CN102908621A

CN102908621A - miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途

Info

Publication number: CN102908621A
Application number: CN2011102201478A
Authority: CN
Inventors: 翟琦巍; 周犇; 李程
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明涉及若干个microRNAs，特别是miR-181a作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途。本发明揭示了miR-181a在调节胰岛素敏感性中发挥作用，其通过抑制SIRT1表达而影响胰岛素敏感性。因此，miR-181a抑制剂可用于提高胰岛素敏感性，从而预防、缓解或治疗胰岛素敏感性下降、胰岛素抵抗、糖代谢失调相关的疾病。

Description

miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途

技术领域

本发明属于生物技术和药学领域；更具体地，本发明涉及若干个microRNAs，特别是miR-181a作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途。

背景技术

糖尿病是一种常见的危害人类健康的慢性代谢疾病。根据糖尿病的发病机制，可将糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病主要由于自身免疫性失常而导致胰腺中胰岛β细胞受损，进而引起胰岛分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，发病率占糖尿病的90％以上，其特点是胰岛素刺激的靶组织出现胰岛素抵抗症状。

胰岛素的主要功能为降低血糖水平，促进骨骼肌和脂肪对葡萄糖的吸收，同时抑制肝脏中的糖异生。当机体不能够对正常浓度的胰岛素产生适当的响应时即产生所谓的胰岛素抵抗。胰岛素抵抗会导致胰岛素分泌代偿性增加，长此以往会逐渐导致胰岛β细胞功能的衰竭。

肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，在维持空腹状态下内源性葡萄糖的生成、输出以及进食后葡萄糖的吸收、利用和储存等方面发挥着重要作用。肝脏胰岛素抵抗主要指胰岛素抑制肝细胞葡萄糖生成、肝糖异生和糖原降解的能力下降，这在很大程度上可导致空腹血糖的升高并持续刺激胰岛细胞分泌胰岛素。肝脏特异性敲除胰岛素受体底物Irs1或lrs2的小鼠分别在进食后或在禁食阶段表现出显著的胰岛素抵抗，证明肝脏胰岛素抵抗在高血糖、糖耐量异常和糖尿病中发挥着重要作用。胰岛素抵抗的发生成因复杂，受环境、遗传等多种因素影响，目前改善胰岛素抵抗依然是当前治疗2型糖尿病的主要方法之一。

SIRT1是一种保守的NAD+依赖性去乙酰化酶，属于哺乳动物Sirtuin家族成员之一，可使多种底物去乙酰化，行使广泛的生物学作用。目前对SIRT1的功能研究发现，它具有延长酵母、线虫和果蝇等多种生物寿命的功能。SIRT1在哺乳动物的肝脏、脂肪、肌肉、肾脏等多种器官和组织中广泛表达，并参与调节血糖平衡和胰岛素分泌等重要的生理过程。

目前越来越多研究表明SIRT1对胰岛素敏感性和2型糖尿病的具有改善作用，很可能成为治疗2型糖尿病的潜在分子靶标。在骨骼肌细胞、脂肪细胞和肝脏细胞中，SIRT1均显示出对胰岛素信号通路的正向调节作用。转基因过表达SIRT1的2型糖尿病模型db/db小鼠和高脂诱导的肥胖小鼠均表现出糖耐量和胰岛素敏感性的改善。口服给予高脂饮食诱导的老年小鼠，剂量为22.4mg/kg/天的SIRT1激动剂白藜芦醇，能够改善其胰岛素敏感性，并使其体重发生略微的下降。白藜芦醇和其他的一些SIRT1的小分子激动剂，例如SRT1720等，同样显示出可预防饮食诱导的肥胖和减轻胰岛素抵抗的特性。因此，SIRTI在胰岛素抵抗相关疾病如2型糖尿病、肥胖症等代谢疾病的发生、发展过程中有重要的作用，日后对于SIRT1调控因子的研究将为改善胰岛素抵抗和治疗2型糖尿病提供新的思路。

在肝脏中，SIRT1被认为参与调控葡萄糖体内平衡。SIRT1可以去乙酰化过氧化物酶增殖体受体γ辅活化因子1α(peroxisome proliferator-activatedreceptorγcoactivator-1alpha，PGC-1α)。PGC-1α是核受体过氧化物酶增殖体受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的一种转录辅活化因子，可在基因转录水平上调控肝脏中葡萄糖代谢。SIRT1通过去乙酰化PGC-1α使糖异生基因表达增加，同时抑制糖酵解基因的表达，从而诱导肝糖输出，调控肝脏的葡萄糖代谢。在胰岛素抵抗的肝细胞HepG2中，SIRT1蛋白水平降低，并且下调或抑制SIRT1可降低HepG2细胞中胰岛素受体磷酸化水平及糖原合成能力对胰岛素的响应，诱导产生胰岛素抵抗。在发生胰岛素抵抗的小鼠肝脏中用腺病毒过表达SIRT1可以缓解脂肪肝和胰岛素抵抗(Li，Y.，et al.，Hepaticoverexpression of SIRT 1in mice attenuates endoplasmic reticulum stress andinsulin resistance in the liver.FASEB J，2011)。

目前，一类参与基因转录后调控的非编码小RNA-microRNAs引起了越来越多生物学家的兴趣，成为现今生命科学领域的研究热点。从microRNAs的表达和生物学产生两个方面可以从如下几个标准对其进行定义：①成熟的miRNA是约有22个核苷酸长度，通过RNA印迹(Northern blot)可检测到的内源非编码RNA；②成熟的microRNAs来源于具有特定二级茎环结构的前体(pre-miRNA)；③成熟的microRNAs由Dicer酶不对称加工形成，在Dicer酶缺陷型个体中，会检测到pre-miRNA的累积；④成熟microRNAs的序列和pre-miRNA的茎环结构在不同物种间存在保守性。已经被鉴定的microRNAs可以通过一些网站进行检索，例如Sanger研究所的microRNA网站：http://microrna.sanger.ac.uk/。MicroRNAs广泛存在于真核生物中，在转录后水平调控基因的表达，参与细胞增殖、分化、代谢和凋亡等一系列生理进程，调节生物体的生长、发育和代谢，并与多种疾病相关。

MicroRNAs进入RISC形成miRNP，在动物细胞中microRNAs通常与靶基因3’UTR以完全或不完全配对的形式相结合，从而引导miRNP到达目标mRNA。MiRNP与目标mRNA的相互作用可以直接抑制靶基因翻译的起始，也可以加速目标mRNA的去腺苷化，从而抑制翻译的起始或导致目标mRNA稳定性降低发生降解，从而调节基因表达。

目前的研究表明microRNAs在代谢相关组织，如脑，肝脏，肌肉，脂肪和胰岛等组织中具有重要的生物学功能。但是，现有已经发现的microRNAs种类繁多，可能发挥着各种各样不同的功能，正面的或者负面的功能都有。因此，很有必要深入研究这些microRNAs，对其功能进行深入了解，以期找到新的、有用的药物靶点，为疾病的临床治疗寻找新的突破口。

发明内容

本发明的目的在于提供若干个microRNAs，特别是miR-181a作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途。

在本发明的第一方面，提供一种miR-181a抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。

在一个优选例中，所述的组合物还用于：抑制胰岛素抵抗，改善糖代谢，预防或治疗糖代谢失调相关疾病(如2型糖尿病)。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：

上调SIRT1蛋白的表达；

上调胰岛素刺激的InsR，Akt或Gsk3β磷酸化水平；和/或

上调胰岛素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。

在另一优选例中，所述的miR-181a抑制剂是抑制或阻止miR-181a(更特别地，为miR-181a的序列(SEQ ID NO：1)中第1-8位)与其靶向基因位点(较佳地，为SIRT1的3’UTR的UGAAUGUU序列位点)结合的物质。

