CN102920526A

CN102920526A - 用于确定glp-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备及其应用

Info

Publication number: CN102920526A
Application number: CN2012104404467A
Authority: CN
Inventors: 陆颖理; 夏芳珍; 吴晖; 翟华玲; 杜世春; 孟盈; 许潇
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2013-02-13

Abstract

本发明提供一种用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备及其应用，所述设备包括动物代谢笼、尾部固定夹子；所述动物代谢笼内设有网格板，所述网格板将动物代谢笼分为上下两部分，动物代谢笼还设有进出代谢笼的门，动物代谢笼的侧壁上设有进水孔和尾巴伸出孔。本发明提供的设备适用于在不同动物体上测试GLP-1类似物在确定血糖调控机制，该设备使用方便，可以便捷、快速确定出2型糖尿病血糖调控机制。

Description

用于确定 GLP-1 类似物对 2 型糖尿病血糖调控机制的设备及其应用

技术领域

本发明涉及调控机制研究领域，尤其涉及一种用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备以及将该设备在血糖调控机制中的研究。

背景技术

21世纪以来2型糖尿病开始在全球范围流行，已然成为全球第四位疾病相关死亡原因，给世界各国带来巨大的经济负担。2型糖尿病是一种遗传和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性复杂疾病，以持续高血糖为显著特征。长期持续的血糖升高会导致视网膜、肾脏和神经病变等糖尿病微血管并发症以及大血管并发症，上述并发症的发生风险与高血糖的暴露时间显著相关。

2型糖尿病个体高血糖成因有多种机制，其中肝脏、肌肉以及脂肪细胞的胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是极为重要的原因，其原因如下：（1）肝脏抵抗，主要表现为肝糖产生及输出（Hepatic Glucose Production，HGP）增加，引起空腹高血糖，同时HGP的增加也是餐后血糖升高的重要原因之一。（2）肌肉抵抗，胰岛素介导的葡萄糖摄取、氧化代谢能力障碍，肌糖原生成及贮存减少。（3）脂肪抵抗，胰岛素抑制脂肪分解作用减弱，血游离脂肪酸（FFA）增高。而血浆高FFA水平又可同时促进肝糖产生过多，加重肝胰岛素抵抗。同时抑制肌细胞胰岛素介导的葡萄糖转运及肌糖原的合成，加重已有的肌肉抵抗。

研究表明，IR作为2型糖尿病的主要特征之一，在机体出现临床高血糖前就已经存在。当机体出现IR时，由于胰岛素的生物效应减低，机体不仅出现高血糖，也常伴有血脂紊乱。

近年来，对于2型糖尿病的研究不断深入，不断有GLP-1的类似物、衍生物和近似物等被合成或发现，例如中国CN1740198A、CN1951965A、CN1918177A中都披露了与GLP-1具有相当高相识度的物质。在对这些物质在正式应用在医疗中，都需要对其进行全方面的了解和研究。

在确定调制机制过程中，通常会根据GLP-1衍生物、近似物与GLP-1的相识度而选用测试方式和测试试剂，由于测试试剂品种多种多样，如果选用测试方法和测试试剂不对则该测试得出的结果是失败，但实际测试过程中多数结果是无效的。

发明内容

本发明针对现有技术中存在不足之处，提供适用于在不同动物体上测试GLP-1类似物在确定血糖调控机制的设备，使用该设备能方便，可以便捷、快速确定出2型糖尿病血糖调控机制。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备，所述设备包括动物代谢笼、尾部固定夹子；所述动物代谢笼内设有网格板，所述网格板将动物代谢笼分为上下两部分，动物代谢笼还设有进出代谢笼的门，动物代谢笼的侧壁上设有进水孔和尾巴伸出孔。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述进水孔和尾巴伸出孔分别设置在动物代谢笼的相对两个侧壁上。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述设备还包括尾部放置台，所述尾部放置台的上表面与尾巴伸出孔下表面平齐。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述动物代谢笼内网格板下方还设有台板。

在本发明提供的一优选实施例中，其中在动物代谢笼侧面设有卡口，所述网格板和台板通过该卡口插入并固定在动物代谢笼中。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述装置还包括动物保定器，所述动物保定器具有一端开口的筒状形状。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述动物保定器一端开口具有圆形或椭圆形的开口截面，所述开口截面中部向上凸出或向下凹进。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述尾部固定夹子包括相对的两个夹片，所述夹片中间部具有圆弧形凹部，夹片两端设有连接固件。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述圆弧形凹部内侧面铺设有弹性垫子。

在本发明提供的一优选实施例中，其中所述设备还包括用于插入动物尾部的尾静脉的静脉留置针。

本发明提供的设备适用于在不同动物体上测试GLP-1类似物在确定血糖调控机制，该设备使用方便，可以便捷、快速确定出2型糖尿病血糖调控机制。

附图说明

图1是本发明提供设备中动物代谢笼的结构示意图。

图2是本发明提供设备中尾部固定夹子的结构示意图。

图3是本发明提供设备中动物保定器的侧视图。

图4是大鼠灌流流程示意图。

图5是Exenatide/对照液干预8周后，各组大鼠空腹胰岛素、HOMA-IR和胰岛素敏感指数比较图。

图6是Exenatide治疗7周后，大鼠腹腔葡萄糖耐量对照试验曲线图。

图7是Exenatide治疗7周后，大鼠腹腔胰岛素耐量对照试验曲线图。

图8是葡萄糖总离子流色谱图。

图9是甲氧胺+硅烷化处理过的葡萄糖的质谱图。

图10是葡萄糖标准曲线。

图11是甘油总离子流色谱图。

图12是硅烷化处理过的甘油的质谱图。

图13是甘油标准曲线。

图14是甘油更新及糖异生相关参数。

图15是高胰岛素正糖钳夹稳态葡萄糖代谢相关参数。

具体实施方式

本发明提供适合在不同动物体上测试GLP-1类似物在确定血糖调控机制的设备，可以便捷、快速确定出2型糖尿病血糖调控机制。

以下大鼠为实验对象，通过实施例对本发明提供的设备作进一步详细的说明，以便更好理解本发明创造的内容，但实施例的内容并不限制本发明创造的保护范围。

实验设备

用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备包括动物代谢笼1、动物保定器3、尾部固定夹子2。如图1所示的动物代谢笼，动物代谢笼1中内从上往下分别设有网格板11和台板12，网格板11和台板12通过设置在动物代谢笼侧面的卡口，插入并固定在动物代谢笼中。在动物代谢笼上设有进去代谢笼的活动门15，动物代谢笼的侧壁上设有进水孔13和尾巴伸出孔14，所述进水孔和尾巴伸出孔分别设置在动物代谢笼的相对两个侧壁上。在进行动物的示踪灌流时，实验动物置于动物代谢笼1中，动物的尾部从尾巴伸出孔14内伸出。伸出的尾部放置在尾部放置台18上，尾部放置台18的上表面与尾巴伸出孔14下表面平齐。

如图2所示的尾部固定夹子2，该固定夹子2用于固定插入静脉留置针处的动物尾部。尾部固定夹子2由相对称形状的夹片21组成，在夹片21中间部具有圆弧形凹部，夹片21两端设有连接固件23。圆弧形凹部内侧面铺设有弹性垫子22，弹性垫子22用于保护动物的尾部不会被固定夹子夹伤。如图3所示的动物保定器3，该动物保定器3具有圆柱形的容器侧壁，顶部具有椭圆形的开口截面31，底部设有动物透气通孔32。动物保定器3一端开口具有圆形或椭圆形的开口截面，所述开口截面中部向上凸出或向下凹进。

