CN102924929B - 一种包封多酚类活性物质的纳米粒子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种包封多酚类活性物质的纳米粒子及其制备方法，本发明属于高分子化学，功能食品技术领域。本发明利用蛋白与多糖的Maillard反应、多酚与蛋白-多糖共价结合物的自组装即可获得包封多酚类活性物质的蛋白-多糖纳米粒子。该纳米粒子对多酚类活性物质具有高包封率、高负载量、良好保护活性等优异性能。通过戊二醛、京尼平等交联剂对这种纳米粒子进行交联，可以进一步提高纳米粒子的稳定性和缓释性能。制备过程在全水相环境中进行，不使用有机试剂、表面活性剂以及其他有毒试剂，载体的原材料属于天然高分子，具有优异的生物相容性、生物可降解性，符合绿色化学的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种包封多酚类活性物质的蛋白-多糖纳米粒子及其制备方法，属于高分子化学和功能食品技术领域。
背景技术
多酚类化合物是一类在自然界广泛分布的物质，现已发现数百种不同类型的多酚化合物具有广泛的生物活性和药理活性。大量研究表明，多酚类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。尽管多酚类化合物具有多种优异的生物功能，但是容易被体内消化系统分解破坏而失去活性，例如在强酸强碱及较高温度下容易被氧化，因此有必要发展一种多酚载体，对多酚类物质进行包封，以保持其生物活性。
目前已有文献报道以合成高分子PLGA-PEG纳米胶束作为载体，将EGCG包埋其中，与自由EGCG相比，纳米EGCG在稀释10倍后仍能保持活性，可有效杀死前列腺癌细胞{Journal ofMedicinal Chemistry2011,54(5):1321-1332.}；将多酚类物质EGCG包裹在乳球蛋白纳米粒子中，可降低EGCG的氧化降解速度{Food Hydrocolloids2012,29(1):57-67.}；包裹儿茶素的壳聚糖纳米粒子可增强肠道对儿茶素的吸收{Food Chemistr2010,122(3):662-667.}。这些研究表明，包裹多酚类物质的纳米粒子不仅增强了多酚的稳定性与抗氧化能力，而且提高了多酚在体内的生物利用度和生物相容性。但这些文献报道的技术方法仍然存在一些局限性。第一，纳米粒子的分散性和稳定性不好，难以调控纳米粒子的粒径分布；第二，纳米粒子的负载量、包封率较低；第三，纳米粒子的制备提纯过程复杂，合成过程涉及有机溶剂和有毒化学试剂的使用。
蛋白（如明胶、谷蛋白、麦醇溶蛋白等）具有良好的生物相容性、可生物降解性以及优良的粘性、胶凝性、成膜性等，被广泛应用于食品、化妆品和医药工业中。多糖作为自然界中含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有的生物中，是生物体维持正常生命活动的必需物质，并具有如免疫调节功能、抗感染、抗肿瘤、抗凝血、降血糖和抗病毒等多种多样的生物学功能。多糖作为生物医用材料在固定化酶、絮凝剂、人工透析膜、吸收缝合线、伤口涂敷料以及人造皮肤等诸多领域都有广泛的应用。Maillard反应是食品加工和储藏过程中氨基化合物（氨基酸、多肽和蛋白质）和羰基化合物（还原糖类）之间自然发生的反应。关于蛋白质和多糖之间的Maillard反应现已有很成熟的理论基础和实验技术，Maillard反应一般在干热条件下进行，不添加其他化学试剂，条件温和，对人体安全无毒。利用Maillard反应将葡聚糖、普鲁兰多糖或半乳甘露聚糖对蛋白进行亲水改性，并对蛋白进行加热交联，可以制备出所需的蛋白-多糖药物载体{公告号100503705C和公开号CN102010513A}。该载体具有优异的亲水性能、良好的生物可降解性与生物相容性，并且可以延长药物在体内的循环时间。但在已公开的蛋白-多糖药物载体专利文献中，由于蛋白和多糖本身具有很好的亲水性，需要采用蛋白加热交联技术对蛋白结构进行变性，才可能组装发生并得到单分散的纳米粒子。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种可有效提高多酚的生物利用度和保持多酚的活性，克服现有多酚载体技术方法中的包封率低、稳定性差，具有良好缓慢释放和保护氧化降解作用的包封多酚类化合物的多酚类化合物-蛋白-多糖纳米粒子。
本发明的目的之二是提供一种制备上述具有核壳结构的多酚-蛋白-多糖纳米粒子的简单、高效、安全、环保的制备方法。
