质溶液制成。在被放入细胞培养板之前，纤维通过在2.8巴下在121℃下的蒸馏水中高压灭菌15分钟进行灭菌。在疏水的6孔细胞培养板(Sarstedt)中制备支架。使用涂覆有聚L-鸟氨酸和纤连蛋白(PORN)的孔作为阳性对照。以下提供了具有“野生型”4RepCT的6孔板的代表性图表：

另外，通过用分别由IKVAV-4RepCT和RGD-4RepCT制成的支架更换“野生型”4RepCT支架来准备类似的平板，准备总共9块实验平板。 

使用以下方案准备待用作对照平板的第十块六孔板中的两个孔：

-向每个孔中加入2ml聚L-鸟氨酸溶液

-在37℃下的细胞培养孵箱中孵育过夜

-通过抽吸去除聚L-鸟氨酸溶液 

-用PBS 1x洗涤两次

-每孔加入2ml纤连蛋白溶液 

-在细胞培养孵箱中孵育2-4h

-用PBS 1x洗涤两次

该平板中剩余的四个孔未被涂覆，即，细胞被直接接种到聚苯乙烯塑料表面上。因此，对照平板可被图表式地呈现为：

涂覆的，阳性对照	空的	空的
			涂覆的，阳性对照	空的	空的

上述材料被用于培养未分化状态的NSC 48小时，届时细胞分化成星形胶质细胞。

另外，为详细研究神经干细胞(NSC)的特征，准备了如下的一系列具有4RepCT膜的细胞培养板：

-3块六孔聚苯乙烯平板(Sarstedt)，每块板的六个孔中的五个具有4RepCT膜。根据上文用纤连蛋白和聚L-鸟氨酸涂覆空孔和一个另外的孔。这些平板被用于培养未分化状态的NSC 48-96小时，其后细胞分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元（参考下文）。

-对照平板：1块六孔聚苯乙烯平板(Sarstedt)。根据上文用纤连蛋白和聚L-鸟氨酸涂覆第一排，用BSA（牛血清白蛋白）涂覆第二排，而第三排被留存为未涂覆。

-准备七块具有4RepCT膜的35-mm聚苯乙烯平板(Sarstedt)以专门并准确地分析增殖（细胞分裂）速度和细胞死亡比例。

溶液

培养基：

N2培养基(500ml)

DMEM:F12(1∶1)+L-谷氨酰胺(500ml瓶；Gibco 11320-074)

1ml的50mg/ml转铁蛋白(SigmaT-1147；稀释在DMEM:F12中)

100μl的100μM孕酮

50μl的1M腐胺溶液

30μl的500μM亚硒酸钠

1ml的12.5mg/ml胰岛素

5ml的青霉素/链霉素(100x)溶液

N2培养基是用于培养原代（组织来源的、非细胞系）细胞的标准培养基。

缓冲液：

HANKS(500ml)

50ml的10xHBSS(Gibco 14170)、1.85g的NaHCO₃和1.95g的HEPES溶解在ddH₂O中并调节至pH7.2。过滤除菌。

工作溶液： 

溶于ddH₂O的聚L-鸟氨酸(15μg/ml)，过滤除菌(Sigma P-3655)

溶于ddH₂O的纤连蛋白(1μg/ml)，过滤除菌(Sigma F-1141)

NaOH(10mM)

储存溶液： 

溶于ddH₂O的腐胺(1M)(Sigma P-5780)

溶于EtOH的孕酮(100μM)(Sigma P-8783)

溶于ddH₂O的亚硒酸钠(500M)(Sigma P-5261)

溶于PBS的FGF(10μg/ml)(R&D Systems，rhFGF-碱性)

无菌过滤的溶于0.02M HCl的胰岛素(12.5mg/ml)(Sigma I-6634)

无菌过滤的溶于DMEM:F12的转铁蛋白(50mg/ml)(Sigma T-1147)

皮层神经干细胞培养物

神经干细胞(NSC)从定时怀孕的Sprague Dawley E15.5大鼠胚胎的离解的脑皮质获得。将NSC培养在1ml/962mm²的富含N2补充物的无血清DMEM:F12培养基中并在聚L-鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的细胞培养皿上生长。使用10ng/ml的FGF2使细胞保持在增殖状态直到到达80%的汇合， 并在用于实验之前传代两次。第二次传代后，以150000细胞/cm²平铺细胞并允许增殖48h。为确定细胞是否保持未分化，用巢蛋白对其染色。

为诱导NSC分化，从培养物中去除FGF2并连同特定的重组生长因子或小分子一起加入新鲜培养基以诱导特定分化。

对于星形胶质细胞分化，加入10ng/ml的重组CNTF(睫状神经营养因子)。CNTF和白介素-6家族的其他因子(例如，CT-1、LIF)诱导皮质NSC快速(48小时内)且有效地(>>50%)分化成具有星形胶质细胞形态和对典型的星形胶质细胞标志GFAP呈阳性的细胞(Hermanson等人(2002),Nature419:934-939)，且最近已通过钙成像技术表明这些细胞是功能性星形胶质细胞(Andersson等人(2011),Mol Cell Neurosci,Epub 2011年1月14日)。

对于神经元分化，在去除FGF2后施用0.5-1.0mM丙戊酸(VPA)或10ng/ml重组的BMP4(骨形态发生蛋白4)和10ng/ml的Wnt3a。VPA诱导NSC快速地(72小时内)分化成10-30%的具有神经元形态的早期、电生理学上不响应的细胞，这些细胞对神经元标志抗体TuJ1呈阳性。VPA-诱导的分化细胞的基因表达分析表明其引发了针对抑制型(GABA能)神经元的分化程序。BMP4+Wnt3a诱导NSC缓慢地(5-14天；本文为7天)分化成10-30%的具有神经元形态的成熟的、电生理学上有活性的细胞，这些细胞对所有泛神经元标志，包括TuJ1( 等人(2010),PloS One 5:e13833)呈阳性。BMP4+Wnt3a-诱导的分化细胞的基因表达和生理学分析表明其引发了针对兴奋性(谷氨酸能)神经元的分化程序。与使用VPA分化的细胞相比，BMP4+Wnt3a处理还导致增加的星形胶质细胞分化，促成神经元细胞的成熟表型。

对于少突胶质细胞分化，加入50ng/ml的甲状腺激素(T3)。T3诱导增强分化(1-20%)成具有少突胶质细胞形态的细胞，这些细胞在4-7天内对大多数典型的少突胶质细胞特征性蛋白质(例如MBP)呈阳性。虽然该分化不如由其他方案产生的分化有效，但是应注意到对照培养物中少突胶质细胞的数量(只去除了FGF2)是非常低的，例如<<1%。

免疫细胞化学 

对于免疫细胞化学，用PBS洗涤培养物一次并使用10%福尔马林(Sigma)固定20min。下一步，用PBS+0.1%Triton X100洗涤细胞3x5min。在4℃下过夜孵育一抗(在PBS+0.1% Triton X100+BSA 0.1%中1:500稀释抗体)。