在另一优选例中，所述的miR-181a抑制剂包括(但不限于)：miR-181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA(沉默miR-181a前体)；或携带或表达miR-181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸，肽核酸；siRNA的构建物。

在另一优选例中，所述的miR-181a抑制剂是：SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸，或2′-O-甲基化修饰的SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种miR-181a抑制剂，其是SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸，或2′-O-甲基化修饰的SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸。

在本发明的另一方面，提供miR-181a的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标。

在一个优选例中，所述的miR-181a用于筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miR-181a的体系；和

(2)检测所述体系中miR-181a的表达情况；

其中，若所述候选物质可降低miR-181a的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-181a的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中miR-181a的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-181a的体系；

如果测试组中miR-181a的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对miR-181a设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系还表达SIRT1蛋白；

步骤(2)中，还包括：检测所述体系中SIRT1基因的转录或蛋白的表达(优选蛋白表达)情况，若转录或表达发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；或者，检测所述体系中miR-181a与SIRT1基因的相互作用(结合或互补)，若相互作用减弱(优选显著减弱，如弱20％以上，较佳的弱50％以上；更佳的弱80％以上)，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系还表达胰岛素通路中的InsR，Akt或Gsk3β；

步骤(2)中，还包括：检测所述体系中InsR，Akt或Gsk3β的磷酸化情况，若磷酸化发生上调(优选显著上调，如上调20％以上，较佳的上调50％以上；更佳的上调80％以上)，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系还表达糖原合成酶；

步骤(2)中，还包括：检测所述体系中糖原合成酶的表达或活性，若表达或活性发生上调(优选显著上调，如上调20％以上，较佳的上调50％以上；更佳的上调80％以上)，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达miR-181a的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如线虫)。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于提高胰岛素敏感性有用的物质。

在本发明的另一方面，提供一种测定miR-181a表达量的试剂的用途，用于制备诊断或检测动物胰岛素敏感性情况或胰岛素抵抗的试剂或试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种提高胰岛素敏感性的方法，包括下调动物中miR-181a的表达。

在另一优选例中，所述的方法包括：给予动物有效量的miR-181a抑制剂。由于MicroRNA的一个家族(如miR-181家族)中各个成员间序列相似，因此具有相似的靶基因，可能发挥相似的生物功能，比如miR-181a，miR-181b都具有调节肌肉细胞分化的功能(Naguibneva，I.et al.，The microRNA miR-181 targetsthe homeobox protein Hox-A11 during mammalian myoblast differentiation)，而miR-181a，miR-181c都能够下调SIRT1的表达(Saunders et al.，miRNAs regulateSIRT1 expression during mouse embryonic stem cell differentiation and in adultmouse tissues)，提示除了miR-181a外，miR-181家族的其他成员miR-181b，c，d也可能与胰岛素敏感性有关，抑制miR-181家族的表达可能提高胰岛素敏感性。

在本发明的另一方面，提供一种miR-27a和miR-146或其促进剂，以及miR-181b，miR-181c和miR-181d的抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种miRNA的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标(或用于筛选提高提高胰岛素敏感性的物质)，所述的miRNA选自：miR-27a、miR-146b、miR-181b，miR-181c或miR-181d。

在本发明的另一方面，一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(a1)用候选物质处理表达miRNA的体系；和

(a2)检测所述体系中miRNA的表达情况；

其中，若所述候选物质可提高miRNA的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；

其中，所述的miRNA选自：miR-27a或miR-146b。

在一个优选例中，上述步骤(a1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或步骤(a2)包括：检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系；如果测试组中miRNA的表达在统计学上高于(优选显著高于，如低20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

(b1)用候选物质处理表达miRNA的体系；和

(b2)检测所述体系中miRNA的表达情况；

其中，若所述候选物质可抑制miRNA的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；

其中，所述的miRNA选自：miR-181b、miR-181c，miR-181d。

在一个优选例中，上述步骤(b1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或步骤(b2)包括：检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系；如果测试组中miRNA的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达所述miRNA(选自：miR-27a、miR-146b、miR-181b、miR-181c，或miR-181d)的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如线虫)。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述miRNA(选自：miR-27a、miR-146b、miR-181b、miR-181c，或miR-181d)设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、MiR-181a作用于SIRT1 3’UTR。

A：在18个潜在的microRNAs中，miR-181a可显著抑制SIRT1 3’UTR的转录活性。在转染pRL-SIRT1-3’UTR及含相应microRNA前体的质粒72小时后，收集HEK293T细胞做荧光素酶基因检测。与pSIF-GFP(pSIF)相比^*p＜0.05，^**p＜0.01。除非另行说明，本图及其它图中误差值的坐标采用标准差。

B：人miR-181a序列与人、大鼠及小鼠中SIRT1 3’UTRs的序列比对。miR-181a的核心区域为加黑体：5’ACAUUCA 3’。

C：SIRT1 3’UTR突变体不具有抑制SIRT1 3’UTR的转录活性的作用。与其它各组相比，^**p＜0.01。

D：miR-181a核心区域突变体不具有抑制SIRT1 3’UTR的转录活性的作用。与其它各组相比^**p＜0.01。

图2、MiR-181a在转录水平抑制SIRT1蛋白表达。

A：miR-181a可显著抑制SIRT1蛋白表达，而miR-181a突变体对SIRT1蛋白表达没有影响。与pSIF-GFP(pSIF)或pSIF-181a-m相比，^**p＜0.01。

B：过表达miR-181a剂量依赖性抑制SIRT1蛋白表达。转染不同剂量的miR-181a类似物(图中简写为“miR-181a类”)72小时后，收集HEK293T细胞做免疫印迹试验检测。与未转染miR-181a类似物的细胞相比^**p＜0.01。

C：用反义核酸(anti-181a)抑制miR-181a可剂量依赖性上调SIRT1蛋白水平。转染不同剂量的anti-181a 72小时后，收集HEK293T细胞做免疫印迹试验检测。与未转染反义核酸的细胞相比^**p＜0.01。

D：过表达miR-181a不影响SIRT1 mRNA水平。在转染相应质粒(表达miR-181a质粒)72小时后，收集HEK293T细胞做实时定量PCR检测。

E：上调或下调miR-181a不影响SIRT1 mRNA水平。在转染相应核苷酸(miR-181a类似物)72小时后，收集HEK293T细胞做实时定量PCR检测。

图3、MiR-181a在产生胰岛素抵抗的HepG2细胞和db/db小鼠肝脏中上调。

A：葡萄糖胺成功诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗。用葡萄糖胺处理HepG2细胞18小时，100nM胰岛素刺激细胞15分钟后收集细胞做免疫印迹试验检测，未用胰岛素刺激细胞作为对照。磷酸化InsR(p-InsR)与不用葡萄糖胺但仅用胰岛素处理的相比减少，表示胰岛素抵抗发生。

B：MiR-181a在产生胰岛素抵抗的HepG2细胞中上调。葡萄糖胺处理HepG2细胞18小时后收集细胞做实时定量PCR检测。^**p＜0.01。

C：SIRT1蛋白水平在db/db小鼠肝脏中下调。蛋白水平通过免疫印迹试验检测。

D：MiR-181a在db/db小鼠肝脏中上调。肝脏样品取自经基因型检测的10周龄小鼠，MiR-181a表达水平用实时定量PCR检测。不同基因型小鼠各14只。

图4、过表达miR-181a抑制SIRT1表达并诱导肝脏胰岛素抵抗。

A：在HepG2细胞中miR-181a下调SIRT1蛋白水平及胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化。转染不同剂量的miR-181a类似物72小时后，用100nM胰岛素刺激细胞15分钟收集细胞做免疫印迹试验检测。

B：对(A)图中SIRT1蛋白水平及胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化水平的量化统计。与同组中未转染miR-181a类似物的细胞相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