本发明的一种包封多酚类化合物的纳米粒子，是以多酚类化合物与蛋白为核，多糖为壳的多酚类化合物-蛋白-多糖纳米粒子；所述多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或半乳甘露聚糖，或者是不带电荷的具有还原性羟基的多糖或该多糖的衍生物。
所述的多酚类活性物质包括表没食子儿茶素没食子酸酯、茶多酚、单宁、姜黄素或白藜芦醇；所述的蛋白包为酸法明胶、碱法明胶、谷蛋白或麦醇溶蛋白。
本发明的制备方法是以多酚类化合物、蛋白、多糖为原料，包括以下制备步骤为：（1）经Maillard反应制备蛋白-多糖共价结合物；（2）在室温下，水溶液中直接混合多酚类化合物与蛋白-多糖共价结合物并调节溶液pH值为3-8使得多酚类化合物与蛋白-多糖共价结合物通过非共价作用力进行自组装形成以多酚类化合物-蛋白-多糖纳米粒子。
本发明的制备方法简单，不需要使用有毒的化学试剂，不需要高温高压，不需要对蛋白进行加热交联，所采用的技术都在水相中进行，符合绿色环保要求。
一般情况下，利用蛋白纳米粒子包裹多酚类物质难以得到单分散的纳米颗粒，主要原因是蛋白和多酚存在较强的非共价相互作用力，蛋白/多酚体系自发产生凝聚反应，不稳定的凝聚进一步导致宏观沉淀的发生。而在已公开的蛋白-多糖药物载体专利文献中，由于蛋白和多糖本身具有很好的亲水性，如果不采用蛋白加热交联技术对蛋白结构进行变性，一般难以使组装发生并得到单分散的纳米粒子。在本发明中，发明人通过研究意外的发现，本发明在制备过程完全不需加热或是加入交联剂等额外的控制条件，就制得具有良好单分散效果的多酚-蛋白-多糖纳米粒子。发明人通过进一步研究发现这是由于在本发明中，一方面利用Maillard反应使蛋白分子共价连接亲水性的多糖分子，共价的亲水多糖链段可以为蛋白/多酚的凝聚反应提供额外的立体稳定作用，阻止沉淀的发生；另一方面，充分利用多酚这类物质既是需要被保护的活性物质，同时又可充当桥接蛋白分子的“交联剂”。通过以上三种成分的相互作用从而最终实现载体对多酚类物质的有效包封，将有利于提高多酚在体内的生物利用度，同时为保护多酚的活性提供了新的有效途径。目前，这方面的研究还没有文献报道。
本发明制备纳米粒子方法简单，即包括以下两步：1、蛋白和多糖在干热条件下发生Maillard反应生成蛋白-多糖共价结合物；2、直接混合多酚与蛋白-多糖共价结合物，调节溶液的pH值，即可获得具有多酚与蛋白核-多糖壳结构的纳米粒子。其制备原理满足以下两点：第一，蛋白与多糖形成共价结合物；第二，多酚与蛋白-多糖共价结合物通过非共价作用力进行自组装。
本发明使用天然来源的蛋白、多糖为原料，不使用任何有机溶剂，通过两个步骤即可制备得到稳定和单分散的纳米粒子。本发明的第一步，通过Maillard反应将多糖共价偶联到蛋白上，形成蛋白-多糖共价结合物。蛋白和多糖的Maillard反应条件，现有实验技术即能实现，本文不另加讨论。较优化的Maillard反应条件：温度为30-120℃，时间为30s-300h，pH为3-12，反应可以在固相进行，也可以在液相进行。上述反应条件温和易控，反应产物一般不表现明显的褐色反应，水溶性较好。一般而言，当反应在较高温度进行时，所需时间大大缩短；当反应在较高pH进行时，所需时间也将大大缩短。另外，通过控制多糖、蛋白的投料比以及多糖链长，可以调节蛋白-多糖共价结合物中多糖的含量。蛋白与多糖的投料质量比值在1:50到50:1之间，多糖分子量在1K到1000K之间所制备的蛋白-多糖共价结合物可以形成纳米粒子。本发明的Maillard反应产物不需要进一步分离，可以直接进行下一步反应。
本发明的第二步，将第一步制备得到的Maillard反应产物加水溶解后，然后加入多酚溶液，调节混合溶液的pH值到，多酚和蛋白存在非共价作用力而倾向于发生自组装自动生成纳米粒子。
本发明中，蛋白为明胶、谷蛋白、麦醇溶蛋白，或其他具有良好生物特性的蛋白。多糖为含有还原性端羟基的多糖，可以是直链型多糖和支链型多糖，例如葡聚糖、普鲁兰多糖和半乳甘露聚糖。多酚为茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、单宁、白藜芦醇或姜黄素，也可以是其它多酚类化合物或衍生物。蛋白分子链中含多种疏水和带电荷氨基酸残基，可以与多酚分子上的大量酚羟基发生氢键、疏水相互作用等非共价作用力。通过控制溶液pH值、多酚浓度、蛋白浓度可以调节纳米粒子的尺寸在50-1000nm之间变化，将多酚负载到蛋白-多糖纳米粒子中，达到高负载量和高包封率的目的，为降低多酚易降解性和不稳定性提供一种新的有效保护途径。