下一步，用PBS+0.1% Triton X100洗涤平板6x5min，并与二抗一起室温孵育1h。

使用了以下抗体：来自Sigma的小鼠单克隆抗平滑肌肌动蛋白(SMA)(1:1000)；来自DAKO的兔多克隆抗-胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)(1:500)；来自CoVance的小鼠TuJ1(以检测神经元)(1:500)以及来自Chemicon的大鼠抗MBP(MAB386)(1:250)，接下来是合适的物种特异性的Alexa-488和Alexa-594偶联的二抗(Molecular Probes；1:500)。使用包含DAPI的Vectashield(Vector Laboratories,Inc.)显现核。使用Zeiss Axioskop 2 mot plus/Axiocam MRm相机通过Axiovision软件获取荧光图像和明视野图像。

增殖测定

加入50μM的5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU；Invitrogen)后，用10%的福尔马林固定细胞15min，接下来根据供应商的推荐进行免疫细胞化学实验。

细胞死亡测定 

使用存活/死亡试剂盒(Invitrogen)区分粘附到支架上的活细胞和死细胞。在根据厂家推荐继续测定之前用预热的PBS(37℃)清洗平板两次。该测定使得能够鉴定活细胞（绿颜色）和死细胞（红颜色）。

结果

关于神经干细胞当在纤维网、泡沫或膜上生长和扩增时的增殖和存活，以及分化成星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的潜力的实验。除非另外指明，所有实验一式三份地进行(n＝3)。

48-72小时后，NSC在泡沫和膜上正常增殖。在其中一部分塑料下一步被暴露于膜和泡沫的孔中，细胞只在膜和泡沫上生长。形态与对照培养 物（聚L-鸟氨酸和纤连蛋白）不可区分。当用巢蛋白染色时（接种后48h），4RepCT膜上的NSC的外观与生长在聚L-鸟氨酸和纤连蛋白上的细胞的外观不可区分（图14）。

在具有已涂覆有纤连蛋白和聚L-鸟氨酸的丝支架的孔中，细胞遍及板孔生长，这是预料到的，因为也涂覆了孔的塑料表面。在48小时之后的任何阶段，未在生长在4RepCT膜上的NSC之间看到与对照相比在增殖或细胞死亡方面的明显或显著差异。另外，与对照相比，未在生长在4RepCT泡沫结构上的NSC之间看到明显差异(n＝1)。在带有BSA涂层的孔中，细胞如所期望地未贴壁且在5天内死亡。

当生长在4RepCT膜和泡沫结构上时，NSC保持在形态上不可与FGF2存在下的对照培养物中的干细胞区分。它们是活的（经存活或/死亡染色测定为85%）、正在增殖的（经EdU测定为28%，对照20-30%）且保持处于未分化状态，且与对照培养物（使用聚L-鸟氨酸和纤连蛋白）相比未检测到显著差异（图14、16和17）。

为测试NSC是否在分化能力方面保持多能性，如以上方法部分详细描述的，应用了一系列的测试向各种神经谱系（例如，神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞）分化的方案。

当按方法中所述用CNTF处理生长在4RepCT膜上的NSC时，它们快速且有效地分化成具有表达典型标志蛋白GFAP的星形胶质细胞形态的细胞，在效率、增殖或细胞死亡方面与对照培养物（聚L-鸟氨酸和纤连蛋白）相比没有显著差异(图15)。

当按方法中所述用BMP4+Wnt3a处理生长在4RepCT膜上的NSC时，它们分化成具有神经元形态的对典型抗体TuJ1呈阳性染色的细胞，在效率、增殖或细胞死亡方面与对照培养物（聚L-鸟氨酸和纤连蛋白）相比没有显著差异(图14)。

当按方法中所述用VPA处理生长在4RepCT膜上的NSC时，它们分化成具有神经元形态的对典型抗体TuJ1呈阳性染色的细胞。虽然与对照培养物相比，未检测到增殖或细胞死亡方面的显著差异，但观察到略微低 一些的分化效率（与对照的数量相比，约10-50%的分化细胞）。先前已观察到VPA介导的分化受到基材的影响，可能是由于这一事实：与重组生长因子相反，在细胞内发挥作用的小分子VPA被粘附在基材上并在该基材上降解。但是，在4RepCT膜上确实观察到VPA介导的NSC的神经元分化。

当按方法中所述用T3处理生长在4RepCT膜上的NSC时，它们有效地分化成具有表达典型标志蛋白MBP的少突胶质细胞形态的细胞，在效率、增殖或细胞死亡方面与对照培养物相比没有显著差异(n=2)。观察到MBP染色表明了可能不如在对照条件下分化的细胞成熟的形态。但是，应注意少突胶质细胞的成熟是复杂的且因而在得出结论之前这种观察需要仔细且长期的分析（图15）。

在由已去除和未去除lps的4RepCT制成的支架之间对比后，未在任何实验中观察到形态、增殖、存活或分化能力方面的显著差异。另外，未在生长在IKVAV-4RepCT或RGD-4RepCT上的NSC中看到形态、增殖或存活方面的明显负差(n＝1)。

实施例5

重组蜘蛛丝支架上的朗格汉斯小岛（A）和单独的（B）或与其他细胞组合(C)的单一β-细胞

背景

朗格汉斯小岛的移植是找到广泛适用的治疗严重的1型糖尿病的最有希望的途径之一。遗憾的是，目前可用的方法受到由胰细胞功能和存活力的丧失引起的低功效的限制(Alejandro等人(2008),Transplantation86:1783-1788)。低的成功率未被完全理解，但在移植之前，在胰岛分离期间，细胞周围的环境被破坏，这导致血管化和神经支配的丧失，并导致被改变的与细胞外基质的相互作用。已暗示这是有限的存活和功能的主要原因(vander Windt等人(2007),Xenotransplantation 14:288-297；Kilkenny和Rocheleau(2008),Mol Endocrinol 22:196-205)。不像外分泌部分那样，胰的内分泌部分不独立地产生基膜而是依赖于其周围的环境，再次表明正确的 小生境（right niche）可能是重要的(Otonkoski等人(2008),Diabetes Obes Metab 10增刊4:119-127)。

胰岛移植的另一个主要障碍是由缺少供体引起的有限的β-细胞可得性。不像许多其他细胞类型那样，迄今为止体外繁殖β细胞是不可能的，因为使其扩增的努力导致去分化(Beck等人(2007),Tissue Eng13:589-599)。因此，对于胰岛和胰岛细胞（β细胞）的研究和增殖和对于用于移植的人工胰岛/β细胞载体的设计来说，建立为胰岛和β细胞而优化的环境是必要的。为了完成这个目的，需要高度多功能的生物材料作为支架。

近来，本发明人的研究小组报道了在生理条件下产生重组蜘蛛丝蛋白的成功。该蛋白质的聚合物可产生牢固且高度多功能的材料，该材料可采用不同的物理形态，例如三维的纤维网、泡沫或膜。这些“支架”的稳定性允许取得用于随后移植的细胞。此外，这些支架可被适合用于例如β-细胞的粘附的特定的细胞结合基序官能化。这些性质使得该蛋白质成为产生模仿天然细胞环境并因此为分离后的朗格汉斯小岛和单独的β-细胞提供支持的支架的极佳的候选物。

移植之后，胰岛充分地纳入到例如具有合适的血管化的宿主环境中是重要的。同时，应避免不利的宿主免疫反应，例如，瞬间的炎症反应。新的毛细血管的形成需要内皮细胞，且当然这些细胞容易耐受与血液的接触。间充质干细胞可上调内皮细胞中重要的生长因子的表达，并还产生蛋白酶，且从而可产生新的毛细血管的通路(Zacharek,A.等人Neurosci Lett404,28-32(2006))。本文描述的实验表明个体化胰岛环境可通过使用允许胰岛细胞、内皮细胞（参考实施例6）和间充质干细胞（参考实施例1）粘附及联合生长的功能化的丝支架建立。

