CN102906270B

CN102906270B - 在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途

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Publication number: CN102906270B
Application number: CN201080064898.9A
Authority: CN
Inventors: J.C.利普梅尔; K.E.埃普特
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2030-12-28
Also published as: WO2011090730A1; EP2519642A1; ES2651313T3; EP2519642B1; US20170191023A1; EP2519642A4; CN102906270A; US20110195448A1

Abstract

本发明涉及在木糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。

Description

在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途

涉及以电子方式提交的序列表

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相关申请的交叉引用

本申请主张2009年12月28日提交的美国申请案第61/290,471号的申请日的权利，此处将其以整体引用的方式并入本文。

发明背景

技术领域

本申请涉及在木糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。

背景技术

脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。根据存在于链中的碳的数目将脂肪酸称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子间不存在双键时称为饱和脂肪酸，而当存在双键时称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，而当存在多于一个双键时是多不饱和的。

多不饱和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键的位置分类：Ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处包含第一个双键，而Ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处包含第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是Ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22个碳的链长和6个双键，通常标为“22:6n-3”。其他Ω-3LC-PUFA包括标为“20:5n-3”的二十碳五烯酸(“EPA”)和标为“22:5n-3”的Ω-3二十二碳五烯酸(“DPAn-3”)。DHA和EPA已被称为“必需”脂肪酸。Ω-6LC-PUFA包括标为“20:4n-6”的花生四烯酸(“ARA”)和标为“22:5n-6”的Ω-6二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。

Ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其存在于细胞膜而影响细胞生理学，调节生物活性化合物的生成和基因表达，且充当生物合成底物。Roche，H.M.，Proc.Nutr.Soc.58：397-401(1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15%-20%、并占视网膜中脂质的约30%-60%，其集中于睾丸和精子中，且是乳汁中的重要成分。Jean-PascalBergé和GillesBarnathan，“来自海洋生物脂质的脂肪酸：分子生物多样性，作为生物标记的作用，生物活性化合物和经济方面”(FattyAcidsfromLipidsofMarineOrganisms：MolecularBiodiversity，RolesasBiomarkers，BiologicallyActiveCompounds，andEconomicalAspects)，《海洋生物技术》(MarineBiotechnology)I49(T.Scheper编，2005)。DHA占大脑中Ω-3脂肪酸的多达97%和视网膜中Ω-3脂肪酸的多达93%。此外，DHA对胎儿和婴儿发育以及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在内的Ω-3脂肪酸还具有抗炎特性。参见例如同上以及Simopoulos，A.P.，J.Am.Coll.Nutr.21：495-595(2002)。特别的是，EPA与花生四烯酸竞争通过环氧合酶和脂氧合酶进行的二十烷类如前列腺素和白三烯的合成。同上。由于Ω-3脂肪酸不在人体内从头合成，这些脂肪酸必须获得自营养源。

破囊壶菌(thraustochytrids)是破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物，其被认为是脂质生产的替代来源。例如，已经报道了破囊壶菌菌种的菌株以占该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。参见例如美国专利第5,130,242号；Huang，J.等，J.Am.Oil.Chem.Soc.78：605-610(2001)；Huang，J.等，Mar.Biotechnol.5：450-457(2003)，以整体引用的方式并入本文。破囊壶菌还被认为是生产生物燃料的脂质来源。参见例如美国公开第2009/0064567号和WO2008/067605，以整体引用的方式并入本文。

植物生物质由三种主要组分构成；纤维素、半纤维素、和木质素。纤维素主要是由葡萄糖聚合物构成，半纤维素富含木糖聚合物，而木质素主要是由复杂的多酚类化合物构成。来自这些生物质级分的碳水化合物被统称为木素纤维素糖，并已被作为乙醇发酵的低成本可再生原料的来源进行了研究。

来自例如甘蔗渣、玉米秸秆、柳枝稷、麦秸秆、硬木和软木等来源的植物半纤维素可以是富含木糖的糖的来源。可以通过酸水解和/或酶消化从半纤维素释放这些糖类。

虽然破囊壶菌代谢葡萄糖和/或果糖，但是其似乎无法天然代谢木糖。参见，例如，Honda等，Mycol.Res.4:439-448(1998)；Goldstein,AmericanJ.ofBotany50：271-279(1963)；Damare,IndianJournalofMarineSciences35:326-340(2006)。由此，破囊壶菌培养，包括商业和工业培养，目前需要葡萄糖浆作为碳源和能源。

对于产生能够在替代碳源如木糖上生长的破囊壶菌以在商业和工业应用中使用的需求一直存在。

发明概述

本发明涉及一种生产破囊壶菌细胞培养物的方法，包括：(a)用包含编码与木糖输入、木糖向木酮糖转换、木酮糖磷酸化、或其组合相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并(b)在包含木糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，与木糖输入、木糖向木酮糖的转换、或木酮糖磷酸化相关的多肽选自下组：异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶、异源木糖醇脱氢酶及其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶、和异源木酮糖激酶。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木糖还原酶、异源木糖醇脱氢酶、和异源木酮糖激酶。在一些实施方案中，编码与木糖输入相关的多肽的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或X55392的多核苷酸序列；编码登录号CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列；SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、或SEQIDNO:23的多核苷酸序列，及其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。在一些实施方案中，本发明涉及通过所述方法生产的破囊壶菌细胞培养物。

本发明也涉及包含含有编码与木糖输入、木糖向木酮糖的转换、木酮糖磷酸化、或其组合相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，与木糖输入、木糖向木酮糖的转换、木酮糖磷酸化相关的多肽选自下组：异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶、异源木糖醇脱氢酶及其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶、和异源木酮糖激酶。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶、和异源木糖醇脱氢酶。在一些实施方案中，编码木糖与输入相关的多肽的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或X55392的多核苷酸序列；编码登录号CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列；SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、或SEQIDNO:23的多核苷酸序列，及其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。

本发明也涉及一种破囊壶菌培养物，其包含：(a)本文所述的任何一种破囊壶菌细胞，和(b)包含木糖作为碳源的细胞培养基。

本发明也涉及一种生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养，并(b)从所述培养基收获生物质。

本发明也涉及一种生产微生物油的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，并(b)从所述生物质提取油。

本发明也涉及一种生产用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养，(b)从所述培养基收获生物质，并(c)从所述生物质制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从生物质提取油并从所述油制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。在一些实施方案中，所述食品是婴儿配方食品。在一些实施方案中，所述婴儿配方食品适合早产儿。在一些实施方案中，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。在一些实施方案中，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。在一些实施方案中，所述食品是营养补充剂。在一些实施方案中，所述食品是动物饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料或其组合。

本发明也涉及一种生产生物燃料的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，(b)从所述生物质提取油，并(c)通过对油进行酯交换(transesterifying)，裂化油，经由热解聚加工油，将油加入石油精炼过程，或其组合生产生物燃料。在一些实施方案中，通过对油进行酯交换生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是生物柴油。在一些实施方案中，通过裂化油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是喷气生物燃料。在一些实施方案中，通过经由热解聚加工油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是可再生柴油。在一些实施方案中，通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是共处理的可再生柴油(co-processedrenewablediesel)。

附图简述

图1显示了pCL0120(SEQIDNO:12)的质粒图谱。

图2显示了裂殖壶菌属的密码子选择表。

图3显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:2)，其编码中间假丝酵母(Candidaintermedia)的木糖转运蛋白GXS1，与GenBank登录号AJ875406对应。

图4显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:3)，其编码拟南芥属(Arabidopsisthaliana)的木糖转运蛋白At5g17010，与GenBank登录号BT015128对应。

图5显示了pCL0130(SEQIDNO:14)的质粒图谱。

图6显示了pCL0131(SEQIDNO:15)的质粒图谱。

图7A和图7B显示了pCL0121的多核苷酸序列(SEQIDNO:4)。该载体赋予对抗生素ZEOCIN^TM的抗性并还包含编码eGFP的分泌形式的基因。

图8A和图8B显示了pCL0122的多核苷酸序列(SEQIDNO:5)。该载体赋予对抗生素巴龙霉素的抗性并还包含编码eGFP的分泌形式的基因。

图9显示了pCL0121的质粒图谱。

图10显示了pCL0122的质粒图谱。

图11显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:6)，其编码瘤胃真菌属菌种(Piromycessp.)E2木糖异构酶蛋白“XylA”，与GenBank登录号CAB76571对应。

图12显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:7)，其编码瘤胃真菌属(Piromycessp.)E2木酮糖激酶蛋白“XylB”，与GenBank登录号AJ249910对应。

图13显示了pCL0132(SEQIDNO:16)的质粒图谱。

图14显示了pCL0136(SEQIDNO:20)的质粒图谱。

图15显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:21)，其编码树干毕赤酵母(Pichiastipitis)木糖还原酶蛋白“Xyl1”，与GenBank登录号X59465对应。

图16显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:22)，其编码树干毕赤酵母木酮糖激酶蛋白“Xuk3”，与GenBank登录号AF127802对应。

图17显示了pCL0133(SEQIDNO:17)的质粒图谱。

图18显示了pCL0135(SEQIDNO:19)的质粒图谱。

图19显示了pCL0123(SEQIDNO:13)的质粒图谱。

图20显示了密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:23)，其编码树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶蛋白“Xyl2”，与GenBank登录号X55392对应。

