CN102847154A - Rtp801的抑制剂的治疗性用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于基于RTP801基因和/或蛋白的抑制治疗微血管病症、眼病和呼吸系统病症的新的分子、组合物、方法和用途。

Description

RTP801的抑制剂的治疗性用途

本申请是申请日2005年8月16日、申请号为200580034968.5、发明名称为“RTP801的抑制剂的治疗性用途”的发明专利申请的分案申请。

本发明要求2004年8月16日提交的EP专利申请号EP 04019405.2、2004年8月17日提交的美国临时专利申请号60/601,983、2004年8月25日提交的60/604,668、2004年9月14日提交的60/609,786、2004年12月22日提交的60/638,659、2005年3月22日提交的60/664,236和2005年6月8日提交的60/688,943的优先权，这些文献在此整体引入作为参考。

发明领域

本发明涉及抑制RTP801基因的新的s iRNA分子和涉及使用这些分子治疗所有类型的呼吸系统病症（包括肺部病症）、眼疾病和病症、微血管病症、血管发生和细胞凋亡相关性病症的用途。

发明背景

肺慢性阻塞性疾病（COPD）

肺慢性阻塞性疾病（COPD），影响着超过一千六百万美国人且在美国为死亡的第4大原因。吸烟导致大多数使人衰弱的疾病发生，但不能排除其他环境因素(Petty T L.2003.Definition，epidemiology，course，and prognosis of COPD.Cl in.Cornerstone,5-10)。

肺气肿是COPD的主要表现。远离终末细支气管的外周气腔的永久性破坏是肺气肿的标志(Tuder RM,等人Oxidative stress andapoptosis interactand cause emphysema due to vascular endothelialgrowth factor blocade.Am J Respir Cell Mol Biol，29：88-97；2003.)。肺气肿的特征也在于炎症细胞例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞在细支气管和肺泡结构中的积累(Petty,2003)。

肺气肿的发病机理是复杂的并且是多因子作用的。在人中，已显示由炎症细胞产生的蛋白酶抑制剂例如α1-抗胰蛋白酶的缺乏促成了蛋白酶/抗蛋白酶的不平衡，从而有利于吸烟（CS）诱导的肺气肿中的肺泡细胞外基质的破坏(Eriksson,S.1964.Pulmonary Emphysema andAlpha1-Antitrypsin Deficiency.Acta Med Scand175：197-205.Joos,L.,Pare,P.D.,和Sandford,A.J.2002.Genetic risk factors ofchronic obstructive pulmonary disease.Swiss Med Wkly132：27-37)。基质金属蛋白酶(MMPs)在实验性肺气肿中起着中心作用，这可通过巨噬细胞金属弹性蛋白酶敲除小鼠对由CS的长期吸入造成的肺气肿的抗性证明(Hautamaki,等人:Requirement for macrophage elastase forcigarette smoke-induced emphysema in mice.Science277:2002-2004)。此外，转基因小鼠中的白细胞介素-13的肺部过量表达导致MMP和组织蛋白酶依赖性肺气肿(Zheng,T.,等人2000.Inducible targeting of IL-13to the adult lung causes matrixmetalloproteinase-and cathepsin-dependent emphysema.J ClinInvest 106：1081-1093)。最近的工作描述了隔细胞凋亡参与导致肺气肿的肺组织破坏(Rangasami T,等人Genetic ablation of Nrf2 enhancessusceptibility to cigarette smoke-iduced emphysema in mice.Submitted to Journal of Clinincal Investigation.;Tuder RM等人Oxidative stress and apoptosis interactand cause emphysema dueto vascular endothelial growth factor blocade.Am J Respir CellMol Biol，29：88-97；2003.;Yokohor i N,Aoshiba K,Naga i A,Increased levels of cell death and proliferation in alveolar wallcells in patients with pulmonary emphysema.Chest.2004Feb；125(2):626-32.;Aoshiba K,Yokohori N,Nagai A.,Alveolar wallapoptosis causes lung destruction and emphysema tous changes.AmJ Respir Cell Mol Biol.2003May；28(5):555-62.)。

在解释肺气肿中肺破坏的两条途径的机制中，首先应当提到活性氧物质（ROS）的过度生成。已明确地确定促氧化剂（prooxidant）/抗氧化剂的不平衡存在于吸烟者的血液和肺组织中(Hulea SA,等人:Cigarette smoking causes biochemical changes in blood that aresuggestive of oxidative stress:a case-control study.J EnvironPathol Toxicol Oncol.1995;14(3-4):173-80.;Rahman I,MacNee W.Lung glutathione and oxidative stress:implications in cigarettesmoke-induced airway disease.Am J Physiol.1999Dec;277(6 Pt1):L1067-88.;MacNee W.Oxidants/antioxidants and COPD.Chest.2000May;117(5Suppl 1):303S-17S.;Marwick JA,Kirkham P,GilmourPS,Donaldson K,MacNEE W,Rahman I.Cigarette smoke-inducedoxidative stress and TGF-beta1 increase p21waf1/cip1 expressionin alveolar epithelial cells.Ann N Y Acad Sci.2002Nov;973:278-83.;Aoshiba K,Koinuma M,Yokohori N,Nagai A.Immunohistochemical evaluation of oxidative stress in murinelungs after cigarette smoke exposure.Inhal Toxicol.2003Sep;15(10):1029-38.;Dekhuijzen PN.Antioxidant properties ofN-acetylcysteine：their relevance in relation to chronicobstructive pulmonary disease.Eur Respir J.2004Apr;23(4):629-36.;Tuder RM,Zhen L,Cho CY,Taraseviciene-Stewart L,Kasahara Y,Salvemini D,Voelkel NF,andFlores SC.Oxidative stress and apoptosis interact and causeemphysema due to vascular endothelial growth factor blocade.AmJ Respir Cell Mol Biol，29:88-97;2003.)。在将小鼠暴露于CS一小时后，在肺泡上皮细胞特别是II型的上皮细胞中存在急剧增加的8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)(参见Inhal Toxicol.2003Sep;15(10):1029-38.同上)。

过度产生的活性氧物质就其细胞毒性活性而言是已知的，所述细胞毒性活性来源于直接的DNA破坏效应和来源于细胞凋亡信号转导途径的激活(Takahashi A,Masuda A,Sun M,Centonze VE,Herman B.Oxidative stress-induced apoptosis is associated with alterationsin mitochondrial caspase activity and Bcl-2-dependent alterationsin mitochondrial pH (pHm).Brain Res Bull.2004Feb15;62(6):497-504.;Taniyama Y,Griendling KK.Reactive oxygenspecies in the vasculature：molecular and cellular mechanisms.Hypertension.2003Dec;42(6):1075-81.Epub 2003Oct 27.;HiguchiY.Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis inducedby oxidative stress.Biochem Pharmacol.2003Oct15;66(8):1527-35.;Punj V,Chakrabarty AM.Redox proteins inmammalian cell dea th：an evolutionarily conserved function inmitochondria and prokaryotes.Cell Microbiol.2003Apr;5(4):225-31.;Ueda S,Ma sutani H,Nakamura H,Tanaka T,UenoM,Yodoi J.Redox control of cell death.Antioxid Redox Signal.2002Jun;4(3):405-14.)。

ROS不仅自身具有细胞毒性而且也是促炎症反应刺激物，是氧化还原敏感型转录因子NFkB和AP-1的功效显著的激活剂(综述见于Rahman I.Oxidative stress and gene transcription in asthma and chronicobstructive pulmonary disease：antioxidant therapeutic targets.Curr Drug Targets Inflamm Allergy.2002 Sep;1(3):291-315.)。两种转录因子反过来强烈地参与促炎细胞因子(综述见于Renard P,RaesM.The proinflammatory transcription factor NFkappaB：a potentialtarget for novel therapeutical strategies.Cell Biol Toxicol.1999;15(6):341-4.;Lentsch AB,Ward PA.The NFkappaBb/IkappaBsystem in acute inflammation.Arch Immunol TherExp (Warsz).2000;48(2):59-63)和基质降解性蛋白酶(Andela VB,Gordon AH,Zotalis G,Rosier RN,Goater JJ,Lewis GD,Schwarz EM,Puzas JE,O'Keefe RJ.NFkappaB:a pivotal transcription factor in prostatecancer metastasis to bone.Clin Orthop.2003 Oct;(415Suppl):S75-85.;Fleenor DL,Pang IH,Clark AF.Involvement of AP-1in interleukin-lalpha-stimulated MMP-3 expression in humantrabecular meshwork cells.Invest Ophthalmol Vis Sci.2003Aug;44(8):3494-501.;Ruhul Amin AR,Senga T,Oo ML,Thant AA,Hamaguchi M.Secretion of matrix metalloproteinase-9 by theproinflamma tory cytokine，IL-1beta：arole for the dualsignallingpathways，Akt and Erk.Genes Cells.2003 Jun;8(6):515-23.)的转录的刺激。这样，促炎细胞因子充当也分泌基质降解性酶、细胞因子和活性氧物质的炎症细胞的吸引子。因此，病原性因子例如CS似乎触发了其中活性氧物质充当肺破坏的主要介体的病理网络。

来自吸入的香烟的活性氧物质(ROS)和由炎症细胞内源形成的活性氧物质都促成了增加的肺内氧化剂负担。

关于COPD的发病机理的一个另外的病原性因子是在气肿患者的肺中观察到VEGF和VEGFRII的减少的表达(Yasunori Kasahara,Rubin M.Tuder,Carlyne D.Cool,David A.Lynch,Sonia C.Flores,和NorbertF.Voelkel.Endothelial Cell Death and Decreased Expression ofVascular Endothelial Growth Factor and Vascular EndothelialGrowth Factor Receptor 2 in Emphysema.Am J Respir Crit Care Med第163卷.pp 737-714，2001)。此外，使用化学VEGFR抑制剂抑制VEGF信号转导导致肺泡中隔内皮细胞凋亡，然后导致上皮细胞的细胞凋亡，这可能是由于肺泡内两种类型的细胞的直接的结构/功能性连接的破坏造成的(Yasunori  Kasahara,Rubin M.Tuder,LaimuteTaraseviciene-Stewart,Timothy D.Le Cras,Steven Abman,Peter K.Hirth,Johannes Waltenberger,和Norbert F.Voelkel.Inhibitionof VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema.J.Clin.Invest.106：1311-1319(2000).;Voelkel NF,Cool CD.Pulmonaryvascular involvement in chronic obstructive pulmonary disease.Eur Respir J Suppl.2003 Nov；46：28s-32s)。

黄斑变性

在美国超过65岁的个体中的降低的最佳矫正视力的最常见的病因是称为与年龄相关的黄斑变性（AMD）的视网膜病症。随着AMD的发展，疾病的特征在于敏锐的中央视觉的丧失。受AMD影响的眼睛的区域是黄斑-视网膜中央的主要由感光细胞组成的小区域。所谓的“干”AMD，占AMD患者的大约85%-90%，涉及眼色素分布的改变、和由于细胞的总体萎缩造成的光感受器的损失和减少的视网膜功能。所谓的“湿”AMD涉及异常的脉络膜血管的增生，导致视网膜下区域中的凝块或疤痕。因此，湿AMD的发病是因为神经视网膜下的异常脉络膜新生血管网络(脉络膜新生血管化,CNV)的形成而发生。新形成的血管是过度渗漏的。这导致视网膜下流体和血液的积累，从而导致视敏度的丧失。最终，随着涉及脉胳膜和视网膜的大的盘状疤痕形成，在受影响的区域内完全丧失了功能性视网膜。虽然干AMD患者可保留质量下降的视力，但湿AMD通常导致失明。(Hamd i和Kenney,Age-related Macular degeneration-a newviewpoint，Frontiers in Bioscience，e305-314,May 2003)。CNV不仅在湿AMD中发生而且还在其他眼睛病症例如眼组织胞浆菌综合征、眼底血管样条纹（angiod streak）、Bruch膜的破裂、近视性变性、眼瘤和一些视网膜退行性疾病中发生。

所进行的各种研究已确定了AMD的几种风险因子，例如吸烟、衰老、家族史(Milton,Am J Ophthalmol 88,269(1979);Mitchell等人.,Ophthalmology 102,1450-1460(1995);Smith等人.,Ophthalmology108,697-704(2001))、性别(在女性中高出7倍:Klein等人.,Ophthalmology 99,933-943(1992)和人种(白种人是最易感的)。另外的风险因子可包括眼的特征例如远视和浅色眼睛（light-colored eyes）以及心血管疾病和高血压。遗传在疾病的发病进程中的作用的证据也已得到证明(参见上面的Hamdi和Kenney)。

两个公司，Acuity Pharmaceuticals和Sirna Therapeutics，最近都已提交了用于治疗AMD的、分别抑制VEGF和VEGF-R1(Flt-1)的siRNA分子的IND。这些分子分别称为Cand5抑制剂和027抑制剂。

微血管病症

微血管病症由广泛的主要影响微毛细血管和淋巴系统从而排除在直接的外科手术范围之外的病症群组成。广泛地可将微血管疾病分为血管痉挛、血管炎和淋巴管闭塞（lymphatic occlusive）。此外，许多已知的血管病症在其中都涉及微血管。

·血管痉挛疾病-血管痉挛疾病是相对普遍的病症，其中，由于未知的原因，外周血管收缩反射（peripheral vasoconstrictive reflexe）高度敏感。这导致不适当的血管收缩和组织局部缺血，甚至组织丢失。血管痉挛症状通常和温度或振动装置的使用相关，但可在其他病症之后继发。

·血管炎疾病-血管炎疾病是包括微循环中主要的炎症过程的疾病。血管炎通常是自身免疫或结缔组织病的一部分且一般不易手术治疗，但如果症状严重需要免疫抑制性治疗。

淋巴阻塞性疾病-下肢或上肢的慢性肿胀(淋巴管性水肿)是外周淋巴闭塞的结果。这是相对罕见的病症，所述病症具有大量病因，一些是遗传性，一些是获得性的。治疗的主要方法是恰当合身的具有压缩作用的衣服和间歇性加压装置的使用。

和糖尿病关联的微血管病理学

糖尿病是失明的首要病因、是截肢和阳萎和其中一种最常发生的慢性儿童期疾病的头号病因。糖尿病在美国也是肾终末期疾病的首要原因，和其他肾脏病相比，流行率为31%。糖尿病也是肾移植的最常见的适应症，占所有肾移植手术的22%。

一般地，糖尿病并发症可广泛地分类为微血管或大血管病变。微血管并发症包括神经病变(神经损伤)、肾病(肾脏疾病)和视觉障碍(例如视网膜病、青光眼、白内障和角膜疾病)。在视网膜、肾小球和神经滋养血管中，类似的病理生理特征表征了糖尿病特异性微血管疾病。

和糖尿病相关的微血管病症被定义为最小血管（毛细血管）的疾病，所述疾病可在例如已患有很长时间的糖尿病的患者中发生。血管壁变得异常厚但很脆弱。因此，其出血、渗漏蛋白并使血液通过身体的流动减慢。

临床和动物模型数据表明慢性高血糖是所有类型的糖尿病性微血管病的中心起始因子。高血糖症的持续时间和强度都和糖尿病性微血管病进展的程度和速度强烈相关。尽管所有糖尿病细胞暴露于提高的血浆葡萄糖水平，但血糖过多的损害局限于发生细胞内高血糖症的细胞类型(例如，内皮细胞)。内皮细胞发生细胞内高血糖症是因为，和许多其他细胞不同，当其暴露于细胞外高血糖时，其不能下调葡萄糖转运。细胞内高血糖症是糖尿病病症的发生必需的和充分的，这可通过培养在正常葡萄糖环境中的系膜细胞中的GLUT1葡萄糖载体（glucose transporter）的过度表达模拟了糖尿病表型，诱导和糖尿病性高血糖症相同的IV型胶原、I型胶原和纤粘连蛋白基因的表达的增加的事实进一步证明。

