CN102907417B - 一种用于提高荷斯坦公牛x精子冻后品质的冷冻稀释液配方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质：柠檬酸钠：0.9～1.2毫克，蔗糖：3～6毫克，低密度脂蛋白：16～18毫克，甘油：4～7毫升，维生素E：500毫克～700毫克，维生素B₁₂：100毫克～200毫克，壮观霉素：0.35毫克，庆大霉素：7～8万单位（IU），蒸馏水补足100毫升。实验数据表明，该冷冻稀释液提高了X精子冻融后的活力和精子顶体完整率，提高了精子冻后品质。

Description

一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液配方

技术领域

本发明涉及一种奶牛人工授精的改良技术，尤其涉及一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻精液稀释液配方。

背景技术

家畜精液的冷冻成功为人工授精技术的发展产生了极其深远的影响，首先为扩大优秀种公畜的利用率和延长利用时间奠定了基础，其次为人工授精和低温生物学的发展提供了广阔的空间。由于冷冻精液在运输上比较方便，不论从时间还是从空间上，都使种公畜的配种效能得到充分发挥，加速了家畜品种改良的步伐。但是，不同性别的动物可以满足人们不同方面的需要，所以人们为了自身需要会通过各种办法去干预动物的正常生殖过程，使成年雌性动物生产出人们期望的性别后代，因而动物的性别差异直接影响其市场价值。因此，性别控制技术在畜牧业生产中意义重大。在奶牛的生产中，目前已经实现X精子和Y精子的分离，通过人工授精成功的实现了对荷斯坦牛的性别控制。但现今荷斯坦牛性控冷冻精液解冻后的活力及受精率与鲜精相比还有很大差异，研究开发更有效的牛性控精液冷冻保护剂，提高性控精子冻后活力等具有重要的意义。在性控精液的X、Y精子分离过程中，获得经检测合格后的鲜精要经过染色、分离、平衡、离心、XY精子分离，稀释、分装、冷冻等一系列过程，这些程序会对精子造成一定的损伤，造成精子死亡及活力降低，严重影响精液品质，最终影响受精率，其中冷冻精液的稀释液配方是非常重要的影响因素。因此，根据目前的趋势，利用实验室条件对奶牛的性控精液稀释液配方进行深入研究，开发出新的精液稀释液，这样既可以提高荷斯坦牛X精子冻融后的存活率及受精率，又加快了我国奶牛的改良力度，为迅速提高奶牛的改良和产奶量，增加奶牛业的经济效益，拉动地方和区域经济发展具有积极的作用。

以下是申请人检索的相关参考文献：

【1】Mustafa S, Eserlf D. The effect of ascorbic acid on the freezability of ram semen diluted with extenders containing different proportions of glycerol 【J】. Turkish Jourmal of Verterinary & animal Science,2004, 28(5): 893-910。

【2】Singh B, Chand D.Siquality of deep frozen murrahbuffalo bull (Bubalus bubalis) semen 【J】. Journalof Pairying Food & Home Sciences,1997,14(4):253-259。

【3】Dawson, E.B., Harris,W.A., Teter,M.C., Powell, L.C., 1992. Effect of ascorbic acid supplementation onthe sperm quality of smokers. Fertil. Steril. 58,1034–1039。

【4】Partida S L G， Setchell B P，Maxwell W M. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa【J】.Reprod FertilDev，1997，9(7): 689-696。

【5】Foote R H，Brockett C C，Kaproth M T. Motilityand fertility of bull sperm in whole milk extendercontaining antioxidants 【J】. Anim Reprod Sci，2002，71(1-2):13-23。

【6】Jones R， Mann T. Damage to ram spermatozoa byperoxidantion of endogenous phospholipids【J】. J Reprod Fertil，1997，50(2): 261-26。

【7】Mustafa S， Esref D. The effect of ascorbic acid on the freezability of ram semen diluted with extenders containing different proportions of glycerol【J】. Turkish Journal of Veterinary & Animal Science，2004，28(5):893-910。

【8】Aitken R J, Clarkson J S. Cellular basis of defective sperm function and its association with thegenesis of reactive oxygen species by human spermatozoa 【J】. J Reprod Fertil, 1998, 81: 459-469.