C和D：在HepG2细胞中miR-181a抑制胰岛素诱导的糖原合成酶活性(C)及糖原合成(D)的上调。与未转染miR-181a类似物胰岛素刺激的细胞相比，^**p＜0.01。

E和F：在原代培养的肝脏(E)和C2C12肌肉细胞(F)中miR-181a类似物抑制SIRT1蛋白水平及胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化。蛋白水平通过免疫印迹试验检测。

图5、抑制miR-181a能够增加SIRT1的蛋白表达并提高胰岛素敏感性。

(A，B)在正常(A)和诱导胰岛素抵抗(B)状态下，用反义核酸抑制HepG2细胞中的miR-181a能够显著增加SIRT1的蛋白表达并提高胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化。指定浓度的反义核酸转染HepG2细胞72小时后，用100nM的胰岛素刺激细胞15分钟，提蛋白进行免疫印迹检测。

(C，D)对于(A和B)中正常(C)及诱导胰岛素抵抗状态(D)时SIRT1蛋白和InsR(IR)，Akt和Gsk3β磷酸化水平的灰度分析定量。^*p＜0.05，^**p＜0.01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。

(E，F)在正常(E)和诱导胰岛素抵抗(F)状态下，用反义核酸抑制小鼠肝脏原代细胞中的miR-181a能够显著增加SIRT1的蛋白表达并提高胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化。

(G，H)抑制miR-181a能够增加胰岛素诱导的糖原合成酶活性(G)以及糖原合成(H)的上调。^*p＜0.05，^**p＜0.01，与每组中未转染anti-181a的作差异分析。

图6、miR-181a对于胰岛素信号通路的调控依赖于SIRT1。

(A)正常状态下，在HepG2细胞中用腺病毒过表达SIRT1(Ad-SIRT1)能够回复miR-181a对于胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的抑制作用，腺病毒过表达的GFP(Ad-GFP)作为负对照，免疫印迹法用来检测蛋白及其磷酸化水平。

(B，C)对于(A)中感染了Ad-GFP(B)和Ad-SIRT1(C)的HepG2细胞中SIRT1蛋白和胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。^*p＜0.05，^**p＜0.01，与每组中未转染miR-181a类似物的作差异分析。

(D)在HepG2细胞中，诱导胰岛素抵抗的情况下，利用尼克酰胺(NAM)来抑制SIRT1的活性后，反义核酸anti-181a对于胰岛素刺激的InsR和Akt的磷酸化的上调作用消失。免疫印迹法用来检测蛋白及其磷酸化水平。

(E)对于(D)中尼克酰胺处理的HepG2细胞中SIRT1蛋白和胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。^*p＜0.05，^**p＜0.01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。

(F)在SIRT1敲除小鼠(KO)的肝脏原代细胞中，反义核酸anti-181a对于胰岛素敏感性的改善作用消失。

(G-H)对于(F)中野生型小鼠(WT)(G)以及SIRT1敲除小鼠(H)的肝脏原代细胞中SIRT1蛋白和胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。^*p＜0.05，^**p＜0.01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。^*p＜0.05，^**p＜0.01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。

图7、小鼠体内实验证明miR-181a能够调节SIRT1的蛋白水平以及肝脏胰岛素敏感性。

(A和B)在小鼠肝脏中利用腺病毒载体过表达miR-181a(Ad-miR-181a)导致胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化的减弱。对八周龄的雄性C57BL/6小鼠尾静脉注射表达miR-181a和GFP(Ad-GFP)的腺病毒载体，注射12天后杀小鼠检测肝脏中miR-181a的表达(A)和胰岛素信号通路一些蛋白的磷酸化(B)。^*p＜0.05，每组9只小鼠。

(C)对于(B)中SIRT1蛋白以及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3β磷酸化水平的灰度分析统计。与Ad-GFP组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

(D)高脂饮食诱导肥胖(DIO)的小鼠腹腔注射LNA-anti-181a增加了肝脏SIRT1蛋白的表达以及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3β磷酸化水平。

(E)对于(D)中SIRT1蛋白以及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3β磷酸化水平的灰度分析统计。与LNA-control组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

(F)注射LNA-anti-181a的DIO小鼠肝脏中miR-181a以及G6Pase，PEPCK的mRNA水平下降。与LNA-control组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01，每组11只小鼠。

(G)注射LNA-anti-181a的DIO小鼠饥饿血糖低于注射LNA-control对照组。与LNA-control组相比，^*p＜0.05，每组11只小鼠。

(H)Pearson correlation coefficient test显示注射LNA-anti-181a的DIO小鼠个体miR-181a的表达与饥饿血糖相关(n＝11)。

(I)最后一次注射LNA9天后，葡萄糖耐受性实验显示LNA-anti-181a改善了DIO小鼠的葡萄糖耐受性。与LNA-control组相比，^*p＜0.05，每组11只小鼠。

(J)LNA-anti-181a减少了(I)图中葡萄糖耐受性实验所作图的曲线下面积。与LNA-control组相比，^*p＜0.05，每组11只小鼠。

(K)Pearson correlation coefficient test显示注射LNA-anti-181a的DIO小鼠个体miR-181a的表达与葡萄糖耐受性实验所作图的曲线下面积相关(n＝11)。

图8、Western检测miR-27a和miR-146b对于细胞的胰岛素敏感性的影响情况。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，意外地发现了一些microRNA(miRNA)在调节胰岛素敏感性中发挥作用，这些miRNA包括：miR-181a、miR-27a、miR-146b。其中，miR-181a通过抑制SIRT1表达而影响胰岛素敏感性。基于本发明的揭示，所述的miR-181a的抑制剂以及所述的miR-27a、miR-146b本身可用于提高胰岛素敏感性，从而预防、缓解或治疗胰岛素敏感性下降、胰岛素抵抗、糖代谢失调相关的疾病，如2型糖尿病。

miR-181a及其用途

本发明中，所述的miR-181a是具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的小核糖核酸：

AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO：1)

miR-181a是为一种本领域已知的microRNA(miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。其在哺乳动物中非常保守，在动物的眼睛，胸腺，免疫细胞表达量较高。然而，对于miR-181a结合的靶点和其与胰岛素敏感性或糖代谢之间的关系目前并不清楚。

miR-181a可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miR-181a或其前体的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-181a或其前体。

本发明人发现，miR-181a是一个新的、与胰岛素敏感性密切相关的药物靶点，其藉由抑制SIRT1蛋白表达，抑制胰岛素信号通路，进一步下调胰岛素敏感性。针对miR-181a的各种治疗手段可以作为提高动物胰岛素敏感性的新颖和有效的手段。

miR-181a为靶点的药物筛选

在得知了miR-181a与胰岛素敏感性的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制miR-181a的物质。之后，可从所述的物质中找到对于提高胰岛素敏感性真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达miR-181a的体系；和检测所述体系中miR-181a的表达或活性；若所述候选物质可抑制miR-181a的表达或活性，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。所述的表达miR-181a的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-181a的细胞；或可以是重组表达miR-181a的细胞。所述的表达miR-181a的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-181a的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-181a的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于提高胰岛素敏感性真正有用的物质。

基于miR-181a的作用机理为：通过抑制SIRT1蛋白表达，进而发挥提高胰岛素敏感性的作用。因此还可以在筛选体系中表达SIRT1蛋白(较佳地包括其编码基因以及3’UTR区作为表达盒)。从而，可通过进一步观察所述体系中SIRT1蛋白的表达情况来分析候选药物的有效性。若SIRT1蛋白表达发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；或者，检测所述体系中miR-181a与SIRT1基因的相互作用(结合或互补)，若相互作用减弱，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

此外，还可以在筛选体系中表达胰岛素通路中的关键因子，如InsR，Akt或Gsk3β，从而通过观察所述体系中这些因子的磷酸化情况来分析候选物质的有效性。若磷酸化水平发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

