CN102935092A

CN102935092A - 新颖乳杆菌及其组合物和在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用

Info

Publication number: CN102935092A
Application number: CN2012104040189A
Authority: CN
Inventors: 吕英震; 谢丰钦
Original assignee: Genmont Biotech Inc
Current assignee: Genmont Biotech Inc
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2030-06-09
Also published as: CN102935092B

Abstract

本发明公开了新颖乳杆菌、及其组合物以及在改善糖尿病症状及其并发症方面的用途，组合物包含有效量的选自于：罗伊氏乳杆菌GMNL-89、加氏乳杆菌GMNL-205、及罗伊氏乳杆菌GMNL-263中的至少一种乳杆菌，及药学上可接受的载体。其中加氏乳杆菌GMNL-205、及罗伊氏乳杆菌GMNL-263为新颖乳杆菌。本发明的组合物或新颖乳杆菌具有用于改善糖尿病症状及其并发症的新颖用途。

Description

新颖乳杆菌及其组合物和在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用

本申请是申请号为：201010205942.5，申请日为：2010年6月9日，发明名称为：新颖乳杆菌及其组合物和在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及新颖乳杆菌及其组合物，以及该新颖乳杆菌和组合物在制备改善糖尿病相关症状及其并发症药物中的应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种多病因性的代谢疾病，是由于胰岛素分泌或作用产生缺陷而引起广泛性代谢障碍，所引起的疾病。糖尿病是以持续性慢性高血糖为主要特征的疾病，且亦会造成体内蛋白质、脂肪、水、电解质等代谢失调。

临床上将糖尿病主要分成二类：

第一型：胰岛素依赖型糖尿病(Insulin-dependent diabetic mellitus，IDDM)，一般发作年龄为30岁以下者居多，因此过去曾称为″青幼年发病型糖尿病″，事实上任何年龄皆可能发生。第一型糖尿病是一种自身免疫系统对胰脏兰氏小岛(Islet of Langerhans)的β细胞进行攻击破坏的自体免疫疾病(AutoimmuneDisease)。原因与个人的基因遗传、环境因素中的病毒感染、或毒性物质破坏胰脏的β细胞、及自体免疫形成抗β细胞的抗体、及细胞免疫作用攻击β细胞有关。最后导致患者的胰脏无法正常分泌胰岛素，而极易发生酮酸血症，因此需注射胰岛素来治疗。

第二型：非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin dependent diabetic mellitus，NIDDM)，大多发生于40岁以后，患者多为体型较肥胖者，过去称为″成年型糖尿病″，但亦可能发生于年轻人，以家族型发病较为常见，此类型糖尿病在台湾占糖尿病总人口数的95％以上。此类型糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷，及胰岛素抗阻性(insulin resistance)所引起的；虽有部分患者胰岛素的分泌减少，但大多数患者分泌胰岛素的能力尚可，因此，大多靠饮食控制及口服降血糖药物控制血糖，而不需立即注射胰岛素治疗。此外，患者大多会伴随胰岛素抗阻性(insulinresistance)的症状。胰岛素抗阻性的形成主要是因胰脏兰氏小岛的β细胞过度地分泌胰岛素(hyperinsulinamia)，造成骨骼肌、脂肪组织及肝脏等周边组织对胰岛素的敏感性(insulin sensitivity)降低。因而减低了组织对葡萄糖的利用率，而造成高血糖的现象。此类型病程进展缓慢，因此，早期并无典型糖尿病症状，不易察觉。但常伴随糖尿病性大血管(如心肌梗塞、脑中风)、小血管(如肾脏、眼网膜及神经病变)等慢性并发症。

此外，在第二型糖尿病病患身上经常伴随着脂质代谢异常的情况，如血浆中三酸甘油酯(triglyceride，TG)浓度上升、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度下降以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度上升。这些症状会导致第二型糖尿病患者心血管疾病的风险。另，根据研究指出，严重糖尿病患者的肝脏血脂值清除能力会下降。当肝脏中三酸甘油脂以及低密度脂蛋白胆固醇不断累积后，肝细胞便会发生病变形成非酒精性脂肪肝进而严重影响肝功能。

目前用于治疗糖尿病的方式，除可施予胰岛素外，另分为非药物治疗与药物治疗两种。在非药物治疗方面，主要是通过饮食调控和运动的方式来加以治疗。而在药物治疗方面，主要目的是使不足的胰岛素上升、调降进食后的高血糖和改善胰岛素抗阻性等。目前用于治疗糖尿病的药物可分为：

