CN102870598A

CN102870598A - 一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法

Info

Publication number: CN102870598A
Application number: CN2012103711326A
Authority: CN
Inventors: 蔡永萍; 王金宁; 李国庆; 聂凡; 陈静娴
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明公开了一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法。不同的糙皮侧耳菌株从保藏状态下取出，经活化培养后接种到经过改良的PDA-Bavendamm平板培养基和经过改良的PDA-RB平板培养基上进行初步筛选出变色反应强且反应时间快的菌株，然后其接种到棉花秸秆固体培养基上再进行筛选。依据木质素降解率和选择性指数的大小，复筛出高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株。本发明建立了一套科学的筛选方法体系，初筛操作简便，通过向普通变色培养基中添加适量的棉秸秆粉末，使筛选更具针对性，保证了筛选结果的准确性；棉秸秆固体培养基碳源单一，使得降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株对碳源的选择具有唯一性，保证复筛结果的精确性。

Description

一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法

技术领域

本发明涉及食用菌降解利用秸秆资源和食用菌栽培技术领域，具体涉及高效降解秸秆木质素的食用菌菌株的筛选方法。

背景技术

农作物秸秆含有大量的有机质，氮磷钾和微量元素，是一项重要的生物资源。我国年生产秸秆近6亿吨，但由于其难以被降解利用，1/3的秸秆被露天焚烧。这不仅是对资源的巨大浪费，也造成了严重的环境污染和一系列社会问题。秸秆难以降解的主要原因是细胞壁中木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，这形成了一道天然屏障，限制了消化酶对细胞壁及细胞内容物的分解功能。棉秸秆中的木质素的含量高达25%以上，极大地限制了棉秸秆的降解利用，也是棉秸秆同其他农作物秸秆相比更难以利用的主要原因。因此消除秸秆中的木质素天然屏障，可促进秸秆资源的有效利用。其中筛选高效的白腐菌降解木质素是重要努力方向之一。筛选高效降解秸秆木质素的白腐菌菌株的方法有多种，但普遍存在操作复杂、准确性差、成本昂贵等缺点，不宜用作大范围菌株的筛选。因此以棉秸秆为培养料，建立一套操作简单、成本低、准确性好的筛选方法体系，筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株，对秸秆资源的开发利用具有重要意义。既可为秸秆生物降解提供一条有效途径，同时又可获得经济效益，减少环境污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株的方法，解决秸秆资源因木质素的存在而难以开发利用的问题。

实现发明目的技术方案如下：

1、整个筛选体系分为初筛和复筛两步，包括以下具体步骤：

（1）将活化培养后的不同糙皮侧耳菌株接种到经过改良的PDA-Bavendamm平板培养基和经过改良的PDA-RB平板培养基上，在25℃±1℃条件下培养7d进行初步筛选，每日观察变色圈的形成情况并记录显色时间及显色圈直径；

（2）将步骤（1）中筛选出的在两种培养基上变色反应强且反应时间快的菌株接种到棉花秸秆固体培养基上，在25℃±1℃条件下培养30d；

（3）将步骤（2）获得的培养后的基质，采用Van Soest法测定木质素降解率并计算选择性指数，以此为依据筛选出高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株。

所述的经过改良的PDA-Bavendamm平板培养基为：在PDA培养基中加入单独灭菌的鞣酸至终浓度为0.01g/100ml，再按W/V为0.1%加入过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉。

所述的经过改良的PDA-RB平板培养基为：在PDA培养基中加入单独灭菌的RB亮蓝至终浓度为625ug/mL，再加入过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，棉秸秆干粉的加入量为每100mlPDA培养基加入0.1g；

所述的棉花秸秆固体培养基为：5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，20mL合成培养液，合成培养液改为低氮无糖高无机盐培养液，配方如下（数值为体积比）：

酒石酸铵液:大量元素液:微量元素液:VB1液:水=15:15:3:16。其中，酒石酸铵(22.0g/L)为氮源,大量元素液每升含20gKH₂PO₄、13.8gMgSO₄·7H₂O、1.0gCaCl₂和0.6gNaCl，微量元素液每升含0.35gMnSO₄·H₂O、60mgFeSO₄·7H2O、110mgCoCl₂·6H₂O、60mgZnSO₄·7H₂O、95mgCuSO₄·5H₂O、6mgAlK(SO₄)₂·12H₂O、6mgH₃BO₃和6mgNa₂MoO₄·2H₂O，VB₁的质量分数为100mg/L。

马铃薯提取液按如下方法制备：马铃薯刮去粗皮，去芽眼，准确称取200g，切成碎块放锅中，加水1000ml加热煮沸，期间不断搅拌；待水沸后再煮20～25min，用双层纱布过滤，所得滤液即马铃薯提取液。