此外，还可以在筛选体系中表达糖原合成酶，从而通过观察所述体系中糖原合成酶的表达或活性来分析候选物质的有效性。若磷酸化水平发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

本发明对于SIRT1、InsR，Akt、Gsk3β或糖原合成酶的基因转录、蛋白表达、蛋白活性、蛋白存在量、分泌情况或磷酸化情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的PCR技术，或蛋白定量或半定量检测技术进行，例如(但不限于)：RT-PCR法，SDS-PAGE法，Western-Blot法等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的提高胰岛素敏感性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制miR-181a的表达和活性，进而提高胰岛素敏感性有用的物质。

miR-27a、miR-146b及其用途

本发明人还找到了若干miRNA，它们对于提高胰岛素敏感性是有用的，所述的miRNA选自miR-27a或miR-146b。

因此，所述的miR-27a或miR-146b或它们的促进剂可用于制备提高胰岛素敏感性的组合物，并且也可以用于作为药物筛选的靶点，筛选通过提高miR-27a或miR-146b的表达或活性而提高胰岛素敏感性的组合物。

所述的miRNA(选自miR-27a或miR-146b)的促进剂是指任何可提高miRNA或其前体的活性、提高miRNA或其前体的稳定性、上调miRNA或其前体的表达、增加miRNA或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调miRNA有用的物质，从而可用于提高胰岛素的敏感性。此外，一些miRNA的模拟物(mimic)或其它修饰形式也可以作为miRNA的促进剂，只要它们具有与所述miRNA相同的效果，或者能够提高miRNA的表达或活性。

因此，本发明提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达miR-27a或miR-146b的体系；和检测所述体系中miR-27a或miR-146b的表达或活性；若所述候选物质可提高(显著提高，如提高20％；更佳地提高40％；更佳地提高60％)miR-27a或miR-146b的表达或活性，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。所述的表达miR-27a或miR-146b的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-27a或miR-146b的细胞；或可以是重组表达miR-27a或miR-146b的细胞。所述的表达miR-27a或miR-146b的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-27a或miR-146b的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-27a或miR-146b的体系。

miR-181b，c，d及其用途

本发明人还推测若干个miRNA，它们对于提高胰岛素敏感性是有用的，所述的miRNA选自miR-181b，c，d。

因此，所述的miR-181b，c，d的抑制剂可用于制备提高胰岛素敏感性(通过下调这些miRNA的表达或活性)的组合物，并且也可以用于作为药物筛选的靶点，筛选通过提高miR-181b，c，d的表达或活性而提高胰岛素敏感性的组合物。

因此，本发明提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达miR-181b，c，d的体系；和检测所述体系中miR-181b，c，d的表达或活性；若所述候选物质可降低(显著降低，如降低20％；更佳地降低40％；更佳地降低60％)miR-181b，c，d的表达或活性，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。所述的表达miR-181b，c，d的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-181b，c，d的细胞；或可以是重组表达miR-181b，c，d的细胞。所述的表达miR-181b，c，d的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-181b，c，d的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-181b，c，d的体系。

miRNA调节剂及其用途

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miRNA抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物，所述的miRNA选自miR-181a，b，c，d。进一步地，所述的miR-181a抑制剂还可用于促进SIRT1基因的转录或蛋白的表达；抑制血管内皮生长因子的转录或表达；或抑制软骨细胞的凋亡。

如本文所用，所述的“miRNA抑制剂”包括了核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调miRNA或其前体的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

所述的miRNA抑制剂是指任何可阻止miRNA(特别是其中的结合关键位点)或其前体与其靶向序列结合、降低miRNA或其前体的活性、降低miRNA或其前体的稳定性、下调miRNA或其前体的表达、减少miRNA或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miRNA有用的物质，从而可用于提高胰岛素的敏感性。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调miRNA的表达。

作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是核酸抑制物。较佳地，所述的核酸抑制物通过阻止miRNA与其靶向序列结合，从而发挥作用。所述的核酸抑制物例如选自(但不限于)：miRNA的反义核酸，miRNA的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA(沉默miRNA前体)。

作为本发明的优选方式，所述的miRNA的抑制剂是miRNA的反义核酸。如本文所用，“反义核酸”又称为“反义核酸”或“反义寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides)”或“反义药物”，是指长度约为15-30个碱基的DNA分子、RNA分子它们的经修饰的形式或它们的类似物，可与mRNA互补。

本领域人员均了解，根据本发明提供的反义核酸，可以进行适当的变化并保留其活性，这些变化形式均可用于本发明。任何可起到抑制或沉默miRNA的作用的反义核酸都是可用于本发明的，其类型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miRNA的反义核酸是与miRNA的序列基本上(较佳地为完全)互补的序列。例如，当所述的miRNA为miR-181a时，所述的miR-181a的反义核酸与SEQ ID NO：5所示的序列具有80％以上的相同性，较佳地具有85％以上的相同性，更佳地具有90％以上的相同性，最佳地具有95％以上的相同性，如具有96％、97％、98％或99％以上的相同性；或者所述的miR-181a的反义核酸是SEQ ID NO：5所示序列的片段；它们均具有SEQ ID NO：5所示序列的反义核酸相同的功能。

现有技术中已经指出了一些反义核酸的变化形式是可取的，它们也可以针对相应的靶序列发挥抑制作用。如Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleotides(2294-2304 Nucleic Acids Research，2006，Vol.34，No.8)文献中提到，在反义核酸的两个末端截短1个碱基是可以保留其活性的。又如Designand delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in culturedDrosophila and human cells(NATURE PROTOCOLS；VOL.3NO.10；2008；1537-1549)文献综述了多个研究，认为一般而言，在反义核酸的两边延长一些碱基是可以的。而在反义核酸和miRNA间亲和性很高(如锁核酸修饰)时，反义核酸可以被截短到约2/3长度。

如本文所用，所述的“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

在本发明中，所述的“反义核酸”还包括经修饰的反义核酸，所述的修饰基本不改变反义核酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核酸的修饰包括但不限于：锁核酸修饰、甲氧基化修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替，这些修饰均是本领域技术人员易于实现的。优选地，所述的修饰为锁核酸修饰。

组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的miRNA(选自miR-27a或miR-146b)或其促进剂；或含有有效量的miRNA(选自miR-181a，b，c，d)抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于提高胰岛素敏感性。任何前述的miRNA或其促进剂或抑制剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述miRNA或其促进剂或抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的miRNA或其促进剂或抑制剂或它们的药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等。

本发明所述的miRNA或其促进剂或抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的miRNA或其促进剂或抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的miRNA或其促进剂或抑制剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料与方法

哺乳动物细胞株及细菌株

HEK293T：人胚胎肾细胞系，由HEK293细胞衍生而来，同时表达SV40病毒的大T抗原。HepG2：人肝癌细胞系。C2C12：小鼠骨骼肌成肌细胞系。以上细胞株均购自中科院上海生命科学院细胞库。

DH5α细菌：用于质粒克隆的大肠杆菌。

主要试剂及试剂盒

miR-181a，miR-543，miR-30a，miR-199b，miR-200a，miR-7，miR-9，miR-22，miR-29a，miR-29b，miR-34a，miR-128，miR-132，miR-138，miR-154，miR-204，miR-212，miR-217从miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)得到。它们相应的Pre-miRNA序列相应的DNA序列化学合成经配对后连入pSIF-GFP的BamH I/EcoR I位点，获得可表达microRNA的质粒。

miR-181a：AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO：1)

miR-181a的前体(Pre-Hsa-miR-181a)：

TGAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGTTGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCCA(SEQ ID NO：2)

MiRNA-181a核苷酸类似物(即miR-181a mimics)；反义核酸(anti-181a)及miR-181a锁核酸反义核酸(LNA-anti-181a)均合成于上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma，Shanghai，China)。它们的序列或结构是：