(1)磺酰尿素类(Sulfonylurea)：此类药物主要作用机制为促进胰脏胰岛素的分泌，特别是加强胰脏β细胞对葡萄糖刺激而释放胰岛素的作用；常用的磺酰尿素类降血糖药物为佑尔康(glibenclamide，商品名：euglucon)，克吡噻(glipizide，商品名：minidiab)及岱蜜克龙(gliclazide，商品名：diamicron)。然而，此类药物除了已发现的副作用，诸如皮疹、搔痒外，其施用对象亦有其局限，如有严重的肝、肾功能障碍者、孕妇及哺乳者、对磺酰尿素类药物出现严重过敏者均不宜使用这类降血糖药物。

(2)α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)抑制剂：此类药物主要作用机制为抑制胰脏α-淀粉酶(α-amylase)及肠内α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的活性，进而抑制碳水化合物在肠道的分解及吸收，此类药物能有效的降低饭后血糖及胰岛素浓度，但副作用为腹胀或偶而腹泻、腹痛及呕心。

(3)噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione)衍生物：此类药物主要作用为增加细胞核内过氧化小体增生活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-gamma)的活性，进而加强了胰岛素的作用，使细胞内葡萄糖转移蛋白GLUT2及GLUT4增加，将葡萄糖运送至细胞内利用。临床上常使用曲格列酮(troglitazone，商品名：rezulin)、罗格列酮(rosiglitazone，商品名：avandia)、皮利酮(pioglitazone，商品名：actos)等；不过，值得注意的是曲格列酮(troglitazone)曾引起致命的肝毒性，因此，在英国上市(1997年10月)后二个月就被禁止使用。此外，噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione)衍生物也遭美国下令全面回收及禁用。

(4)双胍类(Biguanides)：双胍类药物为胍(guanidine)的衍生物，目前，双胍类降血糖药物多以metformin为主。此类药物本身不会刺激胰岛素的分泌，其控制血糖作用机制为以下五点：a.抑制食欲，因此优先使用于肥胖的第二型糖尿病人身上，使其进食减少、体重下降而改善胰岛素的作用、b.延缓肠道吸收葡萄糖、c.促进葡萄糖在肠道的厌氧性分解作用，进而增加葡萄糖在肠道中的利用，但可能会产生过多的乳酸盐(lactate)，易造成乳酸中毒、d.加强胰岛素在肝脏的作用，因此抑制肝脏的葡萄糖新生作用，减少葡萄糖从肝脏释出、e.促使贮藏于细胞内的葡萄糖转移蛋白GLUT4到细胞表面来参与输送工作，使细胞表面的葡萄糖转移蛋白量显著增加。此外，这类降血糖药物的副作用，如初服可能有肠胃道的不适，如厌食，恶心、呕吐或腹泻等，少数人可能出现皮疹，且长期使用后均可能会有失活的现象发生。

乳杆菌用途甚广，除可用于制备发酵食品外，许多研究亦发现乳杆菌具有多种有益的功能，诸如：1.分泌各种分解酵素，帮助食物分解，提高营养价值、2.分解乳糖，改善乳糖不耐症、3.分泌维生素B群、4.维持肠道内正常微生物菌相，抑制有害菌作用、5.改善腹泻或便秘、6.增强免疫系统功能、7.改善肝功能，减低肝的损伤、8.降低血胆固醇、9.具抗癌性及抗致突变性等功能。由于乳杆菌对于宿主有许多有益的功效，因此，乳杆菌对于改善慢性疾病的功能方面也越来越多研究被报导，而糖尿病也是其中之一。此外，用乳杆菌喂食大鼠可以延缓改善糖尿病的发生。现今一些文献或专利中指出喂食糖尿病老鼠乳杆菌可有效的预防糖尿病以及降低血糖的浓度。但是目前已发表有关于乳酸菌改善糖尿病的文献或专利内容中，也仅局限于控制血糖值、体重、血中脂值以及胆固醇浓度。对于其他糖尿病所可能引发的并发症，如体内的发炎反应以及肝脏功能衰退，没有更进一步的改善作用。