异常的内皮细胞功能：在糖尿病的病程的早期，在结构变化变得明显之前，高血糖导致血流的异常和视网膜、肾小球和外周神经的神经滋养血管中的血管渗透性。血流量和毛细血管内的压力的增加被认为反映了毛细血管床的输出侧上的高血糖诱导的减少的一氧化氮（NO）的产生和可能的对血管紧张肽I I的增加的敏感性。作为增加的毛细血管内压力和内皮细胞功能障碍的结果，视网膜毛血细管展示荧光素的渗漏增加，肾小球毛细血管具有提高的白蛋白排泄率（excretion rate）(AER)。在外周神经的滋养血管中发生相似的变化。在糖尿病进程的早期，增加的渗透性是可逆的；然而，随着时间的进展，其变得不可逆。

增加的血管壁蛋白的积累

糖尿病性微血管病的共同病理生理特征是血管腔的进行性变窄和最终闭塞，这导致受影响的组织的不充分灌注和功能不足。早期高血糖诱导的微血管高血压和增加的血管渗透性通过三个过程促成了不可逆的微血管闭塞：

·第一过程是高碘酸-希夫反应（PAS）-呈阳性的、包含糖的血浆蛋白的非正常渗漏，所述蛋白沉积在毛细血管壁中且可刺激血管周细胞例如周细胞和系膜细胞产生生长因子和细胞外基质。

·第二过程是生长因子例如转化生长因子β1(TGF-β1)的外渗，其直接刺激细胞外基质组分的过度产生，且可在某些并发症相关性细胞类型中诱导细胞凋亡。

·第三过程是通过内皮细胞和支持细胞进行的高血压诱导的病理基因的表达的刺激，所述基因包括glut-1葡萄糖载体、生长因子、生长因子受体、细胞外基质组分和可激活循环的白细胞的粘附分子的基因。糖尿病性微血管病的严重度的单侧减轻发生在具有眼（ophthalmic）或肾动脉狭窄的一侧，这和该概念一致。

微血管细胞丢失和血管闭塞

糖尿病性微血管腔的进行性变窄和闭塞也伴随着微血管细胞的丢失。在视网膜中，糖尿病诱导Müller细胞和神经节细胞、周细胞和内皮细胞的细胞凋亡。在肾小球中，衰退的肾功能和广泛的毛细血管闭塞以及足细胞丢失相关，但导致肾小球细胞丢失的机制仍不清楚。在神经滋养血管中，发生内皮细胞和周细胞退化，且这些微血管的变化似乎先于糖尿病性外周神经病变的发生。糖尿病中的轴索变性的多病灶分布支持微血管闭塞的病原作用，但高血糖诱导的神经营养因子的减少可通过阻止正常轴突的修复和再生起作用。

糖尿病性微血管病的另一个共同特征被称为高血糖记忆（hyperglycemic memory）、或在随后的正常的葡萄糖动态平衡期间高血糖诱导的微血管改变的持续或进展。该现象的最惊人的实例是糖尿病狗的组织学正常的眼睛的严重视网膜病的发生，所述疾病在2.5年的高血糖症后在2.5年的正常化的血糖期间完全发生。在体内，高血糖诱导的选择的基质基因转录的增加也在血糖量正常的恢复后持续数周，且较不明显的，但性质上相似的，高血糖症诱导的选择的基质基因的转录的增加的延长在培养的内皮细胞中发生。

关于其他信息，参见“Shared pathophysiologic features ofmicrovascular complications of diabetes”(Larsen:WilliamsTextbook of Endocrinology,第10版,Copyright

2003Elsevier)。

微血管并发症不仅在显性糖尿病中发生而且还因葡萄糖耐量降低(IGT)而引起。IGT的微血管并发症：神经病、视网膜病和肾脏微量蛋白尿（renal microproteinuria）。

糖尿病性神经病

糖尿病性神经病是和糖尿病相关的神经病病症(外周神经损伤)。这些病症通常是由包括供应神经的小血管（神经滋养血管）的糖尿病性微血管损害造成的。可和糖尿病性神经病相关的相对普通的病症包括第三脑神经麻痹、单一神经病变、多发性单一神经病变（mononeuropathymultiplex）、糖尿病性肌萎缩、疼痛性多发性神经病（painfulpolyneuropathy）、自主神经病、和胸腹神经病变（thoracoabdominalneuropathy）以及最普遍的形式，即外周神经病变，其主要影响足和腿。存在四种参与糖尿病性神经病变的发展的因素：微血管病、晚期糖基化终末产物、蛋白激酶C和多元醇途径。

糖尿病性神经病变中的微血管病

血管和神经疾病是紧密相关的且相互纠结。血管依赖于正常的神经功能，而神经依赖于充足的血流。微血管的第一个病理变化是血管收缩。随着疾病的进展，神经元功能障碍和血管异常例如毛细管基膜肥厚和内皮超常增生的发展紧密相关，所述血管异常促成减少的氧张力和低氧。神经元局部缺血（Neuronal ischemia）是糖尿病性神经病变的牢固建立的特征。血管扩张剂(例如，血管紧张肽转换酶抑制剂，α1-拮抗剂)可导致神经血流量的显著增加，和相应的神经传导速度的提高。因此，微血管功能障碍在糖尿病的早期发生，和神经功能障碍的进展平行，且可足以支持在糖尿病性神经病变中观察到的结构、功能和临床改变的严重度。外周神经病变（腿）即感觉运动神经病变是糖尿病中的腿溃疡的发病机理的重要组成。

神经病变是在一段时间内在超过一半的患有I I型糖尿病的患者中发生的糖尿病的共同并发症。神经传导研究表明神经病变已存在于10-18%的在糖尿病诊断时的患者中，暗示着外周神经损伤在疾病的早期阶段发生且具有更轻微的血糖失调。在40年以前就提出了神经病变是糖尿病的早期临床指征的概念，大多数研究报导了IGT和神经病变之间的联系。大部分具有I GT和相关神经病变的患者具有对称的、具有明显的神经性疼痛的末梢感觉性多神经病。IGT神经病(Microvascularcomplications of impaired glucose tolerance-Perspectives inDiabetes,J.Robinson Singleton,in Diabetes December 1，2003)在表型上和早期糖尿病性神经病变相似，其也可导致感觉症状，包括疼痛和自主功能障碍（autonomic dysfunction）。在669个患有早期糖尿病性神经病变的患者的调查中，超过60%呈现感觉症状，接近40%呈现性无能，其他涉及自主神经的达33%，但涉及运动神经的证据只占12%。这些临床发现表明传送疼痛、温度和自主信号的小的无髓鞘神经纤维的显著的早期参予。来自皮肤活组织检查的无髓鞘表皮内神经纤维的直接定量在具有和I GT和早期糖尿病相关的神经病变的患者中显示了相似的纤维丢失和改变的形态学。

自主神经功能障碍（Autonomic dysfunction），特别是勃起机能障碍和改变的心迷走神经反应，是糖尿病中神经病损伤的共同早期特征。使用IGT患者的研究工作也表明流行性迷走神经性自主神经机能异常(prevalent vagal dysautonoinia):独立的实验已发现，和年龄匹配、血糖正常的对照受试者相比，在IGT患者中存在更大比例的运动后异常的心率恢复、深呼吸的减弱的R-R间期变异性（blunted R-R intervalvariability to deep breathing）、和减少的呼气对吸气的比率（迷走神经性自主神经机能异常的所有测量）。

糖尿病中的神经损害影响运动、感觉和自主纤维。运动神经病变导致肌无力、萎缩和麻痹。感觉神经病变导致疼痛、压力和热的保护性感觉的丢失。疼痛的缺乏在无感觉的足中导致许多问题，包括溃疡形成、未被察觉的创伤和夏克氏神经关节病（Charcot neuroarthropathy）。患者可能在创伤进一步恶化之前不寻求治疗。感觉和运动功能障碍的组合可使患者对足施以非正常的压力，导致可导致感染的创伤。自主交感神经病变导致血管舒张和出汗减少，这可导致特别容易遭受皮肤破坏以及微血管流的功能改变的温暖的、过度干燥的足。自主神经功能障碍（和皮肤结构的去神经）也导致皮肤完整性的丧失，这为微生物的侵入提供了理想的场所。神经病变足不会自发地溃烂；相反地，其是一些神经病变伴随的创伤形式的组合。

微血管功能障碍在糖尿病的早期发生，和神经功能障碍的进展同时进行，且可足以支持在糖尿病性神经病变中观察到的结构、功能和临床改变的严重度。

晚期糖基化终末产物-提高的细胞内葡萄糖水平导致和蛋白的非酶促共价结合，这改变了其结构和破坏了其功能。这些糖基化蛋白中的某些蛋白涉及糖尿病性神经病变和糖尿病的其他长期并发症的病理学。

蛋白激酶C(PKC)-PKC涉及糖尿病性神经病变的病理学。增加的葡萄糖水平导致细胞内二酯酰甘油的增加，这激活了PKC。动物模型中的PKC抑制剂将通过增加神经血流来增加神经传导速率。

感觉运动神经多发性神经病变

更长的神经纤维受到影响的程度大于短的神经纤维，因为神经传导的速度和神经的长度成反比。在该综合征中，感觉减退和反射的丧失首先发生在足趾两侧，然后向上延伸。其通常被描述为麻木的套-袜（glove-stocking）分布、感觉缺失、感觉迟钝和夜间疼痛（nighttimepain）。所述疼痛可感觉起来象燃烧、穿刺样的感觉、疼痛或迟钝。针刺感是共同的。在早期影响到本体感受（即感知四肢所处空间的感觉）的丧失。这些患者不能感觉到其何时踩上异物，如刺，或其何时从不合适的鞋产生老茧。因此，其处于在足和腿上产生可导致截肢的溃疡和感染的风险中。类似地，这些患者可产生膝盖、踝或足的多发性骨折和产生夏科关节。运动功能的丧失导致脚趾的背曲挛缩（dorsiflexioncontractures），即所谓的槌状脚指。这些挛缩不仅在足中发生而且可在手中发生。

自主神经病

自主神经系统由作用于心脏、GI道和泌尿系统的神经组成。自主神经病可影响这些器官系统中的任一器官。糖尿病中被最普遍承认的自主神经功能障碍是直立性低血压或当患者站立时不舒适的晕厥的感觉。在糖尿病性自主神经病的情况下，其是由于心脏和动脉不能适当地调节心率和血管紧张度以保持血液持续和完全地流经大脑造成的。该症状通常伴随着窦性呼吸心率变异性（sinus respirato）（即，在正常呼吸中看到的心率的常见改变）的丧失。当这两个发现存在时，心脏自主神经病就存在。

GI道的表现包括胃排空延迟、胃轻瘫（gastroparesis）、恶心、胃气胀和腹泻。因为许多糖尿病患者采用口服法治疗其糖尿病，这些药物的吸收极大地受到胃排空延迟的影响。当口服糖尿病药在饮食前服用且直至数小时或有时数天后才被吸收时，当已存在正常或低血糖时，这可导致低血糖症。小肠的缓慢蠕动可导致细菌过度生长，在低血糖存在时，情况更加恶化。这导致胃气胀、胃气和腹泻。

泌尿症状包括尿频、尿急、尿失禁和尿滞留（retention）。此外，因为甜尿的滞留，尿道感染频繁。尿滞留可导致膀胱憩室（bladderdiverticula）、结石、逆流性肾病。

颅神经病变（Cranial neuropathy）

当颅神经受到影响时，眼球运动(第3)神经病变是最常见的。动眼神经控制除了外侧直肌和上斜肌外的使眼球运动的所有肌肉。其也用于收缩瞳孔和张开眼睑。糖尿病性第三脑神经麻痹的发病通常是突然的，始于额部或眼眶周围的疼痛，然后产生复视。除了控制瞳孔大小的肌肉外，所有由第三神经支配的动眼肌可受到影响。支配眼的外直肌（使第眼向两侧运动）的第六神经(第VI对脑神经)通常也受到影响，但第四神经(第四对颅神经)(支配使眼睛向下运动的上斜肌)例外。胸或腰的脊神经的单一神经病变可发生且导致模拟心肌梗塞、胆囊炎或阑尾炎的疼痛综合征。糖尿病具有更高的受压性神经病变例如腕管综合征发病率。

糖尿病性肢体局部缺血和糖尿病性足溃疡

糖尿病和压力可损坏微血管循环且导致下肢皮肤的改变，这样可导致溃疡的形成和随后的感染。微血管变化导致四肢肌肉微血管病以及对发生外周局部缺血的易感性和对局部缺血事件的减少的血管发生代偿性反应。微血管病症加重了外周血管疾病（Peripheral Vascular Disease）(PVD)(或外周动脉疾病(PAD)或下肢动脉疾病(LEAD)–大血管并发症-由于动脉粥样硬化引起的腿的动脉变窄。PVD在糖尿病的早期发生，其更加严重和普遍，且通常包括影响腿、眼和肾的间发性微循环问题。

足溃疡和坏疽是PAD的常见罹病情况(comorbid conditions)。和受损的感觉并发的周围神经病变使足对创伤、溃疡和感染易感。糖尿病中PAD的进展由这样的共病（comorbidity）例如周围神经病变和足与下肢对疼痛和创伤的不敏感组合。由于受损的循环和受损的感觉，溃疡和感染发生。骨髓炎和坏疽的进展可迫使进行截肢。

患有糖尿病的人遭受下肢截肢的概率比无糖尿病的人高达25倍，这强调了预防足溃疡和随后的肢体损失的必要。

糖尿病足溃疡不仅可和PAD一起发生而且也可和神经病变、静脉机能不全(静脉曲张)、创伤和感染关联。PAD在产生或促成足溃疡中促进这些其他症状。足溃疡不一定代表PAD的进展，因为其可在足够的临床外周动脉灌注存在的情况下发生。基于患者的研究表明，在具有外周神经病变和高足底压力（plantar foot pressure）的糖尿病患者中存在增加的足溃疡的风险。在南威斯康辛州，在基于群体的研究中，足或踝关节上的溃疡或疮的历史患病率（prevalence）占所有糖尿病患者的15%。在年龄小于30岁被确诊的糖尿病个体中患病率更高，男性（16%）的患病率略高于女性（13%），且在用胰岛素治疗的糖尿病患者（17%）中高于未采用胰岛素的患者（10%）。发病率随着年龄的增加而增加，特别是在30岁前被诊断的糖尿病患者中尤其如此。在来自欧洲的患者的研究中，糖尿病患者中的足溃疡的发病率在年龄小于50岁的患者中为3%，在年龄小于60岁的患者中为7%，和在年龄少于80岁的患者中为14%。在年龄70岁时，男性中的发病率高于女性中的发病率。

在糖尿病患者中，足的局部缺血和感染是严重的而且甚至是威胁生命的事件；然而，神经病变是最难治疗的病症。关于糖尿病性足的临床和病理学表现的所有方面的内科和外科文献繁多。神经病变、血管病、视网膜病和肾病，可单独地或组合地并以各种严重程度影响糖尿病足的治疗。

每年，在患有糖尿病的患者中进行82,000例肢体截肢术。这些截肢术主要是在上了年纪的群体中进行的。由糖尿病导致的截肢术可起于多发病因，包括足溃疡、局部缺血、静脉小腿溃疡（venous legulcers）(即，静脉逆流之后继发的溃疡)和踵溃疡（heel ulcers）(即，由于踵部未治疗的压迫性溃疡造成的溃疡)。这些截肢术的大多数源于溃疡。糖尿病患者中足溃疡的发病率为12%。此外，I型糖尿病患者中的下肢溃疡的20年累积发病率为9.9%。糖尿病诱导的肢体截肢术导致39%至68%的5年期死亡率且和增加的其他截肢术风险相关。当和无溃疡的患者相比时，具有糖尿病性足溃疡的患者的住院期的长度长大约60%。

糖尿病性神经病变损害依赖于健康C纤维伤害感受器功能和产生响应疼痛刺激的局部血管舒张的神经轴索反射。该症状还包括存在于应激状况例如损伤或炎症中、糖尿病性神经病变足中的血管扩张性反应。该损伤可部分地解释下列：尽管进行了成功的下肢血管形成术，但糖尿病足中的一些溃疡愈合较慢或根本不能愈合。

