CN102886050B - miRNA-489的用途及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种miRNA-489的用途及药物组合物，具体为miRNA-489在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，所述miRNA-489的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’；所述药物组合物含有miRNA-489和药学上可接受的载体、病毒或辅料。本发明说明miRNA-489通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。

Description

miRNA-489的用途及药物组合物

技术领域

本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药用途，尤其涉及miRNA-489及其在预防或治疗心脏疾病中的用途，属于心脏疾病的诊断、预防和治疗领域。

背景技术

心血管疾病主要包括高血压、冠心病、充血性心力衰竭等。目前，心血管疾病仍然是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。毫无疑问，预防和治疗心血管疾病仍然是医学与生物学的重大任务。

心肌肥大是指组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大的总称。它是由于心肌细胞体积增大而导致心脏体积增大所发生的一种疾病。该病是由一些生理和病理因素的共同刺激而发生的，它是许多心血管疾病的综合性表现。心肌肥大是心肌病的一种，是心肌细胞针对于血液动力学增加的一种应答反应。多种情况可以引起人体内血液动力的增加，比如高血压，心脏瓣膜疾病。长期的超负荷血液动力刺激会引起以心肌细胞体积增大为特征的心肌细胞重塑过程，也就是心肌肥大。现在一般认为存在两种情况的心肌肥大，一种是正常的生理性肥大，比如出生后伴随者发育发生的心肌肥大，还有体育锻炼引起的心肌肥大；另外一种是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室间隔增厚，心肌收缩功能增强，因此被视为代偿性肥大，如果病情一直未得到缓解，心肌肥大后期会发生心室壁间质纤维化、心肌细胞收缩功能失调以及能量代谢，基因表达和电生理特征的异常，最终导致心脏功能衰竭。鉴于心肌肥大的发生是一个进行性不可逆过程，而且最终会引起心力衰竭，现代医学已经把它作为心脏发生临床病变的一个里程碑式的心肌形态变化，认为它是导致心脏疾病和心脏猝死的一个危险因素。

随着近来miRNA研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。对于miRNA来说，它调控方式的特点决定了它的靶基因不会只有一个，而是一对多的方式，这就是使得miRNA的功能研究内容非常丰富。许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。

尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，但在心脏肥厚和心肌纤维化心脏疾病中的关键miRNA仍没有确定，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战。

发明内容

因此，本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞肥大的在心脏中表达的miRNA，进一步确定其在心肌肥大、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。

除非特别指明，本文中的“β-gal”是指“β半乳糖苷酶”。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种miRNA-489在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，所述miRNA-489的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’。

优选地，所述心脏疾病选自心肌肥大、心肌纤维化、冠心病和心衰中的一种或多种。

另一方面，本发明提供一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物，所述药物组合物含有miRNA-489和药学上可接受的载体、病毒或辅料，所述miRNA-489的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’。

优选地，所述miRNA-489的含量为0.5~1g/ml。

优选地，所述载体选自胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。

优选地，所述药物组合物以口服或注射方式给药。

优选地，所述注射方式为静脉注射或肌肉注射。

再一方面，本发明提供一种用于预防或治疗心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒含有miRNA-489、生理盐水和缓冲液，所述miRNA-489的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’。

还一方面，本发明提供一种本发明所述的药物组合物或本发明所述的试剂盒在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。

优选地，所述心脏疾病选自心肌肥大、心肌纤维化、冠心病和心衰中的一种或多种。

本发明通过实验发现miRNA-489在肥大的心肌细胞和心脏肥厚中表达显著下调。通过构建miRNA-489过表达腺病毒或miRNA-489转基因小鼠加强miRNA-489的表达发现，miRNA-489过表达在细胞水平能抑制心肌细胞肥大的发生，miRNA-489的转基因小鼠的心脏在用肥大刺激因子处理后与对照组相比有了明显的肥大表型及纤维化程度的降低，同时一些肥大基因的表达也与对照组相比有了明显的降低。

