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CN102884192A - 针对a型流感病毒的基质蛋白-1的适配子及其应用 - Google Patents

针对a型流感病毒的基质蛋白-1的适配子及其应用 Download PDF

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CN102884192A
CN102884192A CN2010800603935A CN201080060393A CN102884192A CN 102884192 A CN102884192 A CN 102884192A CN 2010800603935 A CN2010800603935 A CN 2010800603935A CN 201080060393 A CN201080060393 A CN 201080060393A CN 102884192 A CN102884192 A CN 102884192A
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CN
China
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seq
nucleic acid
aptamer
stromatin
nucleotide
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Pending
Application number
CN2010800603935A
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English (en)
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让-杰昆西·图尔姆
埃里克·多斯
弗朗索瓦·康奈特
丹尼尔·德斯曼
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Universite de Liege
NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST
Original Assignee
Universite de Liege
NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST
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Publication date
Application filed by Universite de Liege, NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST filed Critical Universite de Liege
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    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸以及其用于检测目标样品中这种病毒的用途。更具体地，本发明涉及特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸，其特征在于所述核酸包含如下核苷酸序列：5’-N1-NS1-U-N3-A-NS3-NS5-NS7-NS6-CGCAU-NS4-C-N4-NS2-N2-3’，其中：-N1由一个核苷酸组成；-NS1和NS2由长度为3或4个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS1和NS2具有互补的序列；-N3和N4由一个核苷酸组成，并且N4与N3互补；-NS3和NS4由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS3和NS4具有互补的序列；-NS5和NS6由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS5和NS6具有互补的序列；-NS7由选自AGAAUC(SEQ ID NO：12)、UGAG(SEQ ID NO：13)、UAUUCC(SEQ ID NO：14)、AGAU(SEQ ID NO：15)、AGAATC(SEQ ID NO：16)或TGAG(SEQ ID NO：17)的多核苷酸组成；-N2由与核苷酸N1互补或不互补的核苷酸组成。

Description

针对A型流感病毒的基质蛋白-1的适配子及其应用
技术领域
本发明涉及特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸以及其用于检测目标样品中这种病毒的用途。
背景技术
流感是正粘病毒，有三个属，A型、B型和C型。A型和B型在临床上最重要，因为它们导致急性呼吸道感染，这是高度传染性的，并以很高的发病率和死亡率折磨着人类和动物。
A型病毒根据两种病毒表面糖蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)，主要分为不同的抗原性亚型。目前鉴定了16种HA亚型(称为H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，其中所有亚型都可以在野生的水鸟中发现。在HA和NA的135种可能的组合中，自从1993年首次分离该病毒以来，仅有4种(H1N1、H1N2、H2N2和H3N2)在人群中广泛传播。基质蛋白-1也是位于病毒衣壳内侧的流感病毒的主要结构成分。它也是A型流感病毒的变异最低的抗原。
目前公众和科学界对流感流行株的可能出现的担忧需要更早地诊断流感病毒。因此，有动机寻求能帮助医生检测目标样品中流感病毒的特异性探针。
例如，已经开发了针对基质蛋白-1的抗体作为用于检测临床样品中流感病毒的探针(Bucher等，(1991))。
适配子是代表抗体在分子识别方面的替代物的一类分子。适配子是具备事实上以高亲和力和特异性识别任何类型的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。这种配体可以通过随机序列文库的指数富集的配体系统进化技术(SELEX)而分离，如Tuerk C和Gold L.，1990所述。因此，已经开发了数个针对流感病毒血凝素的适配子(例如参见Gopinath SC，Kawasaki K，Kumar PK.Selection of RNA-aptamersagainst human influenza B virus.Nucleic Acids Symp Ser(Oxf).2005；(49)：85-6.)。
发明简述
本发明涉及特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸以及其用于检测目标样品中这种病毒的用途。
更具体地，本发明涉及特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸，其特征在于所述核酸包含如下核苷酸序列：
5’-N1-NS1-U-N3-A-NS3-NS5-NS7-NS6-CGCAU-NS4-C-N4-NS2-N2-3’
其中：
-N1由一个核苷酸组成；