图21显示了pCL0134(SEQIDNO:18)的质粒图谱。

图22显示了来自用pCL0130(图22A)或pCL0131(图22B)转化的SMM抗性裂殖壶菌属克隆和裂殖壶菌属野生型菌株ATCC20888(WT)的培养物的培养沉淀裂解物的Western印迹，其用识别中间假丝酵母木糖转运蛋白GXS1(pCL0130转化体)或拟南芥木糖转运蛋白At5g17010(pCL0131转化体)的抗体探查。

发明详述

破囊壶菌

根据本发明，术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌目(Thraustochytriales)的任何成员，其包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)。破囊壶菌当前的分类学地位可以简述如下：

界：管毛生物界(Stramenopila)(Chromista)

门：网粘菌(Labyrinthulomycota)(不等毛门(Heterokonta))

纲：网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulae)

目：网粘菌目(Labyrinthulales)

科：网粘菌科(Labyrinthulaceae)

目：破囊壶菌目(Thraustochytriales)

科：破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)

对于本发明的目的而言，作为破囊壶菌描述的菌株包括如下生物体：目：破囊壶菌目；科：破囊壶菌科；属：破囊壶菌属(种：菌种，arudimentale，aureum，benthicola，globosum，kinnei，motivum，multirudimentale，pachydermum，proliferum，roseum，striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种：菌种，amoeboidea，kerguelensis，minuta，profunda，radiata，sailens，sarkariana，schizochytrops，visurgensis，yorkensis)、裂殖壶菌属(种：菌种，aggregatum，limnaceum，mangrovei，minutum，octosporum)，Japonochytrium属(种：菌种、marinum)、Aplanochytrium属(种：菌种、haliotidis，kerguelensis，profunda，stocchinoi)、Althornia属(种：菌种、crouchii)、或Elina属(种：菌种、marisalba，sinorifica)。出于本发明的目的，吾肯氏壶菌属中描述的物种将被看作是破囊壶菌属的成员。Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium和Sicyoidochytrium是本发明包括的额外的属。

破囊壶菌属的菌株包括但不限于，保藏菌株PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、破囊壶菌属菌种(23B)(ATCC20891)；Thraustochytriumstriatum(Schneider)(ATCC24473)；Thraustochytriumaureum(Goldstein)(ATCC34304)；Thraustochytriumroseum(Goldstein)(ATCC28210)；和Japonochytrium属菌种(L1)(ATCC28207)。裂殖壶菌属包括但不限于Schizochytriumaggregatum、Schizochytriumlimacinum、裂殖壶菌属菌种(S31)(ATCC20888)、裂殖壶菌属菌种(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌属菌种(LC-RM)(ATCC18915)、裂殖壶菌属菌种(SR21)，保藏菌株ATCC28209和保藏的Schizochytriumlimacinum菌株IFO32693。

在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞是Sicyoidochytrium或破囊壶菌属细胞。在一些实施方案中，破囊壶菌的属选自裂殖壶菌属菌种、Schizochytriumaggregatum、Schizochytriumlimacinum、Schizochytriumminutum、破囊壶菌属菌种、Thraustochytriumstriatum、Thraustochytriumaureum、Thraustochytriumroseum、Japonochytrium属菌种及其衍生株。

如本发明所使用的，术语“转化”是指能够将核酸分子(即，重组核酸分子)插入本发明的破囊壶菌细胞的任何方法。在微生物体系中，术语“转化”用来描述由于微生物获得外源核酸所致的一种遗传性改变而且基本上与术语“转染”同义。用于将核酸分子引入破囊壶菌细胞的合适的转化技术，包括但不限于粒子轰击、电穿孔、显微注射，脂转染、吸附、感染和原生质体融合。

虽然短语“核酸分子”主要是指物理的核酸分子而短语“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要是指核酸分子中的核苷酸序列，但所述短语可以互换使用，尤其是能够编码蛋白的核酸分子、多核苷酸序列、或核酸序列。在一些实施方案中，利用重组DNA技术(例如，聚合酶链反应(PCR)扩增或克隆)或化学合成产生本文所述的分离的核酸分子。根据本发明，“分离的”核酸分子是已自其天然环境移出的核酸分子(即已经过人为操作)，其天然环境是该核酸分子在自然界中存在于其中的基因组或染色体。如此，“分离的”并不一定反映核酸分子已被纯化的程度，但表示该分子不包括该核酸分子在自然界中存在于其中的整个基因组或整个染色体。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mDNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然的等位基因变体和修饰的核酸分子，其中已经将核苷酸以如下方式插入、删除、取代和/或倒置，该方式使得这样的修饰在所编码的肽或蛋白的序列、功能和/或生物活性上提供期望的效果。

术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及其中单独的组分多肽通过共价或非共价手段连接的多重多肽复合物。术语“多肽”包括两个或更多个氨基酸长度的肽，通常具有超过5、10或20个氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的多肽是异源多肽。本文使用的术语“异源”是指序列，例如，其不在本发明的破囊壶菌细胞中天然存在。

本发明涉及用包含编码与木糖代谢相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化的破囊壶菌细胞。根据存在于破囊壶菌中的天然基因，可以将完成或补充木糖代谢途径的一种或多种基因引入到破囊壶菌中以允许在木糖上生长。在某些实施方案中，多肽或多肽的组合参与木糖向木酮糖-5-磷酸的转换(例如，为了进入磷酸戊糖途径)。在某些实施方案中，木糖向木酮糖-5-磷酸的转换包括3个步骤：木糖输入，木糖向木酮糖的转换，和木酮糖磷酸化。在某些实施方案中，本发明的多肽参与木糖输入(例如，木糖共转运体(symporter)或木糖转运蛋白)，木糖向木酮糖直接(例如，木糖异构酶)或经由中间体的糖醇木糖醇(例如，木糖还原酶或木糖醇脱氢酶)的转换，和/或木酮糖磷酸化(例如，木酮糖激酶)。在某些实施方案中，用一种或多种编码涉及木糖输入、木糖向木酮糖的转换、和/或木酮糖磷酸化的多肽的多核苷酸序列转化破囊壶菌细胞。

在一些实施方案中，所述多肽是异源多肽。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞包含编码异源木糖转运蛋白(例如，登录号AJ875406和/或BT015128)、异源木糖异构酶(例如，登录号CAB76571)、异源木酮糖激酶(例如，登录号AF127802和/或AJ249910)、异源木糖还原酶(例如，登录号X59465)、异源木糖醇脱氢酶(例如，登录号X55392)、或其任意组合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含编码木糖转运蛋白(例如，登录号AJ875406和/或BT015128)、木糖异构酶(例如，登录号CAB76571)、和木酮糖激酶(例如，登录号AF127802和/或AJ249910)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，木糖异构酶是WO03/062430A1中描述的。在一些实施方案中，多核苷酸序列经密码子优化以使在破囊壶菌细胞中的翻译效率最大化。在一些实施方案中，将编码木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的多核苷酸序列整合到破囊壶菌细胞的基因组中。在一些实施方案中，将编码木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的多核苷酸序列稳定整合到破囊壶菌细胞的基因组中。

在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞包含一种或多种包含编码与木糖输入、木糖向木酮糖的转换、或木酮糖磷酸化相关的三种或更多种多肽的一种或多种多核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括一种或多种与木糖输入相关的多肽、一种或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和一种或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括两种或多种与木糖输入相关的多肽、一种或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和零或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括两种或多种与木糖输入相关的多肽、零或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和一种或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括一种或多种与木糖输入相关的多肽、两种或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和零或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括一种或多种与木糖输入相关的多肽、零或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和两种或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括零或多种与木糖输入相关的多肽、两种或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和一种或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括零或多种与木糖输入相关的多肽、一种或多种与木糖向木酮糖的转换相关的多肽、和两种或多种与木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、和异源木糖异构酶。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、和异源木糖还原酶。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、和异源木糖醇脱氢酶。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶、和异源木糖醇脱氢酶。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、异源木糖异构酶、和异源木糖醇脱氢酶。在一些实施方案中，三种或多种多肽的组合可以包括异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶、和异源木糖异构酶。在一些实施方案中，前述组合的任一组包括其中任何与木糖输入、木糖向木酮糖的转换、和木酮糖磷酸化相关的多肽来自不同生物的组合。

在一些实施方案中，用于在破囊壶菌细胞中产生木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的表达系统包含源自破囊壶菌序列的调节元件。在一些实施方案中，用于在破囊壶菌细胞中产生木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的表达系统包含源自非破囊壶菌序列的调节元件，包括源自非破囊壶菌藻类序列的序列。在一些实施方案中，表达系统包含编码木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与任意启动子序列、任意终止子序列、和/或任意在破囊壶菌细胞中有功能的其他调节序列可操作地连接。可以使用诱导型或组成型活性的调节序列。调节序列包括但不限于美国申请公开号2010/0233760、美国专利第7,001,772号、美国专利公开号2006/0275904和美国专利公开号2006/0286650(将它们通过提述以其整体并入本文)中描述的裂殖壶菌属调节序列，例如：OrfC(也称为Pfa3)启动子，OrfC终止子，EF1短启动子，EF1长启动子，Sec1启动子，60S短启动子，60S长启动子，乙酰乳酸合酶启动子，乙酰乳酸合酶终止子，α-微管蛋白启动子，来自聚酮合酶(PKS)系统的启动子，脂肪酸去饱和酶启动子，肌动蛋白启动子，肌动蛋白终止子，延伸因子1α(ef1α)启动子，ef1α终止子，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子，gapdh终止子，及其组合。