发明内容

本发明发明人鉴于糖尿病是需要病患配合、且长期治疗及控制的慢性疾病，且现今糖尿病药物的多种副作用及使用限制。因此，本案申请人希望能利用本土性的乳杆菌菌株，开发出改善糖尿病症状的产品，可在日常生活中供一般使用者或糖尿病患者使用，除由于乳杆菌本身多种有益功能、无副作用外，更可供一般使用者或患者同时改善、控制、治疗或预防高血糖、高胆固醇等糖尿病相关的症状及可能的并发症。

本发明的目的即在于提供一种用于改善糖尿病症状的组合物，包含有选自于一已知菌种：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，及二株新颖菌种：加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205、及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-263中的至少一种乳杆菌。

本发明的次一目的在于提供新的乳杆菌，该新菌株分别经与已知相对所属菌种的关系具有明显差异，为二株新颖乳杆菌。

本发明的另一目的在于提供一株已知乳杆菌，及二株新颖乳杆菌的新用途，这些分离株可供罹患糖尿病的对象使用，用以改善其糖尿病症状及其并发症。

本发明的再一目的在于提供一种用于改善糖尿病症状及其并发症的组合物的应用，该类应用包含食品、饮品、健康食品、添加物、医疗组合物等日常生活易于使用的形式，以供一般服用者、或慢性病糖尿病患，可易于长期服用，以达日常保健、或病情控制之效。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于改善糖尿病症状及其并发症的组合物，包含有效量的选自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263中的至少一种乳杆菌，及药学上可接受的载体。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，其保藏编号为CCTCCNO：M207154；加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205；加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205的保藏编号为CCTCC NO：M209262；及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263的保藏编号为CCTCC NO：M209263。

其中该加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205、及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263经中国典型培养物保藏中心进行细菌学名鉴定，及基因图谱分析后，确认为二株新颖的乳杆菌。

将本发明所筛选到的新颖乳杆菌及已知的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-89菌株，分别进行糖尿病动物模式分析，以评估该些乳杆菌分离株是否具有改善糖尿病症状及其并发症的功效。结果显示，本发明所提供的三株乳杆菌分离株，均可改善患有糖尿病对象体内的高血糖值、高血糖值变化量、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高LDL/HDL比例、高IFN-γ量、高肝脏三酸甘油脂质浓度及高肝脏胆固醇浓度等糖尿病症状，进而改善糖尿病及其相关并发症。

本发明所筛选到的新颖乳杆菌及已知的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89菌株，除了有血糖值、血中脂肪以及胆固醇的改善效果之外，对于血中糖化血色素、血液中发炎细胞激素以及肝脏中脂值和肝功能指标GOT、GPT均有更进一步的改善效果。现有临床上治疗糖尿病的药物副作用均非常的大。相反的，乳杆菌则是安全无虞的益生菌(Generally Recognized As Safe，GRAS)。因此，利用乳杆菌开发成改善糖尿病的产品，是最自然健康的方法。

本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址在武汉大学)，保藏日期为2007年11月19日，保藏编号为CCTCC NO：M207154。

本发明的加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址在武汉大学)，保藏日期为2009年11月13日，保藏编号为CCTCC NO：M209262；本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-263，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址在武汉大学)，保藏日期为2009年11月13日，保藏编号为CCTCC NO：M209263。

附图说明

请参阅以下有关本发明较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：

图1为加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205在显微镜下的形态图；

图2为加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205的基因图谱；其中M代表分子标记(Molecular Marker)，分别以箭头指出各片段的分子量大小(bp)；

图3为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263在显微镜下的形态图；

图4为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263及GMNL-89的基因图谱；其中M代表分子标记(Molecular Marker)，分别以箭头指出各片段的分子量大小(bp)；

图5A为各组糖尿病大鼠每周体重纪录结果；图5B为各组糖尿病大鼠的脾脏重量测量结果；图5C为各组糖尿病大鼠的肝脏重量测量结果；图5D为各组糖尿病大鼠的肾脏重量测量结果；

图6A为各组糖尿病大鼠的每日血糖值纪录结果；图6B为各组糖尿病大鼠的血糖变化量分析结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(p＜0.05)；

图7A为各组糖尿病大鼠的糖化血红素(HbAlc)测量结果；图7B为各组糖尿病大鼠的总胆固醇浓度测量结果；图7C为各组糖尿病大鼠的LDL/HDL比例测量分析结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(p＜0.05)；