实验材料

基本按Hedhammar等人(2008)，同上中所述的将重组蜘蛛丝蛋白，4RepCT(SEQ ID NO:2)制备成按实施例1中所述制备的支架结构的形态。该材料以初始形态4RepCT，或以通过并入与细胞外基质有关的不同细胞结合基序，例如RGD、IKVAV、和YIGSR或通过并入三肽RGE修饰的 变体的形式使用。其他变体中包括拖丝蛋白N-端结构域(NT)和C-端His-标签，产生指定为NT4RepCTHis(SEQ ID NO:5)的蛋白质。

朗格汉斯小岛（人和啮齿动物）

来自人和小鼠胰岛的细胞，例如β细胞

内皮细胞

间充质干细胞 

实验方法

细胞分离

在瑞典乌普萨拉大学的临床免疫学部门通过使用改进的半自动的消化-过滤方法分离人的朗格汉斯小岛，并此后在具有补充物和10%人血清的CMRL-1066培养基中培养(Johansson等人(2008),Diabetes57:2393-2401)。

通过胶原酶处理的胰分离啮齿动物的朗格汉斯小岛，通过连续的机械振荡消化，与外分泌组织分离，并此后在具有补充物和10%FBS的RPMI-1640培养基中培养(Nyqvist等人(2005),Diabetes 54:2287-2293)。

由来自10个月大的肥胖小鼠的胰岛或由来自人供体的胰岛制备单一细胞。根据accutase消化方案分离单一细胞。简单地说，汇集200个胰岛并用1xPBS洗涤两次。此后，向这些胰岛中加入1ml的accutase。伴随两个温和振荡的步骤将胰岛-accutase悬浮液在37℃中孵育10-15min，其后用1xPBS洗涤胰岛单一细胞两次并然后平铺到处于不同物理形态且不含和含有各种肽基序的4RepCT支架的不同变体上并培养。

细胞培养

在具有补充物的CMRL-1066中培养与4RepCT支架组合的人胰岛(20个胰岛/孔)(Johansson等人，同上)。

在具有补充物的RPMI-1640培养基中培养与4RepCT支架组合的啮齿动物的胰岛(10个胰岛/孔)和单一胰岛细胞(Nyqvist等人，同上)。

获得市售的人微血管内皮细胞并根据提供商的说明以众所周知的方 式保持其处于培养中。

获得市售的来源于骨髓的人间充质干细胞并根据提供商的说明以众所周知的方式保持其处于培养中。

细胞培养板（疏水塑料）用作胰岛对照（因为通常在这些平板中自由漂浮地培养胰岛）。组织培养物处理的塑料用作单一细胞生长的对照。

粘附测定

将若干(10-25)胰岛平铺到作为对照的正常培养塑料及4RepCT支架和细胞结合基序的不同变体上。使用特定的胰岛培养基，并培养4RepCT和胰岛5天。在该时间内，每天对粘附的胰岛计数。在第2天进行培养基更换并在第5天研究胰岛素释放。此后，在4RepCT支架中培养胰岛多达2周，届时分析胰岛的存活。在使用来自人供体的胰岛的一个实验中，培养胰岛12周。

胰岛和胰岛细胞的功能和存活的评价

在不同的促进生长、功能和存活的条件下，并持续不同的时间段，在各种基于4RepCT的支架中培养完整的胰岛或胰岛细胞之后研究人和啮齿动物的单独的胰岛和胰岛细胞中的信号转导。在用于信号转导通路中的特定步骤的各种荧光染料和生物传感器的帮助下监测胰岛细胞的生长、功能和存活。测试了几个关键事件：葡萄糖代谢、游离Ca²⁺的胞质浓度([Ca²⁺]_i)、增殖及凋亡/坏死。测试例如ATP产生、胞吐作用和刺激诱导的胰岛素基因转录也是可能的。

体内移植

根据P.O.Berggren的实验室研发的方法进行胰岛和4RepCT的移植(例如，移植入眼睛的前房)(Speier等人(2008),Nat Protoc 3:1278-1286；Speier等人(2008),Nat Med 14:574-578)。以这种方式，使用角膜作为在生理和糖尿病条件下研究细胞在活的生物体中的存活、功能和整合的窗口。

结果

A)胰岛的培养 

野生型4RepCT和通过并入不同细胞外基质相关的细胞结合基序（例如，RGD、RGE、IKVAV和YIGSR）修饰的变体4RepCT的使用可界定用于保持分离后的胰岛功能和存活的最佳环境。

从人的胰(N=7)和小鼠的胰(N=10)分离胰岛。 

在其特定的培养基和血清中培养这些胰岛3h至3天。此后，将其平铺到4RepCT的不同变体（具有并入的肽基序：无（野生型；WT）、RGD、RGE、IKVAV和YIGSR的纤维、泡沫和膜）上。还将胰岛平铺到NT4RepCTHis上。

如图18A（人）和图18B（小鼠）中所示，胰岛自发地粘附到4RepCT变体上。空的培养板（疏水塑料）用作对照。与膜和纤维相比，从这些结果中观察到对泡沫支架结构的优先粘附（图19）。所以，在泡沫支架上继续粘附和功能的所有测试。

平铺后直到第5天每天计数粘附的胰岛。如图20(人胰岛，n=3，除了对于RGE是n=2；所有实验一式三份地进行)和图21A-B(小鼠胰岛n=4(A)和n＝1(B)；实验一式三份地进行)所示，胰岛以不同的数量粘附。还进行了不同基序之间的对比，并对于包含基序RGD的4RepCT，在第2、4和第5天看到显著的粘附增加（图21A）。与对照相比，胰岛还以增加的方式粘附到NT4RepCTHis上（图21B）。

对接触4RepCT的胰岛进行葡萄糖刺激，并在第5天测量胰岛素释放。图22A-F中示出了结果。胰岛素由培养在4RepCT上的小鼠胰岛释放(图22A-B；n=6；实验一式两份地进行)。当培养在NT4RepCTHis上时小鼠胰岛也释放胰岛素(图22D；n＝1；实验一式三份地进行)。当培养在4RepCT上时人胰岛在葡萄糖刺激后释放胰岛素(图22E；n=3；实验一式三份地进行)。并不是所有胰岛都粘附到泡沫支架上，且因此在单独的实验中测试在第2天和第5天粘附的胰岛的胰岛素释放功能(图22C(小鼠)，图22F(人))。

在涂覆有含有或不含肽基序的4RepCT支架的孔和对照孔中培养之后，胰岛经葡萄糖刺激的胰岛素释放相似。这表明用4RepCT支架培养的胰岛保持其功能。另外，在NT4RepCTHis上培养的胰岛显示出保持的功能（图22D）。

在关于含有或不含肽基序的4RepCT支架的几个小鼠实验中，在初始基础葡萄糖（黑色柱）测量的胰岛素释放更高，且这被认为是暴露于难以从支架上洗掉的初始培养基，和这些实验胰岛之间的高度可变性的结果。分别在每个孔中测量了刺激指数（刺激的胰岛素/基础胰岛素）且表明支架上的所有胰岛都通过与对照一样好地释放胰岛素来对葡萄糖响应（图22B）。