具体的，本发明发现miRNA-489在肥大的心肌细胞中与对照组相比有了明显的下降，对其进行肥大指标的检测发现，心肌肥大的指标如细胞表面积，蛋白/DNA的比值及肌小节的重组也与对照组相比都有了明显的下降。miRNA-489的转基因小鼠在用肥大刺激因子（血管紧张素）后的心脏表型，心脏体重比，边缘区的心肌细胞横截面积（WGA染色）及心肌纤维化（Masson染色）与野生型相比都有了明显的降低。以上实验说明miRNA-489能够抑制心肌肥大的发生，这意味着miRNA-489可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。

以上实验说明miRNA-489通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。具体的，可以合成miRNA-489的核苷酸并与适当载体如胆固醇，纳米颗粒，脂质体等连接形成药物，通过口服，静脉或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病进行治疗。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表明miRNA-489转基因小鼠的表型及心功能与野生型相比没有明显的改变，其中图1A为miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的表型的比较，图中的比例尺为20μm；图1B为miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠心脏体重比的比较；图1C为miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏中左心室后壁厚度的比较，图1D为miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏中短轴缩短率的比较；

图2表明miRNA-489转基因小鼠在血管紧张素（AngⅡ）刺激下与野生型小鼠相比表型及心功能有了明显的改变，其中图2A为在AngⅡ刺激下miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的表型的比较，图中的比例尺为2mm；图2B为在AngⅡ刺激下miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的及心脏体重比；图2C为在AngⅡ刺激下miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏的左心室后壁厚度的比较，图2D为在AngⅡ刺激下miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏短轴缩短率的比较；

图3表明心脏肥大刺激因子AngⅡ（血管紧张素）诱导的心肌细胞肥大过程中miRNA-489表达水平的变化，其中纵坐标表示以0分钟的miRNA-489表达量为基准，在AngⅡ（血管紧张素）诱导的心肌细胞肥大过程中不同诱导时间下miRNA-489的表达量；

图4表明miRNA-489能够在细胞水平上抑制AngⅡ所诱导的肥大，其中图4A表明原代心肌细胞感染miRNA-489腺病毒能够抑制心肌细胞的表面积，其中纵坐标表示在诱导心肌细胞的过程中，每个样品与对照（不存在任何物质的情况下心肌细胞面积）的百分比，图4B表明原代心肌细胞感染miRNA-489腺病毒其蛋白/DNA比率的变化，其中a-d分别表示如下：

a为在AngⅡ存在、β-gal和miRNA-489不存在的情况下处理下的心肌细胞的结果；

b为在AngⅡ和miRNA-489存在、β-gal不存在的情况下处理下的心肌细胞的结果；

c为AngⅡ和miRNA-489存在、β-gal不存在的情况下处理下的心肌细胞的结果；

d为AngⅡ和β-gal存在、miRNA-489不存在的情况下处理下的心肌细胞的结果；

图4C表明原代心肌细胞感染miRNA-489腺病毒其肌小节重组的情况，其中，对照为不存在任何物质的情况下心肌细胞肌小节重组的情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

除非特别指明，以下实施例中所用的小鼠品种为C57/BL6，购自北京医科大学。

除非特别指明，以下实施例中所用的HEK-293细胞购自中国科学院动物研究所。

除非特别指明，以下实施例中所用的酶如限制性内切酶、扩增酶，逆转录酶等均购自北京博奥生物有限公司。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

除非特别指明，以下各实施例中涉及的各种实验方法和操作，包括原代心肌细胞培养，腺病毒的构建及感染心肌细胞的剂量，细胞表面积测量，蛋白/DNA比值计算，肌小节结构的染色，心脏石蜡切片，HE染色及WGA染色，心脏体重比的检测方法，心脏功能指标的详细叙述，载体的构建、扩增及转染，细胞染色等等，均可参见以下文献：W.-Q.Tan,et al,Foxo3aInhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J BiolChem.2008 October 31;283(44):29730-29739；Wang K,et al,miR-9andNFATc3 regulate myocardin in cardiac hypertrophy,J Biol Chem.2010Apr16;285(16):11903-12；Lin Z,et al,miR-23a functions downstream of NFATc3to regulate cardiac hypertrophy，PNAS,2009,106(29):12103-12108）。上述文献在此全文引入作为参考。