将实验用的动物置于保定器内，防止实验过程中动物乱动。在进一步的实施例中，在整个设备中还包括用于插入动物尾部的尾静脉的静脉留置针，静脉留置针插入动物的尾部尾静脉中用于示踪灌流。

实验溶液配置

配置下列用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的试剂，包括链脲佐菌素注射液、磷酸盐缓冲溶液、闪烁液和衍生化试剂。其中，链脲佐菌素注射液中含有链脲佐菌素、柠檬酸和柠檬酸钠。所述磷酸盐缓冲溶液中含有氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠和无水磷酸二氢钾。所述闪烁液中含有b-PBD；所述衍生化试剂中含有甲氧基胺盐酸盐

链脲佐菌素注射液配制：将取一定量柠檬酸和柠檬酸钠，将其加入双蒸水中配置成柠檬酸缓冲液，将柠檬酸缓冲的pH值调节至4.5，用高压蒸汽消毒，保存在4℃冰箱备用。待需要使用时，称取的链脲佐菌素加入之前配置的柠檬酸缓冲液中混合，充分搅拌后即配置成链脲佐菌素注射液。

磷酸盐缓冲溶液（PBS）配制：取一定量氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠和无水磷酸二氢钾加入双蒸水中，用高压蒸汽消毒，保存在4℃冰箱备用。其中加入各物质的重量为氯化钠 7~9份、氯化钾 0.1~0.3份、十二水合磷酸氢二钠 3~4份、无水磷酸二氢钾0.2~0.4份。

闪烁液配制：用微量分析天平称取适量闪烁物质溶于二甲苯中，轻轻振荡混匀，室温保存备用。优选用b-PBD作为闪烁物质，配制的b-PBD闪烁液的浓度为0.6~1.2%。

衍生化试剂配制：用微量分析天平称取适量衍生化物质溶于吡啶中，轻轻振荡混匀，室温保存备用。优选用甲氧基胺盐酸盐（Methoxyamine hydrochloride，MOX），配制的MOX）衍生化试剂中MOX的浓度为94~96%。

以下通过将上述试剂应用在确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制中，来详细说明该试剂在确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制中的应用，以下GLP-1类似物以艾塞那肽（Exenatide）为例子。

大鼠建模

以大鼠为实验对象，以便更好说明本发明提供的设备。选用28只平均体重在123.5±8.5 g 左右的SPF级雄性SD大鼠，基础饲料适应性喂养1周后，随机分为以下四组：以基础饲料喂养的正常对照组（记为C组）、N=6，以基础饲料喂养的正常对照+Exenatide干预组（记为C+E组）、N=6，以高脂饲料喂养的2型糖尿病大鼠组（记为D组）、N=8，以高脂饲料喂养的2型糖尿病大鼠+Exenatide干预组（记为D+E组）、N=8。

所有大鼠按照SPF级动物房饲养要求于室温18~25℃、相对湿度50~80%条件下喂养、自由摄食、饮水。喂养10周后，所有大鼠均过夜空腹12小时，于次日早晨9时始，D组与D+E组大鼠予以1%STZ注射液（临用前现配）30mg/kg腹腔一次性注射，在30秒内注射完毕。C组与C+E组大鼠等体积腹腔一次性注射0.1M、pH值为4.5的柠檬酸缓冲液。

采用快速血糖仪检测给药72 h后大鼠尾静脉随机血糖，连续三次以上测得血糖≥16.7 mmol/L 作为糖尿病大鼠成模标准。STZ腹腔注射后，每天观察大鼠的体重、活动状态、摄食饮水、尿量变化。每天监测尿糖，当尿糖＜+++时（阳性反应），不予处理；当尿糖≥+++时，给予1~3u甘精胰岛素皮下注射预防大鼠发生高渗性昏迷甚至死亡。每周针刺鼠尾取血，用快速血糖仪测定血糖。

糖尿病模型建立后第3天起，C+E组与D+E组大鼠每日腹部皮下注射Exenatide 5μg。C组与D组大鼠腹部皮下注射等体积生理盐水作为对照，治疗8周。

腹腔葡萄糖耐量试验

在开始Exenatide干预后第7周进行腹腔葡萄糖耐量试验。进行试验前一天，暂停Exenatide及其相应对照液注射一次，所有大鼠过夜空腹12~16小时，次晨9时始，给予20%葡萄糖注射液1g/kg体重一次性腹腔注射。分别在注射前（0min）以及注射后30min、60min及120min由鼠尾取血，快速血糖仪测定血糖。

腹腔胰岛素耐量试验

在腹腔葡萄糖耐量试验后3天进行腹腔胰岛素耐量试验。在试验前一天，暂停Exenatide及其相应对照液注射一次，所有大鼠过夜空腹12~16小时，次晨9时始，将生物合成人胰岛素诺和灵R溶于无菌PBS液，予大鼠腹腔一次性注射（0.75Iu/kg体重）。分别在注射前（0min）以及注射后30min、60min及90 min由鼠尾取血，快速血糖仪测定血糖。

大鼠示踪灌流

将大鼠腹面向上平放，用动物保定器固定大鼠。将鼠尾轻轻拉直，以一胶带固定鼠尾于操作台板上。用一细针刺激大鼠尾部，如果鼠尾无反应，则提示麻醉良好，如鼠尾对针刺有疼痛反应，则可以于尾根部追加0.5%利多卡因0.5~1ml。术者持一尖锐的三角形外科手术刀距离鼠尾根部2.5cm处，作一长约1cm纵行切口，不能太深，以免伤及皮下之尾动脉。然后垂直于前纵行切口底端，向左做一2mm横向切口，呈一反向的L形。

用一小止血钳在上述L形切口的游离端小心分离皮下组织，暴露覆盖于尾动脉上方的白色结缔组织层。用三角形外科手术刀刀尖在动脉上方白色结缔组织层轻轻刺一小洞，然后从该小洞中伸入小眼科剪尖端，紧贴结缔组织正下方，剪开结缔组织层，暴露其正下方约5mm之尾动脉。

使用一眼科镊小心分离尾动脉周围附着的深层结缔组织，注意避免损伤周围小血管。分离完毕后，在动脉下方近心端放置一丝线备用。术者左手持一眼科镊夹住暴露尾动脉的远端，略用力向后上方提起，使动脉绷紧，血流被阻断而进一步扩张动脉。右手持预先使用肝素钠溶液湿润的一次性使用静脉留置针（美国BD Insyte，22G×1.0IN），近心端方向，与尾动脉呈约15°置入充血扩张的尾动脉。与尾静脉穿刺相似，注意穿刺针尖刺破动脉管壁进入0.5cm左右后，即将穿刺针稍稍向后退出少许，以免导管继续深入时，锋利的穿刺针刺破动脉管壁，造成穿刺失败。当静脉导管进入大鼠尾动脉1cm左右后，向后拔出穿刺针，如见鲜红色的动脉血快速充满导管，即说明置管成功。继续置入0.5cm后，立即以肝素钠湿润的无菌输液接头封闭导管尾部备用。将前述动脉下方近心端放置的备用丝线打结扎紧，将置入的动脉导管固定于血管内。为防止导管滑脱，再用缝合针将内有导管的尾动脉部分与血管附近的结缔组织缝合1~2针，加强固定。术中，创面如有少量出血，可喷撒少量肾上腺素后压迫数分钟止血。