因此糖尿病性足溃疡的最常见的原因途径可鉴定为神经病变(感觉缺失)、畸形(例如，突起的跖骨头（metatarsal heads）)和创伤(例如，不合脚的鞋)的组合。

因为和更近侧的方法相比的更低的保肢率和效能，大多数外科医生倾向于进行腘或胫骨动脉旁路术。如果腘或胫骨动脉旁路术不能恢复可触及的足动脉搏动，曾报导足分流术为糖尿病和局部缺血性损伤的患者提供了更持久的和有效保肢方法。即使糖尿病患者中广泛的多区段血管闭塞症也不显现对保足的障碍。尽管严重的伤口并发症可具有严重的后果，在足旁路移植术后其是不常见的。已显示预先存在的足感染的充分控制和细心的移植通道（grafttunneling）在避免进一步的并发症中是有效的。下肢中的血管形成术正越来越多地被使用。然而，必需强调的是对于有效的血管形成术，如果更近侧的血管形成术要成功的话，末梢血管或供养血管必须是显著的。

尽管可在一些患者中治理糖尿病性溃疡/肢体病症(通过清创术、抗生素处理、使用刺激肉芽组织（新的胶原和血管发生）的制剂和减少伤口中的细菌负荷)，但具有可更好地治疗这些病症和/或减轻所述症状的药物组合物是非常有益的。

关于其他信息，参见American Journal of Surgery,第187卷Number 5 Suppl 1 May 1,2004,Copyright

2004 Elsevier。

糖尿病中的冠状微血管功能障碍

从以前的实验性研究和尸检中熟知糖尿病中的组织病理学和微循环功能障碍之间的相互关系，其中经常发现基膜的增厚、血管周围纤维化、血管变薄（vascular rarefication）和毛细管出血。尽管近年来的论文证明了病症和眼微血管功能障碍之间的相互关系(Am J Physiol2003;285)，但仍然难以在体内验证这些数据。然而，大量的临床研究表明不仅显性糖尿病而且损伤的代谢控制可影响冠状微循环(Hypert Res2002;25:893)。Werner提及由Sambuceti等人(Circulation2001;104:1129)撰写的重要论文，该论文显示在成功的梗死相关性动脉的再开术后患者的微循环障碍的持久性，且该论文可解释这些患者中的增加的心血管发病率和死亡率。来自大量急性再灌注研究的不断增加的证据证明发病率和死亡率和梗死相关性动脉的再开术本身无关，但更加依赖于TIMI flow+/-心肌显影（myocardial blush）(Stone 2002;Feldmann Circulation 2003)。Herrmann指出，除其他以外，冠状微循环的整体性可能是该情况中最重要的临床和预后因素(Circulation2001)。保护装置的中性效应(对TIMI流、对标准分辨率（ST resolution）或对MACE无相关的改变)可表明微循环的功能性损伤是预后的主要决定子。也存在不断增加的证据，即冠状微循环障碍在非阻塞性CAD中起着主要作用。冠状内皮功能障碍在这些患者中仍然是强预后预测因子。

糖尿病性肾病变(糖尿病患者中的肾功能不全)

糖尿病性肾病变包括微白蛋白尿(微血管疾病效应)、蛋白尿和ESRD。糖尿病是肾衰竭的最常见的原因，其占据超过40%的新病例。即使当药物和饮食能够控制糖尿病时，所述疾病仍可导致肾病和肾衰竭。大多数患有糖尿病的人不发生严重至足以导致肾衰竭的肾病。在美国大约一千六百万人患有糖尿病，且大约100,000人因糖尿病而患肾衰竭。

糖尿病性视网膜病

在糖尿病状态中，高血糖导致视网膜血流量减少、视网膜通透性过高、光感受器神经传导的延迟和视网膜神经元细胞死亡。在短暂持续的糖尿病中，已在视网膜的内核层内鉴定了神经元细胞的死亡。明确地，细胞凋亡已被定位在神经胶质细胞例如Mueller细胞和星形胶质细胞，且已显示，在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，细胞凋亡在糖尿病的一个月内发生。这些事件的原因是多因子的，包括二酯酰甘油/PKC途径的激活、氧化应激和非酶糖基化作用。这些事件的组合使视网膜含氧量降低，最终导致糖尿病性视网膜病的发生。视网膜局部缺血和糖尿病性视网膜中的早期改变之间的一个可能的联系是低氧诱导的生长因子例如VEGF的产生。低氧反应的主要调节因子已被鉴定为低氧诱导型因子1(HI F-1)，其可控制调节细胞增殖和血管发生的基因。以前的研究已证明HIF-1遍在蛋白化的抑制导致和低氧效应元件（HRE）的结合和VEGFmRNA的产生。

糖尿病性视网膜病被定义为由慢性高血糖导致的进行性视网膜血管功能障碍。糖尿病性视网膜病的关键特征包括微动脉瘤、视网膜出血、视网膜脂质渗出、棉絮状渗出斑（cotton-wool spots）、毛细血管无灌注、黄斑水肿和新生血管形成。相关的特征包括玻璃体出血、视网膜脱落、新生血管性青光眼、早熟性白内障（premature cataract）和脑神经麻痹（cranial nerve palsies）。

在美国有一千六百万人患有1型和2型糖尿病。在15年内，80%的1型糖尿病患者已发展成糖尿病性视网膜病，而84%的2型糖尿病患者在19年内发展成视网膜病。这些数目构成了针对新血管系统眼病的治疗剂的重大市场。糖尿病性视网膜病的发展是时间依赖性的。尽管存在最佳的血糖控制，但可预期患有长期疾病的患者会最终发展出视网膜病的一些形式。The National Society to Prevent Blindness已估计在美国4至6百万糖尿病患者患有糖尿病性视网膜病。估计的增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy）和糖尿病性黄斑水肿（diabetic macular edema）的新病例的年发病率分别为65,000和75,000例，流行率分别为700,000和500,000例。在美国，糖尿病性视网膜病每年导致12,000至24,000例新的失明病例。通过手术方法治疗视网膜病在减少严重的视觉丧失中是有效的，但视网膜的经受激光的部分被不可逆地破坏。没有有效的药物治疗。

主要影响毛细血管的微血管病即糖尿病通过破坏结膜、视网膜和中枢神经系统中的血管系统来影响眼睛。患者可呈现伴随有体重减轻（尽管食欲比正常食欲更大）(polyphasia)、异常渴感（剧渴）和异常多尿（多尿症）的长期充血的球结膜的病历。

在不稳定血糖后续发的波动的视力是最常见的视觉体征。晶状体内的肿胀导致大的突然的屈光的偏移和早期白内障的形成。视力的变化将依赖于疾病的严重度和阶段。

在视网膜中，小动脉和毛细胞血管的衰弱可导致视网膜内小点和小点出血、渗出物、视网膜内微血管异常(I RMA)微动脉瘤、水肿和棉絮状梗塞。增殖型糖尿病视网膜病变是严重的血管损害的结果且可见为视神经盘血管新生(NVD)、在某处血管新生(NVE)和虹膜血管新生(NVI，或发红性虹膜)。神经系统并发症包括第三、第四和第六颅神经的麻痹以及糖尿病性视神经乳头炎和面神经麻痹。

糖尿病是受遗传影响的共有葡萄糖耐受不良的疾病类型。其被表征为由于胰岛素不足或胰岛素功能障碍或细胞的胰岛素受体不足或功能障碍造成的代谢调节的紊乱。

参与山梨醇的形成的生物化学在周细胞的破坏中起着重要作用，所述周细胞是支持血管内皮的细胞。随着支持性周细胞死亡，毛细血管内皮逐渐受到损害，导致血液、蛋白和脂质的血管渗漏。这和浓稠的载满葡萄糖的血液一起产生了血管功能不全、毛细血管无灌注、视网膜缺氧、改变的结构和减少的功能。对在视网膜新生血管的发生中起作用的血管增殖因子的形成和释放的理解较少。

在进行医疗控制后，大多数糖尿病的非视力威胁性后遗症在数周至数月的过程中自行消退。在其中存在较大的曲光变化的情况下，患者可能需要临时的眼镜处方（spectacle prescription）直至屈光稳定。当视网膜病威胁黄斑时或当新血管增生时，患者可求助于激光光凝术。糖尿病性视网膜病研究(DRS)最终证明全视网膜光凝术在高危患者中减少严重的视力丧失的风险中是成功的。其将高危特征定义为：(1)大小为视神经盘直径的四分之一至三分之一的视神经盘（NVD）的血管新生和(2)具有玻璃体出血的在某处血管新生(NVE)。

糖尿病性黄斑水肿(DME)

DME是糖尿病性视网膜病的并发症，即影响视网膜的血管疾病。糖尿病性视网膜病导致视网膜中的多发性异常，包括视网膜增厚和水肿、出血、受阻的血流、流体从血管过度渗漏和，在最终阶段，异常的血管生长。该血管生长可导致大出血和严重的视网膜损害。当糖尿病性视网膜病的血管渗漏导致黄斑的肿胀时，其被称为DME。DME的主要症状是中心视觉丧失。和DME关联的危险度因子包括较差控制的血糖水平、高血压、导致液体潴留的异常肾功能、高胆固醇水平和其他一般的全身系统性因子。

根据世界卫生组织，糖尿病性视网膜病是工作年龄的成人中失明的首要原因和糖尿病患者中视力丧失的首要原因。美国糖尿病协会（TheAmerican Diabetes Association）报导，在美国大约有一千八百万例糖尿病，且在美国每年有大约一百三十万例新诊断的糖尿病病例。PreventBlindness America和the National Eye Institute估计在美国有超过五百三十万18岁或以上的患有糖尿病性视网膜病的人，包括大约500,000患有DME的人。CDC估计每年在美国有大约75,000例新的DME病例。

其他神经病变

除了糖尿病外，神经病变的常见病因是带状疱疹感染、慢性或急性创伤(包括手术)和各种神经毒素。神经性疼痛作为癌症对外周神经的直接结果（例如，受肿瘤的压迫）和作为许多化疗药物的副作用在癌症中是常见的。

微血管疾病-血管和神经疾病是紧密相关和交织的。血管依赖于正常的神经功能，而神经依赖于充足的血流。微血管的第一病理变化是血管收缩。随着疾病的进展，神经元功能障碍和血管异常的发展例如毛细血管基膜肥厚和内皮超常增生紧密相关，所述血管异常的发展促成了减少的氧张力和低氧。血管扩张剂(例如，血管紧张素转换酶抑制剂,α1-拮抗剂)可导致神经元血流量的显著提高，相应地导致神经传导速率的提高。

临床表现

神经病变影响所有外周神经：疼痛纤维、运动神经元、自主神经。因此其必定可影响所有器官和系统，因为所有器官和系统是受神经支配的。存在几种基于受影响的器官系统和膜的不同综合征，但这些综合征绝不是排它的。患者可患有感觉运动神经病变和自主神经病变或任何其他组合。

尽管在神经病变的代谢病因的理解上取得了进展，但针对阻断这些病理过程的治疗法一直受到副作用和功效的缺乏的限制。因此，治疗是针对症状的而不解决背后的问题。用于由感觉运动神经病变引起的疼痛的药物包括三环抗抑郁药(TCAs)、5羟色氨再摄取抑制剂(SSRI)和抗癫痫药(AED)。这些药物没有一种逆转导致糖尿病性神经病变的病理过程且没有一种改变疾病的冷酷的病程。因此，具有可更好地治疗这些病症和/或减轻症状的药物组合物将是非常有用的。

其他视网膜病

视网膜微血管病变(AIDS视网膜病)

在100%的AI DS患者中见到视网膜微血管病。其特征在于视网膜内出血、微动脉瘤、罗特斑（Roth spots）、棉絮状斑(神经纤维层的微梗塞)和血管周围鞘化。尽管已认为视网膜病是由于循环免疫复合物、细胞毒素物质的局部释放、异常的血液流变学和内皮细胞的HIV感染造成的，但其病因学仍不清楚。AIDS视网膜病现在是如此的普遍以至于无糖尿病或高血压的但处于HIV风险中的患者的棉絮状斑应当促使医生考虑病毒检测。对于AIDS视网膜病没有特定的疗法，但其持续存在可促使医生重新检查HIV疗法的有效性和患者的依从性。

骨髓移植(BMT)视网膜病

在1983年首次报导了骨髓移植视网膜病。其通常在BMT后六个月内发生，但其可迟至在BMT后62个月发生。危险度因子例如糖尿病和高血压可通过增强局部缺血性微血管病来促进BMT视网膜病的发展。对于BMT视网膜病的发展没有已知的年龄、性别或人种的倾向性。患者呈现视力衰退和/或视野缺陷。后段发现物（Posterior segment findings）通常是双侧的和对称的。临床表现包括多棉絮状斑、毛细血管扩张、微动脉瘤、黄斑水肿、硬性渗出物和视网膜出血。荧光素血管造影术显示毛细血管无灌注和衰弱、视网膜内微血管异常、微动脉瘤和黄斑水肿。尽管BMT视网膜病的准确的病因学仍未被阐明，但其似乎受到几种因子的影响：环孢霉素毒性、全身照射(TBI)和化学治疗剂。环孢霉素是抑制移植物抗宿主免疫反应的强免疫调节剂。其可导致内皮细胞损伤和神经系统副作用，因此，其已被建议为BMT视网膜病的病因。然而，BMT视网膜病可在不使用环孢霉素的情况下发展，且未曾显示环孢霉素在自体或同系基因型骨髓接受者中导致BMT视网膜病。因此，环孢霉素似乎不是BMT视网膜病的唯一病因。全身照射(TBI)也已被认为是BMT视网膜病的病因。照射损伤视网膜微血管从而导致局部缺血性血管病变。变量例如照射的总剂量和照射与骨髓去除的时间间隔似乎是非常重要的。然而，BMT视网膜病可在不接受TBI的患者中发生，且在接受相似的照射剂量的实体器官移植的接受者中未观察到BMT视网膜病。因此，TBI不是唯一的病因，但其是BMT视网膜病的发展中的另一个促进因子。化学治疗剂已被认为是BMT视网膜病中的强力促进剂。药物例如顺铂、卡莫司汀和环磷酰胺可导致眼的副作用，包括视乳头水肿（papilledema）、视神经炎、视野缺陷和皮质性盲。已经提出这些化学治疗剂可使患者易于受到照射诱导的视网膜损害并增强照射的有害作用。一般地，具有BMT视网膜病的患者具有良好的预后。视网膜病通常在停止或减少环孢霉素的剂量后2至4个月内消退。在一个报告中，69%的患者经历了视网膜发现物（retinal finding）的完全消退，和46%的患者经历了其基线视力的完全恢复。因为BMT视网膜病的良好预后和相对非进行性的性质，通常不需要攻击性的干预（aggressive intervention）。

局部缺血性病症

局部缺血可分为2类：第一类包括通常在糖尿病患者中，即在股骨、腘和胫后动脉内发生的加速的动脉粥样硬化。这些血管，直径通常只有1或2cm，可发展出严重减少血流的粥样硬化斑块。在大血管被完全堵塞后，中风、心肌梗塞、局部缺血和非治愈性糖尿病性足溃疡可发生。该形式的局部缺血基本上是大血管疾病。

中风后痴呆

中风后，25%的人具有痴呆，其他许多人在随后的5至10年内发生痴呆。此外，许多个体遭受其脑高级功能(例如筹划能力和处理信息的速度)的更精细的损害并处于随后发生痴呆的非常高的风险中。在该过程中大脑深部的非常小的中风（称为微血管病）似乎在导致已鉴定的对于中风后痴呆是特异性的脑萎缩模式的过程中是必需的。