-NS1和NS2由长度为3或4个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS1和NS2具有互补的序列；
-N3和N4由一个核苷酸组成，并且N4与N3互补；
-NS3和NS4由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS3和NS4具有互补的序列；
-NS5和NS6由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS5和NS6具有互补的序列；
-NS7由选自AGAAUC(SEQ ID NO：12)、UGAG(SEQ ID NO：13)、UAUUCC(SEQ ID NO：14)、AGAU(SEQ ID NO：15)、AGAATC(SEQ ID NO：16)或TGAG(SEQ ID NO：17)的多核苷酸组成；
-N2由与核苷酸N1互补或不互补的核苷酸组成。
本发明也涉及本发明的核酸用于检测或定量目标样品中基质蛋白-1的用途。
本发明也涉及本发明的核酸用于检测和/或定量目标样品中A型流感病毒的用途。
本发明也涉及包含固体载体并携带至少一种权利要求1-10中任一项所述的核酸的微阵列。
本发明也涉及包含至少一种本发明核酸的试剂盒。
发明详述
发明人鉴定了均能以高亲和力结合流感病毒的基质蛋白-1的一小组结构相关的核酸(适配子)(见实施例1)。而且发明人表明，本发明的适配子非常适于生产适配子微阵列，从而高效检测甚至复杂介质中的基质蛋白-1(见实施例2)。因此，本发明的适配子可以用于针对流感检测的各种诊断系统中。
因此，本发明的一个目的由特异性结合基质蛋白-1的核酸组成。
此处所用的术语“基质蛋白-1”是指流感病毒的基质蛋白-1。基质蛋白-1是具有所有A型流感病毒间共有的共同抗原性的型特异性的抗原，无论分离的原始来源是人、鸟、猪、马或其它动物种属。编码基质蛋白-1的示例性的天然氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。
此处本发明的基质蛋白-1-特异性核酸也可以称为“基质蛋白-1适配子”，因为其中数个起初是通过进行SELEXTM方法而筛选的。本发明的基质蛋白-1-特异性核酸由基质蛋白-1的核酸配体组成。
如此处期望的，上述核酸是“基质蛋白-1特异性的”，因为(i)它们与基质蛋白-1以高亲和力结合，和(ii)它们与其它蛋白不结合或以低亲和力结合。
如此处的实施例中所示，本发明的基质蛋白-1-特异性核酸以解离常数(KD)小于50nM，通常小于20nM结合至基质蛋白-1，而这些核酸的实施方式被赋予的解离常数(KD)小于5nM，在一些情况下甚至小于2nM。在本说明书中，解离常数(KD)也可以称为“(KD)亲和力值”。
本发明的基质蛋白-1蛋白和核酸之间形成的复合物的解离常数(KD)可以通过本领域技术人员熟知的任一种技术测定。测定解离常数(KD)的方法的实施方式在此处的实施例中充分说明。
如此处的实施例中所示，本发明的核酸对于基质蛋白-1的特异性通过这些核酸与非基质-1蛋白、包括密切相关的非基质蛋白-1蛋白如非结构蛋白-2(SEQ ID NO：2)或核蛋白(SEQ ID NO：3)不结合或在一些实施方式中非常低的结合而表明。
通常，本发明的基质蛋白-1适配子可以选自DNA分子和RNA分子。在此处的实施例中，描述了由RNA或DNA分子组成的基质蛋白-1适配子。
更具体地，本发明涉及特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸，其特征在于所述核酸包括如下核苷酸序列：
5’-N1-NS1-U-N3-A-NS3-NS5-NS7-NS6-CGCAU-NS4-C-N4-NS2-N2-3’
其中：
-N1由一个核苷酸组成；
-NS1和NS2由长度为3或4个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS1和NS2具有互补的序列；
-N3和N4由一个核苷酸组成，并且N4与N3互补；
-NS3和NS4由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS3和NS4具有互补的序列；
-NS5和NS6由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS5和NS6具有互补的序列；
-NS7由选自AGAAUC(SEQ ID NO：12)、UGAG(SEQ ID NO：13)、UAUUCC(SEQ ID NO：14)、AGAU(SEQ ID NO：15)、AGAATC(SEQ ID NO：16)或TGAG(SEQ ID NO：17)的多核苷酸组成；
-N2由与核苷酸N1互补或不互补的核苷酸组成。
此处所用的“核苷酸”选自A、T、U、G或C以及其任何化学修饰的形式。
在本发明的每一个基质蛋白-1适配子中，茎二级结构中包含各种“NS”序列，其中给定的第一个NS序列与给定的第二个NS序列互补，除了NS7。因此，当存在于本发明的基质蛋白-1适配子的核酸序列中时，(i)NS1与NS2互补并一起形成双链的茎二级结构，对于(ii)NS3和NS4以及(iii)NS5和NS6也是如此。只要确保两个给定的NSx序列之间的碱基对互补性以形成对应所研究基质蛋白-1适配子的茎区域，给定NSx(除了NS7)序列的特定核酸序列不是必需的。
在一种具体实施方式中，N1是U，N2是A。
在另一种具体实施方式中，NS1和NS2由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成。更具体地，NS1是GCC(SEQ ID NO：18)，NS2是GGC(SEQ ID NO：19)。
在另一种具体实施方式中，NS1和NS2由长度为4个核苷酸的多核苷酸组成。更具体地，NS1是GCCC(SEQ ID NO：20)，NS2是GGGC(SEQ ID NO：21)。
在另一种具体实施方式中，N3是G，N4是C。
在另一种具体实施方式中，NS3是CCA(SEQ ID NO：22)，NS4是UGG(SEQ ID NO：23)。
在另一种具体实施方式中，NS5是CUC(SEQ ID NO：24)，NS6是GAG(SEQ ID NO：25)。
在另一种具体实施方式中，NS5是UCC(SEQ ID NO：26)，NS6是GGA(SEQ ID NO：27)。
在另一种具体实施方式中，NS5是CCU(SEQ ID NO：28)，NS6是AGG(SEQ ID NO：29)。
在另一种具体实施方式中，本发明的核酸包含或由选自SEQ IDNO：8(M1R9C136个碱基长度)、SEQ ID NO：9(M1R9C636个碱基长度)、SEQ ID NO：10(M1R9C1RNA/DNA 36个碱基长度)和SEQID NO：11(M1R9C6RNA/DNA 36个碱基长度)的核酸序列组成。
在本发明的基质蛋白-1的某些其它实施方式中，这种基质蛋白-1适配子的核酸序列包含上面所述的核酸序列，因此也包括(i)位于所述适配子的5’-端或3’-端的一个额外的核酸序列或者(ii)位于所述适配子的5’-端和3’-端的每一端的一个额外的核酸序列。这些额外的核酸序列的长度可以为1-30个核苷酸，不论这些额外序列的性质，它们不明显改变获得的适配子与基质蛋白-1的结合特性。因此，这些额外的核酸序列的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，同时保持与相应的没有额外序列的基质蛋白-1适配子的结合特性相似的结合特性，即其(KD)解离常数与相应的没有额外序列的基质蛋白-1的适配子相比最多相差一个数量级。