在一些实施方案中，通过使用木糖转运蛋白基因、木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因或其任意组合转化的重组破囊壶菌表达木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合。在一些实施方案中，一种或多种木糖转运蛋白中的任一种是质膜结合蛋白。在一些实施方案中，一种或多种木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶或木糖醇脱氢酶中的任一种是胞内蛋白。

在一些实施方案中，木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合是胞内表达的。在一些实施方案中，木糖转运蛋白是膜结合的。在某些实施方案中，木糖转运蛋白定位于质膜的外部。

在一些实施方案中，使用表达盒在破囊壶菌细胞中表达木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合。表达盒的设计和构建使用本领域熟练技术人员已知的标准分子生物学技术。参见，例如，Sambrook等，2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含含有遗传元件的表达盒，所述遗传元件例如以使它们在破囊壶菌细胞中具有功能的方式可操作连接的至少下述元件：启动子；包含木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的编码区；和终止子区。在一些实施方案中，表达盒进一步包含编码信号肽或与木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶可操作连接的膜结构域的多核苷酸序列。本文所述的术语“膜结构域”是指使多肽靶向膜和/或允许多肽保持与膜相关联的多肽内的任何结构域，而且包括但不限于，跨膜结构域(例如单次或多次跨膜区)、完整单境域(integralmonotopicdomain)、信号锚定序列、ER信号序列、N-端或内部或C-端终止转移信号、糖基磷脂酰肌醇锚，及其组合。膜结构域可以位于多肽中的任何位置，包括多肽的N-端、C-端或中间。膜结构域可以与永久或暂时将多肽附着于膜相关。在一些实施方案中，重组载体包含表达盒。重组载体包括但不限于，质粒、噬菌体和病毒。在一些实施方案中，重组载体是线性化载体。在一些实施方案中，重组载体是表达载体。本文所用的短语“表达载体”是指适于生产编码产物(例如，木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合)的载体。在一些实施方案中，将编码木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的多核苷酸序列插入到重组载体以产生重组核酸分子。在一些实施方案中，将编码木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合的多核苷酸序列以将核酸序列与载体中的调节序列可操作地连接的方式插入载体，其使得所述核酸序列在重组微生物中能够转录和翻译。在一些实施方案中，选择标记使得能够选择已将本发明的重组核酸分子成功引入的重组微生物。选择标记包括但不限于美国申请公开号2010/0233760和美国专利第7001772号(将它们通过提述以其整体并入本文)中描述的选择标记，如裂殖壶菌属乙酰乳酸合酶或细菌ble。在一些实施方案中，选择标记是营养缺陷型标记、显性选择标记(如，例如，解毒抗生素的酶)，或转化选择中涉及的另一种蛋白。

在一些实施方案中，本发明的任何方法的多核苷酸序列编码异源多肽，所述异源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与同木糖代谢相关的多肽的氨基酸序列是至少90%，至少91％，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的，所述同木糖代谢相关的多肽包括但不限于，与木糖输入、木糖向木酮糖的转换、或木酮糖磷酸化相关的多肽。在一些实施方案中，本发明的任何方法的多核苷酸序列编码异源多肽，所述异源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与下述是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的：木糖共转运体、木糖转运蛋白、木糖异构酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或木酮糖激酶的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的任何方法的多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与下述多肽是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的：由登录号AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或X55392编码的氨基酸序列；或登录号CAB76571的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的任何方法的多核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与由SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、或SEQIDNO:23编码的氨基酸序列是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或完全相同的。在一些实施方案中，本发明的任何方法的核苷酸序列与下述是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的：登录号AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或X55392的多核苷酸序列；经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号AJ875406、BT015128、AF127802、AJ249910、X59465、或X55392的多核苷酸序列；编码登录号CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达；或SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、或SEQIDNO:23的多核苷酸序列。

破囊壶菌培养物、生物质和微生物油

本发明也涉及包含如本文所述的本发明任何破囊壶菌细胞和包含木糖作为碳源的细胞培养基的破囊壶菌细胞培养物。

本发明也涉及生产破囊壶菌细胞培养物的方法，包括用包含编码如本文所述的与木糖代谢相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，选择转化的破囊壶菌细胞，并在包含木糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞，其中生产出破囊壶菌细胞培养物。本发明也涉及通过所述方法生产的破囊壶菌细胞培养物。木糖的来源包括但不限于甘蔗渣、玉米秸秆、柳枝稷、麦秸秆、硬木和软木、或其他植物材料。

在一些实施方案中，木糖是细胞培养基中的主要碳源。在一些实施方案中，木糖是细胞培养基中的唯一碳源。在一些实施方案中，培养基包含糖蜜、糖浆、水解物、提取物、或来自任何产木糖植物的汁、或其组合。在一些实施方案中，培养基包含含半纤维素的原料，例如甘蔗渣、玉米秸秆、柳枝稷、麦秸秆、硬木和软木或其他植物材料。

在一些实施方案中，细胞培养基包含木糖转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或其任意组合。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞将异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶、异源木糖醇脱氢酶或其任意组合输送到培养基中。

用于破囊壶菌细胞的培养条件包括，但不仅限于，允许蛋白生产和/或重组的有效的培养基、生物反应器、温度、pH、和氧条件。有效的培养基是指通常培养破囊壶菌细胞的任何培养基。这样的培养基通常包含具有可同化的碳、氮、磷源，以及适当的盐、无机物、金属，和其他营养物质，如维生素的含水培养基。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母膏、聚胨、麦芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和硫酸钠。适合破囊壶菌的非限制性培养条件描述于，例如，美国专利第5,340,742号。接种、培养、和回收微生物群的多种发酵参数还描述于，例如，美国专利第5,130,242号。液体或固体培养基可含有天然或人工海水。本发明的破囊壶菌细胞可以在发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定皿、和培养皿中培养。

发酵体积可以是用于破囊壶菌生长的任意体积，包括商业和工业体积。在一些实施方案中，发酵体积(培养体积)为至少2L、至少10L、至少50L、至少100L、至少200L、至少500L、至少1000L、至少10,000L、至少20,000L、至少50,000L，至少100,000L、至少150,000L、至少200,000L、或至少250,000L、至少300,000L、至少350,000L、至少400,000L、或至少500,000L。在一些实施方案中，发酵体积为2L-2,000,000L、2L-1,000,000L、2L-500,000L、2L-200,000L、2L-100,000L、2L-50,000L、2L-25,000L、2L-20,000L、2L-15,000L、2L-10,000L、2L-5,000L、2L-1,000L、2L-500L、或2L-100L。

本发明还涉及生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括将本发明的破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养，并从所述培养基收获生物质。破囊壶菌生物质是通过用于分离破囊壶菌生物质的任何常规方法，例如美国专利第5,130,242号和美国申请公开号2002/0001833中所述(将其以整体引用的方式并入本文)，获得的收获的细胞生物质。收获的生物质可以含有破囊壶菌细胞以及破囊壶菌细胞碎片。

本发明也涉及生产微生物油的方法，该方法包括将本发明的破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，并从所述生物质提取油。所述油可从新鲜收获的生物质提取或可以从以前收获的已经在防止腐败的条件下保存的生物质提取。可采用已知的方法培养本发明的破囊壶菌，以从培养物中分离生物质，从生物质提取微生物油，并分析从该生物质提取的油的脂肪酸分布。参见，例如，美国专利第5,130,242号。

微生物油可以是衍生自任何破囊壶菌的任何油，包括，例如：从破囊壶菌生物质提取而没有进一步加工的粗制油；通过用进一步加工，如精炼、漂白、和/或除臭处理粗制油获得的精制油；通过稀释粗制或精制油获得的稀释油；或者例如通过用更多纯化方法处理粗制或精制油以增加油中脂肪酸浓度而获得的富集油。

在一些实施方案中，可以使用标准技术从破囊壶菌分离粗制油，不进行进一步精练或纯化。例如，可以使用溶剂提取，例如但不限于，己烷提取或异丙醇提取分离粗制油。在一些实施方案中，可以使用物理和/或机械提取方法分离粗制油，例如但不限于通过使用均质器或压制提取。

在一些实施方案中，粗制油可以进行进一步加工，例如精炼、去溶剂化、除臭、冬化(winterization)、冷滤、和/或漂白。这种“加工的”油包括已经过溶剂提取和一种或多种进一步加工的微生物油。在一些实施方案中，尽可能少地加工油。“尽可能少地加工的”油包括已经过溶剂提取和过滤的微生物油。在特定实施方案中，尽量少地加工的油进一步经防冻处理。

在一些实施方案中，与方法(WestfaliaSeparatorIndustryGmbH,Germany)相似的方法用于提取破囊壶菌产生的微生物油。方法是一种基于水的物理油提取方法，其中含油原料可以直接用于提取油而不使用任何常规的溶剂提取方法。在此方法中，可以使用水溶性有机溶剂作为加工助剂，并通过采用重力或离心力的密度分离从原料液中分离油。WO96/05278披露了这种提取方法并将其以整体引用的方式并入本文中。

