CN102936277B

CN102936277B - 人血管内皮生长因子抗原表位及其表位疫苗

Info

Publication number: CN102936277B
Application number: CN201110452570.0A
Authority: CN
Inventors: 高建恩; 罗时伟; 钱军
Original assignee: Beijing Wu Kang Emerging Technology Co Ltd
Current assignee: Sampris Beijing Cell Technology Co ltd
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: CN102936277A

Abstract

本发明为一种人血管内皮生长因子抗原表位及其表位疫苗，属于生物技术领域。本发明公开了一种人血管内皮生长因子的抗原表位，还公开了一种基于单域抗体骨架构建的人血管内皮生长因子表位疫苗，该表位疫苗能够有效诱导动物产生针对人血管内皮生长因子的抗体，该表位疫苗在动物体内表现出较好的抗肿瘤生长效应，可用于肿瘤等实体瘤药物之用。

Description

人血管内皮生长因子抗原表位及其表位疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种人血管内皮生长因子的抗原表位，以及利用该抗原表位设计的人血管内皮生长因子表位疫苗，该表位疫苗可用于肝癌等实体瘤的治疗。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体所介导的肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。抗肿瘤新生血管生成是目前抗肿瘤药物研发的重要方向之一。迄今最成功的抗肿瘤血管生成药物是罗氏公司生产的Avastin。Avastin是一种抗体药物，其所识别的抗原分子就是人VEGF。目前，Avastin已被美国FDA批准用于治疗晚期大肠癌、复发性神经胶质瘤和肾肿瘤等。

Avastin是通过哺乳动物细胞生产的，其生产成本高，作为一种抗体药物，其临床用量又较大，所以，用Avastin治疗肿瘤的成本很高，一般人难以承受，因此，寻找、设计以人VEGF为靶标的价格低廉的新型抗肿瘤药物具有现实意义。

Avastin是一种人源化抗体，其人源程度约为95％，用Avastin抑制肿瘤生长是一种被动免疫治疗方法。如果能够设计一种人VEGF疫苗，诱导机体自身产生针对人VEGF的中和性抗体，则可以实现对肿瘤的主动免疫治疗。但是，人VEGF由于是人体自身的分子，人体对其具有免疫耐受性，不能有效诱导人体产生抗体，因此，不能直接将人VEGF作为疫苗在人体内使用。

合成肽疫苗(synthetical peptide vaccine)是用化学合成法人工合成的类似于抗原表位的小肽(约20～40个氨基酸)。合成肽疫苗一般由多个B细胞表位和T细胞表位共同组成。目前，合成肽疫苗的效果一般不理想，主要原因包括，难以准确模拟抗原分子中相应部位的三维结构，T、B细胞表位不能有效发挥协同作用，以及合成肽疫苗分子小、免疫原性差等。因此，分析人VEGF的抗原表位，设计、合成人VEGF多肽疫苗很难达到理想的免疫效果。

若可以设计一种新型人VEGF重组表位疫苗，打破机体的免疫耐受性，让机体能够有效产生针对人VEGF的中和性抗体，就可以实现对肿瘤的主动免疫治疗。给人体免疫人VEGF表位疫苗在体内诱导产生的具有中和活性的抗体将是完全人源抗体，与肿瘤患者自身具有完全的生物相容性。而重组表位疫苗一般可以通过大肠杆菌等原核表达系统进行生产，其制造成本较低，而且其临床用药次数少，用量低，所以，用重组的表位疫苗进行的主动免疫治疗成本也较低。

1989年，Ward等(Nature 1989，341：544-546)首次制备了仅由抗体重链可变区(VH)结构域组成的基因工程抗体，并命名为单域抗体。1993年，Hamers-Casterman等(Nature 1993，363：446-448)报道了在骆驼血清中大量存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体。重链抗体在骆驼的体液免疫中发挥着重要的作用。与一般抗体相比，重链抗体除了缺少轻链之外，重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy antibody，VHH)还具有不同于一般抗体VH区的特征，骆驼的VHH基因通过在几个重要功能位点的选择性进化维持了重链抗体的正常功能，也就是说重链抗体的重链可变区(VHH)能够单独折叠形成稳定且完整的抗原结合位点。基于骆驼等动物重链抗体的重链可变区构建的单域抗体具有较好的结构稳定性，而将人源或鼠源抗体的重链可变区进行骆驼化改造后，也可以构建结构较稳定的单域抗体。