如此处的实施例中所述，如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的示例性的基质蛋白-1适配子包含位于分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID：9所示的核酸序列的特定实施方式的5’-端和3’-端的19-mer的额外序列，同时其结合特性与相应的其中没有这些额外序列的基质蛋白-1适配子的结合特性相似(如果不相同)。额外序列可以形成内环、茎或两者都有的二级结构。
根据另一种具体实施方式，本发明的核酸包含或由选自SEQ IDNO：4(M1R9C1)和SEQ ID NO：5(M1R9C6)的核酸序列组成。
本发明的核酸可以通过本领域已知的任何技术产生，例如但不限于，任何化学、生物学、遗传学或酶学技术，或单独或组合使用。了解所需序列的核酸序列，本领域技术人员可以容易地通过生产多核苷酸的标准技术而生产所述适配子。例如，它们可以用熟知的固相方法，优选用可商购的多核苷酸合成仪来合成。
在优选实施方式中，可以将本发明的任一种基质蛋白-1适配子化学修饰从而增加其体外和体内的化学稳定性，并显著地降低它被细胞酶降解，典型地降低它被核酸外切酶和核酸内切酶的降解。化学修饰的基质蛋白-1适配子尤其适用于它们在体内的使用，以其自身使用或与活性化合物如用于医用目的的蛋白酶抑制剂组合使用。
在核酸的应用中遇到的一个可能的问题是在期望的效果显现前，磷酸二酯形式的寡核苷酸可能在体液中被胞内和胞外酶如核酸外切酶和核酸内切酶快速地降解。因此SELEXTM方法包括鉴定包含能将改进的特性赋予在配体上(如改进的体内稳定性或改进的递送特性)的修饰核苷酸的高亲和力核酸配体。这种修饰的例子包括在糖基和/或磷酸基和/或碱基位置处的化学取代。SELEXTM-鉴定的包含修饰核苷酸的核酸配体例如描述于美国专利No.5,660,985，其描述了在核糖的2′位、嘧啶的5位和嘌呤的8位包含化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸，美国专利No.5,756,703，其描述了包含各种2′-修饰的嘧啶的寡核苷酸以及美国专利No.5,580,737，其描述了包含一个或多个具有2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟代(2′-F)和/或2′-OMe取代基的核苷酸的高度特异性核酸配体。核酸的2’-化学修饰技术也在美国专利申请No.US 2005/0037394和No.US 2006/0264369中描述过。
本发明预期的核酸配体的修饰包括但不限于向核酸配体碱基或核酸配体整体提供引入额外电荷、极性、疏水性、氢键结合、静电作用和流变性的其它化学基团的那些。产生耐受核酸酶的寡核苷酸群体的修饰也可以包括一种或多种取代的核苷酸间连接、改变的糖基、改变的碱基或其组合。这种修饰包括但不限于2′-位糖基修饰、5-位嘧啶修、8-位嘌呤修饰、环外胺的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、硫代磷酸酯或磷酸烷基酯修饰、甲基化和异常碱基配对组合如异碱基(isobase)异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)。修饰也可以包括3′和5′修饰如加帽。
在一种实施方式中，提供了其中P(O)O基团被P(O)S(″硫代物″)、P(S)S(″二硫代物″)、P(O)NR2(″胺代物″)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(″formacetal″)或3′-胺(--NH--CH2--CH2--)取代的寡核苷酸，其中每个R或R′独立为H或取代或未取代的烷基。连接基团可以通过--O--、--N--或--S--键连接至相邻的核苷酸。不是寡核苷酸中所有的键都需要相同。此处所用的术语硫代磷酸酯包括磷酸二酯键中一个或多个非桥连的氧原子被一个或多个硫原子所取代。
在进一步的实施方式中，寡核苷酸包括修饰的糖基，例如一个或多个羟基被卤素、脂族基团取代或被醚或胺官能化。在一种实施方式中，呋喃糖残基的2′-位被O-甲基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤素基团所取代。2′-修饰的糖基的合成方法例如在Sproat等，Nucl.Acid Res.19：733-738(1991)；Cotton等，Nucl.Acid Res.19：2629-2635(1991)；以及Hobbs等，Biochemistry 12：5138-5145(1973)中描述。其它修饰是本领域技术人员已知的。这种修饰可能是SELEXTM方法前修饰或SELEXTM方法后修饰(之前鉴定的未修饰的配体的修饰)或者可以通过引入SELEXTM方法中来进行。
SELEXTM方法前修饰或通过引入SELEXTM方法中进行的修饰产生了兼具对其SELEX.TM.靶标的特异性和改进的稳定性(例如体内稳定性)的核酸配体。对核酸配体进行的SELEXTM方法修饰可以导致改进的稳定性，例如在无不利影响核酸配体的结合能力的情况下的体内稳定性。
SELEXTM方法包括将筛选的寡核苷酸与如美国专利No.5,637,459和美国专利No.5,683,867中所述的其它筛选的寡核苷酸和非寡核苷酸功能单元结合。SELEXTM方法进一步包括将筛选的核酸配体与例如如美国专利No.6,011,020、美国专利No.6,051,698和PCT公开No.WO 98/18480中所述的诊断或治疗复合物中的亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物结合。这些专利和申请教导了将广泛系列的形状和其它特性与寡核苷酸的有效的扩增和复制特性以及其它分子的期望特性结合。
因此，在本发明的基质蛋白-1适配子的某些实施方式中，所述基质蛋白-1适配子通过化学修饰保护而免受核酸酶的水解。
在某些优选实施方式中，所述基质蛋白-1适配子的化学修饰是将2’-氟代基团引入包含在基质蛋白-1适配子中的核苷酸中。
在本发明的基质蛋白-1适配子的某些实施方式中，所述基质蛋白-1适配子可用作检测和/或定量目标样品中基质蛋白-1蛋白(或A型流感病毒)的手段。对于这些检测目的，被可检测的分子标记的基质蛋白-1适配子是很有用的，可容易地检测和/或定量(i)待检测样品中存在的基质蛋白-1蛋白分子和(ii)基质蛋白-1适配子分子之间形成的复合物。
诊断试剂仅需能够允许使用者在特定位置或浓度中鉴定给定靶标的存在。与靶标形成结合配对物的能力足以引发诊断目的的阳性信号。本领域技术人员能够以本领域已知的过程来调节任何基质蛋白-1适配子以引入标记物，从而追踪游离的未结合分子的形式或相反地作为结合至靶标基质蛋白-1蛋白的分子的所述基质蛋白-1适配子的存在。
本发明的基质蛋白-1适配子可以用可检测的分子标记，如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。
因此，本发明的基质蛋白-1适配子可以通过使用选自光谱学、光化学、荧光、生化、免疫化学或化学手段的方法引入可检测的标记而被标记。可用的可检测的分子包括放射性物质(32P、35S、3H、125I)、荧光染料(5-溴脱氧尿苷、荧光素、乙酰氨基芴、洋地黄毒苷)或生物素。
