CN102936234A - 一种制备脂肪酶抑制剂奥利司他的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分离工程技术领域，公开了一种制备脂肪酶抑制剂奥利司他的方法。该方法以发酵后的链霉菌菌丝体为原料，经过细胞破碎后恒温震荡提取制备后恒温震荡提取得到利普司他汀粗提物，利普司他汀粗提物氢化得到奥利司他粗品，经大孔树脂静止吸附、梯度洗脱和浓缩干燥的过程得到奥利司他纯品。本发明工艺简单，生产周期短，生产成本低，所用试剂不会对环境造成污染，得率较高，适合于工业化生产，具有一定的社会、经济效益。
Description
技术领域
本发明属于分离工程技术领域，涉及一种制备奥利司他的方法，具体涉及一种利用混合溶剂超声波法初提链霉菌菌丝体中的利普司他汀，将利普司他汀粗提物氢化后，利用大孔树脂提取得到奥利司他纯品的方法。
背景技术
伴随着科技的飞速发展、物质生活条件的改善和丰富膳食的获得，肥胖症已逐渐成为当今世界一大多发性疾病。当人体进食热量多于消耗热量时，多余热量以脂肪的形式储存于体内，久而久之造成肥胖。无明显病因可寻者成为单纯性肥胖，具有明确病因者称之为继发性肥胖。随着人们物质生活水平的不断提高，单纯性肥胖正逐渐成为一种较为常见的病症。不仅影响美观而且可能诱发多种疾病如非胰岛素依赖型糖尿病、心脏病、脑血管疾病、呼吸系统疾病、某些癌症。因此对它的防治有着十分重要的临床意义。科学家们从未停止过对新的安全性较高的治疗肥胖药物的研究和开发。目前，应用的减肥药主要分为食欲抑制剂、产热剂、消化吸收阻滞剂、激素调控剂四大类。
利普司他汀是Stretomyces toxytricini(毒三素链霉菌)的代谢产物，能选择性抑制肠道中的胰脂肪酶的活性，减少脂肪的水解和吸收；其四羟基衍生物奥利司他已被Roche公司开发为减肥药物，于1997年得到美国FDA认证。目前已在全球100多个国家上市，拥有900多万的使用者，占全球2/3的减肥药市场份额。是目前上市的减肥药物中，唯一一个作为非中枢神经系统作用上市的治疗肥胖症的药物。奥利司他是一种安全的肥胖治疗药物，不仅可以减轻患者体重，而且可以改善血脂浓度、降低血压、改善血糖控制、降低患心血管等疾病的危险；该药物可降低吸收大约30%的脂肪，确保患者能减轻体重。人体对奥利司他的吸收率低于1%，因此不会引起全身性副作用；奥利司他抑制食物中脂肪的吸收，会导致油样便，服用者的轻重程度随饮食中脂肪含量的不同而不同，患者可通过调整饮食结构，减少脂肪的摄入量。
正是由于奥利司他具有高效、安全、毒副作用小等优点，在中国上市的短时间内，市场份额迅速上升，已成为减肥药品市场的一线产品，课题组通过大量的实验研究，确定了应用大孔树脂提取利普司他汀及制备奥利司他的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用超声波法初提链霉菌菌丝体中的利普司他汀，将利普司他汀粗提物氢化后，利用大孔树脂及混合洗脱溶剂提取得到奥利司他纯品的方法。
为达到上述目的，可通过如下技术方案实现：
一种制备奥利司他的方法，包括以下几个步骤：
A、将链霉菌发酵后得到的利普司他汀产生菌菌丝体，清洗后悬浮在萃取剂中，控制pH值在4.0~9.0之间进行微生物细胞破碎，得到含有利普司他汀的混合物；
B、将含有利普司他汀的混合物振荡提取，得到含有利普司他汀的提取液；
C、将含有利普司他汀的提取液离心，收集上清液，将上清液减压浓缩至无液体，得到利普司他汀粗提品；
D、将利普司他汀粗提品溶于溶剂中，在钯催化剂作用下进行催化加氢得到奥利司他，重结晶得到奥利司他粗品；
E、用溶剂溶解奥利司他粗品，采用大孔树脂静止吸附2~5h，再用两种洗脱剂共同进行梯度洗脱，最后浓缩干燥后得到奥利司他纯品。
本发明中的原料利普司他汀产生菌菌丝体，是利用链霉菌发酵生产利普司他汀发酵液中的菌丝体，本发明对链霉菌的种类并无具体要求，只要是能够发酵生产利普司他汀的链霉菌都可以应用。作为举例，本发明的实施例中采用购自美国农业研究菌种保藏中心的链霉菌Stretomyces toxytricini NRRL 15443的发酵液。
步骤A中，采用超声仪进行微生物细胞破碎。
其中的萃取剂为甲醇、乙醇、甲醇水溶液、乙醇水溶液、氯化钠与甲醇、氯化钠与乙醇或其水溶液，其中甲醇或乙醇体积浓度为10%~100%（100%即纯溶剂），氯化钠的浓度为0.01~0.1mol/L，优选0.03~0.09mol/L。
其中利普司他汀产生菌菌丝体与萃取剂的质量体积比为1：10~200g/mL，优选1：10~100g/mL，进一步优选1：10~50g/mL。
步骤A中菌丝体的清洗可直接采用去离子水。
步骤B中，优选采用摇瓶柜进行振荡提取，调节摇瓶柜的温度10~20℃（优选15℃），转速100~300rpm（优选180rpm），提取时间为1.0~4.0h。
步骤C中，提取液在1~10℃、3000~5000r/min下离心2~30min进行提取，优选的离心条件为：4℃、4000r/min、10min。离心得到的上清液在15~25℃下减压浓缩，优选在20℃下减压浓缩。
步骤D中，用于溶解利普司他汀粗品的的溶剂选自甲醇或乙醇中的一种或两种。