当导管安全固定于大鼠尾动脉内后，在创口处喷撒长效局部麻醉药布比卡因适量，缝合皮肤后，于皮肤创面处再喷撒适量布比卡因，对置管创面进行长时镇痛。最后在大鼠尾根部放置一自制的尾夹备用，同时经尾动脉导管注射少量肝素钠溶液，以防止导管堵塞。

将置管完毕的大鼠从自制的保定器中取出，放入实验用的特制代谢笼。通过大鼠尾根部固定的尾夹将大鼠尾部固定于笼外。大鼠静息半小时以上，将手术应激降到最低，以利后续相关实验操作。尾静脉置管处用高精度恒速灌流泵予生理盐水10 μl/min持续输注，以保持尾静脉开放。

在大鼠尾动脉置管处采集一基础血样（0.5ml）后，使用Harvard泵由大鼠尾静脉恒速灌流3-³H-葡萄糖（0.5μCi/kg/min）和U-¹³C-甘油(0.84μmol/kg/min)，速度均为10μl/min，恒速灌流75分钟。在基础期灌流结束的最后10分钟（第65~75分钟）内，每隔3分钟于大鼠尾动脉置管处取动脉血样0.5ml。

取完血后，继续以Harvard泵由大鼠尾静脉恒速灌流3-³H-葡萄糖（0.5μCi/kg/min，10μl/min），同时以另一Harvard泵由大鼠尾静脉恒速灌流生物合成人胰岛素诺和灵R（5mu/kg/min，10μl/min），共持续90分钟。每10分钟从大鼠尾动脉置管处取血10μl，以手持血糖仪监测大鼠血糖一次，当大鼠血糖开始下降且低于6mmol/l左右时，以另一高精度恒速灌流泵从大鼠尾静脉处输注50%葡萄糖溶液，根据所测得的血糖值调整其灌流速度，保持大鼠血糖稳定在6-7mmol/l左右。在钳夹结束前的20分钟（即整个实验的第145分钟）时，由大鼠尾静脉一次性注射1μCi 2-脱氧-D-1-¹⁴C-葡萄糖，用来测定肌肉组织平均葡萄糖摄取率。在胰岛素钳夹期灌流结束前的10分钟开始（第155~165分钟），每隔3分钟于大鼠尾动脉置管处取动脉血样1ml。灌流结束时，予3%的戊巴比妥钠（50mg/kg）由尾静脉输入全身麻醉大鼠后，打开胸腔，心脏穿刺取血，并迅速采取胰腺、肝脏、骨骼肌（腓肠肌），一部分置于液氮后，-80℃保存。另取部分上述组织以2%戊二醛溶液固定以备后续组织超微结构观察。上述所得动脉血样离心，弃去血球部分，将血浆转入含有抗凝剂的试管，-80℃保存待测。图4为整个大鼠灌流流程的示意图。

血浆样品测定（酸性消化法）

取50 μl大鼠同位素示踪剂灌流前采集之血浆（基础血浆），置低钾玻璃测量杯。加入50μl的60% HClO₄，再加入100μl的30%H₂O₂。加盖密闭后置70℃水浴中消化1.5小时（注意仅将测量杯下半部浸入水中）。取出测量杯，加入3ml乙二醇甲醚和3ml含0.8%b-PBD的二甲苯。液体闪烁计数仪经过淬灭校正，测量该血浆样本的本底³H dpm值。再取相同大鼠同位素灌流后所采集之血浆，按照上述方法测量该血浆样本的总³H dpm值。采用氧化酶法测定该50μl血浆样本的总葡萄糖量（μmol），并计算该血浆样本的3-³H-葡萄糖的比活度（SA）。

肌肉组织2-脱氧-D-1-¹⁴C-葡萄糖比活度测定（酸性消化法）

称取待测湿肌组织约0.1g，置低钾玻璃测量杯。加入200μl的60%HClO₄，再加入400μl的30% H₂O₂。加盖密闭后置70℃水浴中消化1.5小时（注意仅将测量杯下半部浸入水中），将待测肌肉组织消化成为无色液体。取出测量杯，加入10ml乙二醇甲醚和8ml含0.8%b-PBD的二甲苯。液体闪烁计数仪经过淬灭校正，测量该样本的总¹⁴C dpm值。取50 μl 同只大鼠同位素示踪剂灌流前采集之血浆（基础血浆）按照之前血浆样品测定中采用的方法，测定该血浆样本的本底¹⁴C dpm值，并计算该组织样本单位质量（g）的2-脱氧-D-1-¹⁴C-葡萄糖放射活性。

血浆 U-¹³C 甘油和 1,2,3-¹³C- 葡萄糖丰度测定

将1,2,3-¹³C-葡萄糖（≥99%，Sigma公司）与普通葡萄糖（≥99%，Sigma公司）分别配制成96μg/ml和202μg/ml的溶液，互相掺入成理论质量比为0%、0.5%、1%、2%、4%和6%等数量级的溶液，离心浓缩真空抽干后备衍生化用。

与葡萄糖标准品处理相似，将U-¹³C-甘油（≥99%，美国Cambridge Isotope）与普通甘油（≥99%，Sigma公司）分别配制成117μg/ml和214μg/ml的溶液，互相掺入成理论质量比为0%、0.5%、1%、2%、4%、6%及10%等数量级的溶液，离心浓缩真空抽干后备衍生化用。

取20μl血浆置于1.5ml的干净EP管内，在上述EP管内加入50ul蒸馏水，在振荡器上振荡5秒钟混合均匀。加0.5ml预冷的无水乙醇后振荡1分钟混合均匀，以3000转/分钟速度离心10分钟。取上清液转移入1.5ml新EP管中，将含有上清液的新EP管开口状态下放入离心浓缩仪，65℃下，离心浓缩2小时，真空抽干。在真空抽干的EP管内，加入100μl预先配制的MOX衍生化试剂，振荡混匀60秒后，转移入标准螺纹口4ml透明样品瓶内（带Teflon隔垫），注意密闭。将上述密闭的透明样品瓶置于80℃烘箱内加热2小时，取出透明样品瓶，待冷却后加入100μl BSTFA+1%TMCS，再加入300μl吡啶，振荡混匀15~30秒后，置于80℃烘箱内再加热30分钟。从烘箱内取出样品瓶后，转移瓶内液体入钳口2ml透明进样瓶（带Teflon隔垫）内，密闭瓶盖后，置入GC-MS仪待测。

空腹胰岛素测定

使用前轻轻的彻底混匀磁分离试剂，确保磁性微粒悬浮均匀备用，清洗浓缩液4.3ml加纯化水至45ml混合均匀备用。

准备各浓度标准品用试管各2只，血清、血浆、质控品用试管各2只，放置于试管架上。测定前将各试剂放至室温（18~25℃），加样前充分混匀。设定恒温水浴锅温度为37℃±1℃。准备好磁分离免疫测定仪。

第一次孵育（免疫反应）：用微量移液器吸取30μl各浓度标准品、质控品、及待测大鼠血浆，加至标记好的相应试管的底部。用微量移液器加15μl Insulin抗试剂—FITC至各试管，用微量移液器加15μl Insulin抗试剂—ALP至各试管。用塑料薄膜覆盖试管架，置于生化摇摆平台上，轻轻往复震荡试管架，使试管内试剂彻底混匀。试管连架置37℃水浴30分钟。