实施例1miRNA-489转基因小鼠的制得

通过PCR的方法从小鼠基因组扩增含有miRNA-489前体序列的DNA片段，具体为提取小鼠心脏的基因组，以其为模板，PCR扩增miRNA-489的全长编码序列（SEQ ID NO:2，ACTGCTGCAGTGGCAGCTTGGTTGTCATATGTGTGATGACACTTTCTAAAGTCTTCCAGAATGACACCACATATATGGCAGCTAAACTGTTACATGGAACAACAAGT），及其上下游两端的序列，PCR体系50μl，PCR条件如下：95°C3min一个循环；95°C 30s,58°C 30s,72°C 1min共28个循环；最后72°C延伸5min)，扩增片段约400bp（SEQ ID NO:3，其全长序列为

TAACTCATATCAAAGTAGGATTGACCCTAGCACAAAGTCATGTCACCTGAGGCCATTTCCTTCTGTACGTCATGATCATTATGAATTAAACCTTCTAGAATGTAAGCCCCATGAGGGCAGAAACCATGCTAGCAAATGTACTGCTGAGTTTTCAGAACCTACAACAGGACCTGGTGACGCCTCATCTGCTGCTA

AAGATATAGGCTTGTGTGTTGGTTAGTTTTTAAAGACATGTGACA

其中标下划线的部分为上下游引物，下游引物与该序列的C末端序列反向互补，加黑标下划线的部分为SEQ IDNO:2的序列，其余为上下游的序列），PCR引物设计如下：

上游引物：5'-TCTGGTAACCCAAAAGCAAACTGAT-3'（SEQ IDNO:4）,

下游引物：5'-TAAAGGTGACAATGACACACAAACA-3'（SEQ IDNO:5）

再将其克隆到pαMHC-clone26载体(购自北京军事医学科学院，通过Kpn1和HindШ双酶切后进行连接)。miRNA-489的表达受该载体上的心脏特异性启动子CMV调控，可以使miRNA-489能够在心脏特异的过表达。应用常规的显微注射方法将该载体导入受精卵，筛选、繁育，获得miRNA-489转基因小鼠（购自沈阳医学院）。

实验例2miRNA-489转基因小鼠的表型及心功能与野生型相比没有 明显的改变

对miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏进行表型分析，每组10-16只小鼠，通过石蜡切片鉴定整体外形，通过HE及WGA染色（图1A）确定细胞的横截面积大小，同时检测了心脏体重比，将测得的结果用one-way ANOVO统计软件进行统计学分析（参见Wang K,et al,miR-9andNFATc3 regulate myocardin in cardiac hypertrophy,J Biol Chem.2010 Apr16;285(16):11903-12），结果如图1A所示，结果显示miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠相比心脏表型没有明显的增大，心脏体重比也没有显著的提高，说明miRNA-489转基因小鼠本身并没有明显的表型改变，表明miRNA-489过表达的转基因小鼠与野生型小鼠有相似的表型结构，miRNA-489转基因的过表达没有对小鼠心肌造成不良的影响，可以间接的说明miRNA-489可能是对心肌起保护作用的小RNA。

同时检测的心功能的指标包括左心室后壁厚度（LVPWd），短轴缩短率）（FS）（图1B-1D）。实验结果显示miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能没有明显的区别。这些心功能的指标也证明了miRNA-489可能是对心肌功能起保护作用的小RNA。