本发明的基质蛋白-1适配子可以在其3’-端或5’-端核苷酸处被标记，同时不显著改变它们对基质蛋白-1的结合特性。
本发明的另一个目的由用于检测和/或定量目标样品中基质蛋白-1的方法组成。
因此，本发明也涉及用于检测样品中基质蛋白-1蛋白的存在的方法，包括如下步骤：
a)提供待检测的样品；
b)将所述样品与一种或多种如本说明书中所述的基质蛋白-1适配子接触；
c)检测在基质蛋白-1蛋白与所述核酸之间最终形成的复合物。
本发明也涉及定量样品中基质蛋白-1蛋白的存在的方法，包括如下步骤：
a)提供待检测的样品；
b)将所述样品与一种或多种如本说明书中所述的基质蛋白-1适配子接触；
c)定量在基质蛋白-1蛋白与所述核酸之间最终形成的复合物。
本发明的另一个目的由用于检测和/或定量目标样品中A型流感病毒的方法组成。
因此，本发明也涉及用于检测样品中A型流感病毒的存在的方法，包括如下步骤：
a)提供待检测的样品；
b)将所述样品与一种或多种如本说明书中所述的基质蛋白-1适配子接触；
c)检测在基质蛋白-1蛋白与所述核酸之间最终形成的复合物，其中所述复合物的存在表明所述样品中A型流感病毒的存在。
本发明也涉及用于定量样品中A型流感病毒的存在的方法，包括如下步骤：
a)提供待检测的样品；
b)将所述样品与一种或多种如本说明书中所述的基质蛋白-1适配子接触；
c)定量在基质蛋白-1蛋白与所述核酸之间最终形成的复合物，其中所述复合物的存在表明所述样品中A型流感病毒的存在。
本发明的“目标样品”包括从受试者中获得且可用于诊断测试中的多种样品类型。此处的样品可以是任何类型的样品，如包含或疑似包含A型流感病毒的个体的样品或培养物样品，包括但不限于实验室培养物、鼻咽清洗物、咳出痰、呼吸道拭子、喉拭子、气管吸出物、支气管肺泡灌洗物、粘液和唾液。在一种实施方式中，本发明预期的样品可包括任何已知作为流感病毒载体的哺乳动物，包括但不限于人、鸟、马、狗、猫和猪。
用特异性针对所述靶标分子的适配子配体检测或定量靶标分子的方法是本领域熟知的，因此可以由本领域技术人员操作。
尤其，本领域技术人员可以进行此处的实施例中公开的任一种检测/定量方法，包括检测或定量(i)预先固定在微阵列上的基质蛋白-1适配子和(ii)基质蛋白-1之间形成的复合物。
通常，可以以多种方式用本发明的基质蛋白-1适配子进行本发明的检测和/或定量方法。
例如，一种进行这种测试的方法包括将基质蛋白-1适配子锚定在微阵列上以及在反应结束时检测锚定在微阵列上的基质蛋白-1/基质蛋白-1适配子复合物。因此，在一个具体实施方式中，将基质蛋白-1适配子锚定至微阵列，来自受试者的样品可以作为测试中未锚定的成分进行反应。
有许多用于将测试组分锚定至微阵列的已建立的方法。这些包括但不限于通过生物素和链霉亲和素的结合而固定的基质蛋白-1适配子分子。可以使用本领域已知的技术(例如，生物素化试剂盒，PierceChemicals，Rockford，Ill)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备这种生物素化测试组分，并固定于链霉亲和素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。在某些实施方式中，可以预先制备具有固定的测试组分的表面并储存。
用于这种测试的其它合适的载体或微阵列支持物包括能够结合基质蛋白-1适配子的任何材料。公知的支持物或载体包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。
本发明的另一个目的由包括固体载体并携带至少一种本发明核酸且用于实施本发明方法的微阵列组成。
为了用上面提到的方法进行测试，将未固定的组分加入其上锚定第二种组分的微阵列中。反应完成后，在任何形成的复合物仍固定在微阵列上的条件下去除(例如，通过洗涤)未复合的组分。可以在此处所述的许多方法中完成锚定至微阵列的基质蛋白-1/基质蛋白-1适配子复合物的检测。
在优选的实施方式中，当基质蛋白-1是未锚定的测试组分时，它可以用此处讨论且本领域技术人员熟知的可检测标记物或直接或间接标记，用于试验检测和读出目的。
也可以在不进一步操作或标记任一种组分(基质蛋白-1或基质蛋白-1适配子)的情况下直接检测基质蛋白-1/基质蛋白-1适配子复合物的形成，例如通过采用荧光能量转移技术(例如参见Lakowicz等，美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos等，美国专利No.4,868,103)。选择在第一“供体”分子上的荧光团标记而使一旦以合适波长的入射光激发后，其发出的荧光能量将被第二“受体”分子上的荧光标记所吸收，这进而能够因为吸收的能量而发荧光。另外，“供体”蛋白分子可简单地采用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记而使“受体”分子标记可以与“供体”分子标记不同。因为标记间能量转移的效率与分隔分子的距离相关，可以评估分子间的空间关系。在其中存在分子间结合的情况下，测试中“受体”分子标记的荧光发射应当最大化。通过本领域公知的标准荧光计量检测方法(例如，用荧光计)可以方便地测定FRET结合事件。
在另一个实施方式中，可以在不标记任一种测试组分(探针或标记物)的情况下通过采用技术如实时生物分子标记物相互作用分析(BIA)而完成测定探针识别标记物的能力(例如参见，Sjolander，S和Urbaniczky，C.，1991，Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)。此处所用的″BIA″或″表面等离子共振″是用于在不标记任何相互作用物(例如，BIAcore)的情况下研究实时生物特异性相互作用的技术。在结合表面的质量的变化(显示结合事件)导致表面附近光的折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，产生可被用作指示生物分子间实时相互作用的可检测的信号。
或者，在另一个实施方式中，可以用作为液相中溶质的基质蛋白-1和基质蛋白-1适配子进行类似的诊断测试。在这种测试中，通过许多标准技术中的任一种将复合的基质蛋白-1和基质蛋白-1适配子与未复合的组分分离，这些技术包括但不限于：差速离心、色谱、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，可能通过一系列离心步骤，由于基于它们不同的大小和密度的复合物的不同沉降平衡而将基质蛋白-1/基质蛋白-1适配子复合物与未复合的测试组分分离(例如参见Rivas，G.，和Minton，A.P.，1993，Trends Biochem Sci.18(8)：284-7)。也可采用标准的色谱技术将复合分子与未复合分子分离。例如，通过采用柱形式中的合适的凝胶过滤树脂，凝胶过滤色谱基于大小而分离分子，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合组分分离。类似地，可以研究标记物/探针复合物相比未复合组分的相对不同的电荷特性而将复合物与未复合组分区分，例如通过采用离子交换色谱树脂。这种树脂和色谱技术是本领域技术人员熟知的(例如参见，Heegaard，N.H.，1998，J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6)：141-8；Hage，D.S.，和Tweed，S.A.J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct.10；699(1-2)：499-525)。也可采用凝胶电泳而将复合的测试组分与未结合的组分分离(例如参见，Ausubel等，ed.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1987-1999)。在这种技术中，基于例如大小或电荷来分离蛋白/核酸复合物。为了在电泳过程期间维持结合的相互作用，典型地优选非变性凝胶基质材料和无还原剂的条件。也可以在与活性表面偶联或不偶联的基质或微珠，或抗体包被的表面或微珠上采用SELDI-TOF技术。