眼局部缺血综合征

遭受眼局部缺血综合征（OIS）的患者通常上了年纪，年龄在50至80岁之间变动。男性受影响的概率是女性的两倍。患者极少无症状。目前90%的病例中发生视力减低，且40%的患者具有伴随性目痛。也可能有短暂脑缺血发作或一时性黑矇的伴随或前例病史。患者在发病时也具有明显已知的或未知的全身性疾病。最常遇到的全身性疾病是高血压、糖尿病、局部缺血性心脏病、中风和外周血管病。在较低的程度上，患者表现作为巨细胞动脉炎（GCA）的结果的OIS。

在80%的病例中存在单侧发现（Unilateral findings）。共同发现（Common finding）可包括晚期单侧白内障（advanced unilateralcataract）、前段炎症、无症状前房反应（asymptomatic anterior chamberreaction）、黄斑水肿、扩张的但非扭曲的视网膜静脉、中外周斑点（mid-peripheral dot）和斑点出血、棉絮状斑点、渗出物以及视盘和视网膜的血管新生。也存在自发性动脉搏动、提高的眼内压和虹膜新生血管形成以及和具有新生血管性青光眼(NVG)的angle。尽管患者可展现前段血管新生，但由于至睫状体的低动脉灌注的原因，可发生眼张力过低。偶尔地，存在可见的视网膜栓子(Hollenhorst plaque)。

OIS中的发现是颈内动脉粥样化性溃疡（internal carotid arteryatheromatous ulceration）和颈总动脉分叉处的狭窄造成的。5%的具有内动脉狭窄的患者发生OIS。然而，只有当狭窄的程度超过90%时，才发生OIS。颈动脉狭窄减少对眼睛的灌注压，导致上述局部缺血现象。一旦狭窄达到90%，视网膜中央动脉（CRA）中的灌注压只下降至50%。通常，减少的灌注压表现为CRA的自发搏动。该发现是可变的且可包括任何一种或所有上面的发现。

具有OIS的患者具有必须被评估的重大全身性疾病。心源性死亡是具有OIS的患者的死亡的主要原因—5年期死亡率是40%。因为该原因，必须将患有OIS的患者交给心脏病专家以进行完全的血清学、EKG、ECG和颈动脉评价。

肾脏的微血管疾病

肾脏涉及许多影响全身性和肾脏微血管的明确的临床病理症状。这些症状中的某些症状的特征在于对内皮细胞的初级损伤，例如：

·溶血性尿毒症综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)HUS和TTP是紧密相关的疾病，其特征在于微血管病性溶血性贫血和可变的器官损伤。一般地，当肾衰竭是综合征的主要特征时，进行HUS的诊断，这在儿童中很普遍。在成人中，神经功能缺损通常占优势，此时综合征被称为TTP。血栓形成性微血管病是两种综合征中的背后的病理性损害，且具有HUS或TTP的患者中的临床和实验室发现在很大程度上交叠。这已促使几个研究者将两种综合征当作单个疾病单元的连续集（cont inuum）。发病机理：实验数据强烈地表明内皮细胞损伤是HUS/TTP的发病机理中的主要事件。内皮损伤触发了事件的级联反应，该级联反应包括局部血管内凝血、纤维素沉积和血小板激活以及聚集反应。最终的结果是对于HUS/TTP综合征的不同形式来说是共同的血栓性微血管病的组织病理学发现。如果不对HUS/TTP进行治疗，死亡率达到90%。支持疗法—包括透析法、抗高血压疗法、输血法和神经病变并发症的管理—促成提高的具有HUS/TTP的患者的存活率。足够的流体平衡和肠休息在治疗和腹泻相关联的典型的HUS中是非常重要的。

·放射性肾炎-超过2500拉德的肾脏照射的长期结果可分为5个临床综合征：

(i)在6至13个月的潜伏期后，急性放射性肾炎在大约40%的患者中发生。其临床特征在于在大多数情况下导致末期肾(end-stage kidney)的高血压、蛋白尿、水肿和进行性肾功能衰竭的突变发作。

(ii)慢性放射性肾炎，相反地，具有在最初的创伤后18个月和14年之间变化的潜伏期。其在发病初期是隐匿的且特征在于高血压、蛋白尿和肾功能的逐渐丧失。

(iii)在暴露于射线后5至19年，第三综合征表现为具有正常肾功能的良性蛋白尿。

(iv)2至5年后，第四组患者只表现良性高血压且可具有可变的蛋白尿。在具有慢性放射性肾炎或良性高血压的患者中在照射之后18个月至11年产生晚期恶性高血压。受影响的肾的切除逆转了所述高血压。已报导了对肾动脉的放射诱导的损伤和随后的肾血管性高血压。

(v)已在用全身照射（TBI）处理的骨髓移植（BMT）患者中观察到和急性放射性肾炎类似的肾机能不全综合征。

已报导照射导致内皮功能障碍但在早期照射后阶段不伤害血管平滑肌细胞。照射可直接破坏DNA，导致这些细胞的减少的再生和肾小球毛细血管和小管中的基膜的denudement。该最初的损伤最终导致肾小球硬化症、肾小管萎缩和间质性纤维化的原因却不清楚。假定内皮细胞层的退化可在毛细血管和更小的小动脉中导致血管内栓塞。因此该肾内血管病可解释表征放射性肾炎的进行性肾纤维化和高血压。经照射的小鼠的肾的最新研究显示肾皮质中的白细胞的剂量依赖性增加，表明炎症性过程在辐射诱发的肾炎中的作用。

在其他肾病中，肾的微血管涉及自身免疫病症，例如全身性硬皮病(硬皮病)。全身性硬皮病中的肾参与表现为缓慢进行的慢性肾脏病或硬皮病肾危象(SRC)，其特征在于恶性高血压和急性氮质血症。假定SRC由肾中的Raynaud样现象导致。严重的血管痉挛导致皮层局部缺血和增加的血管紧张肽原酶和血管紧张肽II的产生，这样可使肾脏血管收缩永久性持续。激素变化(怀孕)、身体和情绪应激或低温可触发Raynaud样动脉血管痉挛。ACE抑制剂在治疗SRC中的显著益处强调了肾素-血管紧张肽系统在永久性肾缺血中的作用。在发展至严重肾机能不全的SRC患者中，尽管进行抗高血压治疗，透析仍成为必需。腹膜透析和血液透析都已使用。关于在1983年和1985年之间进行透析的患有全身性硬化症诱导的ESRD的311位患者的终末期肾病(ESRD)网的报导揭示了33%的3年期存活率。

肾微循环也可在镰状红细胞病中受到影响，因为低氧张力（作为沿着直小血管的氧的逆流传递的结果在肾髓质的深部血管中获得的）的原因，肾脏对于所述病症特别易感。更小的肾动脉和小动脉也可以是来自从大血管壁逐出的包含胆固醇的物质的血栓栓塞损伤的位置。

总之，导致肾脏微血管的暂时性或永久性阻塞的疾病均一地导致肾小球灌注的中断，从而导致肾小球滤过率的中断，从而对全身性内环境稳定构成了严重威胁。

急性肾功能衰竭(ARF)

ARF可由微血管或大血管病（主肾动脉阻塞或严重的腹主动脉病变）引起。经典的微血管病变通常呈现因为肾小球毛细血管血栓形成或阻塞而发生的微血管病性溶血和急性肾功能衰竭，其通常伴随有血小板减少症。这些疾病的一般实例包括：

a)血栓性血小板减少性紫癜-血栓性血小板减少性紫癜中的经典五价物（pentad）包括发烧、神经病学的改变、肾衰竭、微血管病性溶血性贫血和血小板减少症。

b)溶血性尿毒性综合征-溶血性尿毒性综合征类似于血栓性血小板减少性紫癜但不呈现神经病学的改变。

c)HELLP综合征(溶血、提高的肝脏的酶和低血小板)。HELLP综合征是种在具有转氨酶升高的孕妇中发生的溶血性尿毒性综合征。

急性肾功能衰竭可存在于所有医疗环境中但主要是在住院中获得。在5%的住院患者中发展了该病症，且大约0.5%的住院患者需要透析。在过去40年中，急性肾功能衰竭的存活率未得到提高，主要因为受影响的患者当时已上了年纪且具有更多的内科病症。在急性肾功能衰竭的患者中感染导致75%的死亡，心脏呼吸并发症是死亡的第二大最常见病因。依赖于肾衰竭的严重度，死亡率可在7%至高达80%的范围内变化。急性肾功能衰竭可被分为三类：肾前性ARF、肾内ARF和肾后性ARF。肾内ARF被细分为4类：肾小管疾病、肾小球疾病、血管疾病(包括微血管)和间质病。

进行性肾疾病

存在进行性肾病的特征在于微血管的进行性丢失的证据。微血管的丢失和肾小球和小管间质性瘢痕化的发展直接相关。机制部分地由内皮增殖反应的减少介导，且毛细血管修复中的该损伤由肾中的血管形成因子（血管内皮生长因子）和抗血管形成因子（血小板凝血酶敏感蛋白1）两者的局部表达的改变介导。血管形成生长因子的平衡的改变由巨噬细胞关联性细胞因子（白细胞介素1β)和血管活性调节剂两者介导。最后，存在吸引人的证据，即血管发生和/或毛细血管修复的刺激可稳定肾功能和减缓进程以及该有益方面不依赖于对BP或蛋白尿的效应而发生。

关于其他信息参见Brenner和Rector's The Kidney,第7版,Copyright

2004 Elsevier:第33章-Microvascular diseases ofthe kidney和也参见Tiwari和Vikrant Journal of Indian Academyof Clinical Medicine第5卷,No.1 Review Article-Sepsis and theKidney。

总之，预防和/或治疗COPD、黄斑变性和微血管病的目前的治疗模式是不令人满意的，因而存在对开发为了该目的的新化合物的需要。此处上面公开的所有疾病和适应症，以及此处描述的其他疾病和适应症例如MI也可由本发明的新的化合物治疗。

RTP801

本发明的受让方首先报导了基因RTP801。美国专利6455674、6555667和6740738（所有专利都转让给本申请的受让方）公开了和自身要求RTP801多核苷酸和多肽以及针对所述多肽的抗体。RTP801代表可调节低氧诱导的不依赖于生长因子例如VEGF的发病机理的低氧诱导型因子1(HIF-1)的唯一的基因靶。

本发明的发明者已获得导致抑制基因RTP801以改善各种呼吸系统病症的新概念的发现。

下列专利申请和出版物提供了背景信息的方面。

WO 2001070979涉及在卵巢癌细胞中过度表达的核酸标记。

US 6673549公开了包含响应类固醇治疗而差异表达的cDNA的组合。

美国申请2003165864涉及在用DNA去甲基化试剂处理的细胞中差异表达的cDNA。

美国申请2003108871涉及包含几种cDNA的据称用于治疗肝病的组合物，所述cDNA在经处理的人C3A肝细胞培养物中差异表达。

美国申请2002119463公开了用于治疗和诊断前列腺癌的新组合物，所述组合物包含在前列腺癌中差异表达的人cDNA。

WO 2004018999公开了用于估计、表征、监控、预防和治疗子宫颈癌的方法。

EP 1394274涉及方法，所述方法通过比较来自受试者的生物样品中的标记基因的表达水平和来自健康受试者的样品中的基因的表达水平来检测支气管哮喘或慢性阻塞性肺疾病。

WO 2002101075涉及用于检测、表征、预防和治疗人子宫颈癌的分离的核酸分子。

WO 2003010205涉及抑制血管发生以治疗创伤愈合、视网膜病、局部缺血、炎症、微血管病变、骨愈合和皮肤炎症。

WO 2002046465涉及鉴定参与疾病的基因以治疗低氧调节的病症。

WO 2002031111涉及据称是新的多肽和其编码的蛋白，并因此而提供了许多用途。

WO 2001012659涉及用于重组DNA方法学的核酸。

WO 2001077289公开了623个来源于各种人组织来源的多核苷酸。

WO 2003101283涉及包含许多据称在呼吸系统病症中差异表达的cDNA和蛋白的组合物。

JP 2003259877涉及许多肝纤维化疾病标记。

Tzipora Shoshani,等人Identification of a NovelHypoxia-Inducible Factor 1-Responsive Gene，RTP801，Involved inApoptosis.MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，Apr.2002,p.2283-2293;该论文，由本发明的发明人合著，详述了RTP801基因（当时为新的HIF-1依赖性基因）的发现。

Anat Brafman,等人Inhibition of Oxygen-Induced Retinopathyin RTP801-Deficient Mice.Invest Ophthalmol Vis Sci.2004 Oct;45(10):3796-805;也由本发明的发明者合著，该论文证明在RTP801基因敲除小鼠中，低氧不导致视网膜毛细血管网的变性。

Leif W.Ellisen,等人REDD1，a Developmentally RegulatedTranscriptional Target of p63 and p53，Links p63 to Regulation ofReactive Oxygen Species.Molecular Cell,第10卷,995-1005,November,2002;该论文证明RTP801(此处称为REDD1)的过度表达导致活性氧物质的增加的产生。

Richard DR,Berra E,和Pouyssegur J.Non-hypoxic pathwaymediates the induction of hypoxia-inducible factor 1 alpha invascular smooth muscle cells.J Biol.Chem.2000,Sep1;275(35):26765-71，该论文证明HI F-1-依赖性转录可由活性氧物质的过度产生诱导。

Rangasami T,等人,Genetic ablation of Nrf2 enhancessusceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice.被提交给Journal of Clinical Investigation.该工作涉及缺乏抗氧化剂防御系统(由于RTP801（在该文中称为Nrf2）的种系失活造成的)的小鼠。

发明概述

本发明提供了用于治疗微血管病症、黄斑变性、呼吸系统病症和脊髓损伤或疾病的新方法和组合物。

在一个实施方案中，提供了抑制RTP801和可用于治疗不同疾病和适应症的新分子。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有微血管病症、黄斑变性或呼吸系统病症的患者的方法，其包括给患者施用包含RTP801抑制剂的药物组合物。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗患有COPD的患者的方法，其包括给患者施用包含治疗有效量的RTP801抑制剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述抑制剂是siRNA分子、反义分子、抗体（例如中和抗体）、显性负调整肽（dominant negative peptide）或核酶。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗患有黄斑变性的患者的方法，其包括给患者施用包含治疗有效量的RTP801抑制剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述抑制剂是siRNA分子、反义分子、抗体（例如中和抗体）、显性负调控肽或核酶。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗患有微血管病症的患者的方法，其包括给患者施用包含治疗有效量的RTP801抑制剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述抑制剂是siRNA分子、反义分子、抗体（例如中和抗体）、显性负调控肽或核酶。

本发明的另一个实施方案提供了治疗有效量的RTP801抑制剂在制备用于在患有呼吸系统病症的患者中促进恢复的药物中的用途。在一个实施方案中，呼吸系统病症是COPD，所述抑制剂优选地是siRNA。

本发明的另一个实施方案提供了治疗有效剂量的RTP801抑制剂在制备在患有黄斑变性的患者中促进恢复的药物中的用途。在一个实施方案中，所述黄斑变性是AMD，所述抑制剂优选地是siRNA。

本发明的另一个实施方案提供了治疗有效量的RTP801抑制剂在制备用于在患有微血管病症的患者中促进恢复的药物中的用途。在一个实施方案中，微血管病症是糖尿病性视网膜病，所述抑制剂优选地是siRNA。

发明详述

本发明，在其实施方案中的一些实施方案中，涉及抑制RTP801基因或多肽以治疗眼病、呼吸系统疾病和微血管病症等。如将在此处所描述的，优选的用于本发明的抑制剂是生物分子。

不被理论所束缚，本发明的发明者已发现RTP801参与不同的疾病状况，包括微血管病症、眼病、呼吸系统病症以及脊髓损伤和疾病，因此抑制RTP801以治疗任一种所述疾病或病症是有益的。此处详尽地描述了抑制RTP801的方法、分子和组合物，且任一种所述分子和/或组合物可有益地用于治疗患有任一种所述病症的患者。