与细胞结合基序无关，培养在4RepCT支架（含有和不含肽基序）上的人胰岛显示出低的基础胰岛素水平，并在高浓度葡萄糖刺激后展示出满意的刺激后的胰岛素释放。

对于培养在携带不同基序的支架上的胰岛，测量了游离Ca²⁺的胞质浓度([Ca²⁺]_i)。如通过比率成像分析（ratiometric imaging analysis）所证实的，胰岛对高葡萄糖响应并显示出Ca²⁺的增加（图23）。未观察到对照胰岛和培养在支架上的胰岛之间的差异。

培养（每隔一天更换培养基）胰岛2周。此后，对胰岛计数并扫描以获得存活（例如，坏死）。2周后支架上的胰岛的胰岛形态得以保存，而如通过更不规则的形状和悬浮的单一细胞所观察到的，对照胰岛显示出胰岛降解（图24）。通过光学显微镜分析坏死体。在对照胰岛中看到更多的坏死体，而培养在4RepCT支架（含有和不含肽基序）上的小鼠和人的胰岛更为完好和有活力。

长期培养来自年轻人供体的胰岛，并在第5天及4周和12周后测试胰岛样簇的形成和胰岛素释放。4周后，具有RGD基序的泡沫支架上的胰岛显示出增加的胰岛素样簇的形成（表6）。

这些簇粘附到支架上，且胰岛和胰岛样簇之间的细胞沿着RGD-4RepCT支架结构生长（图25）。还在具有YIGSR基序的支架上看到胰岛之间和沿泡沫结构的这种细胞生长。对于具有RGD的支架，胰岛素释放随时间增加，而在具有YIGSR基序的支架中胰岛素释放得以保持，且这些结果展现了在如此长时间的培养之后与对照胰岛相比满意的功能（图26）。染色展示出胰岛和胰岛样簇中的胰岛素阳性细胞（图27）。

B)单独的β-细胞的培养 

从来自肥胖小鼠的胰的朗格汉斯小岛(n=3)中和从人胰岛(n＝1)中分离单一细胞(β-细胞占多数)。将这些单一细胞平铺到4RepCT的不同变体（具有并入的基序：无（野生型；WT）、RGD、RGE、IKVAV和YIGSR的纤维、泡沫和膜）上并培养3-7天。

形态分析表明这些单一细胞以不同方式粘附到4RepCT的不同变体上。

分析了单一细胞的长期培养（超过2周）。组织培养物处理的塑料用作对照(图28A)并与涂覆有具有并入的细胞结合基序，例如RGD的4RepCT的膜和泡沫的孔比较(图28B)。如图28所示，在所有这些不同的孔中，单一细胞形成细胞簇。这些细胞簇形态各异，例如在对照中显示为分散的簇（图28A），而例如在具有RGD基序的4RepCT中显示为圆形的簇（图28B）。2周后对这些簇计数并然后留存用于组织学分析，例如胰岛素染色。结果表明在具有RGD的4RepCT泡沫中所发现的圆形簇的量增加，且如图28C所示，这些圆形簇是胰岛素阳性的。这些结果表明与在正常细胞培养塑料上培养的单一细胞相比，4RepCT可保持胰岛β细胞的功能并增强胰岛素阳性的圆形细胞簇的生长。

C)与其他细胞组合的β细胞的培养

将单一小鼠β细胞、人内皮细胞和人间充质干细胞单独或一起平铺到具有并入的基序：无（野生型；WT）、RGD、RGE、IKVAV和YIGSR的4RepCT泡沫支架上并培养。当单独培养时，间充质干细胞粘附到支架结构上并沿其生长（图29）。

单一β细胞、内皮细胞和间充质干细胞在泡沫支架上生长，并在4RepCT和RGD-4RepCT显示出增加的簇形成（图30）。

期待与朗格汉斯小岛或胰岛细胞的组合的4RepCT支架移植表现出植入支持。

结论

用各种4RepCT支架（具有不同的形式和肽基序）培养胰岛允许关于在细胞水平上开发潜在的糖尿病治疗策略的基础研究。

在不同变体形式的4RepCT支架内培养胰岛和胰岛单一细胞例如β细胞有助于体外保持并增加其功能。

如果使用接受者自身的内皮细胞和间充质干细胞对这些接受者进行移植，在4RepCT支架内培养复合细胞群（包含胰岛β细胞、内皮细胞和间充质干细胞）具有作为胰岛素制备装置的潜力。

期望使用最近在Berggren教授的实验室研发的技术被一起移植到小鼠眼睛的前房内的带有胰岛的4RepCT提高胰岛植入和存活。期望与朗格汉斯小岛或胰岛细胞组合的4RepCT支架的移植表现出植入支持。

该实施例中描述的工作实现了研发基于4RepCT支架（含有或不含肽基序）的可移植的人工胰岛素产生装置的先决条件。

实施例6

重组蜘蛛丝上的内皮细胞

在再生医学中，血管的生长对于组织工程是必不可少的。内皮细胞负责血管生长，且该过程在某些情况，例如伤口愈合期间被引发。在体内，取决于器官和组织，存在许多不同种类的内皮细胞。与组织紧密接触的内皮细胞被称为微血管内皮细胞。

实验材料

获得市售的微血管内皮细胞并根据提供商的说明以众所周知的方式保持其处于培养中。

将包含4RepCT蛋白质的不同变体的聚合物的细胞支架材料制备成 如实施例1中描述的不同物理形态。4RepCT蛋白质以不含任何额外的细胞结合基序的未修饰的、“野生型”形式以及被肽性质的细胞结合基序RGD、IKVAV或YIGSR修饰的形式使用。

实验方法

将细胞加入到不同的支架材料中并研究这些细胞。对细胞进行多种测定，包括增殖测定和BD通路分析（BD Biosciences）。进行例如细胞功能分析、凋亡和坏死的存活/死亡测定及组织学分析也是可能的。组织培养物处理（tissue culture treated）的塑料板用作对照。

结果

图31和32中展现了结果。内皮细胞粘附不同的4RepCT支架并与之一起培养生长。培养3天后，分析其形态和对细胞量计数。形态分析表明不同物理形态的含有和不含细胞结合基序的4RepCT支架上的内皮细胞粘附并且是有活力的（图31和32）。

结论

内皮细胞是有活力的并可在4RepCT支架上生长，还在其上显示出增殖能力。

实施例7

重组蜘蛛丝上的成纤维细胞

进行的实验表明由4RepCT制备的支架支持贴壁依赖性原代成纤维细胞的生长，细胞存活，粘连到该材料并保持其主要功能之一，即分泌I型胶原。与组织培养物处理的塑料相比，4RepCT支架显示出增加的支持细胞生长的能力。引入整联蛋白结合基序RGD进一步提高了这种细胞支持能力。表明在野生型4RepCT和RGD-4RepCT上的生长都不依赖血清蛋白质。

材料和方法

细胞培养

在补充有5%胎牛血清(Gibco)、青霉素和链霉素(National Veterinary Institute，SVA，Sweden)的Dulbecco改良的Eagle培养基营养成分混合物F12 HAM(Sigma)中培养新生儿来源的原代人皮肤成纤维细胞，HDFn(ECACC/HPA)(图34-36和38-41)。在平行实验中，(图37和42)，在补充有25μg/ml抗坏血酸(Sigma)和5mM L-谷氨酰胺(SVA)的无血清细胞培养基PC-1(Lonza，Belgium)中培养原代人成纤维细胞(SF-HDF，PromoCell)。将细胞以3000细胞/cm²或15000细胞/cm²的密度接种到4RepCT支架上。在37℃下，以5%CO₂和95%的湿度在第8代进行所有实验(除了在第4代进行实验的图36和41)。