将所得的多酚类化合物-蛋白-多糖纳米粒子通过加入交联剂戊二醛或京尼平将纳米粒子进行进一步交联。
图1为所发明茶多酚-碱法明胶-葡聚糖纳米粒子的透射电子显微镜（TEM）图，该图显示了该纳米粒子呈现球形，粒径均匀。该图还说明纳米粒子具有以多酚与蛋白为核、多糖为壳的结构，即多酚与蛋白分子主要位于纳米粒子的内部，而亲水性的多糖位于纳米粒子的外部，起着稳定界面的作用。
图2显示了利用本发明获得的茶多酚-碱法明胶-葡聚糖纳米粒子的粒径分布，具有很好的单分散性，用动态光散射测定流体力学直径大约在40-300nm之间。图2还显示了戊二醛和京尼平交联后的纳米粒子的粒径分布情况。交联的纳米粒子稀释时，粒径分布改变很小，从而可以显著降低纳米粒子的临界胶束浓度值，达到生物学实验的浓度要求。
图3为EGCG-酸法明胶-葡聚糖纳米粒子中EGCG在不同pH条件下的体外释放实验结果。在两种pH5.0和pH7.4介质中，包封后的EGCG释放速率都要比自由EGCG释放速率缓慢，说明包封EGCG的酸法明胶-葡聚糖载体对EGCG具有良好的缓释性能，将有效提高多酚类活性药物在体内的生物利用度。
图4为酸法明胶-葡聚糖纳米粒子对EGCG的抗降解保护作用结果。根据文献{FoodHydrocolloids 24(2010):735-743.}中的研究报道，EGCG的降解产物在425nm处有吸收，因此可以通过测试425nm处吸光度的变化值来确定EGCG的降解程度。本发明跟踪测试了不同pH值下的自由EGCG和经过酸法明胶-葡聚糖载体包封后的EGCG在425nm处吸光度随时间的变化值，结果显示了酸法明胶-葡聚糖载体对EGCG具有良好的保护作用。
图5中对比了自由EGCG、酸法明胶-葡聚糖共价结合物载体以及经载体包封后的EGCG对人类乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性，结果显示了酸法明胶-葡聚糖共价结合物载体对细胞的毒性影响相对较小，而自由EGCG和经载体包封后的EGCG在杀死肿瘤细胞过程中均显示出了时间的依赖性，随着作用时间的延长，EGCG逐渐发挥作用。
总之，本发明方法简单易行，避免使用对人体和环境有害的化学试剂，绿色环保，安全无毒，产物无需分离。同时，本发明内容可以提高和保护多酚类活性物质的缓释和抗降解性能，为多酚在食品、生物医药以及化妆品等领域的活性和作用范围显示了重要的应用价值和良好的应用前景。
附图说明
图1.包封多酚类活性物质的茶多酚-碱法明胶-葡聚糖纳米粒子的透射电镜TEM图；
图2.包封多酚类活性物质的茶多酚-碱法明胶-葡聚糖纳米粒子，以及经戊二醛和京尼平交联后的纳米粒子的粒径分布图；
图3.EGCG-酸法明胶-葡聚糖纳米粒子的缓释性能；
图4.酸法明胶-葡聚糖纳米粒子对EGCG的抗降解保护作用；
图5.EGCG-酸法明胶-葡聚糖纳米粒子对人类乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤细胞毒性。
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1.
茶多酚-碱法明胶-葡聚糖纳米粒子
分别将碱法明胶与不同分子量的葡聚糖进行Maillard反应合成碱法明胶-葡聚糖共价结合物，方法如下：将碱法明胶溶于去离子水中，配成20mg/mL的蛋白质溶液后分别加入分子量为10K、40K、70K和500K的葡聚糖到上述溶液中配制成不同分子量的葡聚糖和碱法明胶的混合溶液。搅拌混合后调节溶液的pH值为7-9，并将溶液冷冻干燥。将冷冻干燥后的固体置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中，保持相对湿度为79%，置于60℃下进行Maillard反应12-36h得到反应产物碱法明胶-葡聚糖共价结合物。将Maillard反应产物用去离子水溶解后，混合茶多酚溶液与碱法明胶-葡聚糖共价结合物溶液，使茶多酚与共价结合物的最终浓度均为1.0mg/mL，并调节溶液pH分别为3-8，得到不同组装条件下的茶多酚-碱法明胶-葡聚糖纳米粒子溶液。
表1.不同分子量的葡聚糖与碱法明胶形成的共价结合物与茶多酚自组装制备得到的纳米粒子的光散射分析结果
表2.不同溶液pH值下的茶多酚与碱法明胶-葡聚糖共价结合物形成的纳米粒子的粒径分布及包封率和负载量
实施例2.