本发明与已有技术相比，其有益效果体现在：

（1）本发明建立了一整套筛选体系，分为初筛和复筛两个步骤。初步筛选操作简单，方便快速且成本低廉，在大规模筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株时，可以节省时间，节约成本并减少相当一部分工作量：复筛定量精确，精确性好，本发明将两种筛选方法科学组合，既操作简单，节约成本，又准确可靠，建立了一套更为科学的筛选体系。

（2）本发明初筛过程中，通过向普通变色培养基中添加适量的棉秸秆粉末，使筛选更具针对性，保证了筛选结果的准确性。

（3）复筛过程中，棉秸秆固体培养基中需另加入低氮无糖高无机盐营养液，因而碳源只能是单一的来自棉秸秆中木质纤维素的降解，保证了复筛结果的精确性。

附图说明

图1是实施例复筛实验中各菌株木质素降解率比较。

图2是复筛实验中各菌株选择性指数比较。

以下通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步说明。

具体实施方式

实施例：

1.1实验材料

1.1.1实验菌种

实验采用的平菇菌株共12株，其中皖平1号、P928、P3为安徽省农业科学院园艺所提供；农平1号、P17、天达300为安徽农业大学林学与园林学院提供；苏平1号、苏平3号、新平400是江苏省农科院蔬菜研究所提供；北-1、早、黑平A由华中农业大学应用真菌研究所提供。

1.1.2培养基

PDA综合培养基：马铃薯提取液1000ml、葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄·H₂O1.5g、维生素B1微量、琼脂15.0g。

PDA-Bavendamm培养基：在PDA培养基中加入单独灭菌的鞣酸至终浓度为0.01g/100ml，再加入过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，棉秸秆干粉的加入量为每100mlPDA培养基加入0.1g。

PDA-RB亮蓝培养基：在PDA培养基中加入单独灭菌的RB亮蓝（即雷玛唑亮蓝，英文名为：Remazol Brilliant Blue R，化学式为C₂₂H₁₆N₂O₁₁S₃）至终浓度为625ug/mL，再加入过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，棉秸秆干粉的加入量为每100mlPDA培养基加入0.1g。

秸秆固体培养基:称取5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉于250mL锥形瓶中，加入22mL合成培养液，塞好8层纱布，另用二层报纸覆盖并用细线捆扎好。121-125℃高温蒸汽灭菌30min。合成培养液改为低氮无糖高无机盐培养液，配方如下（数值为体积比）：

合成培养液：酒石酸铵液：大量元素液：微量元素液：VB1液：水=1：15：15：3：16。其中，酒石酸铵(22.0g/L)为氮源，大量元素液每升含20gKH2PO4、13.8gMgSO4·7H2O、1.0gCaCl2和0.6gNaCl，微量元素液每升含0.35gMnSO4·H2O、60mgFeSO4·7H2O、110mgCoCl2·6H2O、60mgZnSO4·7H2O、95mgCuSO4·5H2O、6mgAlK(SO4)2·12H2O、6mgH3BO3和6mgNa2MoO4·2H2O，VB1的质量分数为100mg/L。

栽培培养基：实验组采用棉秸秆70％，麦麸26％，石灰3％，蔗糖1％；对照组为棉籽壳70％，麦麸26％，石灰3％，蔗糖1％。

1.2实验方法

1.2.1菌种的活化培养

将待试菌株母种从保藏状态下取出，分别斜面接种于PDA培养基上活化培养。然后将活化了的菌种接种于PDA培养基平板上,25℃±0.5℃下培养7d后备用。

1.2.2高效降解木素菌株的初步筛选

将普通PDA培养七日龄的菌株平板用打孔器打取经直径为3.5mm×3.5mm的菌块分别接种于PDA-Bavendamm培养基平板和PDA-RB培养基平板上，25℃±0.5℃条件下培养7d，每个菌株做3个重复。每日观察变色圈的形成情况并记录变色时间，以菌落为中心画出两条相互垂直的线，变色圈直径的测量取沿两条线的菌落直径增加的平均值，菌丝密度采用直观比较判断并记录。选择变色快、变色圈大的菌种待下步实验。

1.2.3木质素降解实验（复筛）

将初步筛选出的平菇菌株七日龄PDA平板培养基用打孔器取5.0mm×5.0mm菌块接种到秸秆附体培养基上，25℃±0.5℃条件下培养30d。每个菌种设三个重复。

1.2.4降解率的测定及选择性指数（SF）的计算（采用意大利VELP公司的FIWE6型纤维分析仪）

采用Van Soest法测木质素、纤维素和半纤维素含量。

降解率=木质素（或纤维素、半纤维素）降解总量／原样品中木质素（或纤维素、半纤维素）总量×100%

选择性指数（SF）=木质素降解率／综纤维素（纤维素+半纤维素）降解率×100%。

1.2.5栽培试验

采用瓶栽法,每个菌株按配方,对照组和实验组各装10瓶,封口后,于121℃高压湿热灭菌120min,冷却后以5%的接种量(以湿重计)接入各菌株栽培种,置于25℃恒温培养箱中培养至菌丝满袋后,移入菇房中按常规方法进行培养,采摘2潮子实体后培养结束。