【9】Marti a, L. Mara b, J.I. Marti c, T. Seasonalvariations in antioxidant enzyme activity in ram seminal plasma E 【J】. Theriogenology 67 (2007) 1446–1454。

【10】 Medearos CMO, Forell F, Oliveira ATD, et al.Current status of sperm crypereseration: Why isn’t it better? 【J】. Theriogenology, 2002，57：327～344。

【11】Ukeda H，Maeda S, Ishii T，Sawamura M. Spectrophotometric assay for superoxide dismutase based on tetrazolium salt 3’-{1-【(Phenylamino)-carbonyl】 -34- tetrazolium}-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulphonic acid hydrate reduction by xanthinexanthine oxidase. Anal Biochem 1997；251： 206-209。

【12】Talevi R，Pelosi S，Sansone G，et al. Effects ofdifferent pre-freezing rates on buffalo sperm Motility and ultrastructure preservation 【J】.Buffalo. 1999（43）：537-539。

【13】 Nabil Mansour, Mary A. McNiven, Gavin F. Richardson. The effect of dietary supplementation with blueberry, a-tocopherol or astaxanthin on oxidative stability of Arctic char (Salvelinus alpinus) semen. Theriogenology 66 (2006) 373–382。

【14】Mariola S?owinska, Halina Karol, Andrzej Ciereszko. Comet assay of fresh and cryopreserved bull spermatozoa. Cryobiology 56 (2008) 100–102。

【15】M. Moussa V. Martinet, A. Trimeche, D. Tainturier and M. Anton Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotectiveeffect on frozen–thawed bull semen Theriogenology 57(2002) 1695–1706。

【16】Talevi R，Pelosi S，Sansone G，et al. Effects ofdifferent pre-freezing rates on buffalo sperm Motility and ultrastructure preservation 【J】.Buffalo. 1999（43）: 537-539。

【17】Partida SLG，Setchell BP，Maxwell WM. Epididymalcompounds and antioxidants in diluents for the frozenstorage of ram spermatozoa 【J】. Reprod Fertil Dev, 1997, 9(7): 689-696。

【18】B. A. Ball, V. Medina, C.G. Gravance, I. Baumber. Effect of antionxidants on presernation of motityviability  and acrosomal integrity of equine spermatozoa during storage at 5 °C . Theriogenology，2001, 56: 577-569。

【19】帅志强, 张云梅, 张志国.荷斯坦牛性控冷冻精液处理时间对冻后活力的影响【J】中国奶牛 2008,6(11) 21-22。

【20】哈 福,赵有璋.绵羊冷冻精液稀释液中添加复合维生素B提高冻精解冻后品质的研究【J】.甘肃农业大学学报, 2003, 3(1): 17-19。

【21】罗海玲,贾志海,朱士恩,等.稀释液中添加维生素E对绵羊冷冻精液品质的影响【J】.中国畜牧杂志,2004,40(11): 7-10。

【22】李晓东,边凤玉,丁可为等.牛冻精稀释液配方的实验研究.中国奶牛，1998（3）：15～17。

【23】王肖克，杨健.影响家畜冷冻精液质量的因素【J】内蒙古畜牧科学，2002（6）：20～21。

【24】王丽红,王守勋,张伟，公牛精液检测方法比较，中国奶牛，2002（3）: 45～48。

【25】 张忠诚.家畜繁殖学【M】.北京:中国农业出版社，2004。

【26】 牛冷冻精液生产质量管理手册（试行）.全国畜牧兽医总站，农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心. 2000，21～23。

【27】 邱殿锐.影响牛冷冻精液品质的因素【J】.中国畜牧杂志,2002，35(6):49～50。

【28】 刘玉堂.精液冷冻保存的影响因素分析【J】.黑龙江动物生产杂志，2003，11(2)：10～14。

发明内容

针对X精子在冷冻过程中由于其处理方式与普通精液冷冻前处理方式相比，程序繁琐复杂，处理时间相对较长，处理过程中精子死亡率较高，导致精子活力低，配种后妊娠率低的缺陷，本发明的目的在于，提供一种用于提高荷斯坦牛X精子冷冻精液冻融后品质及受精率的新型精液稀释液配方。该稀释液可以明显提高分离以后的X精子冻后活率和顶体完整率及其他相关指标，从而提高X精子冻融后的品质及受精率。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液配方，其特征在于，制得的该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质：