细胞培养支架 

纯化后，通过离心过滤(Amicon Ultra，Millipore)浓缩重组表达的含有或不含另外的N端细胞结合基序RGD、IKVAV和YIGSR，或三肽RGE的4RepCT(Hedhammar等人(2008)，同上)并在制备根据实施例1的描述的支架之前无菌过滤(0.22μm)。同样地，制备重组NT4RepCTHis。通过在2.8巴下在121℃的蒸馏水中高压灭菌15分钟对纤维灭菌。在疏水的96孔细胞培养板(Sarstedt)或细胞培养腔式玻璃载玻片(LabTek)中制备支架。不含支架的孔用作阴性对照(HP)，而组织培养物处理板用作阳性对照(TCT)。

允许在无菌条件下用全速风扇室温干燥这些平板和腔式载玻片过夜。在细胞接种之前，用无菌PBS洗涤支架两次并在37℃、5%CO₂下与完全细胞培养基预孵育1h。

通过阿尔玛蓝计数细胞

在培养期间每隔一天通过阿尔玛蓝细胞成活力测定(Molecular Probes)监测细胞在96孔板支架上的生长。在细胞培养基中1:10稀释的阿尔玛蓝中孵育4h后，用荧光读板机(FarCyte，TECAN)测量来自培养物的100μl上清液在激发544/发射595下的荧光强度。建立50-64000细胞/孔范围内的标准曲线以使得能够将荧光强度重新计算成细胞数目(活细胞)。一式六份地分析每种支架类型。

细胞染色

在培养期间每隔两天对培养在腔式载玻片中的支架上的细胞进行成活/死亡细胞、丝状肌动蛋白或I型胶原染色。在共聚焦显微镜(Leica)下观察染色，绿色荧光：在488nm下激发/在500-530nm下检测，红色荧光：在543nm下激发/在620-660下检测，并通过Leica共聚焦软件(LCS)拍摄照片。

存活/死亡染色：使用存活/死亡成活力测定(Molecular Probes)显现生长在支架上的活细胞和死细胞。用预热的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤培养物两次并在室温下用钙黄绿素-AM和乙锭同二聚体-1(EthD-1)染色30分钟。

丝状肌动蛋白：在用1:40的于1%BSA的PBS溶液中的AlexaFlour488-鬼笔环肽(Invitrogen)染色之前，洗涤支架两次并用4%低聚甲醛固定，用于0.1%Triton X-100的PBS溶液渗透，并用1%牛血清白蛋白(BSA，AppliChem)的PBS溶液封闭。EthD-1用作核染色。在荧光封固介质(Dako，Copenhagen)中封固载玻片。

黏着斑蛋白：在用9.5μg/ml的溶于1%BSA的小鼠抗人黏着斑蛋白(Sigma V9131)，接下来用1:40于1%BSA的PBS溶液中的交叉吸收的AlexaFlour488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen)和AlexaFlour594-鬼笔环肽(Invitrogen)染色之前，洗涤支架两次并用4%低聚甲醛固定，用0.1%Triton X-100的PBS溶液渗透，并用1%牛血清白蛋白(BSA，AppliChem)的PBS溶液封闭。DAPI用作核染色。在荧光封固介质(Dako,Copenhagen)中封固载玻片。

I型胶原：在用3.5μg/ml的溶于1%BSA的小鼠抗I型胶原(克隆COL-1，Sigma-Aldrich)，接下来是交叉吸收的AlexaFlour488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen)染色之前，洗涤支架两次并在-20℃下用丙酮固定并用1%BSA的PBS溶液封闭。EthD-1用作核染色。在荧光封固介质中封固玻片。小鼠IgG1(克隆B-Z1，BioSite)用作同种型对照。

分泌的I型胶原的定量测定

每隔一天从培养物中收集上清液，1:10稀释并根据来自厂商的说明书使用I型前胶原C-肽EIA试剂盒(TAKARA)分析在I型前胶原分子向细 胞培养基中分泌期间从其裂解下来的C-肽。用Sunrise读板机(TECAN)测量OD450，使用具有Magellan软件的数据管理获得C-肽在初始样品中的浓度。将数据重新计算成pg分泌的C-肽/细胞。

结果

由4RepCT制备的细胞培养支架

由4RepCT蛋白质溶液成功地制备了膜、泡沫、纤维和纤维网支架（图33）。

成纤维细胞在4RepCT支架上的生长 

如由最初的培养阶段（即，从较低接种密度的第7天和从较高接种密度的第5天，图34）之后存在于支架孔中的更高数量的活细胞表明的，与TCT相比，4RepCT支架表现出增加的支持原代成纤维细胞生长和扩增的能力。但是，在最初阶段中，与TCT相比，细胞在支架上好像生长得略微慢些。泡沫支架上活细胞的数量始终低于基于膜和纤维的支架。然而，由于难以估计泡沫支架的可及支架面积，因此不可能与其他支架形式直接比较。通过将4RepCT膜添加到纤维或纤维网支架下面，支持能力增加甚至更多（图35）。

我们还证实成纤维细胞在支架上显示出高的存活/死亡比，其中膜支架表现出接近于细胞培养物处理的玻璃载玻片的相同生长方式、细胞密度和存活/死亡比（图36，右图）。因为基于泡沫和纤维的支架在该测定中染成红色，我们能够看到活细胞的形状，然后是材料的形态。

人成纤维细胞在4RepCT支架上的无血清培养

我们还表明SF-HDF（在无血清条件下扩增的原代人成纤维细胞）能够在培养物中无血清存在下在4RepCT膜支架上生长（图37）。这证明了细胞与材料的相互作用不依赖于与表面非特异性结合的血清蛋白质，而是支架本身为细胞提供在其上生长的舒适表面。

细胞与支架的粘附

在细胞粘附到周围基质期间，丝状肌动蛋白粘附到介导结合的膜结合 受体。通过对细胞内的丝状肌动蛋白染色，可间接显现细胞和下面的材料之间的结合点。通过该方法，我们能证实实际上HDFn在早期和晚期培养期间(第1、4、7、10天)都结合纤维(图38，左图)、纤维网、膜(图38，右图)和泡沫支架。此外，通过对黏着斑蛋白联合丝状肌动蛋白染色，可在野生型（WT）膜、RGD、IKVAV、YIGSR和NRC(NT4RepCTHis)上在无血清条件下培养SF-HDF 3h之后检测到黏着斑(图43)。这些结果表明了整联蛋白介导的对不同基材的粘附。

生长在4RepCT支架上的细胞的I型胶原分泌 

细胞当生长在所有不同形式的4RepCT，即膜、泡沫、纤维和纤维网支架上时产生I型胶原。因此，这些细胞在4RepCT支架材料上体外培养期间保持其重要功能之一。在培养的前5天期间，培养基中分泌的胶原（通过分泌期间裂解下来的C-肽测量）的水平增加（图39，左上图）。但是，每个细胞产生的胶原的量在接种后24-72小时达到最大值，且正是在这个时间点，对于生长在任何一种4RepCT支架上的细胞每个细胞产生的胶原的量与TCT相比更高（图39，右上图）。在接种后第1、4、7和10天，在所有的支架类型上以相似的程度示出了胶原的细胞内产生（图39，下图中所示的实例）。