提取了油之后，可通过本领域已知的任何合适手段从非脂质成分回收或分离油。在一些实施方案中，使用低成本的物理和/或机械技术来将含脂质组合物与非脂质组合物分离。例如，如果通过用于提取油的提取方法产生了多个相或级分，其中一个或多个相或级分含有脂质，用于回收含脂质的相或级分的方法可涉及从非脂质相或级分物理去除含脂质的相或级分，或反之亦然。在一些实施方案中，使用型方法来提取微生物产生的脂质，然后将富含脂质的轻相与富含蛋白质的重相物理地分离(例如通过在密度分离后，撇去在富含蛋白质的重相上部的富含脂质的相)。

由本发明的破囊壶菌生产的微生物油可以通过将破囊壶菌细胞暴露于一定条件而从自溶或经诱导的裂解回收，所述条件包括，但不限于，一定的pH值、一定的温度、酶的存在、洗涤剂的存在、物理破坏、或其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞的裂解或自溶是通过使用机械力进行的。在本发明的进一步实施方案中，破囊壶菌细胞的裂解或自溶后，接着将脂质与非脂质成分机械分离。

可用于诱导破囊壶菌细胞裂解的合适的酶包括，但不限于，商业上可获得的酶或酶混合物，例如蛋白酶K或在一些实施方案中，产油破囊壶菌在洗涤剂存在下经历诱导的裂解，所述洗涤剂例如离子(阳离子或阴离子)洗涤剂、非离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、或其组合。在本发明的进一步实施方案中，可以使用物理破坏方法诱导产油破囊壶菌的裂解，所述方法例如机械研磨、液体均质化、在超声处理中使用高频声波、冻融循环方法、压制、挤压、或碾磨。油的提取可以通过破囊壶菌细胞在罐中的裂解在发酵结束时在发酵罐中进行。

在一些实施方案中，在木糖上生长的本发明的破囊壶菌细胞生产的细胞培养物、生物质和微生物油与在葡萄糖和/或果糖上生长的相应的未经转化的破囊壶菌细胞生产的细胞培养物、生物质和微生物油具有相同或基本上相似的特征(例如，细胞密度、细胞干重、脂肪酸生产能力、和脂肪酸分布)。在一些实施方案中，在木糖上生长后从本发明的破囊壶菌培养物产生的生物质的细胞干重高于在相同条件下从在葡萄糖和/或果糖上的相应未经转化的破囊壶菌细胞的培养物的生长获得的细胞干重。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌在木糖上生长后的脂肪酸总量作为占生物质的细胞干重的百分比高于在相同条件下从在葡萄糖和/或果糖上的相应未经转化的破囊壶菌细胞的生长获得的量。

生产组合物的方法

本发明也涉及制备用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，该方法包括将本发明的破囊壶菌细胞在包含木糖作为碳源的培养基中培养以产生生物质，收获生物质，并从所述生物质制备用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。

破囊壶菌生物质可在用于组合物前通过如下方法干燥，所述方法包括但不限于，冷冻干燥、空气干燥、喷雾干燥、隧道干燥、真空干燥(冻干)或类似方法。或者，可将经收获和清洗的生物质直接用于组合物而不进行干燥。参见，例如，美国专利第5,130,242和6,812,009号，其以整体引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，制备用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，进一步包括从生物质提取油。微生物油可以用作起始材料以更有效地生成富含脂肪酸，如DHA或EPA的产物。例如，可对微生物油进行本领域已知的多种纯化技术，如蒸馏或尿素包合，以生成具有更高浓度DHA、EPA、或其他脂肪酸的更高效力的产物。微生物油也可用于化学反应以生成从所述油中的脂肪酸衍生的化合物，例如DHA、EPA、或其他脂肪酸的酯和盐。

可以基于破囊壶菌的理想属性选择如本文所述经转化以在木糖上生长的任何破囊壶菌用于制备任何描述的组合物，所述属性例如但不限于，破囊壶菌细胞培养物的细胞密度、与破囊壶菌生物质的干细胞相关的脂肪酸百分比和类型、与破囊壶菌的生物质和/或微生物油相关的脂肪酸分布、或其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比单不饱和脂肪酸更高百分比的多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比ω-6脂肪酸更高百分比的ω-3脂肪酸。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比其他ω-3脂肪酸更高百分比的DHA。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质包含比其他多不饱和脂肪酸更高百分比的DHA。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比其他ω-3脂肪酸更高百分比的EPA。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比其他多不饱和脂肪酸更高百分比的EPA。

组合物可包括一种或多种赋形剂。如本文使用的“赋形剂”指用于组合物中以为该组合物提供理想特征的成分或成分的混合物，该组合物包括食物以及药物、化妆品和工业组合物。当赋形剂加入药物组合物时可描述为“药学上可接受”的赋形剂，意味着所述赋形剂是在合理的医学判断范围内适于接触人和动物组织而在与合理的益处/风险比相称的所需接触时间内无过度毒性、刺激、变态反应或其他有问题的并发症的化合物、物质、组合物、盐和/或剂量形式。在一些实施方案中，术语“药学上可接受”指联邦或州政府的监管机构批准或者美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍认可的国际药典中列出用于动物，更具体是人。可使用多种不同的赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂可以是但不限于碱剂、稳定剂、抗氧化剂、粘着剂、分离剂、涂层剂、外相成分、控释成分、溶剂、表面活性剂、湿润剂、缓冲剂、填充剂、软化剂、或其组合。除了本文所讨论之外，赋形剂可包括但不限于Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，第21版.(2005)中所列。

在一些实施方案中，所述组合物是食品。食品是供动物或人消耗的任何食物，且包括固体和液体组合物。食品可以是动物或人的食物的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括牛奶、饮料、治疗性饮品和营养饮品；功能性食品；补充剂；营养制品(nutraceutical)；婴儿配方食品，包括供早产儿用的配方食品；供怀孕或哺乳的妇女用的食品；成人食品；老年食品；和动物食品。

在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油可以作为以下一种或多种中的添加剂直接使用或包括在内：油、起酥油、涂抹物、其他脂肪成分、饮料、调味料、乳制品或豆制品(如牛奶、酸乳、奶酪和冰淇凌)、焙烤物、营养品，例如作为营养补充剂(以胶囊或片剂形式)、维生素补充剂、膳食补充剂、粉末饮品、成品或半成品粉末食品、及其组合。

可以包括微生物油的食物组合物的部分列表包括但不限于豆制品(牛奶、冰淇凌、酸乳、饮品、奶油、涂抹物、增白剂)；汤和汤粉；生面团、糊状物和烘焙食物，包括例如精致烘培制品(finebakeryware)、早餐谷物(breakfastcereal)、蛋糕(cake)、芝士蛋糕(cheesecake)、馅饼(pie)、纸杯蛋糕(cupcake)、曲奇(cookie)、条状食物(bar)、面包(bread)、卷(roll)、饼干(biscuit)、松饼(muffin)、发面点心(pastries)、司康(scone)、油煎面包块(crouton)、薄脆饼干(cracker)、甜食(sweetgoods)、小食糕点(snackcake)、馅饼、格兰诺拉麦片/小食条(granola/snackbar)和烤吐司(toasterpastry)；糖果；硬糖果；巧克力和其他糖果；口香糖；液体食品，例如牛奶、能量饮料、婴儿配方食品、碳酸饮料、茶、流质食物、果汁、果汁饮料、蔬菜饮料；复合维生素糖浆、餐食替代物、药膳和糖浆；粉末冲泡饮料混合物；意大利面；加工鱼制品；加工肉制品；加工禽制品；肉汁和调味料；调味品(蕃茄酱、蛋黄酱等)；植物油涂抹料；乳制品；酸乳；黄油；冷冻乳制品；冰淇淋；速冻甜食；冻酸奶；半固体食品如婴儿食品；布丁和明胶甜品；加工和未加工奶酪；煎饼混合料；食物条，包括能量条；华夫饼混合料；沙拉酱汁；鸡蛋替代混合料(replacementeggmix)；坚果和坚果涂抹物；咸味休闲食品如薯片、和其他片或脆片、玉米片、墨西哥玉米片、膨化休闲食品、爆米花、椒盐卷饼、薯条和坚果；特色小吃如蘸料(dip)、干果小吃、肉类零食、猪肉皮、健康食物条和米糕/玉米饼。

在一些实施方案中，微生物油可用于补充婴儿配方食品。可以用单独的或与源自产生花生四烯酸(ARA)的微生物的物理精制油组合的本发明的微生物油来补充婴儿配方食品。产生ARA的微生物是例如高山被孢霉(Mortierellaalpina)或舒克里被孢霉(Mortierellasect.schmuckeri)。或者，婴儿配方食品可补充以微生物油与富含ARA的油，包括(MartekBiosciences,Columbia,MD)的组合。