MiRNA-181a核苷酸类似物序列或结构：

正义：5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU TT-3’(SEQ ID NO：3)；

反义：5’-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU TT-3’(SEQ ID NO：4)。

反义核酸为2′-O-甲基化修饰的：ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT(SEQ ID NO：5)，每个碱基均有2′-O-甲基化修饰。

miR-181a锁核酸反义核酸(LNA-anti-181a)：购于Exiqon公司。

Taq酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；细菌培养用胰蛋白胨、酵母粉购自Oxoid公司；琼脂粉购自捷倍思公司；核酸分析电泳用琼脂糖购自Biowest公司；质粒大抽试剂盒购自Qiagen公司。细胞总RNA抽提试剂TRIzol购自Invitrogen公司；M-MLV反转录试剂盒购自Promega公司；miR-181a反转录试剂盒购自Applied Biosystems公司。烟酰胺(nicotinamide)，棕榈酸(palmitate)，葡萄糖胺(D-(+)-Glucosamine hydrochloride)均购自Sigma公司；注射用胰岛素购自Novo Nordisk公司；PVDF膜购自Millipore公司；蛋白印迹化学发光试剂

West Pico Chemiluminescent Substrate购自Thermo Scientific公司，ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate购自Millipore公司；X-Omat光片购自Kodak公司。

抗体

小鼠品系和饲养条件

C57BL/KsJ-db/db雄性小鼠购自南京大学模式动物中心，C57BL/6雄性小鼠购自中国科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司(SLAC，Shanghai，China)。SIRT1+/-小鼠(129/Sv背景)获自Professor Departments of Medicine andBiochemistry，Microbiology and Immunology，University of Ottawa，经交配后获得SIRT1^-/-小鼠。

高脂食物诱导肥胖小鼠实验选用Research Diets公司的饲料。

普通食物(chow，D12450B)，其中蛋白含量为19.2gm％(20kcal％)，碳水化合物67.3gm％(70kcal％)，脂肪4.3gm％(10kcal％)。

高脂肪含量食物(high fat diet，D12451)，其中蛋白含量为24gm％(20kcal％)，碳水化合物41gm％(35kcal％)，脂肪24gm％(45kcal％)。

生物信息学

人、小鼠及大鼠的SIRT1 3’UTR序列从NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中检索得到，具体如SEQ ID NO：6(Human：GeneID：23411，3’UTR序列)、SEQ ID NO：7(Mouse GeneID：93759)、SEQ ID NO：8(Rat，GeneID：309757)；。运用miRBase，TargetScan，PicTar和miRanda四个预测软件相结合的方式预测出可能与SIRT1 3’UTR存在相结合位点的潜在microRNAs。

细胞实验

HEK293T和HepG2细胞株培养在含10％FBS和25mM葡萄糖的DMEM培养液中。为诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗，将培养液换为含18mM葡萄糖胺和5mM葡萄糖的DMEM，培养18小时后，加入100nM的胰岛素刺激细胞20分钟后收样，作western blot和糖原合成实验样品用。

C2C12成肌细胞培养于含10％FBS和25mM葡萄糖的DMEM培养液中，培养至密度100％时，换含2％马血清的DMEM继续培养4天至分化成为肌细胞。之后将对照组培养液换为含2％BSA和10％FBS的DMEM培养18小时，实验组则多加0.75mM的棕榈酸来诱导胰岛素抵抗。接下来用100nM的胰岛素刺激细胞20分钟后收样，作western blot和葡萄糖摄取实验样品用。

原代小鼠肝细胞的制备参照文献中报道(参见Koo，S.H.，et al.，PGC-1promotes insulin resistance in liver through PPAR-alpha-dependent induction ofTRB-3.Nat Med，2004.10(5)：p.530-4)的胶原灌注法，培养于含10％FBS和25mM葡萄糖的DMEM培养液中。

细胞一般每两天传代一次，保持传代时的密度为70％至80％之间，并培养基中始终含有100U/ml的青霉素及100μg/ml的链霉素。细胞在转染前16-24小时接种到24孔板或12孔板中。细胞转染均采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，转染72小时后收集样品，进行荧光素酶检测。

质粒构建

pSIF-GFP质粒(简称pSIF)获自中科院生物化学和细胞生物学研究所(Lu，Z.，et al.，MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmedcell death 4 gene.Oncogene，2008.27(31)：p.4373-9)。

pRL-TK和pSV40-β-gal质粒购自Promega公司。

小鼠的SIRT1 3’UTR序列使用下列引物从小鼠基因组DNA中扩增得到：5’-ATTGCTAGCACTATTGAAGCTGTCCGGATTC-3’(SEQ ID NO：9)和5’-ATTGCTAGCAGCTGTCCGGATTCAGGAATTG-3’(SEQ ID NO：10)。经XbaI/Not I位点插入pRL-TK质粒构建成pRL-SIRT1-3’UTR。

SIRT1 3’UTR reporter突变体(即SIRT1 3’UTR突变的pRL-SIRT1-3’UTR)使用QuickChange mutagenesis kit(Stratagene)参照其使用说明构建而成，使用的引物序列如下：

5’-GGAACTTTAGCATGTCATTACTTGTGAACTTGAAC-3’(SEQ ID NO：11)；和

5’-GTTCAAGTTCACAAGTAATGACATGCTAAAGTTCC-3’(SEQ ID NO：12)。

pSIF-181a-m突变所使用的引物序列为：

5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’(SEQ ID NO：13)；和

5’-AUAAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’(SEQ ID NO：14)。

表达SIRT1，miR-181a，GFP的腺病毒的构建：使用Stratagene公司的pshuttle-CMV腺病毒系统，SIRT 1编码序列(NCBI Reference Sequence：NM_001142498.1)，miR-181a及其上下游序列(Gene ID：387176，克隆用引物：Forward：CCGAGATCTATCCTGCAGCTCATTTCTG(SEQ ID NO：29)；Reverse：GTACTCGAGAGGCCACAGGACTGTATCTT(SEQ ID NO：30))，GFP的序列连入pshuttle-CMV载体，按照该表达系统的说明书进行体外重组产生腺病毒。

报告基因检测

细胞样品用荧光素酶报告基因裂解缓冲液(Promega)收取，并用荧光素酶检测试剂盒进行检测。检测体系为20μl细胞裂解液加20μl底物，迅速混匀后用化学发光仪进行荧光素酶活性的检测。

β-半乳糖苷酶(galactosidase)酶活性的检测如下：从检测荧光素酶报告基因裂解液中取20μl加入到96孔板中，加入30μl 0.25M Tris-Cl(pH 8.0)溶液和50μl 2×β-gal assay buffer，混匀后37℃孵育1-2小时，用酶联免疫检测仪通过OD420检测β-galactosidase活性，以其读数作为内标来校正荧光素酶的读数，以排除转染效率方面的差异。

RNA抽提与实时定量PCR

细胞和组织样本用Trizol(Invitrogen)裂解参照使用说明抽提总RNA。之后用Takara公司的RNase-free DNase I试剂盒处理以去除DNA污染，经纯化后检测其纯度及浓度，一般OD260/280＞1.9时符合使用标准，取2-4μg总RNA按照M-MLV反转录酶(Promega)，逆转录系统参照说明书，用随机引物进行反转录，得到cDNA，用于后续的实时定量PCR检测。

Real-time PCR在384孔板上以三复孔方式进行。每孔含有5μl Power

Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，0.4μM正向和反向引物和1μl模板DNA(cDNA根据浓度稀释至10ng/μl)，用ABI公司的7900system来进行实时荧光监测。PCR反应条件是50℃2min，95℃10min，随后是95℃15s和60℃1min的40个循环。为了确定没有非特异性扩增，每一对引物扩增出来的PCR产物都用熔解曲线进行分析，同时也进行琼脂糖电泳以确保产物的特异性。用于相关基因检测的PCR引物如下：