在上面的检测或定量方法的另一个优选实施方式中，这些方法包括使用光学生物传感器如Edwards和Leatherbarrow所述的(Edwards和Leatherbarrow，1997，Analytical Biochemistry，246：1-6)或Szabo等所述的(Szabo等，1995，Curr.Opinion Struct.Biol.，5(5)：699-705)。该技术允许分子间相互作用的实时检测，而不需要标记的分子。该技术基于表面等离子共振(SPR)现象。简言之，将基质蛋白-1适配子分子结合至表面(如羧甲基葡聚糖基质)。然后，用之前固定的基质蛋白-1适配子培养待检测的样品。然后，在检测的样品中检测最终存在的基质蛋白-1适配子和基质蛋白-1蛋白分子间的结合(包括结合水平)或不结合。为此目的，光束导向不包含待检测样品的基质的表面区域侧并被所述表面反射。SPR现象导致具有角度和波长的特定组合的反射光密度的降低。基质蛋白-1适配子和基质蛋白-1分子的结合导致基质表面的折射指数的改变，该改变被检测作为SPR信号的改变。该技术在此处的实施例中充分说明。
样品中基质蛋白-1分子的检测或定量的其它实施方式包括使用固定在溶胶-凝胶基质中的基质蛋白-1适配子(如美国专利申请No.US 2006/0068407中所述)或使用基质蛋白-1适配子-纳米颗粒结合物(如美国专利申请No.US 2006/0014172中所述)。
本发明进一步涉及用于检测或用于实施本发明方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种本发明的基质蛋白-1适配子，以及任选的对于实施此处所述的检测或定量方法所需的一种或多种的试剂。
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：RNA合并进化(pool evolution)的评价。以氨基固定基质蛋白-1之后在CM5生物芯片上进行SPR分析。将2μM的来自筛选的新鲜的RNA合并物以10μl/min的流速在10分钟内注入流动室。
图2：RNA合并物的靶蛋白的特异性研究。对通过氨基固定在CM5上的蛋白进行SPR分析。以10μl/min的流速注射新鲜的RNA合并物(2μM)(A和B)。用RNA文库(空白)和第9轮RNA合并物(C)实现基质蛋白-1与核蛋白的特异性比较。
图3：预测的短适配子的二级结构：用mfold v3.2软件(Zuker，2003)进行结构的预测。http: //frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-forml.cgi。
图4：短适配子的结合能力的评价。68个碱基长度和36个碱基长度的适配子的比较性评价。靶蛋白通过氨基固定在CM5生物芯片上。以20μl/min的流速(22℃)注入100μl 2μM适配子进行SPR分析。
图5：短适配子的靶蛋白的特异性研究。对通过氨基固定的蛋白进行SPR分析。注入2μM的适配子(22℃，20μl/min)。
图6：适配子固定在阵列上的质量控制。用特异性cy-3标记的探针(10nM)在550nm、360PMT下进行质量控制。寡核苷酸以三次重复点排列在E载玻片上并用5’-氨基固定。1.点样缓冲液；2.寡聚C1；3.寡聚C6；4.tRNA；5.M1R9C1 DNA；6.抗-VEGF；7.抗-PDGF；8.M1R9C1无凸出。
图7：用适配子微阵列检测基质蛋白-1。在550PMT检测cy-5标记的基质蛋白-1。样品在来自储存液(100μg/ml)的杂交缓冲液中稀释50x(右)或250x(左)并滴在低密度微阵列(顶部)和高密度微阵列(底部)上。
图8：检测复杂介质中的基质蛋白-1。用cy-3标记的基质蛋白-1和cy-5标记的Vero细胞的总蛋白进行检测。基质蛋白-1(100μg/ml)以1∶1的比例混合在Vero细胞的总蛋白中并在杂交缓冲液中稀释50x。获得低密度微阵列(左)和高密度微阵列(右)在750PMT下的荧光图像。载玻片在550nm和655nm连续扫描。
具体实施方式
实施例1：适配子的表征
材料与方法：
靶标的产生和纯化
用pET 14b-M1表达载体产生流感A病毒的基质蛋白-1，而用pET 28a-NP和pET 16b-NS2分别产生核蛋白和非结构蛋白-2。转化大肠杆菌(E.Coli)(BL21/DE3)pLys细胞并在琼脂糖平板上用氯霉素(17μg/ml)和氨苄青霉素(25μg/ml)筛选。用卡那霉素(50μg/ml)进行大肠杆菌(BL21/DE3)pLys pET 28a-NP的筛选。在含有氯霉素(17μg/ml)和氨苄青霉素(25μg/ml)或卡那霉素(50μg/ml)的LB肉汤培养基中产生生物量(37℃；200rpm)并接种至更大体积的新鲜培养基中(4x500ml)。在0.6O.D，通过加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶(0.8mM)诱导蛋白表达。产生M1、NP和NS2的条件分别为在22℃、30℃和37℃下16小时。离心(10.000g；10min；4℃)后，沉淀物重悬于添加有4片抗蛋白酶鸡尾酒完全EDTA-freeTM(Roche)的50ml冰冷的缓冲液(HEPES 50mM pH 7.5；10μg/ml溶菌酶，购自Sigma)中。细胞在高压(28psi)下溶解。通过核酸酶处理(10分钟，5U/ml；Merck)使制备物澄清并离心(10.000g；10min；4℃)。上清保持在4℃并用NaCl(0.3M)和咪唑(10mM)平衡。
根据厂商(Sigma)说明在Co2+螯合树脂上进行纯化。树脂在由HEPES(50mM)pH 7.5、NaCl(0.3M)和咪唑(10mM)组成的缓冲液中平衡。用咪唑(200mM)进行蛋白的洗脱。用10％SDS-PAGE和Western印迹评价纯度。蛋白用磷酸盐缓冲液(Na2PO4 10mM pH 7.5；NaCl 137mM；KCl 2.7mM)透析并用BradFord方法定量。
文库
如以前所述(Dausse，E.等[2005]，Methods Mol Biol 288：391-410)设计文库。文库包含由侧翼为已知的5’和3’臂的随机序列(N30)组成的中心结构域。ssDNA5’-GTGTGACCGACCGTGGTGC-N30-GCAGTGAAGGCTGGTAACC-3’(SEQ ID NO：30)用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems；#4311820)以及每条2μM的引物(P20：5’-GTGTGACCGACCGTGGTGC-3’(SEQ ID NO：31)；3’SL：5’-TAATACGACTCACTATAGGTTACCAGCC TTCACTGC-3’(SEQID NO：32)扩增。dsDNA用苯酚/氯仿-异戊醇纯化并在存在醋酸钠(3M pH 5.3)的情况下沉淀。用Ampliscribe T7高产量转录试剂盒(TEBU；#AS3107)在37℃转录2小时后获得RNA文库。加入2μl无DNase的RNase处理15分钟。通过在变性的20％聚丙烯酰胺、7M尿素凝胶上电泳(15瓦特/凝胶)纯化RNA候选物。