图8为各组糖尿病大鼠血清中发炎相关细胞激素IFN-γ浓度测量结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(p＜0.05)；

图9A为各组糖尿病大鼠的肝脏三酸甘油脂(liver triglyceride)测量结果；图9B为各组糖尿病大鼠的肝脏胆固醇(liver cholesterol)测量结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(p＜0.05)。

具体实施方式

本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。

本发明提供一种用于改善糖尿病症状的组合物，其包含有效量的至少一种选自于：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)GMNL-205或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263的乳杆菌，及药学上可接受的载体。

其中该罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89为一种公开的菌种(该菌种的特征及寄存资料已公开于中华民国专利申请案″具有抗发炎活性的乳杆菌分离株及其用途″，其公开号为：200944215)。本发明发明人通过糖尿病动物模式，发现其具有改善糖尿病症状的新用途或功能。

其中该加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205、及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263为本发明发明人所新发现的新的乳杆菌，经比对后该二株菌分别与各自所属物种中已公开的菌株不同，且经分析，该二分离株具有改善糖尿病症状及其并发症的新用途或功能。

前述三株乳杆菌，通过糖尿病动物模式分析，发现可有效改善、降低、控制、治疗及预防患有糖尿病的对象体内的高血糖值、高血糖值变化量、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高LDL/HDL比例、高IFN-γ量、高肝脏三酸甘油脂质浓度及高肝脏胆固醇浓度，进而改善其病情及其相关并发症。

其中该乳杆菌还包含其继代培养的后代，或突变株，但仍与本发明所述的菌种特性、基因体(genomic)、或用途(用于改善糖尿病症状)相同。

本发明所述组合物可包含，但不限于：食品、饮品、健康食品、动物饮水添加物、动物饲料添加物、动物用及人类用医疗组合物、食品添加物、饮料添加物等适用本发明的应用形式。

术语“改善”意思是，相较于未使用本发明的乳杆菌、或含其组合物者，使用本发明的乳杆菌、或含其组合物者，将可有效减缓、降低、控制、治疗或预防糖尿病症状及其相关并发症。术语“糖尿病症状”，包含但不限于：罹患有糖尿病的患者体内呈现高血糖值、高血糖值变化量、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高LDL/HDL比例、高IFN-γ量、高肝脏三酸甘油脂质浓度及高肝脏胆固醇浓度等糖尿病症状。

术语“有效量”意思为可有效改善、治疗、减弱或消除疾病(如：糖尿病)的一个或多个症状的活性成分有效量，或可称“治疗有效量”或“改善有效量”。术语″药学上可接受″意思为物质或组合物必须与调配物的其他成份相容，且对患者无害。

术语“糖尿病相关并发症”，包含但不限于：糖尿病性神经病(包含但不限于膀胱无力、腹胀、便秘、泻肚、阳萎、对冷热感觉差)、肾疾病(包含但不限于丝球体性肾炎、肾小球硬化症、肾病征候群、高血压性肾硬化、肾疾病末期、尿毒症)、发炎反应、心血管或胆固醇过高并发症(包含但不限于脑中风、心肌梗塞、冠状动脉栓塞、心绞痛、心衰竭、心律不稳、末梢血液循环不良、足部感染等)、眼疾(视网膜病变、白内障、青光眼、弱视(视力衰弱))、肝脏疾病(包含但不限于肝脏纤维化、脂肪肝、非酒精性脂肪肝、及肝硬化)。

本发明的组合物可利用熟习此技术的人所详知的技术，将上述的乳杆菌，与药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable vehicle)，制备成适用本发明组合物的剂型。其中该剂型包含但不限于：溶液(solution)、乳剂(emulsion)、悬浮液(suspension)、粉末(powder)、锭剂(tablet)、丸剂(pill)、口含锭(lozenge)、片剂(troche)、口嚼胶(chewing gum)、胶囊(slurry)以及其他类似或适用本发明的剂型。

其中该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、表面活性剂(surfactant)，及其他类似或适用本发明的载剂。