小鼠actin：5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’(SEQ ID NO：15)

5’-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’(SEQ ID NO：16)；

小鼠G6Pase：5’-ACCTCGTCTTCAAGTGGAT-3’(SEQ ID NO：17)

5’-GACAGGGAACTGCTTTATT-3’(SEQ ID NO：18)；

小鼠PEPCK：5’-CTGGCACCTCAGTGAAGACA-3’(SEQ ID NO：19)

5’-TCGATGCCTTCCCAGTAAAC-3’(SEQ ID NO：20)；

小鼠SIRT1：5’-TATTCCACGGTGCTGAGGTA-3’(SEQ ID NO：21)

5’-AACTTGGACTCTGGCATGTG-3’(SEQ ID NO：22)；

小鼠U6：5’-GCTCGCTTCGGCAGCACAT-3’(SEQ ID NO：23)

5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’(SEQ ID NO：24)；

人SIRT1：5’-GCCAGAGTCCAAGTTTAGAAGA-3’(SEQ ID NO：25)

5’-CCATCAGTCCCAAATCCAG-3’(SEQ ID NO：26)；

人GAPDH：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(SEQ ID NO：27)

5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ ID NO：28)。

检测miR-181a的引物：购于ABI公司。

Western blot

细胞用SDS-PAGE上样缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 6.8，2％SDS，10％甘油，100mM DTT)裂解，100℃煮沸5分钟使其变性，离心后取上清，上样于8％或10％SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳，湿转，PVDF膜经含5％脱脂奶粉的TBS/T于室温封闭1小时后，用含5％BSA的TBS/T稀释的一抗4℃孵育过夜，经TBS/T充分洗涤后，与用含5％BSA的TBS/T稀释的二抗室温反应1～2小时，洗涤，最后用化学发光试剂SuperSignal West Pico检测，于Kodak X-Omat胶片上曝光。

糖原合成实验及糖原合成酶活性测定

糖原合成实验方法参考文献Sun，C.，et al.，SIRT1 improves insulinsensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B.Cell Metab，2007.6(4)：p.307-19；Sakai，K.，H.B.Lowman，and D.R.Clemmons，Increasesin free，unbound insulin-like growth factor I enhance insulin responsiveness inhuman hepatoma G2 cells in culture.J Biol Chem，2002.277(16)：p.13620-7。简要的步骤如下，HepG2细胞转染miRNA mimics或反义核酸72小时后，用含100nM胰岛素、1μCi/ml[3H]葡萄糖和5mM葡萄糖的DMEM培养液处理3小时之后，收集细胞进行糖原合成实验。每孔加入200μl含5mg/ml糖原的30％KOH，60℃裂解30分钟。收集裂解液，加入1ml乙醇混匀后放于-20℃冰箱中沉淀过夜。5,000g离心10分钟后分离糖原，用75％预冷的冰乙醇洗两次。最后，用200μl 0.1M的HCl溶解，通过液闪仪进行检测。

糖原合成酶活性测定参考文献Thomas，J.A.，K.K.Schlender，and J.Larner，A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase，includingan improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.Anal Biochem，1968.25(1)：p.486-99。HepG2细胞用含有或不含100nM胰岛素处理10分钟后收集样品进行后续测定，其中选用的UDP-[3H]葡萄糖购自GE Healthcare。

动物实验

病毒过表达小鼠体内miR-181a的实验中，通过尾静脉注射将表达miR-181a或GFP的病毒以1×10⁹pfu/鼠的剂量注射到8周龄雄性C57BL/6小鼠体内，12天后收集小鼠肝脏样品进行检测。

检测食物诱导肥胖(diet-induced obesity，DIO)小鼠体内抑制miR-181a的试验中，51只4周龄C57BL/6小鼠适应环境两周后，按照体重随机分为2组，其中15只为一组的给予正常饲料，另外36只为一组的两组给予高脂饲料。喂养8周后，将锁核酸miR-181a反义链或锁核酸对照以8mg/kg的剂量注射到DIO小鼠体内，每5天注射一次，连续注射3次。最后一次注射后的第5天，实验前将小鼠禁食4小时，之后检测其空腹血糖。最后一次注射后的第9天，葡萄糖耐受性实验前将小鼠禁食13小时后根据体重注射2g/kg的葡萄糖溶液，检测空腹血糖后，分别用血糖仪检测注射后15，30，60和120分钟对小鼠的血糖值进行检测。最后一次注射后的第12天，收集小鼠肝脏样品对其体内胰岛素信号通路进行检测。实验前将小鼠禁食16小时，腹腔注射5U/kg人胰岛素或PBS，15分钟后取其肝脏样品。

数据分析及统计

所有定量数据以用平均值±标准偏差表示，每次实验至少重复3次。除特别标注外，两组间数据差异显著性比较均采用非成对Student’s t-test，p＜0.05代表具有统计学意义的显著性差异，p＜0.01代表差异极显著。相关性分析采用Pearson correlation coefficient test。

II.实施例

实施例1、miR-181a直接作用于SIRT1 3’UTR上的结合位点

为了找到作用于SIRT1 3’UTR的microRNAs，本发明人首先利用miRBase，miRanda，PicTar和TargetScan四个预测软件相结合的方法来找寻潜在的microRNAs，最终确定出18个潜在的microRNAs，分别是miR-181a，miR-543，miR-30a，miR-199b，miR-200a，miR-7，miR-9，miR-22，miR-29a，miR-29b，miR-34a，miR-128，miR-132，miR-138，miR-154，miR-204，miR-212，miR-217。之后，本发明人构建并利用受SIRT1 3’UTR调控的荧光素酶报告基因质粒检测了此18个潜在的microRNAs对SIRT1 3’UTR转录活性的影响。将可表达上述的microRNA的质粒(重组pSIF质粒)与受SIRT1 3’UTR调控的荧光素酶报告基因质粒(pRL-SIRT1-3’UTR)共转HEK293T细胞。以共转pSIF空质粒和pRL-SIRT1-3’UTR的HEK293T细胞作为对照(即图中pSIF)。

结果如图1A所示，在HEK293T细胞中miR-181a，miR-543，miR-30a，miR-199b和miR-200a均能显著降低SIRT1 3’UTR的转录活性，其中miR-181a的效果尤为显著。

为了研究miR-181a是否直接作用于SIRT1 3’UTR，本发明人利用PicTar数据库分析了人、大鼠和小鼠三个不同种属SIRT1中3’UTR序列的特点，发现不同种属SIRT1 3’UTR中都包含一个较为保守的miR-181a结合位点(图1B)。

本发明人将荧光素酶报告基因质粒pRL-SIRT1-3’UTR中的miR-181a结合位点突变后转入HEK293T细胞，同时转入可表达miR-181a的重组pSIF质粒，发现miR-181a不能对突变体报告基因质粒产生影响(图1C)。此外，突变了两个结合位点的miR-181a突变体也不能对正常的报告基因质粒产生影响(图1D)。

以上实验结果表明，miR-181a可以直接结合在SIRT1 3’UTR的结合位点，对SIRT1的转录产生影响。

实施例2、miR-181a在转录水平抑制SIRT1蛋白表达

MiR-181a抑制SIRT1 3’UTR转录活性提示miR-181a可能抑制SIRT1的蛋白水平，因此在转染表达miR-181a的重组pSIF质粒72小时后，收集HEK293T细胞，用Western blot来检测SIRT1的蛋白水平以验证这种可能性。如图2A所示，miR-181a可以下调内源SIRT1的蛋白水平，而miR-181a关键位点突变体(转入pSIF-181a-m)几乎没有这样的作用。

而且当转染(利用Lipofectamine 2000)不同剂量的miR-181a mimics到HEK293T细胞时，SIRT1蛋白水平显著下调并与miR-181a mimics成剂量效应(图2B)。