在4RepCT支架上培养后保持的成纤维细胞表型

为验证成纤维细胞在4RepCT支架上培养之后保持其表型，培养14天后从支架上收集细胞并重新接种到TCT上以评价I型胶原分泌，或玻璃上以获得I型胶原的细胞内染色。通过这样做，证实成纤维细胞仍产生（图40，下图）和分泌（图40，上图）I型胶原，且因此即使在4RepCT支架上相对长期地培养之后仍没有丢失其最重要的功能中的一个。

生长在官能化的4RepCT支架上的成纤维细胞

来自阿尔玛蓝存活实验的初始数据表明向4RepCT引入RGD分别增加了来自第3天和第1天的生长在膜和纤维网支架上的活细胞总数（图41）。随时间推移，即从第7天，细胞数量还超过了存在于TCT孔中的细胞计数。在平行设置中，使用了无血清细胞培养系统，表明即使在无血清 存在下，与无RGD的4RepCT相比，在RGD-4RepCT膜上实现了原代成纤维细胞的增强生长(图42)。因此，RGD的引入可明显地提高支架支持贴壁依赖性细胞生长的能力，且该作用不依赖于细胞培养基中存在的血清组分。这些结果还表明RGD基序被适当地暴露在支架表面上。

实施例8

重组蜘蛛丝上的角质形成细胞

进行实验以表明由4RepCT制备的膜支架支持原代角质形成细胞的生长，且细胞粘附到该材料并保持其特征性的形态。表明在野生型4RepCT和官能化的4RepCT上的生长都不依赖血清蛋白质。

材料和方法

将从人皮肤分离的角质形成细胞培养在具有补充物的角质形成细胞SFM(Gibco)中，这是一种为角质形成细胞的生长设计的无血清体系。传统地，在收获细胞之后加入10%的胎牛血清来失活胰蛋白酶以保证重新接种后的结合。在目前设置中进行加入和不加入该血清的平行实验。如前述实施例中所述的，在第4代时将角质形成细胞(10000细胞/cm²)接种到4RepCT的野生型和官能化的膜支架上。所测试的官能化包括普通的细胞结合基序RGD和IKVAV，而且还包括了普通的细胞结合基序YIGSR和/或角质形成细胞特异性的细胞结合基序EPDIM和NKDIL。此外可使用角质形成细胞特异性的标志例如角蛋白(K1、K5、K10、K6/K16/K17)、聚丝蛋白、Tob、G6K12、gp80和MRP-8来保证在培养末期表型被保持，并确定分化状态。

如以上在实施例7中所述的，使用用于检测黏着斑蛋白(克隆V9131，Sigma-Aldrich)联合丝状肌动蛋白(鬼笔环肽，Invitrogen)的免疫荧光染色来鉴定黏着斑，即细胞和材料之间的实际接触点。将通过EnzChek胱天蛋白酶3测定(Molecular Probes)评价对凋亡的影响。如以上在实施例7中所述的，用阿尔玛蓝(Molecular Probes)检测活细胞。

结果

在含有或不含细胞结合基序的4RepCT膜上培养原代人角质形成细 胞4天。在第1天和第4天之间，细胞存活且细胞数量增加（图44）。它们在全部的培养时期内在所有材料上显示出角质形成细胞的特征性形态（图45）。在野生型、RGD和IKVAV膜（第4天时分析的）上检测到黏着斑，表明整联蛋白介导的对所测试的材料的粘附（图46）。这些结果独立于接种之前血清的加入，因此，细胞在严格的无血清条件下与该材料结合。

实施例9

重组蜘蛛丝上的原代肝细胞

肝脏是具有独特功能的必不可少的器官。目前，急性肝衰竭的实例，例如，基于肝的代谢疾病和慢性肝病通过肝移植或肝细胞治疗来救治。遗憾的是，例如，因为许多细胞在肝细胞移植期间被丢失且未被植入，所以目前可用的肝细胞治疗不是最佳的。用作肝细胞宿主并保持其处于适当位置的支架可在移植之前预植入这些细胞。这打开了移植肝细胞的新方式。

实验材料

通过消化胶原酶处理的肝脏经连续的机械振荡分离到啮齿动物的肝细胞，将其分开并培养在补充有10%FBS的RPMI-1640培养基中。

前述实施例中所述的重组蜘蛛丝蛋白4RepCT以野生型和通过并入不同的细胞外基质相关的细胞结合基序(例如，RGD、IKVAV、YIGSR和RGE)修饰的变体的形式使用，并基本上按在Hedhammar等人(2008)，同上所述的以如实施例1中所述制备的支架结构形式制备。

细胞培养：在具有补充物的RPMI-1640培养基中培养与4RepCT支架组合的啮齿动物肝细胞。

肝细胞存活的评价：将细胞平铺到并入了不同的细胞外基质相关的细胞结合基序(例如，RGD、IKVAV、YIGSR和RGE)的纤维和膜支架上。随培养时间的推移评价细胞形态和存活。

结果

肝细胞粘附到纤维和膜支架上（图47）。

肝细胞还能够在具有4RepCT的培养中存活。

实施例10

用于组织工程的重组蜘蛛丝蛋白质支架

该实验被期望表明4RepCT支架能够实现脊髓损伤中轴突的体内再生。采用了无接种细胞的4RepCT支架和与人神经细胞和人少突胶质细胞祖细胞的植入物组合的4RepCT支架。组织学和行为学分析用来证明这些结果。

材料和方法

动物手术

在手术时，大鼠的重量为170-200g。手术30分钟前对动物注射阿托品(腹腔内0.05mg/kg，NM Pharma AB)。用Hypnorm(柠檬酸芬太尼，0.22mg/kg和氟阿尼酮(fluanisome)，6.8mg/kg，Janssen Pharmaceutical)和多美康（dormicum）(咪达唑仑，3.4mg/kg，Hoffman-La Roche)的混合物麻醉大鼠。贯穿手术过程监控大鼠的体温并保持在38℃下。

在脊髓损伤之前，腰椎脊髓通过局部椎板切除术被手术暴露并用几滴赛罗卡因(盐酸利多卡因，20mg/ml，AstraZeneca Sweden AB)对被暴露的脊髓表面处理。

脊髓的横切通过用解剖刀切割脊髓进行。通过仔细的目视检查，外科医生保证吻端和尾端被完全分开，并略微回缩。损害脊髓后，将一层Lyoplant(B/Braun Aesculap AG)在缝合伤口之前放置到脊髓上作为硬膜替代物。在手术之前和之后两次对大鼠皮下注射3ml的Ringer/葡萄糖(2.5%)。手术后，一天两次地给予大鼠Temgesic(丁丙诺啡(buprenorphin)，7μg/kg，Reckitt & Colman)的肌肉内注射，持续四天。每天两次手动排空膀胱，如果泌尿感染征兆出现的话，给予Borgal(二甲氧苄二氨嘧啶磺胺(trimetoprim sulfa)，15mg/kg皮下注射，Intervet International B.V.)。