柠檬酸钠：0.9～1.2毫克，蔗糖：3～6毫克，低密度脂蛋白：16～18毫克，甘油：4～7毫升，维生素Ｅ：500毫克～700毫克，维生素B₁₂：100毫克～200毫克，壮观霉素：0.35 毫克，庆大霉素：7～8万单位（IU），蒸馏水补足100毫升。

本发明一个优选的配方，100毫升冷冻稀释液中各物质含量为：柠檬酸钠：0.9毫克，蔗糖：3.3毫克，低密度脂蛋白：16毫克，甘油：5毫升，维生素Ｅ：500毫克，维生素B₁₂：100毫克，壮观霉素：0.35毫克，庆大霉素：8万单位（IU）

上述用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液的配制方法，其特征在于，按下列步骤进行：

1）准确称取配方量的柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、维生素Ｅ、维生素B₁₂和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，然后放入4℃冰箱过夜；

2）精液稀释前加入壮观霉素和庆大霉素并搅拌10分钟，用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用pH计测定稀释液的pH在6.5～7.5之间，然后用0.22微米滤器对稀释液进行虑菌处理，虑菌处理后放入37.5℃水浴锅中备用。

本发明首次把维生素Ｅ，维生素B₁₂，加入到了冷冻稀释液中，并对冷冻稀释液的配制方法做了修正，实验数据表明，本发明的用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，提高了X精子冻融后的活力和精子顶体完整率，提高了精子冻后品质。

具体实施方式

按照本发明的技术方案，本实施例给出一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，制得的该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质：

柠檬酸钠：0.9～1.2毫克，蔗糖：3～6毫克，低密度脂蛋白：16～18毫克，甘油：4～7毫升，维生素Ｅ：500毫克～700毫克，维生素B₁₂：100毫克～200毫克，壮观霉素：0.35 毫克，庆大霉素：7～8万单位（IU），蒸馏水补足100毫升。

其配制方法是：

1、称取原料：柠檬酸钠，蔗糖，低密度脂蛋白，甘油，维生素Ｅ，维生素B12，蒸馏水。

2、将以上的柠檬酸钠，蔗糖，低密度脂蛋白，维生素Ｅ，维生素B₁₂，甘油，用蒸馏水配置成基础液，用磁力搅拌器搅拌60 分钟，4℃冰箱内过夜备用。

3、在精液稀释前加入庆大霉素，壮观霉素，然后在磁力搅拌器搅拌10分钟。

4、用酸或碱调整稀释液pH值为6.5～7.5，然后用0.22微米过滤器虑菌，虑菌后放入37.5 ℃水浴锅中备用。

使用时，把经过预处理并由流式细胞仪分离后的ＸＹ精子存放在装有已制备好的冷冻稀释液中，平衡五分钟后检查精子活力，活力正常的按照普通精液制作方法开始制作冷冻精液。并做好相关记录。

本试验中，测定上述冷冻稀释液与传统配方的性控精液解冻后在A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度、平均移动角度、曲线运动速度、直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度进行比较。A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度、平均移动角度、曲线运动速度、直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度采用精子自动分析仪进行自动分析。顶体完整率及检测方法如下：

（1）精液解冻后立即在35 ℃～37 ℃的温度下进行活率检查。评定时，用玻璃棒蘸取1滴精液，滴于载玻片上，加上盖玻片，使盖玻片和载玻片之间充满精液，然后置于400倍～600倍显微镜下观察。在显微镜视野中，通过对精液上、中、下三层液面精子活动情况综合观察，评定精子活率。

（2）取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，用另一载玻片呈45度，将精液抹向另一侧，制成抹片。自然风干后用1～2毫升福尔马林磷酸盐缓冲液固定15分钟，水洗干燥后用姬姆萨染色90分钟，然后除去抹片上的染液，风干后置于1000倍生物显微镜下观察500个精子，记录精子总数和顶体完整精子数，最后得到顶体完整率。