另外，转染(利用Lipofectamine 2000)不同剂量的anti-181a 72小时后，收集HEK293T细胞做免疫印迹试验检测。用miR-181a反义核酸(Anti-181a)来抑制miR-181a时，可以显著上调SIRT1蛋白并与miR-181a反义核酸成剂量效应(图2C)。

然而，不管是过表达(转染表达miR-181a的重组pSIF质粒)还是抑制miR-181a(转染miR-181a的反义核酸)均对HEK293T细胞内SIRT1 mRNA水平不产生影响(图2D和E)。

这些结果说明miR-181a是通过抑制SIRT1翻译来下调其蛋白表达的。

实施例3、miR-181a与肝脏胰岛素抵抗相关

MiR-181a下调SIRT1，而SIRT1又被认为是治疗胰岛素抵抗相关疾病的靶基因(Liang，F.，S.Kume，and D.Koya，SIRT1 and insulin resistance.Nat RevEndocrinol，2009.5(7)：p.367-73)，提示miR-181a很可能也与胰岛素抵抗相关。如图3A和B所示，用葡萄糖胺诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗时，miR-181a表达水平显著上升。

2型糖尿病模型db/db小鼠肝脏中，miR-181a表达水平也存在显著上升，而且SIRT1蛋白水平显著下降(图3C和D)。

这些结果表明在肝脏中产生胰岛素抵抗时，miR-181a表达量上升，miR-181a很可能与肝脏胰岛素抵抗相关。

实施例4、抑制SIRT1表达和肝脏胰岛素敏感性

为了验证miR-181a是否能够调节胰岛素敏感性，本发明人首先检测了在肝脏细胞中miR-181a对胰岛素信号通路的影响。胰岛素可诱导胰岛素信号通路中InsR的Tyr1151位点，Akt的Ser473位点和Gsk3β的Ser9位点发生磷酸化。

转染不同剂量的miR-181a类似物72小时后，用100nM胰岛素刺激细胞15分钟收集细胞做免疫印迹试验检测。本发明人发现，在HepG2细胞中miR-181a类似物可以剂量依赖性下调SIRT1蛋白水平及InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化水平(图4A和B)。同时miR-181a类似物能够剂量依赖性下调胰岛素刺激的糖原合成酶活性和糖原合成(图4C和D)。

另外本发明人在原代培养的小鼠肝细胞中和分化了的小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12中同样发现，miR-181a类似物可以剂量依赖性抑制SIRT1蛋白水平及胰岛素信号通路(图4E和F)。

以上实验结果表明，miR-181a类似物在肝脏细胞和肌细胞中均可以抑制SIRT1表达和胰岛素敏感性。

实施例5、抑制miR-181a对SIRT1表达和肝脏胰岛素敏感性具有上调作用

MiR-181a能够诱导产生胰岛素抵抗提示抑制miR-181a很可能有改善胰岛素敏感性的作用。首先本发明人在HepG2细胞中用miR-181a反义核酸抑制内源miR-181a，检测胰岛素敏感性的变化。在正常条件以及胰岛素抵抗条件下，抑制miR-181a均可以剂量依赖性上调SIRT1蛋白水平及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3β磷酸化水平(图5A和B)。

除此之外，本发明人发现在原代培养的小鼠肝脏细胞中，不管在正常条件还是胰岛素抵抗条件下，抑制miR-181a均可以剂量依赖性上调SIRT1蛋白水平及胰岛素刺激的InsR和Akt磷酸化水平(图5E-F)。

另外，在HepG2细胞中抑制miR-181a能够剂量依赖性上调胰岛素刺激的糖原合成酶活性和糖原合成(图5G-H)。

这些结果表明，在正常条件以及胰岛素抵抗条件下，抑制内源性miR-181a对SIRT1表达和肝脏胰岛素敏感性均有上调作用。

实施例6、miR-181a调节肝脏中胰岛素信号通路依赖于SIRT1

为了研究miR-181a对于肝脏中胰岛素信号通路的调节是否依赖于SIRT1，本发明人成功构建包装了表达SIRT1的腺病毒用其感染HepG2细胞，发现在腺病毒介导的SIRT1过表达条件下，miR-181a下调肝脏中胰岛素信号通路的作用减弱(图6A-C)。

在胰岛素抵抗情况下，本发明人用SIRT1抑制剂烟酰胺抑制HepG2细胞中SIRT1活性的同时，用miR-181a反义核酸抑制内源miR-181a，发现抑制miR-181a依然能够促进SIRT1蛋白表达但对于肝脏中胰岛素信号通路的上调作用消失(图6D-E)。

除此之外，本发明人在原代培养的SIRT1^-/-小鼠肝脏细胞中抑制内源miR-181a表达的实验，发现在胰岛素抵抗情况下miR-181a反义核酸改善胰岛素敏感性的作用显著削弱(图6F-H)。

上述结果表明，miR-181a调节肝脏中胰岛素信号通路依赖于SIRT1。

实施例7、miR-181a在体内对胰岛素敏感性和血糖的调节作用

为了进一步研究miR-181a在体内对胰岛素敏感性的调节作用，本发明人利用腺病毒在C57/BL6小鼠肝脏中过表达miR-181a(图7A)，发现小鼠肝脏中过表达miR-181a可以下调SIRT1蛋白水平及InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化水平(图7B-C)。

另外，本发明人腹腔注射LNA-anti-181a到DIO小鼠，发现LNA-anti-181a可显著抑制其体内的miR-181a表达，并可促进DIO小鼠肝脏中SIRT1蛋白水平及InsR，Akt和Gsk3β的磷酸化水平(图7D-E)。

同时本发明人还发现，LNA-anti-181a可下调肝脏中糖异生关键基因PEPCK和G6Pase的mRNA水平(图7F)。而且LNA-anti-181a注射的DIO小鼠的空腹血糖水平较对照小鼠下降(图7G)，Pearson correlation coefficient test显示注射LNA-anti-181a的DIO小鼠个体miR-181a的表达与饥饿血糖相关(图7H)，葡萄糖耐受也得到了改善(图7I)，葡萄糖耐实验受曲线下面积显著下降(图7J)。相关性分析显示肝脏中miR-181a水平分别和LNA-anti-181a注射的DIO小鼠的空腹血糖水平、葡萄糖耐实验受曲线下面积成正相关(图7K)。

以上体内实验结果表明，miR-181a可诱导肝脏胰岛素抵抗，抑制miR-181a有助于缓解高脂食物诱导的肝脏胰岛素抵抗，并改善糖代谢。

实施例8、一些miRNA的功能

本发明人还从众多miRNA中定位了一些对于调节胰岛素抵抗有用的miRNA，并进行了验证。

胰岛素刺激后，胰岛素受体酪氨酸位1146(p-IR1146)磷酸化增强，与酪氨酸位1151的磷酸化相似，都可以用来反映对于胰岛素的响应情况。

在HepG2细胞中，用葡萄糖胺(D-(+)-Glucosamine hydrochloride)诱导胰岛素抵抗的情况下，转染40nM的上述miRNA(miRNA mimics)72h后用100nM胰岛素刺激15分钟后裂解细胞收蛋白，Western检测这些细胞对于胰岛素的响应，发现miR-27a和miR-146b能够显著地改善HepG2细胞的胰岛素敏感性，如图8。

其中，miR-27a序列：5’uucacaguggcuaaguuccgc 3’(SEQ ID NO：31)；

miR-146b序列：5’ugagaacugaauuccauaggcu 3’(SEQ ID NO：32)。

miR-27a mimics：

正义：5’uucacaguggcuaaguuccgc tt 3’(SEQ ID NO：33)；

反义：5’gcggaacuuagccacugugaa tt 3’(SEQ ID NO：34)。

miR-146b mimics：

正义：5’ugagaacugaauuccauaggcu tt 3’(SEQ ID NO：35)；

反义：5’agccuauggaauucaguucuca tt 3’(SEQ ID NO：36)。

在HepG2细胞中，转染40nM的上述miRNA(miRNA mimics)72h后用100nM胰岛素刺激15分钟后裂解细胞收蛋白，Western检测这些细胞对于胰岛素的响应，推测miR-181b，c，d与miR-181a现象较一致，都能够导致HepG2细胞的胰岛素抵抗。提示与miR-181a的抑制剂类似，用这些miRNA的抑制剂抑制这些miRNA会提高胰岛素敏感性。