磁分离：①向各试管中加入60μl 磁分离试剂。磁分离试剂使用前应充分摇匀，确保磁性微粒均匀悬浮。每加液10支试管摇匀磁分离试剂瓶一次。操作全过程小于5分钟。②再次用塑料薄膜覆盖试管，置于生化摇摆平台上，轻轻往复震荡试管架，使试管内试剂轻轻地彻底混匀。③试管连架置37℃水浴6分钟。④试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟。确保每支试管底部都与分离器表面接触。⑤用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。⑥放正分离器，加150μl稀释后的清洗液至各试管。⑦从分离器取出试管架放至摇摆平台，激烈振荡，彻底混匀。⑧试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟。确保每支试管底部都与分离器表面接触。⑨用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，用强有力的动作拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。⑩重复上述⑥～⑨步骤一次。

第二次孵育（酶反应）：①准备一支空白试管，做好标记放置试管架上，为磁分离酶联免疫测定仪校零。②从分离器中取出试管架，迅速加90μl基质至各试管，包括空白管。③再次用塑料薄膜覆盖试管，置于生化摇摆平台上，往复震荡试管架，使试管内试剂彻底混匀。④试管连架置37℃水浴30分钟。⑤加300μl终止液至各试管包括空白管，其加液顺序与加基质顺序相同，5分钟内加完。⑥把试管架放入磁分离器，沉淀15分钟。⑦用空白管在550nm校零。在550nm、492nm读取标准品、质控品、血浆样本的吸光值。

根据标准品的浓度与所测OD值绘制标准曲线，并计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，算出待测样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为待测样品的浓度。

血脂测定

使用Dimension Rel MAX自动生化分析仪测定。其中甘油三酯（triglyceride，TG）采用LPL酶终点法测定，总胆固醇（total cholesterole，TC）采用胆固醇氧化酶法（CHOD-PAP）测定，高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterole，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（lower density lipoprotein-cholesterole，LDL-C），均采用直接法测定。

数据分析

所有数据使用SPSS 17.0统计分析软件包进行统计分析。所有计量数据均采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较首先采用方差分析（ANOVA），若方差分析有显著性则进一步行均数间的两两比较。同一血浆参数前后比较采用配对样本t检验。P<0.05为有统计学意义，P<0.01 为有显著统计学意义。

结果

各组大鼠体重监测结果：实验开始时（0周），四组大鼠体重无明显统计学差异（P=0.407）。C组及C+E组大鼠予普通饲料，D组及D+E组大鼠予高脂饲料喂养10周后，四组大鼠体重组间比较出现统计学差异。高脂饲料喂养的D组及D+E组大鼠体重均较普通饲料喂养的C组及C+E组大鼠体重显著增加（P<0.01）。而在小剂量STZ注射（30mg/kg体重）诱导模型组大鼠成糖尿病并予Exenatide或者等体积生理盐水皮下注射8周后，C+E组大鼠体重较C组显著降低（P<0.01），D+E组大鼠体重较D组显著降低（P<0.01），详细数据如表1所示。

表 1 实验过程中大鼠体重变化

Figure 2012104404467100002DEST_PATH_IMAGE002

同一时间点内，与C组比，^*p＜0.01；与C+E组比，^▲p＜0.01；与D组比，^ϕp＜0.05。备注：C组为正常对照组、C+E组为正常对照加用Exenatide处理组、D组为糖尿病模型组、D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组，其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。

各组大鼠血糖监测结果：实验开始时，四组大鼠基础空腹血糖无明显统计学差异（P =0.663）。10周后，给予高脂饲料喂养的D组和D+E组大鼠空腹血糖与随机血糖均较普通饲料喂养的C组及C+E组大鼠血糖升高，但四组大鼠血糖无明显统计学差异（P =0.091和P =0.135）。而在小剂量STZ注射（30mg/kg体重）后，D组与D+E组大鼠随机血糖均较注射前显著升高，稳定在≥16.7mmol/L 的水平，两组之间无明显统计学差异(P>0.05)。而采用柠檬酸缓冲液等体积注射后的C组及C+E组大鼠其血糖注射前后无明显变化。同一时间点比较（STZ注射后3天），D组与D+E组大鼠随机血糖也较C组与C+E组显著升高（P<0.01）。诱导模型组大鼠成糖尿病后8周，D组大鼠空腹血糖持续升高，显著高于其他三组大鼠空腹血糖（P<0.01）。而D+E组大鼠经过Exenatide皮下注射干预8周后，血糖显著低于未受干预的D组大鼠（P<0.01），但仍高于C组及C+E组（P<0.01）。而经过Exenatide皮下注射干预8周后的C+E组大鼠空腹血糖也低于C组，出现统计学意义（P<0.05），详细数据如表2所示。

表 2 实验过程中大鼠体重变化

Figure 2012104404467100002DEST_PATH_IMAGE004

同一时间点内，与C组比^*p＜0.01；与C+E组比^▲p＜0.01；与D组比^ϕp＜0.05。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组；其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。

各组大鼠血糖监测结果：实验开始时，四组大鼠基础空腹血糖无明显统计学差异（P =0.663）。10周后，予高脂饲料喂养的D组和D+E组大鼠空腹血糖与随机血糖均较普通饲料喂养的C组及C+E组大鼠血糖升高，但四组大鼠血糖无明显统计学差异（P =0.091和P =0.135）。而在小剂量STZ注射（30mg/kg体重）后，D组与D+E组大鼠随机血糖均较注射前显著升高，稳定在≥16.7mmol/L 的水平，两组之间无明显统计学差异(P>0.05)。而采用柠檬酸缓冲液等体积注射后的C组及C+E组大鼠其血糖注射前后无明显变化。同一时间点比较（STZ注射后3天），D组与D+E组大鼠随机血糖也较C组与C+E组显著升高（P<0.01）。诱导模型组大鼠成糖尿病后8周，D组大鼠空腹血糖持续升高，显著高于其他三组大鼠空腹血糖（P<0.01）。而D+E组大鼠经过Exenatide皮下注射干预8周后，血糖显著低于未受干预的D组大鼠（P<0.01），但仍高于C组及C+E组（P<0.01）。而经过Exenatide皮下注射干预8周后的C+E组大鼠空腹血糖也低于C组，出现统计学意义（P<0.05），详细数据如表3和表4所示。

表 3 实验过程中大鼠空腹血糖变化

Figure 2012104404467100002DEST_PATH_IMAGE006

同一时间内，与C组比^#p＜0.05、^*p＜0.01，与C+E组比^▲p＜0.01，与D组比^§p＜0.01。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组；其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。

表 4 造模前后大鼠随机血糖变化

Figure 2012104404467100002DEST_PATH_IMAGE008

同组内，与STZ/对照液注射前比较^αp＜0.01，同一时间内与C组比^*p＜0.01，与C+E组比^▲p＜0.01。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组，其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。

Exenatide 治疗 8 周后，各组大鼠空腹胰岛素、 HOMA-IR 和胰岛素敏感指数比较：

将Exenatide/对照液干预8周后，各组大鼠空腹胰岛素、HOMA-IR和胰岛素敏感指数制成数据图进行对比，详细如图5所示。同一血浆参数内比较，与C组比，^*p＜0.01，与C+E组比，^#p＜0.05，^▲p＜0.01，与D组比，^ϕp＜0.05，^§p＜0.01。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组，其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。FINS为空腹胰岛素，HOMA-IR为稳态胰岛素评价指数，ISI为胰岛素敏感指数。