本发明提供了用于在体内抑制RTP801基因的表达的方法和组合物。一般地，所述方法包括以足以通过RNA干扰机制下调靶基因表达的量施用寡核糖核苷酸例如小干扰RNA（即，siRNA）或可在细胞中产生siRNA的核酸物质，所述小干扰RNA能靶向特定的mRNA并与其杂交。特别地，可使用本方法抑制RTP801基因的表达以治疗呼吸系统病症、微血管疾病或眼病。

因此，在一个实施方案中本发明提供了治疗患有微血管病症、眼病或呼吸系统病症的患者的方法，其包括给患者施用以治疗有效量包含RTP801抑制剂的药物组合物从而治疗患者。本发明还提供了治疗患有微血管病症、眼病或呼吸系统病症的患者的方法，其包括以足以促进恢复的剂量和时间给患者施用包含RTP801抑制剂的药物组合物。眼病可以是黄斑变性例如，与年龄相关的黄斑变性(AMD)等。所述微血管病症可以是糖尿病性视网膜病或急性肾功能衰竭等。呼吸系统病症可以是慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、慢性支气管炎、哮喘和肺癌等。RTP801抑制剂可选自多种分子，包括但不限于化合物例如多核苷酸、AS片段、靶向RTP801基因mRNA的RNA分子例如核酶或siRNA(例如表A-C中的siRNA，特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50)、或包含其的表达载体；多肽例如显性负调控肽、抗体（例如特异性结合存在于多肽内的、包含连续氨基酸的表位的抗体，所述多肽为图2(SEQ I D No:2)中所示的序列），或在一些情况下，酶。此外，RTP801抑制剂可以是化学抑制剂例如小分子，例如，具有低分子量例如低于2000道尔顿的分子量的化学物质。下面给出特定的RTP801抑制剂。

本发明还提供了用于治疗患有黄斑变性、COPD或糖尿病性视网膜病的患者的方法，其包括给患者施用包含治疗有效剂量的RTP801抑制剂的药物组合物从而治疗患者，所述RTP801抑制剂包含特异性地和转录自RTP801基因的mRNA杂交和/或下调RTP801基因表达的多核苷酸。所述多核苷酸可以是包含连续核苷酸的s i RNA，所述连续核苷酸具有和表A-C(SEQ ID NO s:3-344)和特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50所示任一序列同一的序列。

此外，本发明的其他实施方案涉及用于治疗患有微血管病症、呼吸系统病症或眼病的患者的方法，其包括以足以治疗患者的剂量和时间给患者施用包含治疗有效剂量的RTP801抑制剂的药物组合物，所述RTP801抑制剂包含siRNA分子，任选地是表A-C中任一表中详述的siRNA分子。

提供用于治疗患有微血管病症、呼吸系统病症或眼病的患者的其他方法，其包括以足以治疗患者的剂量和时间给患者施用包含治疗有效剂量的靶向RTP801基因mRNA的RNA分子的药物组合物。所述RNA分子可以是siRNA分子或核酶，所述siRNA分子是例如表A-C中，特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50中详述的siRNA分子。

本发明还提供了治疗患有呼吸系统病症、微血管病症或眼病或此处公开的病症中的任一种病症的患者的方法，其包括以足以治疗患者的剂量和时间给患者施用包含治疗有效剂量的靶向RTP801基因mRNA的siRNA分子（任选地表A-C中详述的siRNA分子）的药物组合物。此外，眼病可以是黄斑变性例如与年龄相关的黄斑变性(AMD)；微血管病症可以是糖尿病性视网膜病或急性肾功能衰竭；呼吸系统病症可以是COPD，被治疗的COPD的方面可包括，但不限于，肺气肿、慢性支气管炎或两者。

“治疗疾病”是指施用有效地改善和疾病相关的症状、减轻疾病的严重度或治疗疾病、或预防疾病发生的治疗物质。

“治疗有效剂量”是指有效地在患者或其生理系统中实现改善的药物化合物或组合物的量，所述改善包括但不限于改善的存活率、更快速的恢复或症状的改善或消除以及其他指标，如由本领域技术人员选择作为适当的确定度量（determing measure）的指标。

此处公开的和本发明包括的治疗疾病的方法可包括将RTP801抑制剂和另外的RTP801抑制剂、改善下面详述的活性成分的药理性质的物质、或已知在治疗要被治疗的疾病（例如除其他以外，黄斑变性、COPD、ARF、DR）中是有效的另外的化合物一起施用。“和……一起”是指在之前、同时或之后。下面给出关于示例性联合治疗法的更详细内容。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用治疗有效剂量的RTP801抑制剂制备药物的用途，所述药物用于在患有如上详述的黄斑变性、COPD、ARF、DR或任何其他眼病、微血管或呼吸系统病症的患者中促进恢复，和使用治疗有效剂量的RTP801抑制剂制备用于治疗所述疾病和病症的药物的用途。在该实施方案中，RTP801抑制剂可包括包含连续核苷酸的多核苷酸，所述连续核苷酸具有包含图1(SEQ I D No:1)中所示的序列的反义序列的序列。此外，RTP801抑制剂可以是包含多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸具有为图1(SEQ I D No:1)中所示的序列的反义序列的序列。所述用途的RTP801抑制剂也可以是抗体，例如特异性结合存在于多肽内的表位的中和抗体，所述多肽包含连续的氨基酸序列，即图2(SEQ ID No:2)中所示的序列。此外，RTP801抑制剂可以是靶向RTP801基因的mRNA的RNA分子，任选地s iRNA，任选地包含具有和表A-C(SEQID NOs:3-344)，特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50中所示的任一序列同一的序列的siRNA，或核酶。

因此，根据此处公开的信息，用于此处公开的方法中的任一方法的、此处公开的用途中的任一用途中的和此处公开的药物组合物中的任一种药物组合物中的RTP801抑制剂可选自siRNA分子、包含siRNA分子的载体、可表达siRNA分子的载体和被内源地加工成siRNA分子的任何分子。如此处所详述的，所述siRNA分子优选地是包含连续核苷酸的siRNA分子，所述连续核苷酸具有和表A-C(SEQ ID NOs:3-344)，特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50中所示的任一序列同一的序列。

“呼吸系统病症”是指呼吸系统的病症、疾病或综合征，其包括但不限于所有类型的肺部病症，包括慢性闭塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、慢性支气管炎、哮喘和肺癌等。肺气肿和慢性支气管炎可作为COPD的部分发生或独立地发生。

“微血管病症”是指影响微观毛细血管和淋巴系统的任一病症，特别是血管痉挛病、脉管炎疾病和淋巴管闭塞性疾病。微血管病症的实例包括，但不限于：眼病症例如一时性黑矇(血栓的或继发于SLE)、apla综合征、Prot CS和ATIII缺陷、由IV药物使用导致的微血管病状、异常蛋白血症、颞动脉炎、前部缺血性视神经病、视神经炎(原发性或继发于自身免疫性疾病)、青光眼、冯希-林综合征、角膜疾病、角膜移植排斥白内障、伊尔斯病、frosted branch angiitis、环绕皱曲手术（encircling buckling operation）、色素膜炎包括扁平部睫状体炎、脉络膜黑色素瘤、脉络膜血管瘤、视神经发育不良；视网膜病症例如视网膜动脉阻断、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病、HIV视网膜病、Purtscher视网膜病、系统性脉管炎和自身免疫性疾病的视网膜病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、放射性视网膜病、分枝视网膜动脉或静脉闭塞、自发性（idiopathic）视网膜脉管炎、动脉瘤、视神经视网膜炎、视网膜栓塞形成、急性视网膜坏死、Birdshotretinochoroidopathy、长期视网膜脱落；全身性病症例如糖尿病、糖尿病性视网膜病(DR)、糖尿病相关性微血管病症(如此处所详述的)、高粘滞综合征、主动脉弓综合征和眼缺血综合征、颈动脉海绵窦瘘、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、具有SS-A自身抗体的小动脉炎、急性多病灶出血性血管炎（acute multifocal hemorrhagic vasculitis）、由感染造成的血管炎、由贝切特病造成的血管炎、肉样瘤病、凝固阻碍、神经病变、肾病、肾脏的微血管病和缺血性微血管病症。

微血管病可包括新生血管因素。术语“新生血管性病症（neovasculardisorder）”是指其中血管的形成（新血管形成）对患者是有害的病症。眼新生血管形成的实例包括：视网膜疾病(糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、慢性青光眼、视网膜脱落和镰状红细胞视网膜病)；发红性虹膜炎（rubeosis iritis）；增殖性玻璃体视网膜病变；炎性疾病、慢性色素膜炎、赘生物(视网膜母细胞瘤、假神经胶质瘤和黑色素瘤)、Fuchs氏异色性虹膜睫状体炎、新生血管性青光眼、角膜新生血管形成(虹膜的炎症、移植和发育不全)、进行组合的玻璃体切割术和晶状体切开摘出术后的新血管形成、血管疾病(视网膜缺血、脉络膜血管功能不全、慢性血栓症和颈动脉局部缺血)、视神经的新血管形成、和由于眼睛的穿透或挫伤性眼损伤造成的新血管形成。可使用本发明的化合物和药物组合物治疗所有这些新血管形成病症。

“眼病”是指眼睛的病症、疾病或综合征，包括，但不限于涉及脉络膜新生血管(CNV)、湿AMD和干AMD、眼组织胞浆菌病综合征、angiodstreaks、Bruch氏膜破裂、近视性变性、眼瘤、视网膜退行性疾病和视网膜静脉闭塞（RVO）的任何病症。此处公开的可按照本发明的方法治疗的一些病症，例如DR，在此处提供的定义下已被当作微血管病症或眼病或两者。

“RTP801基因”是指RTP801编码序列开放阅读框架，如图1(SEQ IDNO:1)中所示的，或其优选地具有至少70%同一性，更优选地80%的同一性，甚至更优选地90%或95%的同一性的任何同源序列。这包括来源于SEQ ID NO:1的已接受此处描述的突变、改变或修饰的任何序列。因此，在优选的实施方案中，由SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列编码RTP801。当，优选地，第一片段和第一链通常比本发明的核酸短时，本发明的核酸分别只和编码RTP801的核酸的部分互补或同一，也在本发明内。此外承认，基于RTP801的氨基酸序列，本领域技术人员基于遗传密码子可知道编码这些氨基酸序列的核酸序列。然而，由于本发明的核酸的假定的作用模式的原因，最优选地，编码RTP801，优选地其mRNA的核酸是分别存在于其中RTP801的表达待被降低的生物、组织和/或细胞中的核酸。

“RTP801多肽”是指RTP801基因的多肽，根据本发明的目的，其被理解为包括来源于任何生物，任选地人的术语“RTP779”、“REDD1”、“Ddit4”、“FLJ20500”、“Dig2”和“PRF1”、其保持生物学活性的剪接变体或片段、和其同源物，所述同源物优选地和其具有至少70%、更优选地至少80%、甚至更优选地至少90%或95%的同源性。此外，该术语被理解为包括由RTP801编码序列中的少数改变产生的多肽，所述改变是例如可在所得的多肽和天然发生的RTP801之间的少数氨基酸上产生差异的点突变、置换、缺失和插入。该术语也包括由在高度严紧杂交条件下结合RTP801编码序列或基因组序列的核酸序列编码的多肽，所述高度严紧杂交条件在本领域内是熟知的(例如Ausube l等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1988),于1995和1998年更新)。所述术语也包括化学修饰的RTP801或化学修饰的RTP801的片段，只要生物学活性得到保留。RTP801优选地具有或包含SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。承认的是，在生物的不同组织中和一个物种的不同生物中或不同物种的生物中氨基酸序列可能存在差异，所述物种或生物是在本发明的不同实施方案中可对其使用本发明的核酸的物种或生物。然而，基于此处提供的技术教导，当设计本发明的核酸的任一核酸时，可相应地考虑各自的序列。RTP801的特定片段包括图2中所示的序列的氨基酸1-50、51-100、101-150、151-200和201-232。RTP801的其他特定片段包括图2中所示序列的氨基酸25-74、75-124、125-174、175-224和225-232。

此处所用的RTP801是WO 99/09046等中描述的蛋白。也被称为RTP801的RTP801已被Shoshani T等人(Shoshani等人,2002,Mol CellBiol,22,2283-93)描述为HIF-1α的转录靶。此外由Ellisen等人(Ellisen等人,Mol Cell,10,995-1005)进行的研究已将RTP801鉴定为p53-依赖性DNA破坏反应基因和参与表皮分化的p63依赖性基因。此外，RTP801反映了p53家族成员p63的组织特异性模式，其有效性和TP 63相似或是TP63的补充，或是体外分化的抑制剂，且参与活性氧物质的调控。除此以外，RTP801对低氧反应转录因子低氧诱导因子1(HIF-1)作出反应且在缺血性发作的动物模型中，在体外和体内的低氧期间通常被上调。RTP801似乎在活性氧物质(ROS)的调控中发挥作用，且ROS水平和对氧化应激的减少的敏感性在异位表达RTP801后都得到增加(Ellisen等人2002,同上;Soshani等人2002,同上)。优选地，RTP801是具有生物学活性的RTP801蛋白，所述蛋白优选地展示这些特征中的至少一种特征，优选地两种或更多种和最优选地这些特征中的每一种和任一种特征。

和RTP801相关的基因是RT801L，也称为“REDD2”，其由本发明的发明者发现。RTP801L和RTP801同源，且以相似的方式对氧化应激作出反应；因此，RTP801L可能具有一些和RTP801相似的功能。

不受理论束缚，作为应激诱导型蛋白（对低氧、氧化应激、termalstress、ER应激作出反应）的RTP801是在细胞对能量不平衡的反应的细调中起作用的因子。这样，其是适合用于治疗任何这样的疾病的靶，在所述疾病（例如伴随着正常细胞的死亡的疾病）中，应当从由于应激条件导致的细胞凋亡中拯救细胞，或在所述疾病中，应当杀死由于RTP801表达的改变导致适合于应激条件的细胞（例如，癌细胞）。在后一种情况下，RTP801可被视为癌细胞的存活因子，且其抑制剂可作为单一疗法或作为和化学治疗或放射治疗结合的致敏药物用于治疗癌症。

术语“多核苷酸”是指由DNA核苷酸、RNA核苷酸或两种类型的组合（即包含两种或更多种碱基胍、胞嘧啶、胸苷、腺嘌呤、尿嘧啶或肌苷等的分子）构成的任何分子。多核苷酸可包括天然的核苷酸、化学修饰的核苷酸和合成的核苷酸或其化学类似物。该术语包括“寡核苷酸”和包括“核酸”。

术语“氨基酸”是指由20种天然发生的氨基酸、已被化学修饰（参见下面）的氨基酸或合成的氨基酸中的任意氨基酸组成的分子。

术语“多肽”是指由两个或更多个氨基酸残基组成的分子。所述术语包括肽、多肽、蛋白和肽模拟物（peptidomimetic）。

“肽模拟物”是包含非肽结构成分、能够模拟天然亲本肽的生物学作用的化合物。在肽模拟物中通常不存在一些经典的肽特征例如酶促易断裂的肽键。

术语“显性负调控肽”是指由编码蛋白的部分的cDNA片段编码的多肽(参见Herskowitz I.:Functional inactivation of genes bydominant negative mutations.Nature.1987 Sep17-23;329(6136):219-22.Review;Roninson IB等人,Geneticsuppressor elements:new tools for molecular oncology-thirteenthCornelius P.Rhoads Memorial Award Lecture.Cancer Res.1995Sep15;55(18):4023)。该肽可和产生其的蛋白具有不同的功能。其可和全长蛋白相互作用且抑制其活性或其可和其他蛋白相互作用从而抑制其对全长（亲本）蛋白的响应的活性。显性负调控表示肽能够克服天然亲本蛋白且抑制其活性，为细胞提供不同特征（例如对死亡的抗性和致敏作用）或任何目的细胞表型。对于治疗性干预，可将肽自身作为药物组合物的活性成分进行递送，或可使用已知的方法将cDNA递送至细胞。

肽和多肽的制备

可通过各种方法生产多肽，例如：

1)合成：

可使用商购获得的仪器，使用RTP801的已知序列或其部分制备合成的多肽。

2)重组方法：

制备RTP801多肽或其片段的优选的方法是将包含RTP801基因的cDNA的多核苷酸克隆入表达载体并培养包含该载体的细胞以表达被编码的多肽，然后纯化所得的多肽，使用本领域已知的方法，如例如Marshak等人,″Strategies for Protein Purification andCharacterization.A laboratory course manual."CSHL Press(1996)中描述的方法进行所有步骤。(此外，参见Bibl Haematol.1965‘23：1165-74Appl Microbiol.1967Jul；15(4):851-6；Can JBiochem.1968 May；46(5):441-4；Biochemistry.1968Jul；7(7):2574-80；Arch Biochem Biophys.1968 Sep 10；126(3):746-72；Biochem Biophys Res Commun.1970 Feb 20；38(4):825-30).)