上述组合物中，亦可视需要适宜地添加一种或多种以上制剂领域内通常使用的溶解补助剂、缓冲剂、保存剂、着色剂、香料、风味剂等。

另一较佳实施例中，本发明所提供的前述组合物，可进一步添加可食性材料，以制备为一种食品产品或保健产品。其中该可食性材料包含，但不限于：水(water)、流体乳品(fluid milk products)、牛奶(milk)、浓缩牛奶(concentratedmilk)；发酵乳品(fermented milk)，诸如优酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷冻优格(frozen yogurt)、乳杆菌发酵饮料(lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；干酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；发酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruitjuices)；果汁(juices)；运动饮料(sports drinks)；甜点(confectionery)；果冻(jellys)；糖果(candies)；婴儿食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；动物饲料(animal feeds)；中草药材(Chinese herbals)；膳食补充品(dietary supplements)等。

此外，本发明所发现的新颖菌种，亦可与其他现有菌种一并被包含于组成物中。

其中该组合物，可进一步包含至少一种选自于下列群组中的现有益生菌：乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)、酵母菌(yeasts)。

其中该现有乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)包含但不限于：乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、双岐乳杆菌(lactobacillus bifidus)、乳酪乳杆菌(lactobacillus casei)、副乳酪乳杆菌副乳酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、或其组合。

其中该现有链球菌属物种(Streptococcus sp.)包含但不限于：乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酪链球菌(Streptococcus cremoris)、或其组合。

其中该现有双叉杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)包含但不限于：短型双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长型双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、或其组合。

其中该现有酵母菌(yeasts)包含但不限于：啤酒酵母菌(Saccharomycescereviseae)、乳酒假丝酵母菌(Candida kefyr)、弗罗

酵母菌(Saccharomycesflorentinus)、或其组合。

此外，本发明还提供一种用于改善糖尿病症状及其并发症的方法，系将有效量的前述组合物供患有糖尿病的对象使用，用以改善及降低其体内的高血糖值、血糖值变化量、糖化血红素比例、总胆固醇浓度、LDL/HDL比例、IFN-γ量、高肝脏三酸甘油脂质浓度、高肝脏胆固醇浓度以及肝功能指标GOT、GPT，进而改善糖尿病及相关并发症。

另，本发明亦提供前述乳杆菌用于制备改善糖尿病症状及其并发症组合物的方法或用途。

本发明所提供的组合物及其用于改善糖尿病症状及其并发症的方法，其投药路径，可视需求适宜调整，并未特别限定，较佳者为经口投予适用剂型。

本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所用的药物、生物材料皆市售易于取得，下列仅为示例可取得的渠道。

实施例1菌株挑选

本发明发明人由医院提供的健康成人的胃肠道检体中，分离百余株分离株，以建立分离株菌种库。从菌种库中挑选可调节免疫系统分泌高浓度的IL-10及IFN-γ的三株乳杆菌，挑选分析结果的前三名乳杆菌以进行糖尿病动物模式分析。该三株乳杆菌的寄存编号、寄存日期及菌株名称，如表1所示；其中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89为公开的菌种，其菌株特征、寄存证明、存活试验报告等证明文件正本及相关资讯，已包含于中华民国专利申请案(申请号：97115882；公开号：200944215)中；其中GMNL-205及GMNL-263为本发明新分离出的新乳杆菌。下以实施例2、3分述该二株乳杆菌的菌株特征、API鉴定系统分析、16S rDNA分析、基因图谱分析。

表1本发明的乳杆菌的寄存编号及寄存日期

实施例2加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205

2-1.加氏乳杆菌GMNL-205菌株的学名鉴定

将分离株GMNL-205委托中国典型培养物保藏中心进行细菌学名鉴定，分述如下：

分离株GMNL-205背景资料：

分离源：人体肠胃道

培养基：MRS

培养温度：37℃

病原性：无

请参阅图1及表2所示，分析结果显示分离株GMNL-205为革兰氏阳性杆菌，不具触酶、氧化酶及运动性，于好氧环境及厌氧环境下皆会生长。另，分离株GMNL-205的16S rDNA部分序列如SEQ ID NO：1所示，根据16S rDNA分析，分离株GMNL-205与Lactobacillus gasseri、Lactobacillus taiwanensis及Lactobacillus johnsonii较相似，相似度高达99％以上。再通过API鉴定系统分析(表2)，分离株GMNL-205最接近加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。因此，综合上述结果显示，分离株GMNL-205为加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。

表2分离株GMNL-205的API鉴定分析结果

-：Negative reaction；+：Positive reaction

2-2.加氏乳杆菌GMNL-205菌株的基因图谱分析

本发明通过随机扩增的多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)分析，以分析加氏乳杆菌GMNL-205菌株的基因图谱。其实验步骤简述如下：