单域抗体分子虽小，但结构相对稳定，特别是构建自骆驼、鲨鱼等重链抗体的单域抗体。在单域抗体的三个抗原互补决定区(complementarity-determining region，CDR)中，抗原互补决定区3(CDR3区)在与抗原的结合中发挥主要作用，CDR3的长度变化范围较大，能够形成丰富的构象以参与结合抗原，换一种角度看，也就是说CDR3区能够展示不同长度的肽段，形成各种不同的构象，因此，单域抗体的CDR3应该是一种理想的抗原表位展示部位。

基于以上思路，本发明首先预测了人VEGF的抗原表位，然后，利用单域抗体骨架的CDR3区展示该抗原表位，从而构建了一种人VEGF表位疫苗，该疫苗能够诱导机体产生针对人VEGF的抗体，在体内能够抑制肿瘤的生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有潜在医学或药学价值的新型人VEGF表位疫苗，从而实现对肿瘤的主动免疫治疗，解决目前临床上使用的抗人VEGF抗体药物对肿瘤治疗存在的抗体异源性、治疗成本高等不足。

为实现上述目的，本发明实施了以下技术方案。

本发明提供了一种人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种人VEGF的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

本发明还提供了一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白利用单域抗体为分子骨架，并将SEQ ID NO：1-3任一所述的人VEGF的抗原表位序列展示于所述单域抗体的CDR3区。

进一步，本发明还提供一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白利用单域抗体为分子骨架，并用SEQ ID NO：1-3任一所述的人VEGF的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区。

所述的蛋白中所述单域抗体的FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别被替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸。

本发明还提供一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述单域抗体构建自人抗体、骆驼重链抗体或鼠抗体。

本发明还提供一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10所示的序列。

本发明还提供了制备上述蛋白的方法，当单域抗体来源于重链抗体的重链可变区时，所述制备表位疫苗的基本步骤包括：

(1)确定一种重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列；

(2)用SEQ ID NO：1-3任一人血管内皮生长因子的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将该全长基因序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；

(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白即为人VEGF表位疫苗蛋白；

当所述单域抗体来源于含轻链抗体和重链抗体的常规抗体的重链可变区时，所述制备表位疫苗的基本步骤包括：

(1′)确定含轻链和重链的常规抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2(FR2)和CDR3区的序列，并将FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸；

本发明还提供了一种人VEGF表位疫苗，所述表位疫苗包含上述的蛋白。

本发明还提供了上述蛋白在制备用于治疗或预防实体瘤的药物中的用途。尤其是作为疫苗药物的用途。

本发明还提供了上述的人VEGF表位疫苗在实体瘤治疗领域的应用。

本发明的人VEGF表位疫苗表现出了较好的免疫原性，较好地抑制了肝癌肿瘤的生长，可发展成为一种治疗肝癌等实体瘤的一种主动免疫治疗药物。本发明提供的上述人VEGF表位疫苗克服了合成多肽疫苗免疫原性差的缺点，表现出了较好的免疫原性，避免了目前抗人VEGF抗体类肿瘤治疗药物的异源性和治疗成本高的不足。本发明的人VEGF表位疫苗在肿瘤患者体内诱导产生的抗体是完全人源抗体，与患者本身具有100％生物相容性，并且本发明的人VEGF表位疫苗是可以在大肠杆菌中实现高表达的，生产成本较低，其临床使用量也低，所以，临床治疗成本将较低，这将会克服现有的在CHO等真核细胞中表达的抗体药物生产成本很高、使用量大导致的临床治疗成本居高不下的问题。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1一种小鼠抗体重链可变区氨基酸序列；