所述表达载体可包含用于控制异源材料的转录的启动子，且所述启动子可以是组成型启动子或允许选择性转录的诱导型启动子。可任选地包含获得必需的转录水平所需要的增强子。表达载体也可包含选择基因。

可通过本领域已知的许多方法中的任一种方法将载体导入细胞或组织。一般发现这些方法描述于Sambrook等人,Molecular Cloning：ALaboratory Manua l，Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),in Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989),Vega等人,GeneTargeting，CRC Press,Ann Arbor,MI(1995),Vectors:A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston MA(1988)和Gilboa等人(1986)中。

3)从天然来源纯化：

可使用本领域技术人员已知的许多方法从天然来源（例如组织）纯化RTP801多肽，或其天然发生的片段，所述方法是例如：使用RTP801抗体的免疫沉淀法或使用已知结合RTP801的任何分子的基质结合亲和层析法。

如在本领域已知的，如在例如Mar shak等人,"Stra tegies forProtein Purification and Characterization.A laboratory coursemanual."CSHL Press(1996)中描述的那样实施蛋白质的纯化。

“RTP801的生物学效应”或“RTP801生物活性”是指RTP801在呼吸系统病症中的作用，所述作用可以是直接的或间接的，且包括，不受理论束缚，RTP801对由含氧量低的或含氧量高的条件诱导的肺泡细胞的细胞凋亡的作用。间接效应包括，但不限于，RTP801对几种分子中的一种的结合或具有对其的作用，所述分子参与造成细胞凋亡的信号转导级联反应。

“细胞凋亡”是指由于一些细胞机制的激活造成的生理类型的细胞死亡，即受细胞的机制控制的死亡。细胞凋亡可以是例如通过外部触发剂或通过内部信号激活细胞机制的结果，所述外部触发剂是例如导致细胞死亡的细胞因子或抗FAS抗体。术语“程序性细胞死亡”也可和“细胞凋亡”互换使用。

“细胞凋亡相关性疾病”是指其病因学完全地或部分地和细胞凋亡相关的疾病。所述疾病可由凋亡过程的障碍（例如在癌症或自身免疫性疾病中）或由凋亡过程的过度活动（例如在某些神经变性疾病中）造成。RTP801参与其中的许多疾病是细胞凋亡相关性疾病。例如，细胞凋亡是干AMD的重要机制，其中主要存在于视网膜的中心（黄斑）区域中的光感受器和色素上皮细胞的缓慢萎缩由此而发生。视神经视网膜细胞凋亡也是糖尿病性视网膜病的重要机理。

“抑制剂”是能够抑制基因或该基因的产物的活性至足以获得想要的生物学或生理学效应的程度的化合物。“RTP801抑制剂”是能够抑制RTP801基因或RTP801基因产物，特别是人RTP801基因或基因产物的活性的化合物。这些抑制剂包括影响所述基因的翻译或转录的物质和影响所述基因产物的活性的物质。RTP801抑制剂也可能是RTP801启动子的抑制剂。这些抑制剂的实例可包括：多核苷酸例如AS片段、siRNA、或包含其的载体；多肽例如显性负调控肽、抗体和酶；催化性RNA例如核酶；和具有低分子量例如低于2000道尔顿的分子量的化学分子。下面给出了特定RTP801抑制剂。

“表达载体”是指具有在外源细胞中整合和表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是已知的和/或可商购获得。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。

术语“抗体”是指IgG、IgM、IgD、IgA和IgE抗体等。所述定义包括多克隆抗体或单克隆抗体。该术语表示完整的抗体或包含抗原结合结构域的抗体片段，例如无Fc部分的抗体、单链抗体、微型抗体、基本上只由抗体的可变结构域、抗原结合结构域构成的片段等。术语“抗体”也可指通过cDNA接种获得的抗多核苷酸序列的抗体。所述术语也包括保持选择性地与其抗原或受体结合的能力的抗体片段，举例如下

(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可通过用木瓜蛋白酶降解完整的抗体以产生轻链和重链的部分来生产；

(2)(Fab’)₂，可通过用胃蛋白酶处理完整的抗体而无随后的还原反应获得的抗体的片段；F(ab’₂)是通过两个二硫键连接在一起的两个Fab片段的二聚体；

(3)Fv，定义为经基因工程改造的包含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的片段；和

(4)单链抗体(SCA)，定义为经基因工程改造的包含通过合适的多肽连接体连接的轻链可变区和重链可变区的分子，其是通过基因工程融合的单链分子。

本发明中所用的术语“表位”是指抗原上的和抗体结合的抗原决定簇。表位决定子通常由分子的化学活性表面集团例如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。

抗RTP801抗体的制备

可使用完整的多肽或包含更小的多肽的片段作为免疫抗原制备结合RTP801的抗体或来源于其的片段。例如，产生特异性结合RTP801的N或C末端或任何其他合适的结构域的抗体可以是想要的。用于免疫动物的多肽可从被翻译的cDNA产生或化学合成，且如果想要可将其缀合至载体蛋白。被化学偶联至多肽的这些常用的载体包括钥孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后将偶联的多肽用于免疫动物。

如果想要，可通过例如结合至基质并从基质洗脱来进一步纯化多克隆或单克隆抗体，所述基质结合用于产生所述抗体的多肽或肽。本领域技术员知道在免疫学中用于纯化和/或浓缩多克隆抗体和单克隆抗体的各种常用技术(Coligan等人,Unit 9,Current Protocols inImmunology，Wiley Interscience,1994)。

用于制备所有类型的抗体（包括片段）的方法在本领域是已知的(参见例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory,New York(1988))。免疫的方法，包括在合适的佐剂中制备免疫原、确定抗体结合、抗体的分离的所有必需步骤，获得单克隆抗体的方法和单克隆抗体的人源化对于本领域技术人员来说都是已知的。

抗体可以是人源化的抗体或人抗体。可使用本领域已知的许多种技术人源化抗体，所述技术包括CDR-移植(EP239,400:PCT公开号WO.91/09967;美国专利5,225,539;5,530,101;和5,585,089,镶嵌（veneering）或表面重建（resurfacing）(EP592,106;EP519,596;Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人,Prot e in Eng ineer i ng 7(6):805-814(1994);Rogus ka等人,PNAS91:969-973(1994)),和链重排(美国专利5,565,332)。

定义的单克隆抗体包括来源于一个物种（例如鼠类、兔子、山羊、大鼠、人等）的抗体和来源于两个（或更多个）物种的抗体，例如嵌合和人源化抗体。

对于人患者的治疗，完全的人抗体是特别想要的。可通过本领域已知的许多种方法来制备人抗体，所述方法包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法。也参见，美国专利4,444,887和4,716,111;和PCT公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，其各自以其全文在此引用作为参考。

关于所有类型的抗体，包括人源化抗体、人抗体和抗体片段的其他信息可在WO 01/05998中找到，其以其全文在此引用作为参考。

可通过上述方法，可能加上通过例如存活测定法筛选中和活性的额外步骤来制备中和抗体。

术语“化学化合物”、“小分子”、“化学分子”、“小化学分子”和“小化学化合物”在此处可互换使用，且理解为表示任何特定类型的化学部分，所述化学部分可通过合成产生或从天然来源获得，且通常具有低于2000道尔顿、低于1000道尔顿或甚至低于600道尔顿的分子量。

本发明也涉及包含双链结构的功能性核酸、其用于生产包含这些功能性核酸的药剂、药物组合物的用途以及用于治疗患者的方法。

低氧已被认为是相当多的疾病的病理机制中的关键因素，所述疾病是例如中风、肺气肿以及和不最适宜的氧可得性相关的梗塞和对低氧条件的组织破坏性反应。在快速生长的组织（包括肿瘤）中，通过不想要的新血管发生来补偿不最适宜的氧可得性。因此，至少在癌症疾病的情况下，血管系统的生长是不想要的。

考虑到此，分别对血管发生和血管生长的抑制进行详尽的研究。今天已可获得一些抑制不想要的血管发生和血管生长的化合物。其中一些作用更显著的化合物是抑制VEGF和VEGF受体的化合物。在两种情况下，通过这样阻断VEGF，例如通过使用针对VEGF的抗体阻断VEGF来消除VEGF的作用，所述抗体是例如购自Genentech’s AVASTIN的抗体(对于VEGF是特异性的单克隆AB)(Ferrara N.;Endocr Rev.2004Aug;25(4):581-611)，或通过阻断对应的受体，即VEGF受体来消除VEGF的作用(Traxler P;Cancer Res.2004 Jul 15;64(14):4931-41;或Stadler WM等人,Clin Cancer Res.2004May 15;10(10):3365-70)。

然而，因为血管发生和血管的生长在任何动物和人类中是非常基础和至关重要的过程，因此该类型的化合物的作用必须集中在特定的位置，在所述位置血管发生和血管生长确实是不想要的，这使得恰当地靶向或递送成为该种治疗方法的至关重要的问题。

因此本发明的目的是提供用于治疗分别涉及不想要的血管的生长和血管发生的疾病的其他方法。

“小干扰RNA”(siRNA)是指减少或沉默（阻止）其内源胞内对应物的基因/mRNA的表达的RNA分子。所述术语理解为包括“RNA干扰”(RNAi)。RNA干扰(RNAi)是指哺乳动物中由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(Fire等人,1998,Nature 391,806)。植物中对应的过程通常称为特异性转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中也称为压抑（quelling）。RNA干扰反应的特征可以是包含s iRNA的核酸内切酶复合物，所述核酸内切酶复合物通常称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有和siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的断裂。靶RNA的断裂可在和s iRNA双链体的反义链互补的区域的中部发生(Elbashir等人2001,Genes Dev.,15,188)。关于有关这些术语和提出的机制的最近的信息，参见Bernstein E.,DenliAM.,Hannon GJ:The rest is silence.RNA.2001Nov;7(11):1509-21;和Nishikura K.:A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a keycatalyst.Cell.2001 Nov 16;107(4):415-8。可用于本发明的siRNA分子的实例提供于表A-C中。

近年间，RNAi已作为用于失活基因的最有效的方法中的一种方法出现(Nature Reviews,2002,v.3,p.737-47;Nature,2002,v.418,p.244-51)。作为方法，其基于ds RNA种类进入特定蛋白复合物的能力，在所述复合物中其被靶向互补的细胞RNA并特异性地降解其。更具体地，dsRNA被III型RNA酶(DICER、Drosha等)降解成短(17-29bp)抑制性RNA(siRNA)(Nature,2001,v.409,p.363-6;Nature,2003,.425,p.415-9)。这些片段和互补的mRNA被特异性RISC蛋白复合物识别。整个过程通过靶mRNA的核酸内切酶切割而结束(NatureReviews,2002,v.3,p.737-47;Curr Opin Mol Ther.2003Jun;5(3):217-24)。

关于针对已知的基因设计和制备siRNA的方法的公开内容参见例如Chalk AM,Wahlestedt C,Sonnhammer EL.Improved and automatedprediction of effective siRNA Biochem.Biophys.Res.Commun.2004Jun 18;319(1):264-74;Sioud M,Leirdal M.,Potential design rulesand enzymatic synthesis of siRNAs，Methods MolBiol.2004;252:457-69;Levenkova N,Gu Q,Rux JJ.:Gene specificsiRNA selector Bioinformatics.2004Feb 12;20(3):430-2.和Ui-TeiK,Naito Y,Takahashi F,Haraguchi T,Ohki-Hamazaki H,Juni A,UedaR,Saigo K.,Guidelines for the selection of highly effective siRNAsequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic AcidsRes.2004 Feb 9;32(3):936-48。也参见Liu Y,Braasch DA,Nulf CJ,Corey DR.Efficient and isoform-selective inhibition of cellulargene expression by peptide nucleic acids Biochemistry,2004Feb24;43(7):1921-7。也参见PCT publications WO 2004/015107(Atugen)和WO 02/44321(Tuschl等人),和关于经修饰的/更稳定的siRNA的产生也参见Chiu YL,Rana TM.siRNA function in RNAi:a chemicalmodification analysis,RNA 2003Sep;9(9):1034-48和美国专利5898031和6107094(Crooke)。

已发展了能够在细胞中产生siRNA的基于DNA的载体。所述方法通常包括在细胞中可被有效地加工形成siRNA的短发夹RNA的转录。Paddison等人PNAS 2002,99:1443-1448;Paddi son等人Genes&Dev2002,16:948-958;Sui等人PNAS2002,8:5515-5520;和Brummelkamp等人Science 2002,296:550-553。这些报导描述了产生能够特异性靶向许多内源和外源表达的基因的s iRNA的方法。

关于siRNA的递送，参见，例如，Shen等人(FEBS letters 539:111-114(2003)),Xia等人,Nature Biotechnology 20:1006-1010(2002),Reich等人,Molecular Vision 9:210-216(2003),Sorensen等人(J.Mol.Biol.327:761-766(2003),Lewis等人,NatureGenetics 32:107-108(2002)和Simeoni等人,Nucleic Acids Research31,11:2717-2724(2003)。近年来已将siRNA成功地在灵长类动物中发挥抑制作用；关于更详细内容参见Tolentino等人,Retina 24(1)February 2004pp 132-138。

本发明的siRNA

本发明的siRNA的一般说明

一般地，本发明中所用的siRNA包含含有双链结构的核糖核酸，其中所述双链结构包含第一链和第二链，其中第一链包含连续核苷酸的第一片段且其中所述第一片段至少部分地和靶核酸互补，第二链包含连续核苷酸的第二片段且其中所述第二片段至少部分地和靶核酸相同，其中所述第一和/或所述第二链包含多个在2'位置上具有修饰的经修饰的核苷酸簇，其中在链内每一修饰的核苷酸簇的一侧或两侧是侧翼核苷酸簇，其中形成侧翼核苷酸簇的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或具有和所述经修饰的核苷酸的修饰不同的核苷酸。另外，所述第一链和/或所述第二链可以包含所述多个经修饰的核苷酸，可以包含所述多个经修饰的核苷酸簇。

经修饰的核苷酸簇和/或侧翼核苷酸簇可包含多个核苷酸，其中所述数目选自1个核苷酸至10个核苷酸。关于此处详细说明的任何范围，应当理解各范围公开了用于确定范围的各数字之间的任何单个的整数，包括确定所述范围的所述两个数字。在本情况下，簇因此包含一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸、五个核苷酸、六个核苷酸、七个核苷酸、八个核苷酸、九个核苷酸和十个核苷酸。

所述第一链的经修饰的核苷酸的模式可和所述第二链的经修饰的核苷酸的模式相同，且可和所述第二链的模式对齐。此外，相对于第二链的模式，所述第一链的模式可以偏移一个或多个核苷酸。

上述修饰可选自氨基、氟代、甲氧基、烷氧基和烷基。

可使siRNA的双链结构在一侧或两侧上成为平端。更明确地，可在双链结构的由第一链的5'末端和第二链的3'末端界定的一侧上使双链结构形成平端，或可在由第一链的3'末端和第二链的5'末端界定的一侧上使双链结构形成平端。