A.菌株模板的制备：

将GMNL-205接菌于MRS培养皿上，放置37℃培养。从在37℃培养2天后的MRS培养皿中，于无菌环境中挑出单一菌落接种至1ml的MRS Broth，放置37℃培养16小时。将菌液以13000rpm，离心一分钟后，去除上清液。加入200μl无菌水充分与pallet混合均匀，以13000rpm，离心一分钟后，去除上清液，并重复此步骤一次。将已清洗完成的菌体沉淀物加入200μl无菌水充分均匀混合后，即可为进行菌株RAPD实验的模板。

B.RAPD分析：

利用primer Lac P2(5′-ATg TAA CgC C-3′，SEQ ID NO：3)来进行PCR反应，其PCR mixture的组成如表3所示：

表3PCR mixtrue的组成

PCR反应条件：先于95℃下反应10min后，开始进行35个循环：93℃下进行变性反应历时1min、36℃下进行引物退火历时1min、72℃下进行延长反应历时1min。最后于72℃下反应7min后，停止PCR反应，置于4℃。于PCR完成后，取6μl的PCR产物于2％琼脂糖凝胶(agarose gel)以进行电泳(electrophoresis)，电泳完毕后再以EtBr染色后，在UV灯下显影拍摄，针对照片进行分析该单一菌落的RAPD图谱。

C.实验结果

请参阅图2所示，可清楚显示GMNL-205特有的基因图谱，可用以辨识GMNL-205。

实施例3罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263

3-1.罗伊氏乳杆菌GMNL-263菌株的学名鉴定

将分离株GMNL-263委托中国典型培养物保藏中心进行细菌学名鉴定，分述如下：

分离株GMNL-263背景资料：

分离源：人体肠胃道

培养基：MRS

培养温度：37℃

病原性：无

请参阅图3及表4所示，分析结果显示，分离株GMNL-263为革兰氏阳性杆菌，不具触酶、氧化酶及运动性，于好氧环境及厌氧环境下皆会生长。另，分离株GMNL-263的16S rDNA部分序列如SEQ ID NO：2所示，根据16S rDNA分析，分离株GMNL-263与Lactobacillus reuteri最相似，相似度高达99％以上。再通过API鉴定系统分析(表4)，分离株GMNL-263最接近罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。因此，综合上述结果显示，分离株GMNL-263为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

表4分离株GMNL-263的API鉴定分析结果

-：Negative reaction；+：Positive reaction

3-2.罗伊氏乳杆菌GMNL-263菌株的基因图谱分析

本发明也通过RAPD分析，以分析罗伊氏乳杆菌GMNL-263菌株的基因图谱，其RAPD实验步骤请参阅实施例2中2-2.A至B所示，其中所分析的菌株分别为罗伊氏乳杆菌GMNL-263及罗伊氏乳杆菌GMNL-89。

实验结果

请参阅图4所示，可清楚显示GMNL-89与GMNL-263的基因图谱有很大的差异，根据此结果可说明，虽然GMNL-89与GMNL-263同为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，但此2种菌不是同一种菌株。

实施例4糖尿病动物模式

4-1.实验动物

自乐斯科生物科技购入5周龄的雄性SD大鼠，实验动物入室后等待适应一周后开始进行动物实验。整个实验过程中老鼠皆饲养于黑暗及光照时间各12小时且不限制进食或饮水的动物室，并且通过空调维持室温24±1℃以及室内相对湿度55％。本研究中对实验动物的处理及一切实验过程，均依据实验动物委员会的标准章程规范进行。

4-2.糖尿病造症方法

通过下述方法诱发大鼠为糖尿病动物模式：先配制citrate buffer(含有0.1Mcitrate acid以及0.1M sodium citrate)后，调整pH值到4.5。将链佐菌素(Streptozotocin，STZ)溶在citrate buffer中，将大鼠禁食24小时后，以腹腔注射的方法注射STZ溶液，注射剂量为65mg/kg。经STZ注射后3天，测量大鼠血糖，若血糖高于300mg/dL则视为造症成功。