*：双划线部分为FR2区，斜体部分为CDR3区；

图2用源于小鼠抗体重链可变区的单域抗体骨架展示“PHQGQ”抗原表位；

*：单下划线部分为FR2区，斜体部分为改造后的氨基酸残基；

双下划线部分为替换后的包含“PHQGQ”表位的序列；

图3展示“PHQGQ”抗原表位的小鼠单域抗体骨架重组蛋白编码基因；

*：单下划线部分为酶切位点；

图4展示“PHQGQ”表位的小鼠单域抗体骨架重组蛋白对小鼠的免疫效果；

图5用骆驼单域抗体骨架展示“PHQGQHI”抗原表位；

*：双划线部分为展示的抗原表位序列及两侧的附加序列；

图6展示“PHQGQHI”抗原表位的骆驼单域抗体骨架的编码基因；

*：下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点；

图7用骆驼单域抗体骨架展示的“PHQGQHI”抗原表位在小鼠体内诱导产生抗人VEGF抗体；

图8骆驼化改造的人单域抗体的氨基酸序列；

*：双划线部分为框架区2(FR2)；

加框部分为骆驼化改造后的氨基酸；

单下划线部分为CDR3区；

图9人VEGF表位疫苗氨基酸序列；

*：双划线部分为人VEGF抗原表位的氨基酸序列；

图10人VEGF表位疫苗编码基因序列；

*：双下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点；

图11ELISA法检测人VEGF表位疫苗的免疫效果；

图12人VEGF表位疫苗免疫血清的中和活性分析；

图13人VEGF表位疫苗免疫组和对照组肿瘤重量比较。

具体实施方式

实施例1人VEGF抗原表位的分析、验证

蛋白质的抗原表位分析方法一般有合成肽验证法、计算机辅助的程序预测法和基于蛋白质三维结构的分析法，但任何一种方法都存在局限性，其中基于蛋白质三维结构的抗原表位预测准确度最高。目前，一般是联合运用两种或两种以上的分析方法来预测蛋白质的抗原表位，并且最终确定一个抗原表位是否是真正的抗原表位还必须通过实验进行验证。

本发明采用计算机辅助的程序预测法和基于蛋白质三维结构的分析法预测最可能的人VEGF抗原表位，然后，通过实验验证该表位是否是真正的抗原表位。

首先，用BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)抗原表位预测程序初步分析人VEGF可能的抗原表位，预测候选抗原表位如下：

表1人VEGF表位预测

编号	起始位置	终止位置	表位肽段	肽段长度
					1	1	11	APMAEGGGQNH	11
2	38	42	EYPDE	5
					3	66	75	LECVPTEESN	10
4	85	91	PHQGQHI	7
					5	103	122	ECRPKKDRARQENPCGPCSE	20
6	132	135	PQTC	4
					7	140	146	KNTDSRC	7

结合PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中人VEGF与其受体蛋白质复合体的晶体结构(1FLT)可知，上表中的4号候选表位“PHQGQHI”(SEQ ID NO：2)位于人VEGF与受体的结合面，其中，“PHQGQ”序列形成环状区(Loop区)，因此，包含“PHQGQ”五个氨基酸的序列(SEQ ID NO：1)有可能就是人VEGF的一个抗原表位。

为了验证“PHQGQ”序列是否是人VEGF的真正的抗原表位，将“PHQGQ”序列展示于一种构建自小鼠抗体的单域抗体骨架之上，形成一种新蛋白，利用该新蛋白免疫小鼠，检测血清中是否存在特异识别人VEGF的抗体。

具体做法如下：

从PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中找到一种小鼠抗体结构数据(3D69)，从中确定其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，(如图1，双划线部分为FR2区，斜体部分为CDR3区)，并将此序列作为鼠单域抗体的基础氨基酸序列。

将图1中的鼠源单域抗体基础序列进行骆驼化改造，其中FR2的第9、第10和第12位氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，同时，将“PHQGQ”序列替换到CDR3区中，替换完成后的序列如SEQ ID NO：5所示，(见附图2，其中，斜体部分的氨基酸为FR2改造后的氨基酸，双划线部分为替换后的包含“PHQGQ”表位的序列)。