在一些实施方案中，所述组合物是动物饲料。“动物”指属于动物界的任何非人生物，并且包括但不限于水生动物和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”指用于非人动物的任何食物，无论是鱼；经济鱼类；观赏鱼；鱼苗(fishlarvae)；双壳类；软体动物；甲壳动物；贝类；虾；幼虾；卤虫(artemia)；轮虫；鳃足虫；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家畜；耕畜；动物园动物；运动类动物；种畜；比赛类动物；表演类动物；活化石动物(heirloomanimals)；稀有或濒危动物；伴侣动物；宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类动物如猴(例如，卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和虎；马科动物如马、驴子和斑马；食用动物如奶牛、牛、猪和绵羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产养殖饲料、家畜饲料，包括宠物饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、畜牲饲料或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物是人食用其肉或制品的任何动物的饲料或饲料补充剂，如从其衍生肉、蛋或乳汁供人食用的任何动物。喂养这些动物时，可将营养物如LC-PUFA掺入该动物的肉、乳汁、蛋或其他产品以增加它们的这些营养素的含量。

在一些实施方案中，所述组合物是喷雾干燥的物质，可将其粉碎以形成适当大小的颗粒以供浮游动物、卤虫、轮虫和滤食动物食用。在一些实施方案中，以所述组合物喂食的浮游动物、卤虫或轮虫继而被鱼苗、鱼、贝类、双壳类或甲壳动物吃掉。

在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。合适的药物组合物包括但不限于抗炎组合物、冠心病治疗药物、动脉硬化治疗药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药物、神经退行性疾病治疗药物、退行性肝病治疗药物、抗生素、降胆固醇组合物和降甘油三酯组合物。在一些实施方案中，所述组合物是医疗食品。医疗食品包括在医师指导下服用或外部施用的组合物中的食物和用于某状况的特定饮食控制的食物，对于该状况基于公认的科学原理通过医学评估确定独特营养需求。

在一些实施方案中，所述微生物油可制成剂量形式。剂量形式可包括但不限于片剂、胶囊、扁囊剂、丹剂、丸剂、散剂和颗粒剂、和胃肠外剂量形式，胃肠外剂量形式包括但不限于溶液剂、悬剂、乳剂和干粉，其含有有效量的所述微生物油。本领域也已知这些制剂还可包含药学上可接受稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性运载体、水溶性运载体、乳化剂、缓冲剂、湿润剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等。施用形式可包括但不限于片剂、糖衣丸、胶囊、小胶囊和丸剂，其含有所述微生物油和一种或多种药学上可接受的适当载体。

对于口服施用，所述微生物油可与本领域熟知的药学上可接受载体组合。这些载体使所述微生物油能够制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬剂等，以供由待治疗的受试者口服摄入。在一些实施方案中，所述剂量形式是片剂、丸剂或小胶囊。可通过加入固体赋形剂，任选研磨所得混合物，并且如需要在加入适当辅剂后加工颗粒混合物，从而获得片剂或糖衣丸的芯来获得用于口服使用的药物组合物。合适的赋形剂包括但不限于填充剂如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制备物例如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，可加入崩解剂，例如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。能口服使用的药物制备物包括但不限于由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。

在一些实施方案中，所述组合物是化妆品。化妆品包括但不限于乳剂、乳霜、洗液、面膜、肥皂、洗发水、洗涤剂、面霜、护发素、彩妆用品、沐浴剂和分散液。化妆剂可以是医用或非医用的。

在一些实施方案中，所述组合物是工业组合物。在一些实施方案中，所述组合物是一种或多种制品的原材料。制品包括但不限于聚合物；照相感光材料；洗涤剂；工业用油；或工业洗涤剂。例如，美国专利第7,259,006号描述了使用含DHA的脂肪和油用于生成山嵛酸和用山嵛酸生产照相感光材料。

生产生物燃料的方法

本发明也涉及从本发明的破囊壶菌生产生物燃料的方法。

本文使用的“生物燃料”指产自或使用本发明的破囊壶菌的生物质或微生物油的任何燃料，包括但不限于，生物柴油、可再生柴油、共处理的可再生柴油、喷气生物燃料、取暖用油和燃料添加剂。本领域已知的任何方法可用于从本发明的破囊壶菌的生物质和微生物油生成生物燃料，包括但不限于WO2005/035693、美国申请公开号2005/0112735、WO2007/027633、WO2006/127512、美国申请公开号2007/0099278、美国申请公开号2007/0089356、WO2008/067605、美国申请公开号2009/0035842、和美国申请公开号2009/0064567(其以整体引用的方式并入本文)描述的任何方法。本文描述的任何生物燃料可以与化石燃料混合。例如，生物柴油可以与化石柴油以1%-99%的比例混合。在一些实施方案中，即使本发明的破囊壶菌的微生物油没有经过常规加工，也将它作为生产生物燃料的起始点使用。可以避免的常规加工的例子包括精制(例如，物理精制、硅精制或苛性精制)、去溶剂化、除臭、冬化、冷滤和/或漂白。因此，在某些实施方案中，油没有经过精制、去溶剂化、除臭、冬化、冷滤、漂白或其组合。

在一些实施方案中，生产生物燃料的方法包括在包含木糖作为碳源的培养基中培养本发明的破囊壶菌以产生生物质，从生物质提取油，并通过对油进行酯交换，裂化油，经由热解聚加工油，将油加入传统的石油精炼过程中，或其组合生产生物燃料。

在一些实施方案中，通过对油进行酯交换生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是生物柴油。生物柴油的各种形式是已知的并且包括但不限于WO07/061903、美国专利第7,172,635号、欧洲专利第1227143号、WO02/38709、WO02/38707、和美国申请公开号2007/0113467中描述的生物柴油。油中甘油三酯的酯交换产生长链脂肪酸酯，即烷基酯，并可以通过本领域已知的任何方法进行以生产生物燃料。在一些实施方案中，烷基醚是甲酯或乙酯。在一些实施方案中，从破囊壶菌生物质提取油和对油进行酯交换可以同时进行。在一些实施方案中，从破囊壶菌生物质提取油和对油进行酯交换分开进行。参见，例如，美国申请公开号2009/0064567。

在一些实施方案中，使用低级烷基醇和酸或碱催化剂进行酯交换。适合本发明使用的醇包括含有1-6个碳原子的任何低级烷基醇(即，C_1-6烷基醇，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、戊基、己基醇及其异构体)。在一些实施方案中，醇构成油组合物、醇和催化性碱的混合物的5wt.%-70wt.％，5wt.%-60wt.%，5wt.%-50wt.%，7wt.%-40wt.%，9wt.%-30wt.%，或10wt.%-25wt.%。在一些实施方案中，油组合物和碱可以加入纯的乙醇或纯的甲醇。醇的用量可以随油在醇中的溶解度变化。可以使用本领域已知的适合作为反应剂使用的任何碱，包括式RO-M的碱，其中M是单价阳离子且RO是C_1-6烷基醇的醇盐。适合的碱的例子包括但不限于，元素钠、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾和乙醇钾。在一些实施方案中，碱是乙醇钠。在一些实施方案中，以油中甘油三酯的0.05-2.0摩尔当量，0.05-1.5摩尔当量，0.1-1.4摩尔当量，0.2-1.3摩尔当量，或0.25-1.2摩尔当量的量将碱与油组合物和醇一起加入反应。包含甘油三酯、醇和碱的油在某个温度一起反应一定时间以允许从脂肪酸残基和纯产生酯。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应在20℃-140℃，20℃-120℃，20℃-110℃，20℃-100℃，或20℃-90℃的温度下进行。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应在至少20℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃，至少105℃，或至少120℃的温度下进行。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应在20℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，105℃或120℃的温度下进行。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应进行从2小时-36小时，从3小时-36小时，从4小时-36小时，从5小时-36小时，或从6小时-36小时的时间。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应进行0.25，0.5，1，2，4，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，10，12，16，20，24，28，32或36小时的时间。在一些实施方案中，油组合物、醇和碱的反应可以通过回流组分以产生脂肪酸酯，如PUFA酯来进行。在一些实施方案中，油组合物的反应可以在不导致反应组分的回流的温度下进行。例如，在大于大气压的压力下进行油组合物的反应可以增加反应混合物中存在的溶剂的沸点。在这种情况下，反应可以在溶剂在常压下会沸腾的温度下进行，而不会导致反应组分的回流。在一些实施方案中，反应在5磅每平方英寸(psi)-20psi；7psi-15psi；或9psi-12psi的压力下进行。在一些实施方案中，反应在7psi，8psi，9psi，10psi，11psi或12psi的压力下进行。在压力下进行的反应可以在上面列出的反应温度下进行。在一些实施方案中，在压力下进行的反应可在至少20℃-140℃，20℃-120℃，20℃-110℃，20℃-100℃，或20℃-90℃下进行。在一些实施方案中，在压力下进行的反应可以在至少70℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，或至少90℃下进行。在一些实施方案中，在压力下进行的反应可以在70℃，75℃，80℃，85℃，或90℃进行。

用于生产生物燃料，如生物柴油的油中减少的PUFA量可以增加生物燃料的能量密度并且能够减少潜在的氧化或硫酸盐化的位点数量。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油，或其甘油三酯级分，包含比多不饱和脂肪酸更大百分比的单不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，分级微生物油以去除多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，将油氢化以将多不饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸。为了确保更高百分比的微藻油(microalgaloil)衍生的生物柴油能够别燃烧，可以使用部分或全部油氢化的任何方法，如在人造奶油(margarines)制造中的常规一样。在一些实施方案中，使用生产低水平的PUFA的破囊壶菌来生产微生物油。在一些实施方案中，选择产生比多不饱和脂肪酸更大量的单不饱和脂肪酸的本发明的破囊壶菌。在一些实施方案中，生物油中少于50%的不饱和脂肪酸是PUFA。在一些实施方案中，生物油中的不饱和脂肪酸中含有低于40%，低于30%，低于20%，低于10%，或低于5%的PUFA。在一些实施方案中，微生物油包含低于50%，低于40%，低于30%，低于20%，低于10%，或低于5%重量的PUFA。