诱导模型组大鼠成糖尿病8周后，D组大鼠空腹胰岛素（FINS）水平（29.09±3.61 μIu/ml）显著高于C组（12.84±5.26 μIu/ml，P <0.01）、C+E组（15.00±5.55 μIu/ml，P <0.01），也高于D+E组（18.86±2.48 μIu/ml，P <0.05）。而予Exenatide干预8周的D+E组大鼠，其空腹胰岛素水平与C组、C+E组大鼠的空腹胰岛素水平相比，无明显统计学差异（P >0.05）；C+E组大鼠的空腹胰岛素水平虽然较C组升高，但无显著差异性（P >0.05）。

应用稳态模型（homeoestasis model assessment，HOMA）及胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）评价各组大鼠胰岛素抵抗的程度。其中，HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5 表示胰岛素抵抗的程度；ISI=Ln[1/（FBG×FINS）]，表示胰岛素敏感性，使用自然对数表示。实验结果显示，D组大鼠的HOMA-IR（18.40±3.84）显著高于C组（3.19±1.38，P<0.01）、C+E组（2.79±0.94，P<0.01）以及D+E组大鼠（7.54±1.58；P<0.01）；D+E组大鼠其HOMA-IR虽然显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组大鼠（P<0.01）。而C+E组大鼠HOMA-IR较C组大鼠略低，无显著差异性（P>0.05）。

与上述各组大鼠HOMA-IR改变相应，胰岛素敏感指数（ISI）也出现相应变化。D组大鼠的ISI（-6.01±0.21）显著低于C组（-4.15±0.61，P<0.01）、C+E组（-4.09±0.35，P<0.01）以及D+E组大鼠（-5.12±0.21；P<0.01）；D+E组大鼠其ISI虽然显著高于D组大鼠（P<0.01），但仍显著低于C组与C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠ISI虽然略高于C组大鼠，但无显著差异性（P>0.05）。

Exenatide 治疗 7 周后，大鼠腹腔葡萄糖耐量试验

在Exenatide治疗7周后，对大鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验并记录下相关数据，将这些数据制成图进行比较，详细如图6所示。同一时间点内比较，与C组比，^*p＜0.01；与C+E组比，^▲p＜0.01；与D组比，^§p＜0.01。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组，其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。

各组大鼠予20%葡萄糖注射液1g/kg体重一次性腹腔注射后，D组大鼠0 min、30 min、60 min、120 min 血糖分别为（14.20±1.82mmol/L）、（28.10±1.92 mmol/L）、（30.74±1.58mmol/L）、（29.44±0.87 mmol/L），D+E组大鼠对应时间点血糖分别为（7.98±1.34mmol/L）、（19.44±3.80 mmol/L）、（17.78±3.10mmol/L）、（15.20±2.71 mmol/L），C组大鼠对应时间点血糖分别为（3.25±0.54mmol/L）、（6.72±1.03mmol/L）、（3.45±0.77mmol/L）、（3.33±0.66 mmol/L），C+E组大鼠对应时间点血糖分别为（3.12±0.31mmol/L）、（6.50±0.66 mmol/L）、（3.20±0.49mmol/L）、（2.48±0.33 mmol/L）。各时间点血糖水平，D组大鼠较其余三组大鼠均显著升高，具有显著性差异（P<0.01）。而经过Exenatide干预7周的D+E组大鼠各时间点血糖水平均显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组（P<0.01）。葡萄糖注射后，D组大鼠血糖峰时后延，其高峰在60min时出现，120min时其血糖水平仍显著增高，没有明显下降趋势。而经过Exenatide干预7周的D+E组大鼠在腹腔葡萄糖注射后，血糖高峰出现时间与C组及C+E组大鼠相似，在30min时出现，随后血糖出现回落趋势。

Exenatide 治疗 7 周后，大鼠腹腔胰岛素耐量试验

在Exenatide治疗7周后，对大鼠进行腹腔胰岛素耐量试验并记录下相关数据，将这些数据制成图进行比较，详细如图7所示。同一时间点内比较，与C组比，^*p＜0.01；与C+E组比，^▲p＜0.01；与D组比，^ϕp＜0.05，^§p＜0.01。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组，其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。Initial Plasma Glucose Level（%）：与0min的血糖比值。

Exenatide治疗7周后，各组大鼠腹腔一次性注射生物合成人胰岛素诺和灵R（0.75Iu/kg体重）后，D组大鼠30 min、60 min、90 min 血糖分别为其初始血糖的（99.05±3.71%）、（94.20±2.67%）、（91.53±2.14%），D+E组大鼠对应时间点则为（92.00±2.05%）、（80.63±3.27%）、（69.75±3.73%），C组大鼠对应时间点分别为（56.00±5.80%）、（33.00±7.79%）、（20.49±2.81%），C+E组大鼠对应时间点分别为（58.48±6.41%）、（29.41±3.83%）、（18.99±3.08%）。由腹腔胰岛素耐量试验曲线（图7）可以发现，胰岛素腹腔注射后，C组及C+E组大鼠血糖快速下降，90分钟时间内，较初始血糖值下降达近80%，但是在D组大鼠血糖下降非常缓慢，胰岛素腹腔注射30分钟后，才出现下降趋势，且在90分钟内均维持在较高水平，仅较初始值下降约10%。而D+E组大鼠血糖下降速度虽然较C组及C+E组显著缓慢，但是相对于D组大鼠，下降速度加快，胰岛素注射90分钟后，血糖较初始值下降约30%。

Exenatide 治疗 8 周后，大鼠血脂谱对比

在Exenatide治疗8周后，将大鼠的血脂谱进行对比录下相关数据，并将这些数据制成图进行比较，详细如图8所示。同一血浆参数内比较，与C组比，^*p＜0.01；与C+E组比，^▲p＜0.01；与D组比，^ϕp＜0.05，^§p＜0.01。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组，其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。TC，总胆固醇，TG为甘油三酯，HDL为高密度脂蛋白，LDL为低密度脂蛋白。

GC-MS 检测相关结果

葡萄糖衍生化产物结果及葡萄糖相对丰度 TTR 标准曲线建立

在图8的总离子流图（TIC）中，保留时间（Retention Time，Rt）20.62 min时出现葡萄糖特征峰，将该峰图与GC-MS自带的NIST98和WILEY7.0谱库对照，确定甲氧胺+硅烷化处理过的葡萄糖的质谱图后，行选择性离子监测（SIM）特征片段为质核比（m/z）319和322的离子片段（图9），进行特征峰面积积分。将标准品的质量百分比（0%、0.5%、1%、2%、4%、6%）换算为TTR后，结合实际测量结果（特征性峰面积积分比），得出葡萄糖标准曲线的直线回归方程为y=1.2153x+2.947（R²=0.9969）。图10是根据实际测得的样品峰面积积分比，得到四组大鼠血浆样品中的1,2,3-¹³C葡萄糖MPE值（见表5）。

GC-MS 检测甘油衍生化产物结果及甘油相对丰度 TTR 标准曲线建立

在图8的总离子流图（TIC）中，保留时间（Rt）11.74min时出现甘油特征峰（见图11）将该峰图与GC-MS自带的NIST98和WILEY7.0谱库对照，确定硅烷化处理过的甘油的质谱图，行选择性离子监测（SIM）特征片段为质核比(m/z) 218和221的离子片段（图12），进行特征峰面积积分。将标准品的质量百分比（0%、0.5%、1%、2%、4%、6%、10%）换算为TTR后，结合实际测量结果（特征性峰面积积分比），得出甘油标准曲线的直线回归方程为y=0.8006x+5.0676（R²=0.996）（图13）；根据实际测得的样品峰面积积分比，得到四组大鼠血浆样品中的¹³C-甘油MPE值（表5）。