将替换后的SEQ ID NO：5序列转换为其基因编码序列(http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)，同时在其上下游分别添加BamHI和Xho I酶切位点，得到全长序列如SEQ ID NO：6所示(如图3，下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点)，将SEQ ID NO：6序列交由北京英茂盛业生物科技有限公司合成并克隆到pUCE载体中，命名为pUCE-VE1。

将合成后的全长序列用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切操作，酶切体系为：

37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收目的基因片段。

将pET24a载体(购自Novagen公司)同样用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：

37℃条件下，酶切6小时。然后，通过琼脂糖电泳回收pET24a载体的大片段。

将回收的目的基因片段和回收的pET24a表达载体大片段在16℃水浴连接过夜，体系如下：

将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，冰浴上放置30min，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却2min，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基500μl，37℃震荡培养45min；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃温箱中培养过夜，次日挑取3～5个单菌落至Kan抗性的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD₆₀₀达到0.5时，加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，通过电泳分析目的蛋白表达情况，并保留表达量大的重组克隆菌。

将诱导表达后的重组工程菌，置于冰浴中超声处理，条件为电流350mA，脉冲5秒，间隔4秒，共超声30分钟，然后将超声后的菌体于12000r/min，4℃离心15分钟，分别收集沉淀和上清，并进行12.5％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果表明，目的蛋白主要包涵体形式存在。

将包涵体分别用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％Triton X-100、2mol/L尿素分别洗涤30分钟，最后，在4℃条件下12000r/min、离心15分钟，收集沉淀即包涵体。

将洗涤好的包涵体称重，按每克包涵体加入20ml 8mol/L尿素(溶解于20mM Tris-HCl中)的比例将包涵体裂解。次日，将裂解液在室温下10000r/min离心15min，收集裂解上清。

由于表达的重组蛋白C末端含有载体序列编码的(His)6标签，可在变性状态下，通过Ni²⁺亲和层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：

将Ni²⁺亲和层析柱用20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液(平衡缓冲液)平衡后，将包涵体裂解上清上样品，上样完毕用平衡缓冲液洗去不结合的杂蛋白，然后，用溶解于平衡缓冲液中的10mmol/L咪唑进行充分洗脱，然后，再用溶解于平衡缓冲液中的100～200mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。将纯化的目的蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。

纯化产物的复性：将纯化的目的蛋白用20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液调整蛋白浓度至400-600μg/ml，然后，用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液作4倍稀释，将稀释液置4℃冰箱中过夜，第二天用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液充分透析，之后再用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。

用复性后的样品，按照常规方法免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠5只。基本方法为：第一次免疫为100μg的目标蛋白加等体积的福氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射，15天后，采用100μg的目标蛋白加等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射，7天后，仍采用100μg的目标蛋白加等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射，再过7天后，采用100μg的目标蛋白直接进行腹腔注射，一周后从尾静脉采血，通过ELISA法检测血清抗体滴度。

检测抗原为人VEGF，包被浓度为2μg/ml。用2μg/ml人VEGF包被ELISA微孔板，50μl/孔，4℃冰箱中包被过夜，次日，用1％的牛血清白蛋白进行封闭，37℃封闭1小时，用0.1％Tween 20的Tris盐缓冲液(TBST溶液)洗涤5次，然后加入100倍稀释的免疫血清和相应的免疫前血清，37℃温育1小时，然后，用TBST溶液洗涤5次，之后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37℃温育1小时，再用TBST溶液洗涤5次，之后，加入辣根过氧化物酶底物四甲基联苯胺二盐酸(TMB)避光显色10min，然后，每孔加入终止液(2mol/L硫酸)50μl/孔，终止反应，测CD₄₅₀。

如附图4所示，ELISA结果表明，免疫后的小鼠血清能够识别人VEGF，而免疫前血清与人VEGF无反应。这表明，展示于鼠源单域抗体骨架之上的“PHQGQ”表位能够有效诱导小鼠产生针对人VEGF的抗体，也说明“PHQGQ”Loop区的确是人VEGF的抗原表位。