基质蛋白-1结合适配子的体外筛选
在微管中的SELEX缓冲液(Na2PO410mM pH 7.5；NaCl 137mM；KCl 2.7mM；(CH3COO)2Mg 1mM)中在22℃下进行筛选45分钟。以50∶1的RNA/蛋白摩尔比用1000pmol的原始文库进行第一轮筛选。在筛选期间，靶标的浓度下降并在第4轮至第9轮维持25∶1的摩尔比。在筛选前，RNA文库在65℃加热3分钟，然后冰冷1分钟，最后保持在室温5分钟。每轮筛选后，首先通过用1平方mm的硝酸纤维素膜片培养然后通过在存在13pmol的His标记SNEV(衰老逃避因子，SeNescence EVasion factor)蛋白的条件下培养而分离非特异的RNA。在室温培养45分钟后，通过过滤经过碱处理的硝酸纤维素膜(Millipore；#HAWP02500)而回收基质蛋白-1-RNA复合物并以1ml SELEX缓冲液洗涤两次。在用7M尿素和Tris缓冲的苯酚-氯仿pH 7.9变性后回收RNA。回收的RNA在20μl包含引物P20(2μM)的反应混合物中用240单位的M-MLV逆转录酶RNase H-点突变试剂盒(Promega；#M368A)在50℃逆转录50分钟。产生的cDNA通过PCR扩增、转录并用于下一轮筛选。
克隆和测序
在针对基质蛋白-1的9轮筛选后，筛选的序列用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen；#K460001)克隆并根据厂商说明书用BigDye终止剂v1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems；#4336697)测序。分析序列并用mfold v3.2软件(Zuker，M.(2003)Nucleic Acids Res 31(13)：3406-15)预测二级结构。
用表面等离子共振(SPR)分析
用Biacore 3000仪器以及CM5生物芯片在22℃进行SPR评价。将生物芯片用HBS pH 7.4平衡并用35μl NHS(50mM)/EDC(200mM)1∶1混合物活化。对于固定，将蛋白在CH3COONa(10mM)pH 5中1∶1混合并以5μl/min的流速注射。将生物芯片用35μl乙醇胺(1M)pH 8.5饱和。为了比较来自不同筛选循环的RNA合并物的结合能力，制备新鲜转录产物。将RNA以2μM在SELEX缓冲液中混合并折叠(65℃5min；4℃1分钟；室温5分钟)。以10μl/min的流速在22℃进行评价。在注射结束时，以三次脉冲的5μl NaOH(3mM)再生靶蛋白。然后用SELEX缓冲液清洗整合的流体盒、针以及靶标。
以在SELEX缓冲液中2μM的浓度以20μl/min的流速确定筛选的适配子的序列的修饰的影响。同样，用SELEX缓冲液中一定浓度范围(0.2-10μM)以20μl/min的流速进行适配子亲和力常数的分析。传感图(sensorgrams)调整至动态滴定1∶1相互作用模型并用BIAeval软件2.2.4分析。
结果：
筛选的适配子的表征
在9轮筛选后，用SPR分析RNA群体的进化。将每轮筛选的RNA注入靶蛋白包被的CM5生物芯片上。一轮接一轮，观察到筛选的RNA和基质蛋白-1(SEQ ID NO：1)之间结合能力的逐渐增加(图1)。伴随地，RNA群体显示出对链霉亲和素和对两种无关病毒蛋白-非结构蛋白(SEQ ID NO：2)和核蛋白(SEQ ID NO：3)-的低且稳定的亲和力(图2)。
逆转录后，克隆第9轮筛选的适配子。序列分析显示，RNA群体主要由适配子M1R9C1(87.5％)(SEQ ID NO：4)组成。剩余的群体由三种不同的适配子组成，它们在随机序列(黄色)中有一些差异(SEQ ID NO：5、6和7)。
SPR的单个研究显示四种筛选的适配子之间结合能力的轻微差异。用浓度从0.1增加到10μM的M1R9C1和M1R9C6测定最有效的适配子的动力学成分(表2；68个碱基长度)。传感图调整至动态滴定1∶1相互作用模型。M1R9C1适配子和基质蛋白-1的结合常数(ka)和解离常数(kb)分别估测为约8x103(M-1s-1)和2x10-3(s-1)。M1R9C1-M1复合物的平衡解离常数(KD)为约4x10-7M。
M1R9C6适配子获得了相同类型的结果，其结合常数(ka)和解离常数(kb)分别为约4x103(M-1s-1)和1x10-3(s-1)。M1R9C1-M1复合物的平衡解离常数(KD)为约3x10-7M。
缩短形式的适配子的表征
通过去除5′和3′端的16个碱基而产生M1R9C1和M1R9C6的缩短形式(SEQ ID NO：8和9)。这些碱基对应于用于RT-PCR的不变结构域部分。所有新的缩短的适配子显示预测的二级结构(图3M1R9C136个碱基长度和M1R9C6 36个碱基长度)。将适配子组织为主要的发夹结构，其中侧面与小的发夹结构相连。即使主要发夹结构的长度有两个碱基的差别，它们的特征为一个凸出部分和一个内环。
缩短形式的适配子的单个研究显示M1R9C1 36个碱基长度和M1R9C636个碱基长度保持了与基质蛋白-1的结合能力(图4)。相反地，M1R9C6 36个碱基长度中凸出部分和内环的消除导致结合能力的几乎完全丧失。用浓度从0.2μM增加至8μM的M1R9C1 36个碱基长度和M1R9C636个碱基长度进行结合动力学研究(表2；36个碱基长度)。研究显示了平衡解离常数(KD)的加倍。M1R9C1 36个碱基长度适配子结合基质蛋白-1的结合常数(ka)和解离常数(kb)分别为约7x103(M-1s-1)和1x10-3(s-1)。M1R9C1-M1复合物的平衡解离常数(KD)为约2x10-7M。同样，M1R9C6 36个碱基长度适配子结合基质蛋白-1的结合常数(ka)和解离常数(kb)分别为约7x103(M-1s-1)和9x10-4(s-1)。M1R9C1-M1复合物的平衡解离常数(KD)为约2x10-7M。
测试了缩短形式的适配子与核蛋白(NP)的特异性。这种病毒蛋白天然表现出对核糖核苷酸的高亲和力。然而，M1R9C1 36个碱基长度和M1R9C636个碱基长度不与NP复合(图5)。
适配子的化学修饰
为了赋予对核酸酶的抗性，我们将修饰的核苷酸如2′-氟代嘧啶引入DNA。2′-氟代嘧啶的引入诱导了结合能力的显著改变，可能是由于未能保持二级结构。相反，用脱氧核苷酸替代一些核糖核苷酸似乎改进了适配子的性能。修饰位于分子的侧环。在M1R9C1ARN/DNA中六个碱基被替代，AGAAUC替代AGAATC(SEQ IDNO：10)。在M1R9C6ARN/DNA中，仅四个碱基被替代，UGAG替代TGAG(SEQ ID NO：11)。对DNA修饰的M1R9C1 36个碱基长度(M1R9C1 RNA/DNA)进行动力学研究。这种新形式的适配子以相比于7x103(M-1s-1)更高的结合常数(ka)1x104(M-1s-1)结合基质蛋白-1。平衡解离常数(KD)稍微改进，1x10-7M(表2)。
实施例2：用于检测流感病毒的适配子微阵列
材料与方法
捕获寡核苷酸