以下是发明人给出的具体试验实施例，试验选用体质健壮、性欲旺盛的成年荷斯坦种公牛，按种公牛饲养管理要求进行饲养，其采精频率为每周3次。利用假阴道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在35℃～37℃下镜检。所采集的精液为乳白色或乳黄色，无异味，精子形态正常，活率达到0.7以上方可用于制作冷冻精液。

试验按照不申请的技术方案设置了三个不同配方，并和传统配方进行了比较。

配方1：配制100毫升冷冻稀释液：柠檬酸钠 0.9毫克，蔗糖3.3毫克, 低密度脂蛋白16毫克，甘油5毫升，维生素Ｅ 500毫克，维生素B₁₂ 100毫克，壮观霉素0.35毫克，庆大霉素8万单位（IU）。

配方2：配制100毫升冷冻稀释液：柠檬酸钠 1.0毫克，蔗糖4.3 毫克，低密度脂蛋白17毫克，甘油6毫升，维生素Ｅ 600毫克，维生素B₁₂ 150毫克，壮观霉素0.35毫克，庆大霉素8万单位（IU）。

配方3：配制100毫升冷冻稀释液：柠檬酸钠1.1毫克，蔗糖5.3毫克，低密度脂蛋白18毫克，维生素Ｅ 700毫克，维生素B₁₂  200毫克；甘油 7 毫升，壮观霉素0.35毫克，庆大霉素8万单位（IU）。

传统配方：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠 1.2 毫克，蔗糖6.3 毫克，卵黄 20 毫升，甘油 5毫升，壮观霉素0.35毫克，庆大霉素8万单位（IU）。

严格按以上配方称取称取所含成分，加蒸馏水至100毫升。在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，然后放入4 ℃冰箱过夜。

精液稀释前加入壮观霉素0.35毫克，庆大霉素8万单位（IU）并搅拌10分钟。用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用pH计测定稀释液pH在6.7～7.2之间。用0.22微米滤器对稀释液进行虑菌处理，完毕后放入37.5℃水浴锅中备用。

然后按照性控精液制作方法进行制作即可，解冻后用精子自动分析仪检测精液品质，具体指标见下表：

不同配方冷冻精液稀释液对冻融后X精子品质的影响  （平均数±标准差）

注： 同行数据后所标字母相异标示差异显著（P<0.05），所标字母相同标示差异不显著（P<0.05）。

由上表可以看出，最佳配方是配方一。该配方中，A级精子百分率显著高于传统配方16.12%，同时高于配方二、配方三；B级精子百分率高于传统配方16.98%，同时高于配方二、配方三。顶体完整率高于传统配方组6.24%；同时高于配方二、配方三；平均路径速度显著高于传统配方7.15%，同时高于配方二、配方三；平均移动角度显著高于传统配方5.78%，同时高于配方二、配方三；曲线运动速度高于传统对照组显著高于传统配方7.07%，同时高于配方二、配方三；直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度，则跟对照组相差不大。

所以经过以上分析得出配方一在精子冷冻解冻过程中对精子的品质能起到最大保护作用。

Claims (2)

1.一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，其特征在于，制得的该冷冻稀释液每100毫升中由以下物质组成：

柠檬酸钠：0.9毫克，蔗糖：3.3毫克，低密度脂蛋白：16毫克，甘油：5毫升，维生素Ｅ：500毫克，维生素B₁₂：100毫克，壮观霉素：0.35毫克，庆大霉素：8万单位（IU），蒸馏水补足100毫升。

2.权利要求1所述的用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液的配制方法，其特征在于，按下列步骤进行：

1）准确称取配方量的柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、维生素Ｅ、维生素B₁₂和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，然后放入4℃冰箱过夜；

2）精液稀释前加入壮观霉素和庆大霉素并搅拌10分钟，用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用pH计测定稀释液的pH在6.5～7.5之间，然后用0.22微米滤器对稀释液进行虑菌处理，虑菌处理后放入37.5℃水浴锅中备用。