为了进一步验证以“PHQGQ”为核心的4号候选表位“PHQGQHI”是否是人VEGF真正的抗原表位，将4号候选表位展示在一种骆驼的单域抗体的CDR3区，形成的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示(附图5，其中双划线部分为展示的抗原表位序列及两侧的附加序列)，此蛋白质如果能够诱导动物产生抗人VEGF的抗体，则该蛋白即可被认为是一种人VEGF疫苗。将此蛋白质的氨基酸序列通过反翻译程序转换为其基因编码序列(http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)，由北京英茂盛业生物科技有限公司合成该基因编码序列及两端的BamHI和Xho I酶切位点得到全长序列如SEQ ID NO：8所示，(附图6，下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点)并克隆到pUCE载体中，命名为pUCE-VE2。由于骆驼的单域抗体为完全来源于重链抗体的重链可变区，因此无需进行骆驼化改造。

将pET24a载体(Novagen)同样用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：

37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收pET24a载体的大片段。

将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，冰浴上放置30min，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却2min，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基500μl，37℃震荡培养45min；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃温箱中培养过夜，次日挑取3～5个单菌落至Kan抗性的的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD₆₀₀达到0.5时，加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，通过电泳分析其表达情况，并保留表达量大的重组克隆菌。

由于表达的目的蛋白以包涵体形式存在，因此，要先破菌分离包涵体。

将筛选得到的工程菌置于冰浴中超声处理，条件为电流350mA，脉冲5秒，间隔4秒，共超声30分钟，然后将超声后的菌体于12000r/min，4℃离心15分钟，收集沉淀即为包涵体。将包涵体分别用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％Triton X-100、2mol/L尿素分别进行洗涤，然后4℃条件下12000r/min、离心15分钟，收集沉淀即包涵体。

由于表达的重组蛋白C末端含有载体序列编码的(His)₆标签，可在变性状态下，通过Ni²⁺亲和层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：

纯化产物可通过稀释和透析进行复性，基本方法为将纯化产物作4倍稀释，稀释后蛋白浓度维持在100μg/ml左右，将稀释液置4℃冰箱中过夜，第二天用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液充分透析，之后再用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。

用复性后的样品，按照常规方法免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠3只，经过四次免疫后，通过ELISA法检测免疫小鼠血清。检测用抗原为人VEGF，包被浓度为2μg/ml。ELISA结果表明，免疫后的小鼠血清能够识别人VEGF，而免疫前血清则不能识别人VEGF(附图7)。这表明，包含“PHQGQ”核心Loop区的4号候选表位“PHQGQHI”的确为人VEGF的抗原表位。

为了保证选择的表位能够更好地模拟人VEGF中相应的天然表位，我们增加了“PHQGQ”核心序列两侧的序列，整个表位序列为“QIMRIKPHQGQHIGEM”，以此表位序列构建人VEGF表位疫苗。

实施例2：人VEGF表位疫苗表达载体的构建、表达与纯化

将人源单域抗体BT32/A6(Journal of Biology Chemistry 2001，276：24774-24780)，进行骆驼化改造，即将人源单域抗体BT32/A6的FR2的第9、第10和第12位氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，其序列如SEQ ID NO：9所示，(见附图8，其中双划线部分为框架区2(FR2)；加框部分为骆驼化改造后的氨基酸；单下划线部分为CDR3区)。

用人VEGF抗原表位序列“QIMRIKPHQGQHIGEM”替换附图8中的CDR3区的“DRLKVEYYDSSGYYVSRFGA”氨基酸序列，从而形成一种新的蛋白质的氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，(如附图9，其中双划线部分为人VEGF抗原表位的氨基酸序列)。此新蛋白序列即人VEGF表位疫苗的氨基酸序列。

将人VEGF表位疫苗的氨基酸序列通过反翻译程序转换为其基因编码序列(http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)，合成人VEGF表位疫苗的编码基因，其序列如SEQ ID NO：11所示，(如附图10，其中下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点)。