实施例5乳杆菌分离株对于改善糖尿病及相关指标的效果评估

5-1.实验流程

将大鼠随机地分成六组，分组及各组的处理方式如表5所示。其中仅对照组，没有使用STZ来进行糖尿病造症，其他五组皆先以STZ造症成功后，才分别每天喂食逆渗透水(RO水，安慰剂组(placebo))、注射胰岛素(胰岛素组)、或喂食各乳杆菌分离株，经处理、喂食一个月后，将大鼠牺牲并采集血清，侦测血清中各种生化指标，以评估各乳杆菌分离株对改善糖尿病及相关指标的功效。

表5实验分组

组别	处理方-式(Treatment)

对照组	没有沒有腹腔注射STZ，每天喂食RO水1ml
		安慰剂组	有腹腔注射STZ，每天喂食RO水1ml
胰岛素组	有腹腔注射STZ，每天腹腔注射Insulin 7-10U/Kg
		GMNL-89组	有腹腔注射STZ，每天喂食乳杆菌分离株GMNL-892×10⁹cfu/天
GMNL-205组	有腹腔注射STZ，每天喂食乳杆菌分离株GMNL-2052×10⁹cfu/天
		GMNL-263组	有腹腔注射STZ，每天喂食乳杆菌分离株GMNL-2632×10⁹cfu/天

5-2.相关指标的测量：(皆以适用的现有技术进行相关的测量)

1.体重以及血糖纪录

实验期间，每天早晚各测量血糖一次，每周纪录体重一次。

2.检测血清中生化指标

血清生化值：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)，丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase)，天门冬氨酸转胺酶(aspartate aminotransferase)，γ-麸胺酰转移酶(γ-glutamyl transferase，γ-GP)，白蛋白(albumin)，胆红素(bilirubin，total)，肌酸酐(creatinine)，尿素氮(urea nitrogen)，葡萄糖(glucose)，磷(phosphorus)，钙(calcium)，氯(chloride)，钾(potassium)，钠(sodium)，蛋白质(protein，total)，三酸甘油脂，总胆固醇，HDL，LDL，C-反应蛋白(c-reactive protein，CRP)，糖化血色素(HbAlc)。

血球分类计数：全血球计数(CBC)。

3.检测细胞激素：用ELISA方法侦测血清中的IFN-γ浓度。

4.肝脏脂质的检测：

将动物处死取下肝脏右下最大叶，分别秤取0.25g肝脏放至2个组织均质机(Model：MICROMOT IB/E，PROXXON)专用的1.5ml微量离心管，各加入0.5ml萃取液(chloroform/methanol混合溶液2∶1v/v)，以组织均质机以转速10,000rpm均质约20秒后，再将此俩装满均质液的微量离心管倒入15mlFALCON离心管后，以微量分注器吸取1ml chloroform/methanol混合溶液(2∶1v/v)至各刚倒完萃取液的离心管清洗管壁残余组织后，再倒入上述15mlFALCON离心管中，最后加入chloroform/methanol混合溶液(2∶1v/v)7ml(总体积10ml)。取250μl肝脂质萃取液，加入250μl Triton X-100(sigma)，混合均匀后分析肝脏中总胆固醇、三酸甘油脂的含量。

5-3.统计方法

本发明所使用的统计方法，为student′s test。

5-4.结果

A.体重方面

请参阅图5A至图5D所示，经分别喂食乳杆菌分离株一个月后，相较于安慰剂组，各乳杆菌喂食组的糖尿病大鼠体重均无显著变化。而在肝脏、脾脏以及肾脏重量方面，各乳杆菌喂食组与安慰剂组相比亦无显著的差异。

B.血糖及其他离子方面

请参阅图6A及图6B所示，在血糖值方面，经分别喂食分离株GMNL-205或GMNL-263的糖尿病大鼠，其血糖变化量相较于安慰剂组有显著的降低。因此，经服食乳杆菌分离株GMNL-205或GMNL-263后，可有效降低糖尿病患者的高血糖值及血糖变化量。在血液中离子浓度方面(请参阅表6所示)，乳杆菌喂食组和安慰剂组相比，则无显著差异。