1.2.5.1子实体产量测定

子实体产量采用单瓶产量计算，即依次称量10个重复的单瓶子实体鲜重，记录并计算平均值；

1.2.5.2栽培基质中木质纤维素降解率测定

测定方法同1.2.4降解率的测定

2结果与分析

2.1高效降解木素菌株的初步筛选

表1 各菌株PDA-Bavendamm平板显色结果

注：－表示显色反应为阴性；±表示显色反应刚刚开始；﹢、﹢﹢、﹢﹢﹢表示显色反应逐渐加强；﹢﹢﹢﹢表示显色反应非常彻底；表中小写字母表示差异显著(P＜0.05)，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

表2 各菌株RB-亮蓝平板脱色结果

注：－表示脱色反应为阴性；±表示脱色反应刚刚开始；﹢、﹢﹢、﹢﹢﹢表示脱色反应逐渐加强；﹢﹢﹢﹢表示脱色反应非常彻底；表中小写字母表示差异显著(P＜0.05)，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。

许多研究表明，平菇等食用菌对秸秆中木质素的降解利用主要是依靠其菌丝体分泌的三种胞外酶类，即过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。Bavendamm平板显色的原理就是利用平菇所分泌的漆酶能使酚类化合物聚合，在菌落周围形成棕褐色氧化带，呈现阳性反应。过氧化物酶能使染料Remazol Blue（RB）亮蓝脱色，在加入RB的PDA培养基中，产生过氧化物酶的菌株会在菌落周围形成脱色轮环。这两种变色反应的强弱和所需时间都取决于菌种的遗传背景和培养条件。并且平菇所分泌的这三种对木质素有降解作用的的酶均属于诱导酶，因此，在培养基中存在一定量的棉花秸秆木质素诱导作用的情况下，我们可根据变色圈的直径大小、变色的深浅程度和产生时间来判断菌株产酶性能的高低，进而判断出菌株对棉花秸秆木质素的降解能力，筛选出降解棉花秸秆木质素能力较高的菌株。

采用SPSS统计软件进行数据统计分析。各处理间实验数据以平均数±标准差表示，各处理平均值采用方差分析中的Tukey法进行显著性分析。PDA-Bavendamm平板显色实验结果如表1所示。实验中，皖平1号、早、苏平1号、苏平3号这四个品种在接种后的第一天便开始呈现出明显的棕褐色。其余大部分菌株也在接种后的的第二天开始显色。北-1显色反应开始的最晚，第三天才有明显的变色圈形成。比较培养七天后的变色圈直径，我们发现除了苏平1号、北-1和P928差异显著外，其余菌株显色直径在统计上没有明显的差异。苏平1号变色圈直径显著大于其他菌株，同时显色效果很深，说明其在棉花秸秆木质素的诱导下，漆酶分泌能力很强。北-1和P928显色圈直径最小，同时在显色效果方面，它显色效果也是最浅的，说明其分泌漆酶能力比较弱。

从表2可知，PDA-RB亮蓝平板脱色结果中各菌株的差异较为明显。通过比较脱色时间和脱色圈大小可以看出，菌株苏平1号、苏平3号、天达300、皖平1号和P17的脱色时间开始较早，脱色彻底，脱色圈直径大而明显，分泌过氧化物酶能力较强；其次为早、北-1、P928、新平400;农平1号和P3脱色时间开始最晚，脱色圈直径最小，分泌过氧化物酶的能力最弱。

平菇对木质素的降解不是依靠一种酶作用，而是几种酶共同作用的结果，主要通过木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶这3种酶相互协同来完成。因此综合两种平板筛选方法，我们选择了漆酶和过氧化物酶分泌能力都很强的8个平菇菌株作为初步筛选出的高效降解棉花木质素的菌株，投入到下一轮的复筛实验中。

从图1可以看出，复筛实验中苏平1号菌株的木质素降解率最高，在30d的培养中，其木质素降解率达到了14.82%；其次是皖平1号和黑平A，木质素降解率分别是13.79%和13.65%;最低的是早，木质素降解率为10.81%