上述人VEGF表位疫苗的基因编码序列及其两侧的Bam HI和Xho I酶切位点序列由北京英茂盛业生物科技有限公司进行合成，并连接到pUCE载体中，命名为pUCE-VE3。

将合成后的全长序列用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：

将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，冰浴上放置30min，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却2min，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基500μl，37℃震荡培养45min；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃温箱中培养过夜，次日挑取3～5个单菌落至Kan抗性的的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD₆₀₀达到0.5时，加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，电泳分析表达情况，保留表达量大的重组克隆。

经电泳分析，表达的人VEGF表位疫苗以包涵体的形式存在。

将包涵体用磷酸缓冲液、0.5％Triton X-100、1mol/L NaCl和2mol/L尿素洗涤后，用8mol/L尿素裂解，裂解上清用用Ni²⁺亲和柱纯化。具体纯化步骤为：

将Ni²⁺亲和层析柱用20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液(平衡缓冲液)平衡后，将包涵体裂解上清上样品，上样完毕用平衡缓冲液洗去不结合的杂蛋白，然后，用溶解于平衡缓冲液中的10mmol/L咪唑进行充分洗脱，然后，再用溶解于平衡缓冲液中的100～200mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。将目的蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。

将纯化后的处于8mol/L尿素中的变性的人VEGF表位疫苗进行复性，具体复性条件为，在4℃条件下，用复性缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)进行4倍稀释，使蛋白质终浓度维持在100～150μg/ml，4℃放置24小时后，将复性样品用复性缓冲液充分透析，以去除残留的尿素。

将复性后样品浓缩、过滤除菌，即得到人VEGF表位疫苗，并用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。分装后，4℃保存备用。

实施例3：人VEGF表位疫苗免疫效果分析

用实施例2中所获得的人VEGF表位疫苗免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠5只，观察疫苗免疫效果。

免疫剂量为50μg/只，免疫部位为腹腔，免疫程序为第0、14、21、35天。第一次免疫采用福氏完全佐剂，第二、三次免疫采用福氏不完全佐剂，最后一次免疫不加佐剂。最后一次免疫后7天，取血，检测疫苗免疫效果。

将5只动物的免疫前血清和免疫后血清均作10000倍稀释，然后，采用ELISA方法检测其对人VEGF的识别，人VEGF的包被浓度为2μg/ml。检测结果表明，经过4次免疫，5只小鼠均产生了较高滴度的抗人VEGF的抗体(附图11)。

实施例4：人VEGF表位疫苗免疫血清的中和活性分析

通过protein G亲和层析柱纯化实施例3中得到的免疫动物血清中的抗体。首先，将免疫血清用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)进行5倍稀释，过滤，备用。

用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)充分平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱(Protein G 1ml，GE)。取待纯化的样品30ml上柱，流速为0.5ml/min，上样品完毕，用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)充分平衡，然后，用0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.7)将抗体洗脱下来，洗脱下来的样品用1mol/LTris调pH至7.0。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后的抗体浓度为1000μg/ml。

将纯化的抗体与等体积的0μg/ml和100μg/ml的人表皮生长因子溶液混合，37℃孵育1小时。将2组样品分别加入培养在96孔培养板中的已预培养12小时的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，继续培养24小时，加入MTT，用酶标仪测定各孔的OD₅₇₀值。

结果显示，单纯加入人VEGF的细胞增殖较好，抗体中和组细胞生长状态较差，二者有显著性差异(附图12)。这说明，来源于抗血清中的抗体的确具有中和人VEGF的活性，也就说明了人VEGF表位疫苗中的抗原表位“QIMRIKPHQGQHIGEM”的确是人VEGF的抗原表位，而且是一种中和性抗原表位。

实施例5：人VEGF表位疫苗的抗肿瘤效果分析

根据人VEGF的cDNA序列，参考有关文献，设计、合成人VEGF上、下游引物P-up和P-dh：

P-up：5′-GGGGATCCGCCGCCAGCCAACTTTCTGCTGTCTTG-3′(BamH I)

P-dn：5′-CCGAATTC CCGCCTCGGCTTGTCAC-3′(EcoR I)