在损伤时或在损伤一周后，将例如按前述实施例中所述制备的2-3mm长的4RepCT纤维束(含有或不含另外的肽基序例如RGD、RGE、IKVAV和YIGSR或使用拖丝蛋白蛋白质的另一种变体，例如 NT4RepCTHis)放置到脊髓的空隙中。在急性植入范例中，4RepCT纤维束被切割成适合被切脊髓的空隙，并通过使4RepCT纤维处于与脊髓同轴，温和地放置成在植入物的吻端或尾端接触脊髓残余部分。此后将Lyoplant硬膜替代物放置到4RepCT植入物上方。

如果在损伤后一周植入4RepCT纤维束，则麻醉动物，重新打开伤口并使脊髓暴露。修整髓的吻端和尾端残余部分以后，被切割成适合空隙的纤维束被放置成与脊髓同轴以确保纤维和植入物吻端和尾端的脊髓组织之间的接触。如上所述地封合伤口。

人未成熟细胞的共植入

在相似的实验中，将如上所述的4RepCT纤维的植入与人神经干细胞和人少突胶质细胞祖细胞的植入组合。根据被地区伦理委员会批准的方法，并在寻求流产的女性书面同意之后，从人的常规流产获得细胞。

根据专利方法体外培养合适的细胞后，将最小体积的不含生长因子的DMEM-F12中的100,000-500,000个细胞的悬浮液注射到4RepCT纤维束中，然后如前述部分所述地使用该纤维束。

行为评价

为研究后肢的运动功能，允许大鼠在开放区域(150x64cm)运动并观察至少四分钟。根据Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)Locomotor Rating Scale(Basso等人(1995),J Neurotrauma 12:1-21,对于综述参见Basso(2004),J Neurotrauma 21:395-404)评价和分级后肢的功能、关节的运动、爪子的定位、重量承受、协调和趾间隙（toe clearance）。视频记录这些测试，且对该治疗不了解的至少两个独立的观察者评价每只大鼠。在手术前和手术后1、2、6、12和18周评价动物。

神经元突起生长（outgrowth）的追踪

通过在顶叶皮层中的多个部位根据厂家说明注射生物素化的葡聚糖胺(BDA，Neurotrace)进行顺行追踪，持续一周。顺行追踪通过将荧光金注射到伤口尾端3-5mm的脊髓中实现。在受伤尾端的脊髓中显现BDA，以显现穿过脊椎伤口的皮层-脊髓下行轴突，而在脑干的红核中荧光金标 记的神经元作为下行脊髓-脊髓神经元的再生的证据被筛选。

形态学分析 

在损伤后18周的最后一次行为评价之后，静脉内给予大鼠致命剂量的镇静剂并贯穿升主动脉输注100ml的无Ca²⁺Tyrode’s溶液，接下来输注400ml的磷酸盐缓冲的4%低聚甲醛(PFA,Merck)。解剖出整个的脑干和包括伤口的4-5cm的脊柱，在同一固定剂中后固定2小时并在4℃下的10%蔗糖中冷存至少24小时。然后小心地从脊柱中解剖出脊髓，将脊髓和脑干包埋到组织-Tek中，冷冻，在低温恒温器中以10μm切片并封固到明胶涂覆的载玻片上。

对于免疫组织化学分析，使用以下一抗：人特异性的兔抗热激蛋白27、兔抗巢蛋白、兔抗II型β微管蛋白、小鼠单克隆人特异性抗胶质细胞原纤维酸性蛋白、兔抗微管相关蛋白质2。在含有0.3%Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(TPBS)中稀释一抗。将所用的二抗偶联到Cy3(Jackson ImmunoResearch Laboratories Lab.Inc)或Alexa 488(Molecular Probes)上。室温下用1.5%的正常山羊血清(Sigma)处理切片30分钟，在4℃下用一抗孵育过夜，接下来冲洗并在室温下用二抗孵育两小时。用核标志Hoechst33342(30μg/ml，Molecular Probes)对所有切片复染，并用DABCO(1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷，0.03mg/ml，Sigma)中的聚乙烯醇(0.1mg/ml,Sigma)封固。在荧光显微镜(Zeiss Axiophot)中研究免疫标记的组织切片，对于定量分析，使用CCD相机(Hamamatsu ORCA-ER)和用于Macintosh的Openlab软件(Improvision)捕捉图像。

实施例11

用于支持轴突在器官型培养物中再生的重组蜘蛛丝蛋白支架

该实验将表明4RepCT支架可支持并指导轴突的再生。将数片脊髓和脑干保持在活体外的培养物中。通过应用连接两个该组织片的4RepCT支架，将提供足以支持桥接空隙的再生的轴突。该实验将提供对4RepCT支架支持轴突突起生长的有用性和体内修复脊髓损伤中的损伤组织的证明。

制备脑干和脊髓的颈部区域的器官型培养物。从产前早期和产后的 Sprague-Dawley(SD)大鼠收集脑和脊髓。使用振动切片机制备穿过脑干和脊髓的颈部区域的矢状面切片。在37℃具有5%CO₂的加湿环境中，将解剖的组织放置到6-孔组织培养板中的1ml基于血清的培养基(具有Earle's盐的50%基础培养基Eagle(BME；Sigma，St.Louis，MD，USA)、25%热失活的马血清(Gibco，Grand Island，NY，USA)和25%的Earle's平衡盐溶液(EBSS；Sigma)、1mM的L-谷氨酰胺和0.5%d-葡萄糖)中的膜(Millicell-CM;Millipore,Billerica,MA,USA)上。孵育组织切片7-14天，每隔2天更换培养基。在损伤时，用剃须刀片进行上颈部脊髓的横切。在倒置显微镜中检查组织以保证外植体两个部分的完全分离。

将按前述实施例中所述制备的一束4RepCT纤维(含有或不含另外的肽基序例如RGD、RGE、IKVAV和YIGSR或使用拖丝蛋白蛋白质的另一种变体，例如NT4RepCTHis)放置到组织片之间的空隙中。在通过浸没到磷酸盐缓冲的4%低聚甲醛(PFA，Merck)中2小时被固定并在4℃下的10%蔗糖中冷存至少24小时之前，再孵育培养物14天。

对于免疫组织化学分析，使用以下一抗：人特异性的兔抗热激蛋白27、兔抗巢蛋白、兔抗II型β微管蛋白、小鼠单克隆人特异性抗胶质细胞原纤维酸性蛋白、兔抗微管相关蛋白质2。在含有0.3%Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(TPBS)中稀释一抗。将所用的二抗偶联到Cy3(Jackson ImmunoResearch Laboratories Lab.Inc)或Alexa 488(Molecular Probes)上。室温下用1.5%的正常山羊血清(Sigma)处理固定培养物30分钟，在4℃下用一抗孵育过夜，接下来冲洗并在室温下用二抗孵育两小时。用核标志Hoechst 33342(30μg/ml，Molecular Probes)对所有组织复染，并用DABCO(1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷，0.03mg/ml，Sigma)中的聚乙烯醇(0.1mg/ml,Sigma)封固。在用于定量分析的荧光显微镜(Zeiss Axiophot)中研究免疫标记的组织切片，使用CCD相机(Hamamatsu ORCA-ER)和用于Macintosh的Openlab软件(Improvision)捕捉图像。