表 5 各组大鼠的血浆 1,2,3-13C- 葡萄糖和 U-13C- 甘油丰度值（ MPE ）

	C组	C+E组	D组	D+E组	P
						1,2,3-¹³C-葡萄糖	0.52±0.12	0.55±0.07	0.44±0.11	0.45±0.05	0.172
U-¹³C-甘油	8.12±1.22	8.81±1.11	3.00±0.53^*▲	4.52±0.61^*▲ ^ϕ	0.000

同一血浆参数内比较，与C组比，^*p＜0.01；与C+E组比，^▲p＜0.01；与D组比，^ϕp＜0.05。备注：C组为正常对照组，C+E组为正常对照加用Exenatide处理组，D组为糖尿病模型组，D+E组为糖尿病加用Exenatide处理组；其中C+E组及D+E组从第10周起开始予Exenatide 5μg/d，皮下注射一日一次处理。

Exenatide 治疗 8 周后，各组大鼠示踪动力学研究结果

基础状态

1. 葡萄糖出现率

D组大鼠的葡萄糖出现率（121.07±16.55μmol/kg/min）显著高于C组（42.27±10.56μmol/kg/min，P<0.01）、C+E组（35.11±3.96μmol/kg/min，P<0.01）以及D+E组大鼠（94.70±13.46 μmol/kg/min，P<0.01），虽然D+E组大鼠的葡萄糖出现率已经显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠的葡萄糖出现率虽然较C组大鼠低，但无显著差异性（P>0.05）。（见图15）

2. 甘油出现率

与上述葡萄糖出现率相似，D组大鼠的甘油出现率（24.65±5.39μmol/kg/min）显著高于C组（8.23±1.42μmol/kg/min，P<0.01）、C+E组（7.63±0.97μmol/kg/min，P<0.01）以及D+E组大鼠（15.75±2.04μmol/kg/min，P<0.01）。D+E组大鼠的甘油出现率虽然已经显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组大鼠（P<0.01）。而C+E组大鼠的甘油出现率虽然较C组大鼠略低，但无显著差异性（P>0.05）。（见图14-A）

3. 甘油糖异生相关参数

（ 1 ）甘油通过糖异生作用转化为葡萄糖的百分率比较：

在四组大鼠中，D组大鼠甘油转化为葡萄糖的百分率（61.53±7.44%）显著高于C组（25.13±4.62%，P<0.01）、C+E组（22.98±3.86%，P<0.01）以及D+E组大鼠（48.23±11.20%，P<0.01）。D+E组大鼠甘油转化为葡萄糖的百分率虽然显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠甘油转化为葡萄糖的百分率虽然较C组大鼠略低，但无显著差异性（P>0.05）。（见图14-B）

（2 ）来源于甘油的葡萄糖百分率比较：

在四组大鼠中，D组大鼠葡萄糖Ra中来源于甘油的葡萄糖百分比（14.78±3.38%）显著高于C组（6.55±2.16%，P<0.01）、C+E组（6.35±1.36%，P<0.01）以及D+E组大鼠（10.17±1.41%，P<0.01）。D+E组大鼠其葡萄糖Ra中来源于甘油的葡萄糖百分比虽然显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠其葡萄糖Ra中来源于甘油的葡萄糖百分比较C组大鼠略低，无显著差异性（P>0.05）。（见图14-C）

（ 3 ）来源于甘油的糖异生速率

在四组大鼠中，D组大鼠来源于甘油的糖异生速率（17.54±2.68μmol/kg/min）显著高于C组（2.66±0.67μmol/kg/min，P<0.01）、C+E组（2.23±0.54μmol/kg/min，P<0.01）以及D+E组大鼠（9.76±2.54μmol/kg/min，P<0.01）； D+E组大鼠其甘油糖异生速率虽然显著低于D组大鼠（P<0.01），但仍显著高于C组与C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠其甘油糖异生速率虽然较C组大鼠低，但无显著差异性（P>0.05）。（见图14-D）

钳夹稳态

1. 钳夹稳态下血糖、胰岛素浓度

给予生物合成人胰岛素诺和灵R（5mu/kg/min）钳夹90分钟后，C组、C+E组、D组以及D+E组大鼠钳夹血糖浓度相似（6.17±0.49 mmol/l vs 6.08±0.48 mmol/l vs 6.68±0.39 mmol/l vs 6.14±0.57mmol/l，P>0.05）。（图15-A）同时，上述四组大鼠的血浆胰岛素浓度较基础状态时显著上升，C组大鼠由基础状态的12.84±5.26 μIu/ml增加到105.95±7.38μIu/ml（P<0.01），C+E组大鼠由15.00±5.55μIu/ml增加到98.60±6.86 μIu/ml（P<0.01），D组大鼠由29.09±3.61μIu/ml增加到118.92±8.81μIu/ml（P<0.01），而D+E组大鼠则由18.86±2.48μIu/ml增加到108.47±7.91μIu/ml（P<0.01）；在上述各组中，D组大鼠钳夹稳态下的血浆胰岛素浓度高于C组（P<0.05）与C+E组（P<0.01），有统计学意义。（见图15-B）

2. 肝糖输出

随着外源性胰岛素的持续输注，四组大鼠的肝糖输出均显著下降。当达到钳夹稳态时，C组大鼠的HGP由基础状态的42.27±10.56μmol/kg/min下降到3.45±0.75μmol/kg/min（P<0.01），下降幅度约92%；C+E组大鼠的HGP由基础状态的35.11±3.96μmol/kg/min下降到2.88±1.13μmol/kg/min（P<0.01），下降幅度约92%；D组大鼠的HGP则由基础状态的121.07±16.55μmol/kg/min下降到44.14±8.49μmol/kg/min（P<0.01），下降幅度约64%；而予Exenatide干预8周的D+E组大鼠其HGP由基础状态的94.70±13.46μmol/kg/min下降到21.37±5.89μmol/kg/min（P<0.01），下降幅度约77%。钳夹稳态下，四组大鼠的HGP具有显著性差异，D组大鼠的HGP显著高于其余三组大鼠（P<0.01），D+E组大鼠HGP虽然较D组为低，但仍显著高于C组与C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠的HGP略低于C组，无显著性差异（P>0.05）。（见图15-C）

3. 葡萄糖消失率

给予生物合成人胰岛素诺和灵R（5mu/kg/min）钳夹90分钟后，C组GRd从42.27±10.56μmol/kg/min增加到182.16±9.15μmol/kg/min（P<0.01）；C+E组GRd从35.11±3.96μmol/kg/min增加到180.87±8.85μmol/kg/min（P<0.01）；D组GRd从121.07±16.55μmol/kg/min增加到158.63±6.06μmol/kg/min（P<0.05），D+E组GRd从94.70±13.46μmol/kg/min增加到167.92±5.50μmol/kg/min（P<0.01）。钳夹稳态下，虽然D组大鼠的血浆胰岛素浓度高于C组（P<0.05）与C+E组（P<0.01），但是其GRd低于C组（P<0.05）及C+E组大鼠（P<0.01）。而D+E组大鼠的稳态GRd也低于C组（P<0.01）及C+E组大鼠（P<0.05），其稳态GRd虽然高于D组大鼠，但未见明显统计学差异（P>0.05）。C组与C+E组稳态GRd无显著差异（P>0.05）。（见图15-D）