步骤E中，用于溶解奥利司他的溶剂选自甲醇或氯化钠的甲醇水溶液；所述氯化钠甲醇水溶液中氯化钠的浓度为0.03~0.09mol/L，甲醇体积分数为30%~70%，优选40%~60%。
步骤E中，采用大孔树脂进行静止吸附，其中大孔树脂优选采用大孔树脂D101、安伯莱特XAD-2大孔树脂或安伯莱特XAD-16大孔树脂。大孔树脂在使用前可先按常规处理方法进行预处理。
步骤E中溶解奥利司他的溶剂选自甲醇、氯化钠的甲醇水溶液；所述氯化钠甲醇水溶液中氯化钠的浓度为0.03~0.09mol/L，甲醇体积分数为30%~70%，优选40%~70%。
步骤E中在用大孔树脂进行静止吸附前，先采用溶剂对大孔树脂进行平衡，该溶剂可采用甲醇、氯化钠的甲醇溶液、氯化钠的甲醇水溶液；所述氯化钠的甲醇溶液和氯化钠的甲醇水溶液中，氯化钠的浓度为0.01~0.1mol/L，优选0.03~0.09mol/L；所述氯化钠的甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30%~90%，优选40%~70%。
步骤E中的两种洗脱剂选自：①甲醇体积分数30%~90%的甲醇水溶液、②氯化钠浓度为0.01~0.1mol/L及甲醇体积分数为30%~90%的氯化钠甲醇水溶液、③氯化钠浓度为0.01~0.1mol/L及乙醇体积分数为30%~90%的氯化钠乙醇水溶液、④乙醇体积分数30%~90%的乙醇水溶液中的任意两种，两种洗脱剂的体积比为1:9~9:1。优选条件下，洗脱剂①与洗脱剂④不同时使用。其中洗脱剂②优选采用氯化钠摩尔浓度为0.03~0.09mol/L及甲醇体积分数为40%~70%的氯化钠甲醇水溶液，洗脱剂③优选采用氯化钠摩尔浓度为0.03~0.09mol/L及乙醇体积分数为35%~65%的氯化钠乙醇水溶液。
有益效果：利用该提取方法制备奥利司他，具有工艺简单、生产周期短、提取率高、操作简单和生产成本低等特点，所用试剂不会对环境造成污染，得率较高，易于实现工业化，为脂肪酶抑制剂利普司他汀的生产提供了可行的制备工艺，具有一定的社会、经济效益。
具体实施方式
实施例中的原料利普司他汀产生菌的菌丝体采用链霉菌Stretomyces toxytriciniNRRL 15443（购自美国农业研究菌种保藏中心）按现有发酵制备利普司他汀的方法进行发酵。
实施例1
新鲜培养的利普司他汀产生菌的菌丝体，取1g湿菌体，用去离子水清洗，悬浮在30mL乙醇中，乙醇的体积浓度为70%，pH为6.5，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有利普司他汀的混合物，
将破碎后的混合物，用HYG-Ⅱa型摇瓶柜振荡（调节摇瓶柜的温度15℃，转速180rpm）提取2h，得到含有利普司他汀的提取液，
然后将含有利普司他汀的提取液在4℃、4000r/min离心10min，收集含有利普司他汀的上清液，将上清液在20℃下减压浓缩至无液体，得到利普司他汀粗提品。
将利普司他汀粗品溶于甲醇，在钯催化剂作用下进行催化加氢得到奥利司他，重结晶得到奥利司他粗品；
将大孔树脂D101按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用氯化钠浓度为0.06mol/L、甲醇浓度70%的甲醇水溶液以60mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。奥利司他粗品溶解在10mL甲醇中，放在柱子的顶端，静止吸附2小时，用0.5L的洗脱剂（甲醇60%/氯化钠浓度为0.09mol/L、甲醇60%的甲醇水溶液的体积比为1：9）梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到81%。
实施例2
新鲜培养的利普司他汀产生菌的菌丝体，取1g湿菌体，用去离子水清洗，悬浮在10mL乙醇中，乙醇的体积浓度为10%，pH为4.0，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有利普司他汀的混合物，
将破碎后的混合物，用HYG-Ⅱa型摇瓶柜振荡（调节摇瓶柜的温度15℃，转速180rpm）提取1h，得到含有利普司他汀的提取液，
然后将含有利普司他汀的提取液在4℃、4000r/min离心10min，收集含有利普司他汀的上清液，将上清液在30℃下减压浓缩至无液体，得到利普司他汀粗提品。
将利普司他汀粗品溶于乙醇，在钯催化剂作用下进行催化加氢得到奥利司他，重结晶得到奥利司他粗品。
将安伯莱特XAD-16按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用甲醇40%氯化钠浓度为0.09mol/L的甲醇水溶液以60mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。奥利司他粗品溶解在氯化钠摩尔浓度为0.06mol/L、甲醇体积分数为50%的氯化钠甲醇水溶液中，放在柱子的顶端，静止吸附3小时，用2.0L的洗脱剂（氯化钠摩尔浓度为0.05mol/L及甲醇体积分数为60%的氯化钠甲醇水溶液/氯化钠浓度为0.09mol/L、乙醇60%的乙醇水溶液，体积比为5：5）梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到42%。