此外，两条链的至少一条链可在5'末端具有至少一个核苷酸的突出端；突出端可由至少一个脱氧核糖核苷酸构成。至少一条链任选地也可在3'末端具有至少一个核苷酸的突出端。

siRNA的双链结构的长度通常是大约17至21和更优选地18或19个碱基。此外，所述第一链的长度和/或所述第二链的长度可相互独立地选自大约15至大约23个碱基、17至21个碱基和18或19个碱基的范围。

此外，所述第一链和靶核酸之间的互补性可以是完全的，或第一链和靶核酸之间形成的双链体可包含至少15个核苷酸，其中在形成所述双链结构的所述第一链和靶核酸之间存在一个错配或两个错配。

在一些情况下，第一链和第二链都各自包含至少一个修饰的核苷酸簇和至少一个侧翼核苷酸簇，其中各修饰的核苷酸簇包含至少一个核苷酸，其中各侧翼核苷酸簇包含至少一个核苷酸，将第一链的各修饰的核苷酸簇和第二链上的侧翼核苷酸簇对齐，其中第一链的最末端5'核苷酸是修饰的核苷酸簇的核苷酸，且第二链的最末端3'核苷酸是侧翼核苷酸簇的核苷酸。各经修饰的核苷酸簇可由单一核苷酸组成和/或各侧翼核苷酸簇可由单一核苷酸组成。

此外，在第一链上形成侧翼核苷酸簇的核苷酸可以是未修饰的核苷酸，所述未修饰的核苷酸，相对于形成修饰的核苷酸簇的核苷酸，排列在3'方向，且在第二链上形成修饰的核苷酸簇的核苷酸可以是相对于形成侧翼核苷酸簇的核苷酸以5'方向排列的修饰的核苷酸。

此外，siRNA的第一链可包含8至12个，优选地9至11个修饰的核苷酸簇，且第二链可包含7至11个，优选地8至10个修饰的核苷酸簇。

第一链和第二链可通过环结构连接，所述环结构可以由非核酸聚合物例如聚乙二醇构成。可选择地，环结构可由核酸构成。

此外，可将siRNA的第一链的5'末端连接至第二链的3'末端，或可将第一链的3'末端连接至第二链的5'末端，所述连接可通过通常具有10-2000个核碱基之间的长度的核酸连接体进行。

本发明的siRNA的具体说明

本发明提供了具有下列结构（结构A）的化合物：

5’(N)_x-Z 3’(反义链)

3’Z’-(N’)_y5’(有义链)

其中各N和N’是可在其糖残基上被修饰或不被修饰的核糖核苷酸，而(N)_x和(N’)_y是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡聚物；

其中各x和y是19和40之间的整数；

其中各Z和Z’可存在或不存在，但如果存在，则是dTdT，且共价地附着在其存在的链的3’末端；

和其中(N)_x的序列包含RTP801基因的cDNA的反义序列。

特别地，本发明提供了上面的化合物，其中(N)_x的序列包含一个或多个表A、B和C中所示的反义序列。

特别地，本发明提供了上面的化合物，其中所述共价键是磷酸二酯键，其中x=y,优选地其中x=y=19，其中Z和Z’都不存在，其中至少一个核糖核苷酸在其糖残基中在2’位置被修饰，其中2’位置上的部分是甲氧基(2’-O-甲基)，其中在反义和有义链上对交替的核糖核苷酸进行修饰，其中反义链的5’和3’末端上的核糖核苷酸在其糖残基上被修饰，有义链的5’和3’末端上的核糖核苷酸在其糖残基上被修饰。

特别地，本发明中所用的siRNA是寡核糖核苷酸，其中一条链包含从5’ 至3’具有SEQ ID NOS:3-52或SEQ ID NOS:103-174或SEQ ID NOS: 247-295中所示的序列的连续核苷酸（其是有义链）或其同源物，其中 多个碱基可以被修饰，优选地被2-O-甲基修饰，在所述同源物中，各末 端区域中至多2个核苷酸被改变。

此外，本发明提供了治疗患有呼吸系统病症、眼病、微血管病症或脊髓损伤或疾病的患者的方法，其包括给患者施用以治疗有效量包含上述结构（A）的化合物（具有上述结构中的任一种结构）的药物组合物以治疗患者。此外，本发明提供了使用治疗有效量的上述结构（A）（具有上述结构中的任一种结构）制备用于在患者中促进恢复的药物的用途，所述患者患有呼吸系统病症、眼病、微血管病症或脊髓损伤或疾病。

本发明的另外方面提供了用于治疗此处提到的任一种疾病和病症的、包含上述结构（A）的化合物的药物组合物。

此外，该方面提供了用于治疗此处提到的任一种疾病和病症的、包含两种或更多种上述结构（A）的化合物的药物组合物，其中所述两种化合物可在药物组合物中以可产生相同的或有益的活性的量物理地混合在一起，或共价地或非共价地结合，或可被长度范围在2-100，优选地2-50或2-30个核苷酸范围内变化的核酸连接体连接在一起。因此这些siRNA分子由此处描述的双链核酸结构组成，其中选自表A-C，优选地选自表A，ID Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50的两种siRNA序列，共价地或非共价地结合或通过连接体连接起来，形成串联siRNA分子。这些包含2种siRNA序列的串联siRNA分子在长度上通常为38-150个核苷酸，更优选地长度为38或40至60个核苷酸，如果串联分子包含超过2种siRNA序列则相应地具有更长的长度。也涉及由两种或更多种更长的序列（所述序列编码通过细胞内加工产生的siRNA）组成的更长的串联分子，如长dsRNA，编码两种或更多种shRNA的串联分子也是如此。这些串联分子也被认为是本发明的部分，下面提供关于其的其他信息。

所述组合或串联结构具有有利方面，即各siRNA的毒性和/或脱靶（off-target）效应被减少至最小，而功效得到增加。

特别地已这样修饰实施例中所用的siRNA，使得2’O-Me基团存在于反义链的第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19核苷酸上，其中完全相同的修饰，即2’-O-Me基团存在于有义链的第2、4、6、8、10、12、14、16和18核苷酸上。此外，要指出的是在本发明的这些特定的核酸的情况下，第一片段和第一链相同且第二片段和第二链相同，这些核酸也是平端的。磷酸化siRNA，但想象可更容易地大规模制备未磷酸化的形式且发现称为REDD-14NP的所述未磷酸化的REDD14在CNV模型中和REDD-14具有相同的生物学活性（参见实施例6）。用于实施例6-8的实验中的该siRNA的序列是REDD14的序列，即具有内部参照号（internalreference No.）14的序列(参见表A)。

寡核苷酸的末端区域是指19聚体序列（下面的表A和B）中的碱基1-4和/或16-19和指21聚体序列（下面的表C）中的碱基1-4和/或18-21。

此外，本发明中的siRNA是寡核糖核苷酸，其中一条链包含具有（从5’至3’）SEQ ID NOS:53-102或SEQ ID NOS:175-246或SEQ ID NOS:296-344(反义链)所示的序列的连续核苷酸或其同源物，在所述同源物中各末端区域中至多2个核苷酸的碱基被改变。

因此，在特定的方面，寡核苷酸包含双链结构，其中该双链结构包含第一链和第二链，其中第一链包含连续核苷酸的第一片段，第二链包含连续核苷酸的第二片段，其中第一片段和编码基因RTP801的核酸互补或相同，其中所述第二片段和编码RTP801的核酸序列相同或互补。所述第一片段包含至少14个核苷酸，优选地至少18个核苷酸和更优选地19个核苷酸或至少21个核苷酸。在实施方案中所述第一片段包含大约14至40个核苷酸，优选地大约18至30个核苷酸，更优选地大约19至27个核苷酸和最优选地大约19至23个核苷酸。在实施方案中，所述第二片段包含大约14至40个核苷酸、优选地大约18至30个核苷酸、更优选地大约19至27个核苷酸和最优选地大约19至23个核苷酸或大约19至21个核苷酸。在实施方案中，第一片段的第一个核苷酸对应于编码RTP801的核酸序列的核苷酸，其中所述第一片段的最后一个核苷酸对应于编码RTP801的核酸序列的核苷酸。在实施方案中第一片段包含寡核苷酸的至少14个连续核苷酸的序列，其中该寡核苷酸选自SEQ.ID.Nos.3-344，优选地选自具有表A中的系列号14、22、23、25、27、39、41、42、49和50中的任一系列号的序列的寡核苷酸。另外本发明中所用的s iRNA分子的说明可提供寡核糖核苷酸，在所述寡核糖核苷酸中，二核苷酸dTdT共价地附着至3’末端，和/或在至少一个核苷酸中，糖残基被修饰，可能具有包括2’-O-甲基修饰的修饰。此外，可用选自-H-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-NH₂和F的基团或部分取代2’OH基。此外，上面公开的本发明的优选的化合物可被磷酸化或非磷酸化。

此外，本发明所用的siRNA可以是寡核糖核苷酸，其中在交替的核苷酸中被修饰的糖位于两条链中。特别地，所述寡核糖核苷酸可包含有义链中的一条链，在所述链中末端5’和3’核苷酸中的糖未被修饰，或包含反义链中的一条链，在所述链中末端5’和3’核苷酸中的糖被修饰。

此外，用于本发明的其他核酸包含SEQ.ID.NO.3至344中的任一个的至少14个连续核苷酸，更优选地在由上述第一片段和第二片段构成的双链结构的任一末端包含14个连续核苷酸碱基对。本领域技术人员将理解，给定本发明的核酸的可能长度，特别是形成本发明的该核酸的单个片段的潜在长度，相对于SEQ ID NO:1中详述的RTP801的编码序列，在各侧可能发生一些偏移，其中这些偏移在两个方向上可至多1、2、3、4、5和6个核苷酸，由此所产生的双链核酸分子也将在本发明的范围之内。

本发明的另外的方面涉及包含双链结构的功能性核酸，其中该双链结构包含

第一链和第二链，其中

所述第一链包含连续核苷酸的第一片段，所述第二链包含连续核苷酸的第二片段，其中

所述第一片段和编码RTP801的核酸序列互补或相同，其中所述第二片段和编码RTP801的核酸序列相同或互补。

在实施方案中，所述核酸下调RTP801，其中RTP801的下调选自RTP801功能的下调、RTP801蛋白的下调和RTP801mRNA表达的下调。

在实施方案中，所述第一片段包含至少14个核苷酸，优选地至少18个核苷酸和更优选地19个核苷酸。

在实施方案中，所述第一片段包含大约14至40个核苷酸，优选地大约18至30个核苷酸，更优选地大约19至27个核苷酸和最优选地大约19至23个核苷酸。

在实施方案中，所述第二片段包含大约14至40个核苷酸，优选地大约18至30个核苷酸，更优选地大约19至27个核苷酸和最优选地大约19至23个核苷酸。

在实施方案中，所述第一片段的第一个核苷酸对应于编码RTP801的核酸序列的核苷酸，其中第一片段的最后一个核苷酸对应于编码RTP801的核酸序列的核苷酸。

在实施方案中，一个片段包含核酸序列的至少14个连续核苷酸的序列，其中该核酸序列选自表A-C中公开的序列，优选地选自SEQ.ID.NOs 53、66、67、72、73、74、75、76、77、91、92、93、94、96、101和102，更优选地选自SEQ.ID.Nos 66、75、79、91、94、101和102，最优选地选自SEQ.ID.Nos 66、74、75和79。

在实施方案中，另一个片段包含核酸序列的至少14个连续核苷酸的序列，其中该核酸序列选自表A-C中公开的序列，优选地选自SEQ.ID.NOs.3、16、22、23、24、25、26、27、29、41、42、43、44、45、46、51和52，更优选地选自SEQ.ID.Nos.16、24、25、29、41、44、51和52，最优选地选自SEQ.ID.Nos 16、24、25和29。

在实施方案中

第一片段具有SEQ.ID.NO.53的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.3的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.66的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.16的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.67的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.17的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.72的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.22的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.73的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.23的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.74的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.24的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.75的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.25的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.76的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.26的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.77的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.27的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.79的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.29的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.91的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.41的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.92的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.42的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.93的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.43的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.94的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.44的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.95的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.45的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.96的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.46的序列;

第一片段具有SEQ.ID.NO.101的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.51的序列;和

第一片段具有SEQ.ID.NO.102的序列且第二片段具有SEQ.ID.NO.52的序列。

在实施方案中所述第一片段具有选自SEQ.ID.NO.53、66、72、73、74、75、76、77、79、91、92、93、94、95、96、101和102的核酸序列。

要理解，当术语“第一”和“第二”片段和本发明的核酸一起使用时，只是为了方便地使用其，且被描述为具有第一片段（具有序列X）和第二片段（具有序列Y）的本发明的任何核酸分子也可同样地被描述为具有第一片段（具有序列Y）和第二片段（具有序列X），只要理解在反义链中包含一个片段，所述片段必须对RTP801基因的编码序列的部分是反义的，且在有义链中包含另一个片段，所述片段必须和反义链互补（尽管不是100%的互补），所有内容都根据此处提供的定义和说明书。

在实施方案中，所述第一和/或第二链在3’末端包含至少一个突出的核苷酸，所述核苷酸和编码RTP801的核酸序列的对应的核苷酸互补或相同。

在实施方案中，第一和/或第二链在3’末端包含1至15个突出的核苷酸，优选地所述第一和/或第二链在3’末端包含1至10个突出的核苷酸，更优选地所述第一和/或第二链在3’末端包含1至5个突出的核苷酸，最优选地所述第一和/或第二链在3’末端包含1至2个突出的核苷酸。

在实施方案中，所述第一和/或第二链包含至少一个突出的核苷酸，所述核苷酸不同于编码RTP801的核酸序列的对应核苷酸。

在实施方案中，第一链包含两个突出的核苷酸，所述核苷酸不同于编码RTP801的核酸序列的对应核苷酸。

在实施方案中第一链只由第一片段组成。

在实施方案中第二链只由第二片段组成。

在实施方案中第一片段和/或第一链包含核糖核苷酸。

在实施方案中第二片段和/或第二链包含核糖核苷酸。

在实施方案中第一片段和/或第二链由核糖核苷酸组成。

在实施方案中修饰一些或所有核苷酸。

在优选的实施方案中，该修饰涉及核苷酸的核碱基部分，涉及核苷酸的糖部分和/或涉及核苷酸的磷酸部分。

在更优选的实施方案中，修饰是糖部分的修饰且修饰是在2’位置上的修饰，其中2’OH基被选自-H-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-NH₂和-F的基团或部分取代。

在实施方案中，修饰是核碱基部分的修饰，所述修饰或修饰的核碱基选自肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫基腺嘌呤、8-硫基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫基鸟嘌呤、8-硫基烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤、其他氮杂和脱氮腺嘌呤、其他氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基脲嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

在实施方案中，修饰是磷酸部分的修饰，其中经修饰的磷酸部分选自包含硫代磷酸酯的基因。

在实施方案中，所述第一片段和/或第二片段包含在2’位置上具有修饰的多个经修饰的核苷酸簇，其中在所述片段内各修饰的核苷酸簇在一侧或两侧连接侧翼核苷酸簇，其中形成侧翼核苷酸簇的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或具有和所述修饰的核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸。

在优选的实施方案中，第一片段和/或第二片段由核糖核苷酸组成。

在更优选的实施方案中，第一和第二片段包含多个修饰的核苷酸簇。

在实施方案中，第一片段包含所述多个修饰的核苷酸簇。

在实施方案中，第二片段包含所述多个修饰的核苷酸簇。

在实施方案中，各修饰的核苷酸簇和/或各侧翼核苷酸簇包含多个核苷酸，其中所述数目选自1个核苷酸至10个核苷酸。

在实施方案中，第一片段包含修饰的核苷酸的第一模式，第二片段包含修饰的核苷酸的第二模式。

在实施方案中，所述第一模式和所述第二模式相同。

在另一个实施方案中，所述第一模式和所述第二模式对齐（align）。

在优选的实施方案中，相对于第二模式，第一模式偏移一个或多个核苷酸。

在实施方案中，各修饰的核苷酸簇由一个修饰的核苷酸构成，各侧翼核苷酸簇由一个修饰的核苷酸或具有和所述修饰的核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸构成。