寡核苷酸以40nmol的合成规模提供(表1)。在生产期间，在5’端引入接头。接头由12个碳和5’侧用于固定在载玻片上的一个氨基组成。
适配子检测探针
合成下列探针并在5’侧偶联至cy-3染料：Cy-3-TGCCGGCCAA(探针C1)(SEQ ID NO：33)和Cy-3-TGCCCGGCCA(探针C6)(SEQ IDNO：34)。探针C1和C6分别对于C1适配子(即M1R9C1适配子)和C6适配子(即M1R9C6适配子的)的3′端最后10个碱基是特异性的。
蛋白与荧光探针的偶联
基质蛋白-1(100μg/ml)与Vero细胞的总蛋白(1mg/ml)用cy-5和cy-3琥珀酰亚胺酯(Amersham Pharmacia，#PA15101and#PA13101)标记。简单来说，蛋白溶液(23μl)与2μl染料(DMSO中50μg)和25μl标记缓冲液(Na2CO3，200mM，pH 8.3)混合。蛋白在室温下暗处培养30分钟。标记的蛋白通过在Micro Bio-spin 6色谱柱(BioRad，#732-6221)上离心(4分钟，400rpm)而纯化。通过UV分光光度计在550nm和655nm估计浓度和染料整合。标记的蛋白在暗处-20℃下储存。
适配子微阵列
在Nexterion Slide E(Schott，由Isogen life science销售，#1064016)上开发适配子微阵列。简单来说，捕获的寡核苷酸以20μM和100μM浓度稀释在Eurogentec(EGT)点样缓冲液中。根据厂商建议，在受控的大气(40％湿度)和温度(22℃)下将寡核苷酸溶液排列在载玻片表面。载玻片在相同条件中培养过夜并直接干燥储存在4℃。
质量控制
用对适配子的最后10个碱基特异性的10个碱基长度的探针DNA寡核苷酸进行质量控制。在合成期间用cy-3染料与探针化学偶联。Cy-3探针(4μl)新鲜溶解在EGT-杂交缓冲液(12.5μl)和DEPC水(7.5μl)中。在杂交前，载玻片根据厂商说明书在室温平衡并条件化。然后，探针滴在阵列的区域上并用玻璃盖玻片再次覆盖。在暗处4℃下3分钟后，载玻片用SSC(2X)SDS(0.1％)、SSC(2X)和SSC(0.2X)连续洗涤30秒。载玻片通过离心干燥(1000rpm，4分钟)并用GenePix4100A(Molecular Devices)在360PMT扫描。用GenePix pro v 5.1软件进行定量。
基质蛋白-1检测
在室温平衡后，载玻片根据厂商说明书用Nexterion缓冲液洗涤并封闭。适配子在SELEX缓冲液(mM Na2HPO4 pH 7.5，140mMNaCl，2.5mM KCl，1mM Mg(CH3COO)2)中折叠，条件为65℃5分钟、4℃1分钟以及室温(22℃)5分钟。载玻片表面在BSA(3％)、SELEX缓冲液中包被60分钟并在PBS、NaCl(0.5M)、TWEEN 20(0.2％)中洗涤三次(5分钟)。离心(1000rpm，4分钟)后，将标记的蛋白滴在阵列的区域上并用盖玻片(Invitrogen，#H24723)再次覆盖。杂交期间(15分钟、37℃；暗处)，将载玻片放在杂交室(Corning，#2551)中以维持湿度。在杂交结束时，载玻片首先在PBS、0.5M NaCl和0.2％TWEEN 20中洗涤(三次，5分钟)；然后在PBS、0.1％TWEEN20中洗涤；接着在PBS中洗涤，最后在超纯水中洗涤。扫描前，通过离心(1000rpm，4分钟)干燥载玻片。
蛋白在由PBS pH 7.5；NaCl(0.5M)；TWEEN 20(0.2％)；BSA(3％)；MgCl2(3mM)；CaCl2(0.2mM)组成的杂交缓冲液中稀释50倍或250倍，并以终浓度分别为0.5μM或0.125μM以tRNA溶液培养15分钟。使用前，用40U RNase抑制剂在室温下处理Vero细胞的标记的总蛋白15分钟(Applied Biosystems，Ambion；SUPERase-In#AM2694)。
结果：
适配子微阵列的质量控制
用5’-氨基将适配子和对照分子固定在E载玻片上。在使用微阵列检测基质蛋白-1前，载玻片经历数步处理如适配子的封闭和折叠。这些可能破坏适配子或它们与表面的结合。质量控制步骤由与适配子的最后10个3′端碱基互补并对适配子C1或适配子C6特异的cy-3探针杂交组成。图6分别显示了探针C1(左)和C6(右)的典型结果。在探针C1的情况下，对于位置2和3的阳性对照和不同形式的36个碱基长度的适配子观察到了明显的荧光信号。同样，对应于26个碱基长度的适配子的阴性对照没有看到信号。在区域5观察到的阳性信号是由于M1R9C1DNA和适配子C1之间的高度同一性。
探针C6观察到相似的结果。然而，探针C6的特异性似乎比探针C1更高，因为源自C6的分子的荧光信号比源自C1的分子更高。注意到在区域1和4中没有观察到非特异信号。通过荧光信号的定量验证了这些观察(表3)。在探针C1的情况下，源自适配子C1的分子获得了最高值。对于寡聚C1观察到最高的检测值(13.148)，对于M1R9C1DNA、M1R9C1RNA/DNA和M1R9C1分别获得了逐渐变弱的信号。第二步，源自适配子C6的分子分为寡聚C6的最高信号和M1R9C6的最低信号。阴性对照显示了接近检测极限的非常低的信号。注意到寡聚C6相比于M1R9C1获得的更高值可能是由于这些分子间性质的差异。相比于核糖核苷酸严格组成的M1R9C1，寡聚C6的脱氧核糖核苷酸性质更有利于与DNA探针杂交。在使用C6探针的情况下，观察到相似的结果。然而，C6探针显示更佳的特异性，因此允许区分源自C1或C6的分子。对于M1R9C6RNA/DNA、M1R9C6和寡聚C6获得了最高值。它们所有都高于10.000，而源自适配子C1的分子显示出约1.000的荧光信号，除了M1R9C1 DNA。阴性对照显示了接近检测极限的荧光信号。
适配子微阵列检测基质蛋白-1的功能性
验证用于检测流感病毒的适配子微阵列的第一步由研究其检测纯化靶标的能力组成。为此，cy-5标记的基质蛋白-1的储存溶液在杂交缓冲液中稀释50倍和250倍。在非特异性位点饱和并折叠适配子后，将样品滴在阵列区域上，在暗处37℃下放置15分钟。洗涤后，载玻片用GenePix 4100A仪器在650PMT扫描。使用两种类型的载玻片，一种用20μM的寡核苷酸溶液(低密度微阵列)排列，另一种用100μM的寡核苷酸溶液(高密度微阵列)排列。对于所有的测试，我们观察到相同的检测模式(图7)。仅36个碱基长度的适配子能够与cy-5靶标形成复合物，并且没有观察到任何背景或非特异性结合。较低量的靶蛋白可以通过该系统检测，因为250-倍稀释(10ng)观察到了阳性信号。然而，四种适配子没有显示出相同的识别基质蛋白-1的能力。事实上，在适配子M1R9C6RNA/DNA和M1R9C6的区域中的斑点比以源自C1的适配子排列的区域中的斑点更明显。用GenePix v 5.1软件对荧光信号的定量验证了这些结果。在我们使用不同稀释度和低密度或高密度微阵列的测试中，M1R9C6和M1R9C6RNA/DNA适配子对于检测基质蛋白-1最有效(表4)。随后的降序为：M1R9C1 RNA/DNA和M1R9C1。阴性对照显示了在检测极限以下的非常低的信号水平。使用高密度微阵列至少增加了两倍信号，对M1R9C6适配子从7.368增加至17.165，然而阴性对照的信号没有增加，停留在检测极限。注意到在信号水平和靶蛋白的量之间的直接关系。事实上，样品的5倍稀释导致信号水平以相同的系数降低。