4. 外源性葡萄糖输注率

随着外源性胰岛素的持续输注，大鼠体内出现高胰岛素血症，为了维持大鼠血糖于钳夹血糖（6~7mmol/l）而不出现低血糖，需要外源性葡萄糖的持续输注。在钳夹稳态时，四组大鼠中，D组大鼠维持钳夹血糖所需要的GIR（114.50±9.40μmol/kg/min）显著低于C组（178.71±8.73μmol/kg/min，P<0.01）、C+E组（177.95±9.89μmol/kg/min，P<0.01）及D+E组大鼠（144.68±11.03μmol/kg/min，P<0.01）。而D+E组大鼠其GIR虽然显著高于D组（P<0.01），但仍显著低于C组与C+E组大鼠（P<0.01）。C组与C+E组大鼠的外源性葡萄糖输注率相似，无显著差异（P>0.05）。（见图15-E）

5. 肌肉组织葡萄糖摄取率

四组大鼠中，D组大鼠的肌肉组织葡萄糖摄取率（0.17±0.02 μmol/g/min）显著低于C组（0.37±0.04 μmol/g/min，P<0.01），C+E组（0.41±0.05 μmol/g/min，P<0.01）及D+E组大鼠（0.24±0.02 μmol/g/min，P<0.01）。D+E组大鼠的肌肉组织葡萄糖摄取率虽然高于D组大鼠，但仍显著低于C组（P<0.01）及C+E组（P<0.01）。C+E组大鼠的肌肉组织葡萄糖摄取率略高于C组，但无显著性差异（P>0.05）。（见图15-F）

GLP-1 类似物 Exenatide 对 2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响

临床及实验室的研究均表明2型糖尿病体重减轻能改善胰岛素抵抗和血糖控制。许多胃肠激素，如GLP-1，食欲素，神经肽Y和胃动素均能够通过调节食物的摄取和能量的消耗对机体的代谢进行调节，在健康机体以及2型糖尿病机体中具有重要的生理意义。

Exenatide，一种新近合成的GLP-1类似物，具有相似的胃肠激素的作用，长期治疗能引起渐进性的体重下降，而且其减重的作用能够持续至少2年。已有的研究表明Exenatide主要通过以下三个机制，有效的降低食物摄取，从而减少体重：（1）参与体内存在的一种主要的抑制性反馈机制“回肠刹车”作用，作用于迷走神经以及脑干内的孤束核，抑制胃肠运动从而延长胃排空。（2）增加饱食感。GLP-1受体除了主要分布于胰岛和胃腺外，也发现存在于中枢神经系统多个区域，广泛分布于下丘脑，尤其密集分布于室旁核和弓状核。而上述区域正是调节食欲的关键部位。（3）抑制促进食欲相关激素的分泌。研究证实Exenatide能长效抑制强效促食欲激素ghrelin的分泌，其作用独立于瘦素和胰岛素。证据表明，Exenatide所致的持续的体重降低除能进一步改善血糖的控制和胰岛素介导的骨骼肌葡萄糖摄取外，还能降低血清甘油三酯，总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇，增加高密度脂蛋白胆固醇从而改善2型糖尿病的血脂紊乱。

实验中经过Exenatide干预8周的糖尿病大鼠体重较未干预的糖尿病大鼠显著减轻；同时与正常对照组大鼠比较，Exenatide干预的正常大鼠体重也显著减轻；这说明Exenatide的减重作用在多食的2型糖尿病状态和正常进食的健康状态下都是显著有效的。同时，Exenatide干预的糖尿病大鼠空腹血糖较未干预的糖尿病大鼠显著下降，血浆空腹胰岛素较其显著降低，且与正常对照组无显著差别；采用HOMA-IR以及ISI评定的胰岛素抵抗程度也较未干预的糖尿病大鼠显著降低，提示经过Exenatide 8周的干预，糖尿病大鼠的高胰岛素血症得到纠正，其胰岛素抵抗得到了显著改善。在2型糖尿病患者中常存在血游离脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TG）和胆固醇升高等脂代谢紊乱。近年来，众多证据表明，脂代谢紊乱在2型糖尿病发病中居于重要地位，其与胰岛素抵抗的产生与恶化关系密切。实验也显示，Exenatide干预8周的糖尿病大鼠的血TC、TG和LDL均显著低于未干预的糖尿病大鼠，提示Exenatide能有效改善2型糖尿病脂代谢紊乱，从而对胰岛素抵抗产生有益的作用。在腹腔葡萄糖耐量试验中，经过Exenatide干预的糖尿病大鼠葡萄糖耐量曲线与正常对照组大鼠耐量曲线相似，血糖高峰出现在30min左右，随后血糖出现回落趋势，提示其丢失的第一时相胰岛素分泌有所恢复，糖负荷处理能力有所改善。同时腹腔胰岛素耐量试验也显示其对胰岛素敏感性有所增强。

上述研究结果从各个方面暗示Exenatide对2型糖尿病胰岛素抵抗具有切实有效的改善作用，能够使2型糖尿病的糖脂代谢紊乱得到一定程度的纠正。但是，上述研究仅通过检测血糖血脂变化，采用葡萄糖耐量试验，以及HOMA、ISI指数来评定胰岛素抵抗，研究结果不够精确，说服力有限，未能动态而且直观的显现与追踪Exenatide在治疗2型糖尿病时，机体血浆中血糖的出现与消失这一重要的生理稳态的改变，而上述血糖稳态的失衡正是2型糖尿病高血糖产生的根本机理。而作为代谢研究的重要组成部分的同位素示踪技术，则能对机体碳水化合物的代谢流在非侵入方式下进行精确定量。但是以往的大鼠模型示踪研究中，常常采取大鼠全身麻醉后或者经历比较大的外科创伤置管后进行，对机体代谢不可避免出现较大干扰，影响研究结果的准确性。在本研究中，引进并且改良了一种新的大鼠示踪灌流研究平台，有效避免了以往此类示踪研究常有的弊端，参与实验的大鼠在研究的过程中始终处于清醒安静状态，将其应激程度减到最低，有效避免了相关应激激素对葡萄糖代谢产生的影响，保证了研究结果的准确性。