结果被预测为表明4RepCT支架可指导受损轴突的再生。

实施例12

重组蜘蛛丝上的人胚胎干细胞

建立在以上实施例2中报道的研究的基础上，该实验进一步探索了在重组蜘蛛丝材料上培养人胚胎干细胞的可行性。

材料和方法

准备标准的六孔组织培养板。在这些平板中，三个孔包含下列4RepCT变体之一的膜：RGD-4RepCT、RGE-4RepCT、IKVAV-4RepCT、YIGSR-4RepCT和NT4RepCTHis，而每块板的剩余三个孔是空的。基本上按实施例1中所述制备具有肽基序的4RepCT和NT4RepCTHis的膜。实验中总共包括15块板（代表一式三份的每种4RepCT变体）。在室温下保持平板干燥直到进一步使用。

在对实验的准备中，在II类微生物安全箱中UV辐射组织培养板30分钟。然后按照厂家说明用CELLstart^TMCTS^TM(Invitrogen；目录号A10142-01)涂覆每块平板中的三个空的孔。

按照厂家说明，将人胚胎干细胞(RCM-1，DeSousa等人,Stem Cell Res2:188-197；Roslin Cells,Edinburgh,UK)培养在具有血清和无饲养层培养基 hESCSFM–人胚胎干细胞培养基(Invitrogen；目录号A1000701)的CELLstart^TM上。按照厂家说明使用 EZPassage^TM-一次性干细胞传代工具(Invitrogen；目录号23181-010)以1:6的比例对来自90%汇合的孔中的细胞传代。

在细胞接种之前，用PBS洗涤孔，并将培养基放入所有的孔中并预孵育。以推荐密度将第60代的细胞接种到五块六孔板(代表五种不同的变体)的所有孔内，加小心不要破坏接种后的细胞。按照厂家说明用 hESC SFM培养所有孔。在37℃下、空气中5%CO₂、95%的湿度下的标准培养孵箱中进行孵育。每天观察细胞并每48小时更换100%培养基。在更换养料之前将所有培养基预平衡至孵箱条件，持续两小时。

16天后将细胞传代，并在又6天后再传代到各个变体的剩余两块六孔板上。这两个时间点的传代方案包括由Roslin Cellabs建立的用于人胚胎干细胞的单一细胞分离的方法。通过按照厂家说明书使用ROCK抑制 因子(ROCK抑制因子/Y27632；FluoroChem目录号047265)预处理1h，按照厂家说明书使用TrypLE Select(Invitrogen目录号A12177(100ml10x))实现单一细胞分离(Watanabe等人(2007),Nat Biotechnol 25,681-686)。已表明这对于酶促传代后胚胎干细胞的成功生长是必不可少的。同样地处理对照和试验细胞并随后相等地接种所有细胞。

该研究的第三次传代24小时后，按照厂家说明用Sigma-Aldrich：碱性磷酸酶(AP)、白细胞(Sigma-Aldrich；Ref 86R-1KT，Lot 019K4349)对各个孔染色。

结果

来自细胞培养实验的选定图像被呈现为图48-52。

未观察到各种4RepCT变体之间的差异。最初，细胞是具有低度粘附的非粘附“丛”。如实施例2中所见，生长比对照孔中所看到的生长慢得多，这可能是细胞系适应4RepCT变体的结果。情况往往是这样，在再次在新的基质上或真正地在新的培养基组合物中定植之前，胚胎干细胞系将经历一个过渡或滞后阶段。如由实验的第一、第二和第三次传代细胞的照片(图48-52)所示的，这些拟胚体(EB)结构最终的确粘附到基质上，并从这些EB团状物中看到细胞生长和扩增，这表明了对新的基质的适应。

随后的传代导致改善的形态和生长。

如由碱性磷酸酶染色表明的，细胞令人惊奇地在培养23天后仍在各个4RepCT变体上显示出未分化的干细胞特征（图50-52）。

结论

所有对照孔都显示出对于该hESC细胞系在所采用的对照培养条件下将被预测到的特征和形态。该细胞系表现出适应所有4RepCT变体的征兆。在第一次传代时，在4RepCT变体上的最初粘附、生长和培养形态是差的。然而，随后的生长和传代产生了显示出未分化细胞的形态特征的集落，对于所有变体都呈阳性碱性磷酸酶染色。

在4RepCT变体上培养hESC的该研究令人惊奇地表明这些变体允许hESC的培养且它们适合用于在例如形态、生长特征和碱性磷酸酶染色方面保持细胞的干细胞性。

Claims (35)

1.用于培养真核细胞的方法，包括

-提供待培养的真核细胞的样品；

-将所述样品应用到细胞支架材料；以及

-在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料；

其特征在于：

所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物：

细胞结合基序；

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；以及

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；

且在于：

所述真核细胞是选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组的哺乳动物细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞支架材料还包含衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。

3.用于制备真核细胞的方法，包括：

-提供真核细胞样品；

-将所述样品应用到细胞支架材料；

-在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料；以及

-由所述细胞支架材料制备细胞样品；

其特征在于：

所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物：

细胞结合基序；

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；以及

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；

且在于：

所述真核细胞是选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组的哺乳动物细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞支架材料还包含衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。

5.下列的组合物：

-真核细胞；和

-细胞支架材料；

其特征在于：

所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物：

细胞结合基序；

衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；以及

衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；

且在于：

所述真核细胞是选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组的哺乳动物细胞。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞支架材料还包含衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。

7.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述干细胞是选自非人胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的干细胞。

8.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述干细胞是非人胚胎干细胞。

9.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述干细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组的成体干细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述干细胞选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组。

11.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述真核细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中来自朗格汉斯小岛的所述真核细胞是β细胞。

13.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述真核细胞以单一细胞提供。

14.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个神经球提供的神经干细胞。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。

16.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中

NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，所述片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段；

REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L(AG)_nL、L(AG)_nAL、L(GA)_nL和L(GA)_nGL组成的组，其中

n是2至10的整数；

每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala；

每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸残基是Gly；且

每个单独的L区段是0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；

且

CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，所述片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。

17.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到所述蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述寡肽被偶联到所述蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、RGE、IKVAV(SEQ ID NO:23)、YIGSR(SEQID NO:24)、EPDIM(SEQ ID NO:25)和NKDIL(SEQ ID NO:26)。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、RGE、IKVAV(SEQ ID NO:23)、YIGSR(SEQID NO:24)、EPDIM(SEQ ID NO:25)和NKDIL(SEQ ID NO:26)。

21.根据任一项权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。

22.根据权利要求5所述的组合物，其中所述干细胞是选自非人胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的干细胞。

23.根据权利要求5所述的组合物，其中所述干细胞是非人胚胎干细胞。

24.根据权利要求5所述的组合物，其中所述干细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组的成体干细胞。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述干细胞选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组。

26.根据权利要求5所述的组合物，其中所述真核细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中来自朗格汉斯小岛的所述真核细胞是β细胞。

28.根据权利要求5所述的组合物，其中所述真核细胞以单一细胞提供。

29.根据权利要求5所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个神经球提供的神经干细胞。

30.根据权利要求27所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。

31.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中

NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，所述片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段；

REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L(AG)_nL、L(AG)_nAL、L(GA)_nL和L(GA)_nGL组成的组，其中

n是2至10的整数；

每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala；

每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸残基是Gly；且

每个单独的L区段是0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；

且

CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，所述片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。

32.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到所述蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述寡肽被偶联到所述蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。

34.根据权利要求32-33中任一项所述的组合物，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、RGE、IKVAV(SEQ ID NO:23)、YIGSR(SEQ ID NO:24)、EPDIM(SEQ ID NO:25)和NKDIL(SEQ ID NO:26)。

35.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。