总之，我们的适配子微阵列允许清楚地检测基质蛋白-1，即使在很低的量(0.33x10-12摩尔)。
检测复杂介质中的基质蛋白-1
为此，基质蛋白-1和Vero细胞的总蛋白混合。在冻融提取后，总蛋白用cy-5染料标记。注意在相同条件下用cy-3染料标记基质蛋白-1。在混合前，Vero细胞的总蛋白提取物用RNase抑制剂处理10分钟。然后将两种蛋白制备物混合(比例1∶1)并在杂交缓冲液中稀释。在暗处在37℃下进行杂交15分钟。为了检测cy-5标记的细胞蛋白的非特异性结合，在750PMT增加检测水平。在这些条件下，获得图8所示的检测图。首先，在基质蛋白-1和适配子之间形成特异性复合物。如之前所述，M1R9C6和M1R9C6RNA/DNA适配子似乎比M1R9C1和M1R9C1 RNA/DNA更有效。在载玻片上观察到非常弱的非特异性信号。其次，在适配子和cy-5细胞蛋白之间没有观察到复合物。这些观察结果与SPR所示的我们的适配子的高度特异性一致。大部分的Cy-5信号位于阵列区域之外。
定量结果验证了M1R9C6RNA/DNA和M1R9C6检测复杂介质中基质蛋白-1的很强的能力(表5)。对于低密度微阵列上的M1R9C6RNA/DNA，信号达到3780，而使用高密度微阵列可以增加到达5222。相反，源自C1的适配子的荧光信号维持在中等，且使用高密度微阵列也没有增加。阴性对照的荧光信号明显低于由适配子获得的信号。如果我们仅仅考虑最有效的适配子，阴性对照的信号没有超过阳性信号(M1R9C6RNA/DNA，表5A)的15.2％。我们的微阵列显示对于流感病毒的基质蛋白-1的高度特异性，因为cy-5总蛋白的荧光信号低于检测极限。
表1.固定在微阵列上的分子序列
Figure BPA00001573241200251
寡核苷酸以40nmol规模合成。在合成期间，在5’端引入12个碳的接头。将所述接头化学修饰以形成氨基。下划线序列为在DNA中。
表2：适配子的动力学构成
Figure BPA00001573241200261
通过连续注射从0.1μM到10μM逐渐增加的浓度的适配子(22℃，20μl/min)而进行结合动力学研究。
表3.质量控制的定量
Figure BPA00001573241200262
Figure BPA00001573241200271
4℃下将探针在适配子微阵列上应用30分钟。在GenePix 4100A设备上采用GenePix pro v 5.1软件在360PMT下进行荧光水平的定量。减去背景后获得三个点的平均值即为测定值。
表4：基质蛋白-1检测水平的定量
Figure BPA00001573241200272
Figure BPA00001573241200281
Figure BPA00001573241200291
将靶蛋白以50x(A)或250x(B)在杂交缓冲液中稀释并在37℃下在低密度微阵列和高密度微阵列上应用15分钟。在GenePix 4100A设备上采用GenePix pro v 5.1软件在650PMT进行荧光水平的定量。减去背景后获得三个点的平均值即为测定值。
表5.复杂介质中基质蛋白-1检测的定量
Figure BPA00001573241200292
Figure BPA00001573241200301
cy-3靶蛋白与Vero细胞的cy-5总蛋白以1∶1比例混合。混合物以50x在杂交缓冲液中稀释并在37℃下在低密度微阵列(A)和高密度微阵列(B)上应用15分钟。将载玻片在GenePix 4100A仪器上在750PMT下在550nm和655nm连续扫描。用GenePix pro v 5.1软件分析数据。减去背景后获得三个点的平均值即为测定值。
参考文献：
贯穿本申请，各种参考文献描述了本发明所属的技术领域的状态。这些参考文献的公开内容在此处通过引用方式合并入本公开内容。
Figure IPA00001573240700021
Figure IPA00001573240700031
Figure IPA00001573240700041
Figure IPA00001573240700051
Figure IPA00001573240700071
Figure IPA00001573240700081
Figure IPA00001573240700091

Claims (15)

1.特异性结合A型流感病毒的基质蛋白-1的核酸，其特征在于所述核酸包含如下核苷酸序列：
5’-N1-NS1-U-N3-A-NS3-NS5-NS7-NS6-CGCAU-NS4-C-N4-NS2-N2-3’
其中：
-N1由一个核苷酸组成；
-NS1和NS2由长度为3或4个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS1和NS2具有互补的序列；
-N3和N4由一个核苷酸组成，并且N4与N3互补；
-NS3和NS4由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS3和NS4具有互补的序列；
-NS5和NS6由长度为3个核苷酸的多核苷酸组成，并且NS5和NS6具有互补的序列；
-NS7由选自AGAAUC(SEQ ID NO：12)、UGAG(SEQ ID NO：13)、UAUUCC(SEQ ID NO：14)、AGAU(SEQ ID NO：15)、AGAATC(SEQ ID NO：16)或TGAG(SEQ ID NO：17)的多核苷酸组成，以及
-N2由与核苷酸N1互补或不互补的核苷酸组成。
2.权利要求1的核酸，其中N1是U，N2是A。
3.权利要求1的核酸，其中NS1是GCC(SEQ ID NO：18)，NS2是GGC(SEQ ID NO：19)。
4.权利要求1的核酸，其中NS1是GCCC(SEQ ID NO：20)，NS2是GGGC(SEQ ID NO：21)。
5.权利要求1的核酸，N3是G，N4是C。
6.权利要求1的核酸，其中NS3是CCA(SEQ ID NO：22)，NS4是UGG(SEQ ID NO：23)。
7.权利要求1的核酸，其中NS5是CUC(SEQ ID NO：24)，NS6是GAG(SEQ ID NO：25)。
8.权利要求1的核酸，其中NS5是UCC(SEQ ID NO：26)，NS6是GGA(SEQ ID NO：27)。
9.权利要求1的核酸，其中NS5是CCU(SEQ ID NO：28)，NS6是AGG(SEQ ID NO：29)。
10.权利要求1的核酸，其包含或由选自SEQ ID NO：4(M1R9C1)、SEQ ID NO：5(M1R9C6)、SEQ ID NO：8(M1R9C136个碱基长度)、SEQ ID NO：9(M1R9C636个碱基长度)、SEQ ID NO：10(M1R9C1RNA/DNA 36个碱基长度)和SEQ ID NO：11(M1R9C6RNA/DNA 36个碱基长度)的核酸序列组成。
11.权利要求1-10中任一项的核酸用于检测或定量目标样品中基质蛋白-1的用途。
12.权利要求1-10中任一项的核酸用于检测和/或定量目标样品中A型流感病毒的用途。
13.权利要求11或12的用途，其中所述目标样品选自实验室培养物、鼻咽清洗物、咳出痰、呼吸道拭子、喉拭子、气管吸出物、支气管肺泡灌洗物、粘液和唾液。
14.微阵列，包含固体载体并携带至少一种如权利要求1-10中任一项所述的核酸。
15.试剂盒，包含至少一种如权利要求1-10中任一项所述的核酸。
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