其中，上游引物中，在起始密码子ATG之前，添加了KOZAK序列，以有利于人VEGF在真核细胞中的表达。

用PCR方法从人胎脑cDNA文库中，克隆出全长的含有信号肽编码区的人VEGF cDNA。PCR条件为：在PCR仪上反应30循环，每个循环的条件为：94℃30秒，55℃45秒，72℃1分30秒。PCR结束后，将PCR产物进行电泳，得到分子大小为590bp左右的条带。将PCR产物连到T载体中(pT-sVEGF)，经测序表明，序列完全正确。

将克隆到的含有信号肽编码区的人VEGF cDNA酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建分泌型人VEGF真核表达载体pcDNA-hVEGF。具体酶切、连接的条件如下：

将pT-sVEGF用BamH I(Takara)和EcoR I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：

37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳VEGF基因片段。

将pcDNA3.1(+)载体同样用BamH I(Takara)和EcoR I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：

37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收pcDNA3.1(+)载体的大片段。

将回收的VEGF基因片段和回收的pcDNA3.1(+)载体大片段在16℃水浴连接过夜，体系如下：

将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却5分钟，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基700μl，37℃震荡培养50分钟；之后，将菌液涂布到含有Amp抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃培养箱中培养过夜，次日挑取3～5个克隆进行测序鉴定。

取测序正确的克隆，提取质粒，保存，备用。

用pcDNA-hVEGF载体，用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)按照说明书要求转染H22小鼠肿瘤细胞，之后，用G418抗性筛选人VEGF稳定表达细胞，G418的浓度为100μg-1000μg/ml，通过逐渐增加培养基中的G418筛选出人VEGF稳定表达细胞，命名为hV-H22细胞。

取6～8周龄的Balb/c小鼠20只，按照随机均衡原则分为A、B两组，每组10只。A组小鼠用实施例2中所述的如SEQ ID NO：3所示的人VEGF表位疫苗免疫4次，免疫剂量为100μg/次，免疫部位为腹腔，第一次免疫用等体积福氏完全佐剂将疫苗充分乳化，第二、三次免疫用等体积福氏不完全佐剂将疫苗充分乳化，最后一次免疫不加佐剂。免疫周期为第1、14、21、28天。B组用等体积的生理盐水免疫，程序同A组。最后一次免疫后3天，给每只小鼠右侧腋下接种3×10⁶的hV-H22细胞，制备肿瘤模型，接种后第10天，可用手摸到肿瘤，第20天时，杀死动物，取肿瘤，测量肿瘤大小。

实验结果表明，注射人VEGF疫苗组动物肿瘤明显小于生理盐水对照组(附图13)，对照组和疫苗组的平均瘤重分别为5.46g和2.67g，疫苗对肿瘤的抑制率达到51％，说明人VEGF表位疫苗的确能够诱导动物产生针对人VEGF的中和性抗体，从而中和肿瘤细胞产生的人VEGF的活性，进而抑制肿瘤的生长，这表明，人VEGF表位疫苗可用于实体肿瘤的治疗。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种包含有人血管内皮生长因子抗原表位的蛋白，其特征在于，所述蛋白利用构建自人抗体、骆驼重链抗体或鼠抗体的单域抗体为分子骨架，并用如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的人血管内皮生长因子的抗原表位替换所述单域抗体的CDR3区。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述单域抗体的FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别被替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸。

3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10所示。

4.一种制备权利要求1-3任一所述的蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)确定骆驼重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列；

或

(1′)确定含轻链和重链的人抗体或鼠抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2(FR2)和CDR3区的序列，并将FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸；

(2)用如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的人血管内皮生长因子的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将该全长基因序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；

(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白即为权利要求1-3任一所述的包含有人血管内皮生长因子抗原表位的蛋白。

5.一种人血管内皮生长因子表位疫苗，其特征在于，所述表位疫苗包含权利要求1-3任一所述的蛋白。

6.权利要求1-3任一所述的蛋白在制备用于治疗或预防肝脏实体瘤的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的药物为疫苗。