其中，miR-181b序列：5’aacauucauugcugucggugggu 3’(SEQ ID NO：37)；

miR-181c序列：5’aacauucaaccugucggugagu 3’(SEQ ID NO：38)；

miR-181d序列：5’aacauucauuguugucggugggu 3’(SEQ ID NO：39)

miR-181b mimics：

正义：5’aacauucauugcugucggugggu tt 3’(SEQ ID NO：40)

反义：5’acccaccgacagcaaugaauguu tt 3’(SEQ ID NO：41)

miR-181c mimics：

正义：5’aacauucaaccugucggugagu tt 3’(SEQ ID NO：42)

反义：5’acucaccgacagguugaauguu tt 3’(SEQ ID NO：43)

miR-181d mimics：

正义：5’aacauucauuguugucggugggu tt 3’(SEQ ID NO：44)

反义：5’acccaccgacaacaaugaauguu tt 3’(SEQ ID NO：45)

实施例9、筛药方法

(1)基于miR-181a进行筛药

设置：

测试组：HepG2细胞(其中内源表达miR-181a)，并给予候选物质；

对照组：HepG2细胞(其中内源表达miR-181a)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR-181a的表达情况，并进行比较。如果测试组中miR-181a的表达在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

将miR-181a的反义核酸anti-181a作为候选物质，加入到HepG2细胞培养物中，观察胞内miR-181a的表达情况，结果发现anti-181a可有效地降低miR-181a的表达，从而指示其可以作为提高胰岛素敏感性的候选药物。

(2)基于miR-27a进行筛药

设置：

测试组：HepG2细胞(其中内源表达miR-27a)，并给予候选物质；

对照组：HepG2细胞(其中内源表达miR-27a)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR-27a的表达情况，并进行比较。如果测试组中miR-27a的表达在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

将miR-27a mimics作为候选物质，加入到HepG2细胞培养物中，观察胞内miR-27a或其mimics的量，结果发现miR-27a或其mimics的量增加，从而指示miR-27a mimics可以作为提高胰岛素敏感性的候选药物。

(3)基于miR-146b进行筛药

设置：

测试组：HepG2细胞(其中内源表达miR-146b)，并给予候选物质；

对照组：HepG2细胞(其中内源表达miR-146b)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR-146b的表达情况，并进行比较。如果测试组中miR-146b的表达在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

将miR-146b mimics作为候选物质，加入到HepG2细胞培养物中，观察胞内miR-146b或其mimics的量，结果发现miR-27a或其mimics的量增加，从而指示miR-27a mimics可以作为提高胰岛素敏感性的候选药物。

(4)基于miR-181b，c，d进行筛药

设置：

测试组：HepG2细胞(其中内源表达miR-181b，c，d)，并给予候选物质；

对照组：HepG2细胞(其中内源表达miR-181b，c，d)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR-181b，c，d的表达情况，并进行比较。如果测试组中miR-181b，c，d的表达在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

将miR-181b，c，d的反义核酸作为候选物质，加入到HepG2细胞培养物中，观察胞内miR-181b，c，d的表达情况，结果发现miR-181b，c，d的表达被有效地降低，从而指示miR-181b，c，d的反义核酸可以作为提高胰岛素敏感性的候选药物。

讨论

NAD依赖的去乙酰化酶SIRT1被认为是胰岛素信号通路中正向调节因子。本研究发现，miR-181a可以结合在SIRT1mRNA的3’非翻译区的miR-181a结合位点，在翻译水平抑制SIRT1的蛋白表达。另外，本发明人发现在胰岛素抵抗的肝脏细胞和db/db小鼠肝脏中miR-181a表达量均呈上升趋势，提示miR-181a与肝脏中胰岛素抵抗具有一定相关性。进而本发明人在肝脏细胞中过表达miR-181a发现miR-181a可以抑制SIRT1蛋白表达并引起胰岛素抵抗；用反义核酸抑制肝脏细胞中的miR-181a则可以促进SIRT1蛋白表达并缓解肝脏胰岛素抵抗。分别通过在病毒过表达SIRT1，抑制SIRT1活性及SIRT1缺失情况下的对miR-181a作用于肝脏胰岛素信号通路的进行研究，本发明人发现miR-181a对肝脏中胰岛素敏感性的调节是依赖于SIRT1的。此外，本发明人的体内试验显示在小鼠肝脏中过表达miR-181a同样会破坏胰岛素信号通路；而通过腹腔注射锁核酸修饰的miR-181a反义核酸来抑制miR-181a可以改善DIO小鼠体内的葡萄糖代谢。综上所述，本发明人的研究表明miR-181a通过SIRT1调节肝脏中胰岛素敏感性，抑制miR-181a对胰岛素抵抗和II型糖尿病可能具有潜在的治疗意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种miR-181a抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：抑制胰岛素抵抗，改善糖代谢，预防或治疗糖代谢失调相关疾病。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：

上调SIRT1蛋白的表达；

上调胰岛素刺激的InsR，Akt或Gsk3β磷酸化水平；和/或

上调胰岛素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂是抑制或阻止miR-181a与其靶向基因位点结合的物质。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂是抑制或阻止miR-181a与SIRT1的3’UTR的UGAAUGUU序列位点结合的物质。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂包括：miR-181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA；或携带或表达miR-181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸，肽核酸；siRNA的构建物。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂是：SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸，或2′-O-甲基化修饰的SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸。

8.一种miR-181a抑制剂，其特征在于，其是SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸，或2′-O-甲基化修饰的SEQ ID NO：5所示的反义核苷酸。

9.一种miR-181a的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标。

10.一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miR-181a的体系；和

(2)检测所述体系中miR-181a的表达情况；

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-181a的体系中；和/或

如果测试组中miR-181a的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系还表达SIRT1蛋白；

步骤(2)中，还包括：检测所述体系中SIRT1基因的转录或蛋白的表达情况，若转录或表达发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；或者，检测所述体系中miR-181a与SIRT1基因的相互作用，若相互作用减弱，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系还表达胰岛素通路中的InsR，Akt或Gsk3β；

步骤(2)中，还包括：检测所述体系中InsR，Akt或Gsk3β的磷酸化情况，若磷酸化发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系还表达糖原合成酶；

步骤(2)中，还包括：检测所述体系中糖原合成酶的表达或活性，若表达或活性发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

15.一种测定miR-181a表达量的试剂的用途，用于制备诊断或检测动物胰岛素敏感性情况或胰岛素抵抗的试剂或试剂盒。

16.一种miRNA或其促进剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物；所述的miRNA选自：miR-27a或miR-146b。

17.一种miRNA的抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物；所述的miRNA选自：miR-181b、miR-181c，miR-181d。

18.一种miRNA的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标，所述的miRNA选自：miR-27a、miR-146b、181b、miR-181c或miR-181d。

19.一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(a1)用候选物质处理表达miRNA的体系；和

(a2)检测所述体系中miRNA的表达情况；

其中，所述的miRNA选自：miR-27a或miR-146b。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(a1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或

步骤(a2)包括：检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系；

如果测试组中miRNA的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。

21.一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(b1)用候选物质处理表达miRNA的体系；和

(b2)检测所述体系中miRNA的表达情况；

其中，所述的miRNA选自：miR-181b、miR-181c，miR-181d。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(b1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或

步骤(b2)包括：检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系；

如果测试组中miRNA的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。