实施例3
新鲜培养的利普司他汀产生菌的菌丝体，取1g湿菌体，用去离子水清洗，悬浮在30mL分析纯乙醇中，pH为9.0，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有利普司他汀的混合物，
将破碎后的混合物用HYG-Ⅱa型摇瓶柜振荡（调节摇瓶柜的温度15℃，转速180rpm）提取2h，得到含有利普司他汀的提取液，
然后将含有利普司他汀的提取液在4℃、4000r/min离心10min，收集含有利普司他汀的上清液，将上清液在50℃下减压浓缩至无液体，得到利普司他汀粗提品。
将利普司他汀粗品溶于乙醇，在钯催化剂作用下进行催化加氢得到奥利司他，重结晶得到奥利司他粗品。
将安伯莱特XAD-2按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用氯化钠浓度为0.03mol/L的甲醇（分析纯）溶液以60mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。奥利司他粗品溶解在氯化钠甲醇水溶液中，氯化钠摩尔浓度为0.06mol/L、甲醇体积分数为40%，放在柱子的顶端，静止吸附1小时，用1.0L的洗脱剂（氯化钠浓度为0.06mol/L、甲醇40%的甲醇水溶液/氯化钠摩尔浓度为0.04mol/L及乙醇体积分数为55%的氯化钠乙醇水溶液，体积比为5：5）梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到50%。
Claims (10)
1.一种制备脂肪酶抑制剂奥利司他的方法，其特征在于包括以下几个步骤：
A、将链霉菌发酵后得到的利普司他汀产生菌菌丝体，清洗后悬浮在萃取剂中，控制pH值在4.0~9.0之间进行微生物细胞破碎，得到含有利普司他汀的混合物；
B、将含有利普司他汀的混合物振荡提取，得到含有利普司他汀的提取液；
C、将含有利普司他汀的提取液离心，收集上清液，将上清液减压浓缩至无液体，得到利普司他汀粗提品；
D、将利普司他汀粗提品溶于溶剂中，在钯催化剂作用下进行催化加氢得到奥利司他，重结晶得到奥利司他粗品；
E、用溶剂溶解奥利司他粗品，采用大孔树脂静止吸附2~5h，再用两种洗脱剂共同进行梯度洗脱，最后浓缩干燥后得到奥利司他纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述萃取剂为甲醇、乙醇、甲醇水溶液、乙醇水溶液、氯化钠与甲醇水溶液、氯化钠与乙醇水溶液，其体积浓度为10%~100%；利普司他汀产生菌菌丝体与萃取剂的质量体积比为1：10~200g/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中采用超声仪进行微生物细胞破碎。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B中采用摇瓶柜进行振荡提取，调节摇瓶柜的温度10~20℃，转速100~300rpm，提取时间为1.0~4.0h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中提取液在1~10℃、3000~5000r/min下离心2~30min进行提取；所述上清液在15~25℃下减压浓缩。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D中的溶剂选自甲醇或乙醇中的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤E中溶解奥利司他的溶剂选自甲醇、氯化钠的甲醇水溶液；所述氯化钠甲醇水溶液中氯化钠的浓度为0.03~0.09mol/L，甲醇体积分数为30%~70%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤E中所述大孔树脂为大孔树脂D101、安伯莱特XAD-2大孔树脂或安伯莱特XAD-16大孔树脂。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤E中在用大孔树脂进行静止吸附前，先采用溶剂对大孔树脂进行平衡，该溶剂可采用甲醇、氯化钠的甲醇溶液或氯化钠的甲醇水溶液；所述氯化钠的甲醇溶液和氯化钠的甲醇水溶液中，氯化钠的浓度为0.01~0.1mol/L；所述氯化钠的甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30%~90%。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤E中所述两种洗脱剂选自甲醇体积分数30%~90%的甲醇水溶液、乙醇体积分数30%~90%的乙醇水溶液、氯化钠浓度为0.01~0.1mol/L及甲醇体积分数为30%~90%的氯化钠甲醇水溶液、氯化钠浓度为0.01~0.1mol/L及乙醇体积分数为30%~90%的氯化钠乙醇水溶液中的任意两种，两种洗脱剂的体积比为1:9~9:1。
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