实验例3miRNA-489转基因小鼠在血管紧张素(AngⅡ)刺激下与野生 型小鼠相比表型及心功能有了明显的改变

对miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠，每组8-12只小鼠的心脏用0.6mg/kg/天血管紧张素（AngⅡ，购自sigma公司）腹腔埋泵注射二周的方法对心脏进行肥大刺激，通过石蜡切片鉴定整体外形，通过HE染色（图2A），同时检测了心脏体重比，将测得的结果用one-way ANOVO统计软件进行统计学分析，并且还用生理盐水按前述同样的步骤处理miRNA-489转基因小鼠与野生型小鼠的心脏作为对照。实验结果如图2A所示，显示miRNA-489转基因小鼠经过AngⅡ处理后的表型与野生型小鼠相比心脏表型有了明显的减小，心脏体重比也有了显著的降低，说明经过AngⅡ处理后的miRNA-489转基因小鼠有了减小的肥大表型改变。以上实验结果说明miRNA-489能够保护肥大刺激因子AngⅡ所诱导的心脏肥大表型及反应，近一步证明了miRNA-489对心脏的保护作用。

心功能的检测包括左心室后壁厚度（LVPWd），短轴缩短率（FS）以及室间隔厚度（LVSd）与野生型小鼠相比有了明显的心功能的改善（图2B-2D）。心功能的指标也显示miRNA-489能够保护肥大刺激因子AngⅡ所诱导的心脏功能的下降，从而近一步证明了miRNA-489对心脏功能的保护作用。

实验例4在AngⅡ刺激下miRNA-489表达水平的变化

对于心肌细胞肥大模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，对心肌细胞用150nM AngⅡ进行处理，在培养的不同时间，0分钟、5分钟、15分钟、30分钟和60分钟分别提取细胞的总RNA，通过实时荧光定量PCR技术检测miRNA-489的表达水平，PCR体系25μl，PCR条件如下：95°C 1min一个循环；95°C 15s,56°C 15s,72°C 1min共28个循环；最后72°C延伸5min，PCR引物设计如下，扩增片段约107bp（SEQID NO:2）：

上游引物：5'-ACTGCTGCAGTGGCAGCTTGG-3'（SEQ ID NO:6）,

下游引物：5'-ACTTGTTGTTCCATGTAACAG-3'（SEQ ID NO:7）。

如图3所示，结果表明，miRNA-489表达水平在AngⅡ处理60分钟之内有了显著的下降。

实验例5miRNA-489能够在细胞水平上抑制AngⅡ所诱导的心肌肥 大

采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统（购自Clonetech）构建miRNA-489过表达载体或腺病毒。按照公司说明书构建相应载体及腺病毒，具体方法如下。

提取大鼠心脏的基因组，以其为模板，PCR扩增miRNA-489的全长编码序列（SEQ ID NO:2）及其上下游两端的序列，即SEQ ID NO:3用spe1和xho1进行双酶切，再将腺病毒载体pSilencer Adeno CMV1.0-CMV穿梭载体进行双酶切后与上述酶切后的片段进行连接，即将片段克隆入腺病毒载体中。PacⅠ酶切线性化该pSilencer Adeno1.0-CMV载体（即腺病毒骨架），Adenovirus LacZ Backbone），共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度。通过实时定量（Real-time）PCR鉴定miRNA-489表达。

对原代心肌细胞感染腺病毒miRNA-489后，β半乳糖苷酶作为负对照腺病毒。细胞用150nM AngⅡ对心肌细胞进行处理，经过24小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如细胞表面积（图4A）、蛋白/DNA（图4B）及肌小节的重组（图4C）检测。实验结果证明miRNA-489能够有效的抑制AngⅡ所诱导的心肌细胞肥大。

Claims (7)

1.一种药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，所述药物组合物含有miRNA-489和药学上可接受的载体或辅料，所述miRNA-489的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’

其中，所述心脏疾病选自心肌肥大、心肌纤维化、冠心病和心衰中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-489的含量为0.5～1g/ml。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述载体为病毒。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述载体选自胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物以口服或注射方式给药.

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述注射方式为静脉注射或肌肉注射。

7.一种试剂盒在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，所述试剂盒含有miRNA-489、生理盐水和缓冲液，所述miRNA-489的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’，

其中，所述心脏疾病选自心肌肥大、心肌纤维化、冠心病和心衰中的一种或多种。

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