表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）-酸法明胶-葡聚糖纳米粒子
酸法明胶和分子量为70K的葡聚糖进行Maillard反应合成酸法明胶-葡聚糖共价结合物，Maillard反应条件同例1。将Maillard反应产物用去离子水溶解，配成酸法明胶-葡聚糖浓度为20mg/mL的共价结合物溶液。混合不同浓度的EGCG溶液与酸法明胶-葡聚糖共价结合物溶液，得到不同EGCG浓度的EGCG-酸法明胶-葡聚糖纳米粒子溶液。表3为不同浓度的EGCG与酸法明胶-葡聚糖共价结合物形成的纳米粒子的光散射结果。
表3.不同浓度的EGCG与酸法明胶-葡聚糖共价结合物形成的纳米粒子的粒径分布及包封率和负载量
实施例3.
其他包封多酚类活性物质的蛋白-多糖纳米粒子
采用上述类似方法包封其他多酚类活性物质，制备得到不同的多酚-蛋白-多糖纳米粒子，其光散射分析及包封率和负载量结果如表4所示。
表4.包封多酚类活性物质的蛋白-多糖纳米粒子的粒径分布及包封率和负载量
实施例4.
戊二醛交联包封茶多酚的碱法明胶-葡聚糖纳米粒子
将碱法明胶与分子量为70K的葡聚糖进行Maillard反应合成碱法明胶-葡聚糖共价结合物，Maillard反应条件如例1。将Maillard反应产物用去离子水溶解，得到碱法明胶-葡聚糖共价结合物浓度为20mg/mL的溶液。混合茶多酚溶液与碱法明胶-葡聚糖共价结合物溶液，使茶多酚与共价结合物的终浓度均为1.0mg/mL，并调节溶液pH为5.0，并加入戊二醛溶液对所制备的纳米粒子进行交联，使其终浓度为0.1%，置于室温下反应过夜。得到粒径为122nm，多分散性指数为0.12的纳米粒子，其中茶多酚的包封率为76%，负载量为25%。
实施例5.
京尼平交联的包封茶多酚的碱法明胶-葡聚糖纳米粒子
将碱法明胶与分子量为70K的葡聚糖进行Maillard反应合成碱法明胶-葡聚糖共价结合物，Maillard反应条件如例1。将Maillard反应产物用去离子水溶解，得到碱法明胶-葡聚糖共价结合物浓度为20mg/mL的溶液。混合茶多酚溶液与碱法明胶-葡聚糖共价结合物溶液，使茶多酚与共价结合物的终浓度均为1.0mg/mL，并调节溶液pH为5.0，并加入京尼平溶液对所制备的纳米粒子进行交联，使其终浓度为0.1%，置于室温下反应过夜。得到粒径为130nm,多分散性指数为0.05的纳米粒子，其中茶多酚的包封率为78%，负载量为26%。
Claims (8)
1.一种包封多酚类化合物的纳米粒子的制备方法，其特征在于：以多酚类化合物、蛋白、多糖为原料，包括以下制备步骤为：(1)经Maillard反应制备蛋白-多糖共价结合物；(2)在室温下，水溶液中直接混合多酚类化合物与蛋白-多糖共价结合物并调节溶液pH值为3-8使得多酚类化合物与蛋白-多糖共价结合物通过非共价作用力进行自组装形成多酚类化合物-蛋白-多糖纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的多酚类活性物质选自EGCG、茶多酚、单宁、姜黄素或白藜芦醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所得的多酚类化合物-蛋白-多糖纳米粒子通过加入交联剂戊二醛或京尼平将纳米粒子进行进一步交联。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的Maillard反应条件是：
(1)反应温度是30-120℃；
(2)反应时间是30s-300h；
(3)反应pH值为3-12；
(4)反应在固相或者液相中进行。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征是多糖的分子量在1K～1000K之间；蛋白与多糖的质量比值在1:50-50:1之间。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白为酸法明胶、碱法明胶、谷蛋白或麦醇溶蛋白。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多糖是不带电荷的具有还原性羟基的多糖或该多糖的衍生物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或半乳甘露聚糖。
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