近年来，肝胰岛素抵抗在2型糖尿病发生与发展中的作用日益受到人们的重视。不管是在轻度糖尿病人群还是重度糖尿病人群，都存在明显的肝胰岛素抵抗，甚至在糖尿病前期状态，肝胰岛素抵抗已经存在。甘油、丙氨酸等底物糖异生作用的增强是肝胰岛素抵抗的主要成因。糖异生是机体重要的生理作用，指的是非碳水化合物（乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等）转变为葡萄糖或糖原的过程。糖异生作用是机体空腹状态下EGP的主要来源之一，保证了机体的空腹血糖处于正常水平。糖异生的主要器官是肝脏，肾在正常情况下糖异生能力只有肝的十分之一。比较于其他糖异生底物，甘油是一种有效的糖异生前体，它常来自于外周贮存的甘油三酯降解后释放入血，甘油糖异生转化为葡萄糖也是其从血中清除的主要途径之一。本研究中采用稳定同位素示踪技术，以U-¹³C-甘油作为示踪剂对各组大鼠体内天然存在的甘油的代谢动力学进行了定量。U-¹³C-甘油与被追踪的天然甘油具有完全相同的化学结构与功能，唯一不同的是其碳架上的3个天然¹²C由稳定同位素¹³C取代，他们经历同样的代谢途径，在微量的情况下，U-¹³C-甘油不会对机体内源性甘油的代谢产生干扰，因此具有足够的准确性能够真实反映机体内源性甘油的代谢经过。与此同时，还采用了3-³H-葡萄糖作为示踪剂，对各组大鼠基础状态下的葡萄糖代谢动力学也进行了追踪。研究显示在基础状态下，糖尿病大鼠的葡萄糖出现率显著高于其余三组，而经过Exenatide干预8周的糖尿病大鼠其葡萄糖出现率明显低于未干预的糖尿病大鼠，这与测得的四组大鼠的空腹血糖比较相符合。与葡萄糖出现率的比较相似，糖尿病大鼠基础状态下甘油的出现率在三组大鼠中也是最高的，经过Exenatide干预的糖尿病大鼠其甘油出现率较未干预的糖尿病大鼠明显降低，在正常大鼠中Exenatide干预则没有显著影响其甘油出现率。在空腹状态下，体内的甘油主要来自于外周脂肪组织的分解作用，由于脂肪组织缺乏甘油激酶，脂肪细胞经过脂解作用释放的甘油不能重新合成甘油三酯，因此，血中的甘油出现率也是脂解的一个可靠指标。从四组大鼠甘油出现率的比较中，可以发现经过Exenatide干预8周后，增强的2型糖尿病的脂解作用得到部分抑制。Exenatide在改善2型糖尿病大鼠脂解作用的同时，实验也显示甘油参与的糖异生的相关指标也得到了显著的改善。无论是甘油通过糖异生作用转化为葡萄糖的百分率、来源于甘油的糖异生速率，还是来源于甘油的葡萄糖百分比，Exenatide干预的糖尿病大鼠组都显著低于未干预的2型糖尿病大鼠，因此， Exenatide能够抑制2型糖尿病病理性增强的肝脏糖异生作用，从而改善肝胰岛素抵抗。

为了进一步评价Exenatide对2型糖尿病大鼠葡萄糖代谢的影响，在灌流实验基础期结束后，继续采用3-³H-葡萄糖作为示踪剂对各组大鼠进行了高胰岛素正糖钳夹研究。高胰岛素正糖钳夹试验一直以来是评定体内胰岛素作用的金标准。实验显示，当钳夹达到稳态时，四组大鼠血浆胰岛素浓度均显著升高，在高浓度胰岛素作用下，正常对照组大鼠与正常对照加用Exenatide干预的大鼠总葡萄糖外周摄取（GRd）较基础状态增加了约3~4倍，糖尿病大鼠仅增加19%，而糖尿病大鼠经过Exenatide干预8周则增加了70%，上述比较清楚的显示Exenatide能够显著增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取。为了维持正常的血糖水平，Exenatide干预的糖尿病组大鼠维持钳夹血糖所需要的外源性葡萄糖的输注率较D组大鼠增加约28%，再次说明Exenatide能增加糖尿病机体胰岛素刺激的全身葡萄糖代谢。实验显示，稳态时高浓度的胰岛素完全抑制了正常对照组与正常对照加用Exenatide组的HGP，抑制率达到90%以上，但是并未能完全抑制余下2组糖尿病大鼠的HGP，提示糖尿病大鼠存在肝胰岛素抵抗。虽然Exenatide干预的糖尿病大鼠仍存在肝胰岛素抵抗，但是，其稳态HGP值低于未干预的糖尿病大鼠近50%，胰岛素作用下的HGP抑制率也明显高于未干预的糖尿病大鼠，因此，高胰岛素正糖钳夹试验也证实了Exenatide不仅能够改善肝胰岛素抵抗，其对外周组织的胰岛素抵抗也具有显著的改善作用。

在2型糖尿病中，骨骼肌胰岛素抵抗是其主要缺陷，在2型糖尿病的发生发展中起着关键的作用。研究显示，骨骼肌胰岛素抵抗甚至可以早于2型糖尿病人群胰岛β细胞功能衰竭、出现明显高血糖数十年前存在。在高胰岛素正糖钳夹试验中，约80~90%外源性输注的葡萄糖由骨骼肌摄取，因此胰岛素钳夹技术主要反映骨骼肌的胰岛素敏感性。在结合高胰岛素正糖钳夹试验，同时使用2-脱氧-D-1-¹⁴C-葡萄糖对钳夹稳态下四组大鼠骨骼肌组织的平均葡萄糖摄取率进行了测定。由于2-脱氧-葡萄糖与普通葡萄糖一样能被组织摄取并在细胞内被磷酸化，形成6-P-葡萄糖，但是不能再进一步代谢，因此是经典的测定特定组织葡萄糖摄取能力的金方法。实验显示，四组大鼠中糖尿病大鼠腓肠肌平均葡萄糖摄取率最低，较正常对照组大鼠腓肠肌平均葡萄糖摄取率降低约54%，该结果与DeFronzo RA等在2型糖尿病人群中的研究结果相似，说明糖尿病大鼠存在显著的骨骼肌胰岛素抵抗。而在Exenatide干预8周后的糖尿病大鼠，其腓肠肌平均葡萄糖摄取率较正常对照组大鼠降低约35%，比糖尿病组无干预大鼠则增加近41%，显示该组大鼠骨骼肌胰岛素抵抗得到了一定程度的改善。而在Exenatide干预8周的正常大鼠中，其平均葡萄糖摄取率也略高于正常对照组，但无显著性差异，说明Exenatide对正常机体外周骨骼肌不会产生过度胰岛素增敏作用。

综上所述，采用同位素示踪技术有力的证实了GLP-1类似物Exenatide能显著抑制2型糖尿病大鼠肝脏糖异生，改善肝胰岛素抵抗；同时也可以显著增加外周骨骼肌组织葡萄糖摄取率，从而改善肝外胰岛素抵抗，进而发挥调控2型糖尿病糖脂代谢紊乱的有益作用。

本发明提供的用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备可用于治疗2型糖尿病药物的筛选、2型糖尿病治疗的临床和科研使用。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种用于确定GLP-1类似物对2型糖尿病血糖调控机制的设备，其特征在于，所述设备包括动物代谢笼、尾部固定夹子；

所述动物代谢笼内设有网格板，所述网格板将动物代谢笼分为上下两部分，动物代谢笼还设有进出代谢笼的门，动物代谢笼的侧壁上设有进水孔和尾巴伸出孔。

2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述进水孔和尾巴伸出孔分别设置在动物代谢笼的相对两个侧壁上。

3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备还包括尾部放置台，所述尾部放置台的上表面与尾巴伸出孔下表面平齐。

4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述动物代谢笼内网格板下方还设有台板。

5.根据权利要求1或4所述的设备，其特征在于，在动物代谢笼侧面设有卡口，所述网格板和台板通过该卡口插入并固定在动物代谢笼中。

6.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述装置还包括动物保定器，所述动物保定器具有一端开口的筒状形状。

7.根据权利要求1所述设备，其特征在于，所述动物保定器一端开口具有圆形或椭圆形的开口截面，所述开口截面中部向上凸出或向下凹进。

8.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述尾部固定夹子包括相对的两个夹片，所述夹片中间部具有圆弧形凹部，夹片两端设有连接固件。

9.根据权利要求8所述的设备，其特征在于，所述圆弧形凹部内侧面铺设有弹性垫子。

10.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备还包括用于插入动物尾部的尾静脉的静脉留置针。