除了以上所述的酯交换方法，其他减少微生物油粘度的技术也可用于生产生物燃料。这些技术包括但不仅限于，脂肪酶的使用、超临界甲醇催化、和全细胞系统的使用，其涉及在宿主细胞中脂肪酶的胞质过表达，接着透化宿主以允许在细胞质内对甘油三酯的酯交换的催化。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞还包含编码用于催化胞质内甘油三酯酯交换的脂肪酶的多核苷酸序列。参见，例如，美国专利第7,226,771号、美国申请公开号2004/0005604、WO03/089620、WO05/086900、美国申请公开号2005/0108789、WO05/032496、WO05/108533、美国专利第6,982,155号、WO06/009676、WO06/133698、WO06/037334、WO07/076163、WO07/056786、和WO06/124818，其以整体引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，通过裂化油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是喷气生物燃料。“裂化”在本领域理解为描述通过如在油工业中使用的那些方法降低油中脂肪酸的链长度。在一些实施方案中，油中大量多不饱和脂肪酸的存在将为烃的生产提供更大的灵活性和多样性，因为多不饱和脂肪酸中的多个不饱和位点提供了多个位点以供切割以生成烃。例如，某些喷气燃料需要具有2-8个碳原子的烃。可以通过本领域已知的方法，如裂化，来切割多不饱和脂肪酸以产生不同链长的较短的烃。

在一些实施方案中，通过热解聚生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是可再生柴油。正如本文所使用的，热解聚包括任何使用过热的水生产可再生柴油的方法。

在一些实施方案中，在柴油燃料的生产过程中通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是共处理的可再生柴油。

已经一般描述了本发明，参考本文提供的例子可获得进一步的理解。这些例子仅出于说明目的而不是为了限制本发明。

实施例1

木糖转运蛋白、木糖还原酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶和木糖异构酶表达载体的构建

以HindIII消化载体pAB0018(ATCC登录号PTA-9616)、用绿豆核酸酶处理、纯化，然后再进一步以KpnI消化，产生四种不同大小的片段。通过标准电泳技术在琼脂凝胶中分离了2552bp的片段并使用商用DNA纯化试剂盒纯化。然后使用PmeI和Kpn对pAB0018进行二次消化。从该消化物中分离并纯化了6732bp的片段并与2552bp的片段连接。然后使用制造商的方案将所述连接产物用于转化商业提供的感受态DH5-α大肠杆菌细胞菌株(Invitrogen)。将来自氨苄青霉素抗性克隆的质粒增殖、纯化，然后通过限制性消化或PCR筛选确认连接产生了预期的质粒结构。将一个经验证的质粒命名为pCL0120。参见图1和SEQIDNO:12。

按照图2所示的裂殖壶菌属密码子选择表的指导，将编码中间假丝酵母木糖转运蛋白GXS1(GenBank登录号AJ875406)和拟南芥木糖转运蛋白At5g17010(GenBank登录号BT015128)的序列发送到BlueHeronBiotechnology(Bothell，WA)进行密码子优化和合成。SEQIDNO:2是GSX1密码子优化的核酸序列(图3)，而SEQIDNO:3是At5g17010密码子优化的核酸序列(图4)。按照标准技术使用5'和3'限制性位点BamHI和NdeI进行插入和连接将SEQIDNO:2和SEQIDNO:3分别克隆到pCL0120。产生的载体pCL0130和pCL0131的图谱分别如图5和图6所示。载体pCL0130和pCL0131的序列分别作为SEQIDNO:14和15提供。

通过连接已经通过用HindIII和KpnI消化从pCL0120释放的5095bp片段与设计以赋予ZEOCIN^TM或巴龙霉素抗性的合成选择标记盒构建了载体pCL0121和pCL0122。这些盒包含驱动shble基因(对于ZEOCIN^TM)或npt基因(对于巴龙霉素)表达的α微管蛋白启动子。两种选择标记基因的转录均由SV40终止子终止。载体pCL0121(SEQIDNO:4)和pCL0122(SEQIDNO:5)的全序列分别如图7和图8所示。载体pCL0121和pCL0122的图谱分别如图9和图10所示。

按照图2所示的裂殖壶菌属密码子选择表的指导，将编码瘤胃真菌属菌种E2木糖异构酶(CAB76571)和瘤胃真菌属菌种E2木酮糖激酶(AJ249910)的序列发送到BlueHeronBiotechnology(Bothell，WA)进行密码子优化和合成。“XylA”(SEQIDNO:6)是CAB76571密码子优化的核酸序列(图11)，而“XylB”(SEQIDNO:7)是AJ249910密码子优化的核酸序列(图12)。将SEQIDNO:6克隆到载体pCL0121产生命名为pCL0132的载体(图13和SEQIDNO:16)。将SEQIDNO:7克隆到载体pCL0122产生命名为pCL0136的载体(图14和SEQIDNO:20)。

按照图2所示的裂殖壶菌属密码子选择表的指导，将编码树干毕赤酵母木糖还原酶(X59465)和树干毕赤酵母木酮糖激酶(AF127802)的序列发送到BlueHeronBiotechnology(Bothell，WA)进行密码子优化和合成。“Xyl1”(SEQIDNO:21)是X59465密码子优化的核酸序列(图15)，而“Xuk3”(SEQIDNO:22)是AF127802密码子优化的核酸序列(图16)。将SEQIDNO:21克隆到载体pCL0121产生命名为pCL0133的载体(图17和SEQIDNO:17)。将SEQIDNO:22克隆到载体pCL0122产生命名为pCL0135的载体(图18和SEQIDNO:19)。

通过连接已经通过用HindIII和KpnI消化从pCL0120释放的5095bp片段与设计以赋予ZEOCIN^TM抗性的合成选择标记盒构建了载体pCL0123。该表达盒包含驱动shble基因(对于ZEOCIN^TM)表达的α微管蛋白启动子。选择标记基因的转录由SV40终止子终止。载体pCL0123的图谱如图19和SEQIDNO:13所示。

按照图2所示的裂殖壶菌属密码子选择表的指导，将编码树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶(X55392)的序列发送到BlueHeronBiotechnology(Bothell，WA)进行密码子优化和合成。“Xyl2”(SEQIDNO:23)是X55392密码子优化的核酸序列(图20)。将SEQIDNO:23克隆到载体pCL0123产生命名为pCL0134的载体(图21和SEQIDNO:18)。

实施例2

用木糖转运蛋白、木糖异构酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶表达载体对裂殖壶菌属的转化

使用如下所述的伴有酶预处理的电穿孔各自以载体pCL0130(中间假丝酵母木糖转运蛋白)、pCL0131(拟南芥木糖转运蛋白)、pCL0132(瘤胃真菌属菌种E2木糖异构酶)、pCL0133(树干毕赤酵母木糖还原酶)、pCL0134(树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶)、pCL0135(树干毕赤酵母木酮糖激酶)、或pCL0136(瘤胃真菌属菌种E2木酮糖激酶)转化裂殖壶菌属菌株ATCC20888。

伴有酶预处理的电穿孔-将细胞在50mLM50-20培养基中(见美国公开号2008/0022422)在30℃以200rpm在摇床上培养2天。将细胞按1∶100稀释到M2B培养基(见下文段落)中并培养过夜(16-24h)，以期达到中-对数期生长(1.5-2.5的OD600)。将细胞在50mL锥形管中以约3000×g离心5min。移去上清并将细胞重悬于合适体积的1M甘露醇，pH5.5，以达到2OD₆₀₀单位的终浓度。将5mL细胞分装到25mL摇瓶并以10mMCaCl₂(1.0M贮液，过滤灭菌)和0.25mg/mL蛋白酶XIV(10mg/mL贮液，过滤灭菌；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)修正。将摇瓶在30℃和约100rpm的摇床上温育4小时。在显微镜下监测细胞以确定原生质体程度(degreeofprotoplasting)，理想的是单个的细胞。将细胞在圆底管(即14mLFalcon^TM管，BDBiosciences，SanJose，CA)中以约2500xg离心5分钟。除去上清并轻轻地用5ml冰冷的10%甘油重悬细胞。将细胞在圆底管中以约2500xg重新离心5分钟。除去上清并使用大口径枪头以500μL冰冷的10%甘油轻轻重悬细胞。将90μL细胞分装入预冷的电穿孔小杯(electro-cuvette)(Gene小杯-0.1cm间隙或0.2cm间隙,Bio-Rad,Hercules,CA)。向小杯中添加1μg至5μg的DNA(以小于或等于10μL体积)，用枪头轻轻混合，并置于冰上5分钟。将细胞在200ohms(电阻)，25μF(电容)，和250V(0.1cm间隙)或500V(0.2cm间隙)下电穿孔。将0.5mLM50-20培养基立即加入小杯。然后将细胞转移到25mL摇瓶中的4.5mLM50-20培养基中并在30℃和约100rpm的摇床上温育2-3小时。将细胞在圆底管中以约2500xg离心5分钟。移除上清并将细胞沉淀重悬于0.5mLM50-20培养基中。将细胞铺板到适当数量(2-5个)的含有适当选择(如需要)的M2B平板上并在30℃温育。