通过图2我们可以看出，选择性指数最高的菌株是黑平A和苏平1号，其次为苏平3号和皖平1号，其余四个菌株的选择性指数均小于1。研究表明，选择性指数的高低反映的是白腐菌选择性降解木质素和棕纤维素的能力，而高效降解木质素的平菇菌株，应当是在尽可能减少降解利用棕纤维素的前提下，做大限度的优先降解利用秸秆木质素。综上所述，在复筛实验中，我们以各菌株对棉花秸秆的木质素降解率为主要依据，将选择性指素作为重要参考，筛选出了一株高效降解棉花秸秆木质素的平菇菌株—苏平1号。

将初筛选出的8株糙皮侧耳进行栽培试验，比较它们在复筛与栽培中木质素的降解率高低变化，实验结果数据采用三个重复实验的平均值表示，标准偏差均小于1。结果表明，本发明筛选出的高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株－苏平1号，在栽培试验中木质素降解率和选择性指数降解率依然是最高，且本发明筛选出的各糙皮侧耳菌株在复筛与栽培试验中的木质素降解率高低变化是一致的（表3）。说明本发明用来筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株是完全可行的。

表3 复筛与栽培中木质素降解率比较

同时复筛测定的木质素降解率与棉花秸秆栽培子实体产量（表4）的相关性检验中，样本的相关系数r²=0.787，说明利用木素降解率来筛选高效降解棉秸秆的糙皮侧耳菌株是可行的。

表4 棉花秸秆栽培中各菌株子实体产量

设复筛测定的木质素降解率为X，糙皮侧耳在棉花秸秆上的产量为Y，计算一元线性回归方程:

Y=3.494X-2.489

样本的相关系数r²=0.787,r=0.887

通过栽培实验，我们将复筛与栽培实验中测定的各聘雇菌株木质素降解率进行比较，发现两者高低变化是一致的。筛选实验中测定的木质素降解率准确的反映了实际栽培过程中各菌株对棉花秸秆基质的木质素降解情况。同时复筛木质素降解率与子实体产量之间的相关性检验也表明棉秸秆木质素降解率与子实体产量呈显著正相关关系。

因此，我们建立的这套筛选高效降解棉花秸秆木质素平菇菌株的方法是科学准确并且可行的。

Claims

1.一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧菌株的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）将待筛选菌株母种分别斜面接种于PDA培养基上活化培养，然后将活化了的菌种接种于PDA培养基平板上,25℃±0.5℃下培养7d后备用；所述PDA培养基按如下组分配比：马铃薯提取液1000ml、葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄·H₂O1.5g、维生素B₁0.1g、琼脂15.0g；

（2）将步骤1）培养的七日龄的菌株平板用打孔器打取经直径为3.5mm×3.5mm的菌块分别接种于PDA-Bavendamm培养基平板和PDA-RB培养基平板上，25℃±0.5℃条件下培养7d，每日观察变色圈的形成情况并记录变色时间及变色圈直径；

所述PDA-Bavendamm培养基是向步骤1）的PDA培养基中加入单独灭菌的鞣酸至终浓度为0.01g/100ml，再加入过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，所述棉秸秆干粉的加入量为每100mlPDA培养基加入0.1g；

所述PDA-RB培养基是向步骤1）的PDA培养基中加入单独灭菌的RB亮蓝至终浓度为625ug/mL，再加入过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，所述棉秸秆干粉的加入量为每100mlPDA培养基加入0.1g；

（3）将步骤（2）中筛选出的在两种培养基上变色反应强且反应时间快的菌株接种到棉秸秆固体培养基上，在25℃±1℃条件下培养30d；

所述棉秸秆固体培养基按如下组分配比：5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉秸秆干粉，20mL合成培养液，所述合成培养液的按体积比其配方为：酒石酸铵液:大量元素液:微量元素液:VB1液:水=15:15:3:16；其中，酒石酸铵溶液浓度为22.0g/L,大量元素液每升含20gKH₂PO₄、13.8gMgSO₄·7H₂O、1.0gCaCl₂和0.6gNaCl，微量元素液每升含0.35gMnSO₄·H₂O、60mgFeSO₄·7H2O、110mgCoCl₂·6H₂O、60mgZnSO₄·7H₂O、95mgCuSO₄·5H₂O、6mgAlK(SO₄)₂·12H₂O、6mgH₃BO₃和6mgNa₂MoO₄·2H₂O，VB₁的质量分数为100mg/L；

（4）将步骤（3）获得的培养后的基质，采用Van Soest法测定木质素降解率并计算选择性指数，以此为依据筛选出高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧耳菌株。

2.根据权利要求1所述的一种筛选高效降解棉秸秆木质素的糙皮侧菌株的方法，其特征在于，所述马铃薯提取液按如下方法制备：马铃薯刮去粗皮，去芽眼，准确称取200g，切成碎块放锅中，加水1000ml加热煮沸，期间不断搅拌；待水沸后再煮20～25min，用双层纱布过滤，所得滤液即马铃薯提取液。