表6喂食GMNL-89，GMNL-205及GMNL-263一个月后，糖尿病大鼠血液中离子浓度的测量结果

C.血清生化值方面

请参阅图7A至图7C及表7所示，于血清生化值方面，经喂食分离株GMNL-205一个月后，糖尿病大鼠血清中糖化血色素(HbAlc)的浓度相较于安慰剂组显著的降低；经喂食分离株GMNL-89一个月后，糖尿病大鼠血清中总胆固醇浓度以及LDL/HDL比例相较于安慰剂组亦显著的降低；其余组别则无显著差异。在肝功能指标改善方面，经喂食分离株GMNL-89一个月后，糖尿病大鼠血清中GOT以及GPT的浓度相较于安慰剂组有下降的趋势。经喂食分离株GMNL-263一个月后，糖尿病大鼠血清中GPT的浓度相较于安慰剂组也有下降的趋势。

血色素于红血球寿命周期(平均约120日)中逐渐被血液中的血糖所糖化，因此，除了监测糖尿病患者的血糖值、血糖变化量外，HbAlC(糖化血色素Glycatedhemoglobin)亦广泛作为监控糖尿病患者血糖控制情形的指标。此外，许多研究指出糖尿病患，除了血糖浓度明显较高之外，临床上还会明显增加血胆固醇浓度，因此罹患心血管疾病的机会也会明显增加。综合上述结果证实，经服食乳杆菌分离株GMNL-205一个月后，将可有效降低糖尿病患者的糖化血色素值，反映出长期服食该乳杆菌分离株GMNL-205将可有效控制糖尿病患者体内的血糖变化情形。另，服食乳杆菌分离株GMNL-89一个月后，将可有效降低糖尿病患者的总胆固醇浓度以及LDL/HDL比例，进而降低糖尿病患者罹患心血管疾病或胆固醇过高的相关疾病或并发症的机会。

另，在血球分类计数方面(请参阅表8所示)，喂食乳杆菌组和安慰剂组均无显著差异。

D.细胞激素(cytokine)方面

请参阅图8所示，在血清中细胞激素浓度方面，经喂食乳杆菌分离株GMNL-263一个月后，乳杆菌喂食组相较于安慰剂喂食组，乳杆菌喂食组可显著降低糖尿病大鼠血清中的IFN-γ浓度。近年许多文献指出糖尿病与发炎反映息息相关，导致糖尿病患者常并发慢性发炎的情形。因此，本发明证实经服食乳杆菌分离株GMNL-263一个月后，除可有效调节改善糖尿病患者的血糖值外，将可有效降低糖尿病患者血清中的发炎相关细胞激素IFN-γ浓度，表示服食该些乳杆菌分离株将可有效改善糖尿病、发炎反应或相关并发症。

E.肝脏脂质方面

请参阅图9A所示，在肝脏中的三酸甘油脂浓度方面，喂食乳杆菌分离株GMNL-89或GMNL-263的糖尿病老鼠和对照组相比有下降的趋势。请参阅图9B所示，在肝脏中的胆固醇浓度方面，喂食乳杆菌分离株GMNL-89的老鼠与对照组相比有下降的趋势；而喂食乳杆菌分离株GMNL-263的老鼠，其肝脏中的胆固醇浓度和对照组相比具显著的下降。

由结果可知，服用本发明所提供的乳杆菌的糖尿病患者，相较于未服用者，将可有效降低肝脏中三酸甘油脂以及胆固醇浓度，进而减少发生非酒精性脂肪肝的风险。

上列详细说明系针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims

1.一种用于改善糖尿病症状及其并发症的组合物，其特征在于，所述组合物包括有效量的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263及药学上可接受的载体，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263的保藏编号为CCTCC NO：M209263。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述糖尿病指标包含高血糖值、高血糖值变化量、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高LDL/HDL比例、高IFN-γ量、高肝脏三酸甘油脂质浓度、高肝脏胆固醇浓度以及高GOT值、高GPT值。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括选自于下列益生菌中的至少一种：乳杆菌属物种(lactobacillus sp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacteriumsp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)和酵母菌(yeasts)。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含可食性材料，该可食性材料包括水、流体乳品、优酪乳、酸乳、冷冻优格、乳杆菌发酵饮料、奶粉、冰淇淋、乳酪、干酪、豆奶、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、婴儿食品、健康食品、动物饲料、中草药材或膳食补充品的一种或几种。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述液体乳品为牛奶。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述液体乳品为浓缩牛奶。

7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述豆奶为发酵豆奶。

8.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述果汁为蔬果汁。

9.一种新的乳杆菌，其特征在于，所述乳杆菌为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-263，其保存于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCCNO：M209263。

10.权利要求9所述的乳杆菌在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用。