M2B培养基由10g/L葡萄糖，0.8g/L(NH₄)₂SO₄，5g/LNa₂SO₄，2g/LMgSO4·7H₂O，0.5g/LKH₂PO₄，0.5g/LKCl，0.1g/LCaCl₂·2H₂O，0.1MMES(pH6.0)0.1%PB26金属，和0.1%PB26维生素(v/v)组成。PB26维生素由50mg/mL维生素B12，100μg/mL硫胺素和100μg/mL泛酸钙组成。PB26金属调整到pH4.5并由3g/LFeSO₄·7H₂O，1g/LMnCl₂·₄H₂O，800mg/mLZnSO₄·7H₂O，20mg/mLCoCl₂·6H₂O，10mg/mLNa₂MoO₄·2H₂O，600mg/mLCuSO₄·5H₂O，和800mg/mLNiSO₄·6H₂O组成。PB26贮液单独过滤灭菌后加入到高压灭菌后的培养液。在混合前，将葡萄糖、KH₂PO₄和CaCl₂·2H₂O与剩余的培养液成分分开各自高压灭菌，以防止盐析出和糖焦化。所有培养基成分均购自SigmaChemical(St.Louis,MO)。

选择转化体在含有合适抗生素的固体培养基上的生长。将每种载体的20-100个原代转化体重铺到“木糖-SSFM”固体培养基上，其与SSFM(下面描述的)相同除了它包含木糖代替葡萄糖作为唯一碳源，并且不添加抗生素。在这些条件下未观察到产自用任何单一载体转化的任何克隆的生长。

SSFM培养基：50g/L葡萄糖，13.6g/LNa₂SO₄，0.7g/LK₂SO₄，0.36g/LKCl，2.3g/LMgSO₄·7H₂O，0.1MMES(pH6.0)，1.2g/L(NH₄)₂SO₄，0.13g/L谷氨酸钠，0.056g/LKH₂PO₄，和0.2g/LCaCl₂·2H₂O。维生素从由0.16g/L维生素B12，9.7g/L硫胺素和3.3g/L泛酸钙组成的贮液，以1mL/L加入。痕量金属元素从由1g/L柠檬酸，5.2g/LFeSO₄·7H₂O，1.5g/LMnCl₂·₄H₂O，1.5g/LZnSO₄·7H₂O，0.02g/LCoCl₂·6H₂O，0.02g/LNa₂MoO₄·2H₂O，1.0g/LCuSO₄·5H₂O，和1.0g/LNiSO₄·6H₂O组成的贮液，以2mL/L加入，调整到pH2.5。

提取和纯化pCL0130和pCL0131原代转化体的gDNA并用作PCR模板以检测转基因的存在。

用于裂殖壶菌属的基因组DNA提取方案–裂殖壶菌属转化体在50mL培养基中培养。将25mL培养物无菌吸到50mL锥形瓶中并在3000xg离心4分钟形成沉淀。去除上清并将沉淀储存在-80°C直到使用。在50mL锥形瓶中将沉淀重悬于约4-5倍体积的含20mMTrispH8，10mMEDTA，50mMNaCl，0.5%SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中。沉淀在50°C温和振荡温育1小时。溶解后，加入100μg/ml的核糖核酸酶A并将溶液在37°C振荡温育10分钟。接着，加入2体积的苯酚：氯仿：异戊醇并将溶液在室温下振荡1小时，然后在8000xg离心15分钟。将上清转移到一个干净的管中。再一次，加入2体积的苯酚：氯仿：异戊醇并将溶液在室温下振荡1小时，然后在8000xg离心15分钟并将上清转移到一个干净的管中。生成的上清中加入等体积的氯仿并将溶液在室温下振荡30分钟。溶液以8000xg离心15分钟并将上清转移到一个干净的管中。生成的上清中加入等体积的氯仿并将溶液在室温下振荡30分钟。溶液以8000xg离心15分钟并将上清转移到一个干净的管中。上清中加入0.3体积的3MNaOAc和2倍体积100%EtOH，轻轻摇晃几分钟。用无菌玻璃棒卷出DNA并浸入70%EtOH中1-2分钟。DNA转入1.7ml微离心管并使其风干10分钟。DNA中加入至多0.5mL预温热的洗脱缓冲液(Tris缓冲液，10mM，pH8.0)并在4°C放置过夜。

另外，核糖核酸酶A温育后，按照制造商的方案使用QiagenGenomictip500/G柱(Qiagen,IncUSA,Valencia,CA)进一步纯化DNA。

PCR-用于检测GXS1转基因的引物是5’CL0130(CCTCGGGCGGCGTCCTCTT)(SEQIDNO:8)和3’CL0130(GGCGGCCTTCTCCTGGTTGC)(SEQIDNO:9)。用于检测At5g17010转基因的引物是5’CL0131(CTACTCCGTTGTTGCCGCCATCCT)(SEQIDNO:10)和3’CL0131(CCGCCGACCATACCGAGAACGA)(SEQIDNO:11)。发现pCL0130转化产生的10个克隆中的4个包含GSX1转基因；而pCL0131转化产生的10个克隆中的7个发现包含At5g17010转基因。从这些pCL0130和pCL0131阳性转化体中各选择1个克隆用于使用选自pCL0132、pCL0133、pCL0134、pCL0135、或pCL0136的第二载体的转化以产生以下组合：pCL0130+pCL0132、pCL0130+pCL0133、pCL0130+pCL0134、pCL0130+pCL0135、pCL0130+pCL0136、pCL0131+pCL0132、pCL0131+pCL0133、pCL0131+pCL0134、pCL0131+pCL0135、和pCL0131+pCL0136。用第二载体转化后，将每个培养物铺板到含抗生素的SSFM或直接铺板到木糖-SSFM。在每个转化体在含抗生素的SSFM板上生长4-12天后出现的众多菌落中，将5个克隆重铺到木糖-SSFM。共转染pCL0130或pCL0131和任一其他载体产生的任何克隆在木糖-SSFM固体培养板上均没有观察到生长。

实施例3

裂殖壶菌属中木糖转运蛋白的表达

以5000xg离心培养物后，收集在sPFM中生长3天的50mL摇瓶培养物的上清。sPFM培养基描述于下表1。裂解培养物沉淀以按之前所述方法提取蛋白。参见，美国申请公开号2010/0233760。使用培养物沉淀裂解物进行SDS-PAGE并用考马斯染料直接染色凝胶或电转移到PVDF膜上。转移后，将PVDF膜用于按常规方法进行的Western印迹。参见，例如，Sambrook等。简言之，用1:500稀释的衍生自兔的原代抗血清探测膜，所用兔已经通过注射(OpenBiosystemsProducts,Huntsville,AL)缀合于匙孔血蓝蛋白(KLH)的木糖转运蛋白肽的制备物进行了免疫。缀合于KLH的特定合成肽是RLRKLPIDHPDSLEELRD(SEQIDNO:24)–“130-p1”或ETKGLTLEEIEAKCL(SEQIDNO:25)-“131-p2”(OpenBiosystemsProducts,Huntsville,AL)以产生分别对SEQIDNO:2(白色假丝酵母(C.albicans)GSX1)或SEQIDNO:3(拟南芥At5g17010)特异性的抗血清。接着在抗血清中加入缀合于碱性磷酸酶(PromegaCorporation,Madison,WI)的小鼠抗-兔IgG单克隆抗体二抗。然后将BCIP/NBT试剂用于膜以产生信号。来自用pCL0130转化的克隆和野生型裂殖壶菌属菌株ATCC20888的培养物沉淀裂解物的Western印迹如图22A所示。来自用pCL0131转化的克隆和野生型裂殖壶菌属菌株ATCC20888的培养物沉淀裂解物的Western印迹如图22B所示。在每一实施例中，在所有野生型或转化体裂解物的条带中，仅发现一条是给定转化体特有的而且在每种情况下该特有条带均与表达的木糖转运蛋白预期的大小相对应。

表1：sPFM培养基

用HCl调pH到2.5

*高压灭菌后加入

实施例4

用木糖转运蛋白、木糖异构酶和木酮糖激酶表达载体转化的裂殖壶菌属在木糖上的生长

用两种不同的载体混合物共转化裂殖壶菌属野生型菌株ATCC20888。混合物含有中间假丝酵母木糖转运蛋白(pCL0130)或拟南芥木糖转运蛋白(pCL0131)以及两种额外的载体：包含瘤胃真菌属菌种E2木糖异构酶的载体(pCL0132)和包含瘤胃真菌属菌种E2木糖激酶的载体(pCL0136)。一种载体组合，称为130瘤胃真菌系列，包括pCL0130、pCL0132和pCL0136。另一种载体组合，称为131瘤胃真菌系列，包括pCL0131、pCL0132和pCL0136。将转化体直接铺于固体木糖SSFM培养基并于3-5周后挑取菌落并在液体木糖-SSFM中进一步增殖。从130瘤胃真菌系列转化中回收2个菌落并从131瘤胃真菌系列转化中回收4个菌落。在含木糖的液体培养基中的几轮连续传代(serialtransfer)提高了转化体的生长速率。130瘤胃真菌系列和131瘤胃真菌系列的转化体也重铺入含有甲嘧磺隆(SMM)、ZEOCIN^TM或巴龙霉素的固体SSFM培养基。铺入这些培养基的所有转化体对每一种测试的抗生素有抗性，表明转化体包含所有三种它们对应的载体。用木糖转运蛋白、木糖异构酶和木酮糖激酶转化的裂殖壶菌属细胞能够在包含木糖作为唯一碳源的固体和液体SSFM培养基中生长。

将来自瘤胃真菌130系列的一个克隆和来自瘤胃真菌131系列的一个克隆在含木糖液体培养基中连续传代。在连续传代的第5、11、19代测量每种培养物的细胞干重(DCW)值、脂肪对DCW的重量百分比(%脂肪)、和每升细胞培养物的脂肪克数(g/L脂肪)。结果如下表2所示。

表2：生长在含木糖培养基中的瘤胃真菌130系列和瘤胃真菌131系列的细胞干重、%脂肪和g/L脂肪

相同的克隆进一步在液体培养中培养以进行FAME分析。将从选择以木糖作为碳源生长的固体培养板挑取的菌落在含木糖作为首要碳源的液体培养基中增殖超过19次连续传代。用于开始第19次连续传代的接种物也用于开始对于每一克隆的在含葡萄糖作为首要碳源的液体培养基中的比较对照培养。野生型(WT)裂殖壶菌属也在含葡萄糖液体培养基中平行培养。在含木糖液体培养基中未检测到野生型裂殖壶菌属菌株生长，因此无法进行FAME分析和其他生长表征。

使用标准流程从细胞培养物中提取油并按脂肪酸甲酯(FAMEs)的百分比分析脂肪酸组成。参见，例如，美国申请公开号2010/0239533，以整体引用的方式并入本文。

细胞干重(DCW)、脂肪对DCW的重量百分比(%脂肪)、每升细胞培养物的脂肪克数(g/L脂肪)、每克总脂肪中DHA毫克数、每种检测的脂肪的百分比值、和脂肪类别(饱和、单不饱和、和长度大于18碳的脂肪)的百分比值总和列于下表3。

表3：瘤胃真菌130系列和瘤胃真菌131系列转化体的FAME分析

实施例5

用木糖转运蛋白、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶表达载体转化的裂殖壶菌属在木糖上的生长

进行裂殖壶菌属野生型菌株ATCC20888的共转化，其中将含有中间假丝酵母木糖转运蛋白的载体(pCL0130)和三种其他载体共转化：包含树干毕赤酵母木糖还原酶的载体(pCL0133)、包含树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶的载体(pCL0134)和包含树干毕赤酵母木酮糖激酶的载体(pCL0135)。这种载体组合称为130毕赤酵母系列。将转化体直接铺于固体木糖SSFM培养基并于3-5周后挑取菌落并在液体木糖-SSFM中进一步增殖。130毕赤酵母系列的共转化率与实施例4的130瘤胃真菌系列和131瘤胃真菌系列相似。用中间假丝酵母木糖转运蛋白、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶转化的裂殖壶菌属细胞能够在包含木糖作为唯一碳源的固体和液体SSFM培养基中生长。

本文所述的各个方面、实施例和选项均可以与任何和所有的变化相结合。

只要个人出版物、专利或专利申请是专门单独表示将纳入本文作为参考的，在本文中提到的所有出版物、专利和专利申请，以相同的程度纳入本文作为参考。

Claims

1.一种生产破囊壶菌目(Thraustochytriales)细胞培养物的方法，该方法包括：

a.以包含编码与木糖输入相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子、包含编码与木糖向木酮糖转换相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子和包含编码与木酮糖磷酸化相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌目细胞，其中所述与木糖输入相关的多肽为异源木糖转运蛋白，所述与木糖向木酮糖转换相关的多肽选自下组：(1)异源木糖异构酶、(2)异源木糖还原酶和异源木糖醇脱氢酶、(3)(1)和(2)的组合，所述与木酮糖磷酸化相关的多肽为异源木酮糖激酶；并

b.在包含木糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌目细胞。

2.依照权利要求1所述的方法，其中所述破囊壶菌目细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶和异源木酮糖激酶。

3.依照权利要求1所述的方法，其中所述破囊壶菌目细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶和异源木糖醇脱氢酶。

4.依照权利要求1-3任一项所述的方法，其中

编码与木糖输入相关的多肽的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号AJ875406、BT015128的多核苷酸序列；SEQIDNO:2、SEQIDNO:3的多核苷酸序列，及其组合；

编码与木糖向木酮糖转换相关的多肽的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号X59465、X55392的多核苷酸序列；编码登录号CAB76571的氨基酸序列的多核苷酸序列；SEQIDNO:6、SEQIDNO:21或SEQIDNO:23的多核苷酸序列，及其组合；

编码与木酮糖磷酸化相关的多肽的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号AF127802、AJ249910的多核苷酸序列；SEQIDNO:7或SEQIDNO:22的多核苷酸序列，及其组合。

5.依照权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述破囊壶菌目细胞是裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。

6.依照权利要求4所述的方法，其中所述破囊壶菌目细胞是裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。

7.依照权利要求1-6任一项所述的方法产生的破囊壶菌目细胞培养物。

8.一种破囊壶菌目细胞，其包含如下核酸分子：包含编码与木糖输入相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子、包含编码与木糖向木酮糖转换相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子和包含编码与木酮糖磷酸化相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子，其中所述与木糖输入相关的多肽为异源木糖转运蛋白，所述与木糖向木酮糖转换相关的多肽选自下组：(1)异源木糖异构酶、(2)异源木糖还原酶和异源木糖醇脱氢酶、(3)(1)和(2)的组合，所述与木酮糖磷酸化相关的多肽为异源木酮糖激酶。

9.依照权利要求8所述的细胞，其中所述破囊壶菌目细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木糖异构酶和异源木酮糖激酶。

10.依照权利要求8所述的细胞，其中所述破囊壶菌目细胞表达异源木糖转运蛋白、异源木酮糖激酶、异源木糖还原酶和异源木糖醇脱氢酶。

11.依照权利要求8-10任一项所述的细胞，其中

12.依照权利要求8-10任一项所述的细胞，其中所述破囊壶菌目细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。

13.依照权利要求11所述的细胞，其中所述破囊壶菌目细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。

14.一种破囊壶菌培养物，其包含：

a.权利要求8-13任一项所述的破囊壶菌目细胞，和

b.包含木糖作为碳源的细胞培养基。

15.一种生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括：

a.在包含木糖作为碳源的培养基中培养权利要求8-13任一项所述的破囊壶菌目细胞，并

b.从所述培养基收获生物质。

16.一种生产微生物油的方法，该方法包括：

a.在包含木糖作为碳源的培养基中培养权利要求8-13任一项所述的破囊壶菌目细胞以生成生物质，并

b.从所述生物质提取油。

17.一种生产用于动物或人的食品、化妆品、或药物组合物的方法，该方法包括：

a.在包含木糖作为碳源的培养基中培养权利要求8-13任一项所述的破囊壶菌目细胞，

b.从所述培养基收获生物质，并

c.从所述生物质制备食品、化妆品或药物组合物。

18.依照权利要求17所述的方法，进一步包括从所述生物质提取油并从所述油制备食品、化妆品或药物组合物。

19.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述药物组合物是治疗性饮品。

20.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述食品是婴儿配方食品。

21.依照权利要求20所述的方法，其中所述婴儿配方食品适合早产儿。

22.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述食品是牛奶、营养饮品或其组合。

23.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述食品是饮料。

24.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述食品是用于动物或人的食物的添加剂。

25.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述食品是营养补充剂。

26.依照权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述食品是动物饲料。

27.依照权利要求26所述的方法，其中所述动物饲料是水产养殖饲料。

28.依照权利要求26所述的方法，其中所述动物饲料是动物园动物饲料、牲畜饲料或其组合。

29.依照权利要求28所述的方法，其中所述牲畜饲料是家畜饲料。

30.依照权利要求28所述的方法，其中所述牲畜饲料是役畜饲料。

31.一种生产生物燃料的方法，该方法包括：

a.在包含木糖作为碳源的培养基中培养权利要求8-13任一项所述的破囊壶菌目细胞以生成生物质，

b.从所述生物质提取油，并

c.通过对油进行酯交换、裂化油、经由热解聚加工油、将油加入石油精炼过程，或其组合生产生物燃料。

32.依照权利要求31所述的方法，其中通过对油进行酯交换生产生物燃料。

33.依照权利要求31所述的方法，其中所述生物燃料是生物柴油。

34.依照权利要求33所述的方法，其中通过裂化油生产生物燃料。

35.依照权利要求31或权利要求34所述的方法，其中所述生物燃料是喷气生物燃料。

36.依照权利要求31所述的方法，其中通过经由热解聚加工油生产生物燃料。

37.依照权利要求31或权利要求36所述的方法，其中所述生物燃料是可再生柴油。

38.依照权利要求31所述的方法，其中通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。

39.依照权利要求31或权利要求38所述的方法，其中所述生物燃料是共处理的可再生柴油。