在优选的实施方案中，修饰的核苷酸在2’位置具有-OMe基。

在优选的实施方案中，侧翼核苷酸是具有2’OH基的核糖核苷酸。

在实施方案中，所述第一片段在5’末端始于修饰的核苷酸且所述片段的每隔一位的核苷酸也是修饰的核苷酸，而第二核苷酸始于5’末端且每隔一位的核苷酸是未修饰的核苷酸或具有和所述修饰的核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸。

在实施方案中，所述第一片段对于编码RTP801的编码序列是以反义方向排列的。

本发明的其他方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含本发明的第一方面的核酸和/或本发明的第二方面的载体和优选地药物可接受的媒介物，所述组合物任选地用于全身性施用或局部施用。

在实施方案中，组合物用于治疗疾病，其中所述疾病选自肿瘤疾病。

在另外的方面，通过预防和/或治疗需要该预防和/或治疗的患者的方法解决本发明背后的问题，所述方法包括施用本发明的核酸和/或本发明的载体和/或本发明的药物组合物。

在其他实施方案中，使用本发明的核酸和/或本发明的载体生产药物。所述药物可用于预防和/或治疗疾病，其中该疾病选自肿瘤疾病。所述肿瘤疾病可选自实体瘤、转移性肿瘤，包括PTEN阴性肿瘤、具有抗药性的肿瘤和其中RTP801抑制可用于致敏的肿瘤。此外，所述肿瘤疾病可以是晚期肿瘤疾病，或可以涉及为肿瘤抑制剂阴性的细胞；所述肿瘤抑制剂可以是PTEN。

通过用于设计或筛选适合于下调RTP801的核酸的方法解决本发明的其他方面，所述方法包括下列步骤：

a)设计或筛选适合于下调RTP801的核酸；

b)评估本发明的上述方面的任一方面的核酸的缺陷；和

c)比较步骤a)的核酸的效应和步骤b)的核酸的效应。

在实施方案中，所述效应是RTP801的下调。

本发明的其他方面是将本发明的核酸用作致敏剂，特别是在疾病的治疗中用作致敏剂，其中该疾病优选地选自肿瘤，更特别地对使用化学疗法和/或放射疗法的治疗具有抗性的肿瘤。此处公开了本发明的核酸可用作其的致敏剂的其他疾病。

该应用公开了，包含对于RTP801是特异性的双链结构的核酸是抑制血管发生/血管系统的生长以及血管渗漏（两者都来自现有的血管系统和来自正生长的血管系统）的合适的方法。此外，该应用公开了（不受理论所束缚）作为应激诱导型蛋白（由低氧、氧化应激、热应激、ER应激诱导的）的RTP801是在细胞对能量不平衡的反应的细调中起作用的因子。因此，通过该双链核酸导致的RTP801的抑制适合用于治疗任何这样的疾病，即在所述疾病（例如伴随正常细胞的死亡的疾病）中应当从由于应激条件引起的细胞凋亡中拯救细胞或在所述疾病（例如肿瘤细胞）中应当杀死由于RTP801表达的改变导致的适合应激条件的细胞。在后一种情况中，在通过该双链核酸抑制RTP801后，具有在含氧低的细胞，更特别地含氧低的癌细胞中抗细胞凋亡功能的存活因子被无效，从而使得细胞缺乏RTP801介导的保护作用，从而被驱入细胞凋亡。当其他细胞凋亡促进因子存在时，这又可发生。这些其他的细胞凋亡促进因子包括化学疗法和放射疗法等。换句话说，本发明的双链核酸单独在癌症治疗（单一疗法）中可以是有效的并且也可作为补充治疗。

这些双链结构包括第一和第二链，其中所述第一链包含连续核苷酸的第一片段，所述第二链包含连续核苷酸的第二片段，其中所述第一片段对于编码RTP801的核酸序列是互补的或相同的，其中第二片段对于编码RTP801的核酸序列是相同的或互补的。特别地使用RTP801作为该类型的双链核酸的靶，从而也可能在分别涉及血管系统的生长和发育以及血管发生的级联反应中立即寻靶，从而以和VEGF抑制剂例如VEGF抗体所使用的途径相比不同的方法寻靶。不希望受任何理论束缚，本发明者假定本发明的核酸可在提供背景的、参与任何疾病或经观察和所述疾病关联的细胞中发挥其功能，在所述疾病中，不想要的、特别是低氧诱导的血管发生和/或血管系统的生长或发育发生。RTP801基因敲除小鼠在非低氧条件下不展现任何和野生型小鼠不同的表型的发现支持该理解。只有在疾病条件（例如在肿瘤的生长）中观察到的低氧的诱导时，RTP801相关性基因敲除才导致和在遭受该类疾病的人中观察到的病症相似的病症。

要理解，本发明的核酸优选地是功能性核酸。如此处所用的，术语功能性核酸优选地是指其功能不同于在细胞中作为任何hnRNA、mRNA或任何其他转录产物的模板的活性核酸，其中分别地将所述hnRNA、mRNA或任何其他转录产物或本发明的核酸接受翻译过程，优选地细胞翻译过程，从而产生具有生物学活性的RTP801蛋白。已承认此处优选地使用的功能性核酸能够减少靶核酸的表达。更优选地，该减少基于靶基因的转录后基因沉默过程。更优选地该减少基于RNA干扰。功能性核酸的最优选的形式是siRNA分子或具有和siRNA分子的作用相同的作用的任何其他分子。所述其他分子选自siRNA、合成的siRNA、shRNA和合成的shRNA。如此处所用的，siRNA可额外地包含表达载体衍生的siRNA，其中所述表达载体在优选的实施方案中是病毒例如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。如此处所用的，shRNA优选地是指短发夹RNA。可通过合成制备该shRNA或可使用载体编码的表达系统，优选地使用RNA聚合酶III启动子产生所述shRNA。因此承认，本发明的功能性核酸针对此处也优选地称为靶的RTP801和作为靶核酸的编码所述靶的核酸。

如此处优选地使用的，本发明的核酸双链结构包括任何双链结构，其中该双链结构优选地由第一片段和第二片段（由具有基本设计的核酸提供）产生。双链结构可包含一个或几个错配。通过Watson-Crick碱基配对和/或Hoogsteen碱基配对和/或类似的碱基配对机制形成该双链结构。基于本发明的核酸的基本设计，优选地，一个片段对于编码RTP801的核酸序列或其部分是以反义方向排列的，而另一个片段对于编码RTP801的核酸序列或其部分是以有义方向排列的。因为该原因，一个片段和编码RTP801的核酸序列或其部分互补，而另一片段和RTP801的核酸序列或其部分相同。因此，承认，术语相同，当然也是指部分相同，其中所述相同，表示为同源性，是至少80%、优选地90%、更优选地95%、96%、97%、98%、99%和100%的同源性。和相同的定义相似，互补可按照同源性进行定义，其中当根据Watson-Crick配对原则互补链可被翻译成相同的链时，所述同源性和相同的意思相同。在可选择的实施方案中，一个片段和编码RTP801的核酸序列或其部分相同，而另一片段和编码RTP801的核酸序列或其部分互补。

在优选的实施方案中，本发明的核酸具有下调RTP801的功能。RTP801功能的下调通过减少蛋白水平和/或mRNA水平上的表达水平来发生，其中参照本发明的核酸未被施用或未发挥功能活性的条件下的表达，该表达水平的减少，优选地在蛋白水平上的减少，可低至5%和高至100%。该条件优选地是表达系统（优选地RTP801的表达系统）的条件或和所述表达系统中存在的条件一样。该表达系统优选地是可以是体外翻译系统的翻译系统，更优选地是细胞、器官和/或生物。更优选地所述生物是多细胞生物，更优选地是哺乳动物，其中所述哺乳动物优选地选自人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、绵羊、奶牛、马、牛和猪。关于下调，承认所述下调可以是时间的函数，即下调效应不一定在本发明的核酸施用后或功能激活后立即被观察到，但可在时间和空间（即在不同的细胞、组织和/或器官）上被延迟。该延迟可在5%-100%、优选地10至50%的范围内变化。本领域技术人员将承认对于更长时间的5%减少可能和更短时间的100%减少一样有效。本领域技术人员也将承认，根据本应用的技术教导，该延迟强烈地依赖于所用的特定的功能性核酸以及靶细胞群体，从而最终依赖于要治疗和/或预防的疾病。就此而言，在更长的时间期间内5%的减少可能和在更短的时间期间内100%的减少一样有效。本领域技术人员也将承认，延迟可在上述任何水平上发生，即功能的延迟（其中该功能是由RTP801展示的任何功能），蛋白表达的延迟或mRNA表达水平的延迟。

在优选的实施方案中，第一片段包含至少14个核苷酸、优选地14个连续核苷酸。本领域技术人员将承认第一片段应当具有一定的长度，所述长度适合于使得能够特异性靶向编码RTP801的核酸序列和更特别地靶向其中RTP801的表达要被减少的翻译系统中存在的编码RTP801的核酸。此外不希望受本发明的核酸的作用模式或任何模型的束缚，本发明的核酸和编码RTP801的核酸序列之间，优选地在转录水平上即在从各编码RTP801的核酸序列产生mRNA上似乎存在相互作用。由于本发明的核酸和翻译系统的基因组或转录组中包含的序列可能相同或互补的原因，因此所述第一片段的长度应当确保，在假定编码RTP801的核酸和本发明的核酸的一条链之间的一些类型的碱基配对事实上发生的情况下，只有编码RTP801的序列但无其他编码序列，优选地无基因组或转录组的其他必需编码序列被该碱基配对靶向。通过该长度，可减少和完全消除脱靶效应的发生。为增加该类型的特异性靶向RTP801和编码其的核酸的严格性，所述第一片段优选地具有至少18或19个核苷酸的长度。第一片段的长度的上限优选地少于50个核苷酸，然而，长度可明显地更长且可包含100、200或甚至500个核苷酸或它们之间的任何长度。除此以外，本领域技术人员将偏向于具有相当短的片段，特别在化学合成本发明的核酸的情况下，因为序列越短，其合成的时间将越短且消耗的物质将越少，从而不正确核苷酸插入各序列的比例越低。关于固定第一片段的长度要考虑的另一个因素是这样的事实，即通常在超过50或更多核苷酸时，可观察到不确定的干扰素反应。其依赖于要治疗的特定病症，依赖于该类型的不确定性干扰素反应是否是可耐受的。例如，如果干扰素反应和/或干扰素基因的表达可被限制在病原性细胞内，那么干扰素反应可被耐受。

考虑到该因素，第一片段的更优选的长度是大约14至40个核苷酸、18至30个核苷酸、19至27个核苷酸、21至25个核苷酸和19至23个核苷酸。

和上述关于第一片段的考虑相同的考虑适用于第二片段，所述第二片段因此可包含和此处描述的第一片段的长度相同的任何长度。第一片段的长度和第二片段的长度不同也在本发明的范围之内，然而，优选地两个片段都具有相同的长度。

根据核酸的基本设计，所述第一片段和所述第二片段分别是本发明的核酸的第一链和第二链的部分。要承认的是，在任一末端，即在5’和3’末端，第一链和/或第二链可以任何组合包含一个或几个核苷酸，优选地是额外的核苷酸。

因此承认，超出对应于各自链的片段的末端的单个链的那些核苷酸可分别用于进一步贡献所述链的互补性和同一性，从而对特异性靶向编码RTP801的核酸序列作出贡献。

要承认的是，基本上，基于此处提供的技术教导，本发明的核酸可靶向核酸序列的任何部分，所述核酸序列编码RTP801，优选地编码其中RTP801的表达要被减少的翻译系统中的RTP801。在这个范围内，本发明包括具有此处定义的特征的任何核酸，其中本发明的核酸的互补和相同的链和片段基本上可从编码RTP801的核酸序列的任一核苷酸开始。因此，在本发明的核酸的第一片段和编码RTP801的核酸序列互补，即是其反义链或对其以反义方向排列的条件下，所述片段的第一个核苷酸，即最5’末端的核苷酸，对应于，即对准编码RTP801的序列在3’末端上的最末端核苷酸。在其他实施方案中，该最5’末端的核苷酸对应于编码RTP801的序列的倒数第二位核苷酸并依此类推直至达到假定反义片段的长度仍然允许本发明的核酸的反义链和编码RTP801的核酸序列互补的最后位置为止。在这个范围内，本发明的任何核酸在本发明的范围之内，所述核酸可通过从编码RTP801的核酸序列的最5’末端核苷酸开始扫描其并覆盖本发明的核酸的基本设计并获得本发明的该核酸的特征来产生。相同的考虑适用于此处公开的实施方案，其中本发明的核酸的互补性和同一性不仅分别由第一片段和第二片段提供，而且该互补性和同一性也包括一个或多个分别超出所述第一片段和第二片段的核苷酸（从而分别为所述第一片段和第二片段的部分）。

此处公开的本发明的不同核酸中，具有内部参考编号14、22、23、25、27、39、41、42、49和50(参见表A)的核酸是特别优选的。因此，要指出的是可用于人和动物模型例如大鼠和/或小鼠的本发明的核酸是特别有用的。本发明的这些核酸的令人吃惊的有利方面在于其在人和动物模型中都是有效的事实，这意味着在动物模型中获得的试验结果可直接从动物模型转移至人类且更特别地不必对人序列进行任何改变，这些改变在设计本发明的核酸以使其包含物种之间，更特别地用于动物模型试验的动物和作为最终优选的生物的人或患者之间不同的序列的情况下成为必需的。更优选地，这些核酸也具有实施例中描述的修饰模式。

然而，SEQ.ID.NOs.3、16-17、22-27、29、41-46、51-53、66-67、72-77、79、91-96和101-102的序列中的任何序列和导致具有内部参考编号14、22、23、25、27、39、41、42、49和50的本发明的核酸分子的各自组合只是部分地包含于本发明的其他核酸中，这也在本发明的范围之内。优选地，本发明的其他核酸包含SEQ.ID.NO.s 3、16-17、22-27、29、41-46、51-53、66-67、72-77、79、91-96和101-102的至少14个连续核苷酸，更优选地在由前面的表中所示的第一片段和第二片段组成的双链结构的任一末端上包含至少14个连续核苷酸碱基对。本领域技术人员将理解，给定本发明的核酸，特别是形成本发明的该核酸的单个片段的潜在长度，对于各侧可能存在相对于RTP801的编码序列的一些偏移，其中所述偏移在两个方向上可至多1、2、3、4、5和6个核苷酸，且其中所产生的双链核酸分子应当也在本发明的范围内。

在本发明的优选的实施方案中，所述第一片段和所述第一链具有相同的长度。同样，优选地，所述第二链和所述第二片段具有相同的长度，其中更优选地所述第一片段和所述第二片段具有相同的长度。在其他更优选的实施方案中，第一链只包含第一片段且第二链只包含第二片段。在更优选的实施方案中，第一片段从而第一链，和第二片段从而第二链都不包含突出端。换句话说，本发明的双链核酸是平端，优选地在本发明的核酸的双链结构的各末端是平端也在本发明的范围之内。可通过本发明的核酸的任何其他实施方案，特别是其中本发明的核酸具有修饰模式，更优选地具有此处描述的修饰模式的实施方案来获得该平端结构。

在其他方面，本发明的核酸因此具有在本发明的核酸的双链结构的两个末端都提供平端的基本设计。然而，存在突出部分，即从双链结构突出的一个或多个核苷酸的片段也在本发明的范围之内。所述突出部分原则上可在反义链的5’末端，在反义链的3’末端，在有义链的5’末端和/或有义链的3’末端。要指出的是，实现所述选择的任一单个选择以及其任何组合在本发明的范围之内。更优选的是这样的组合，其中突出部分位于反义链的3’末端和位于有义链的3’末端。突出部分在反义链的5’末端和有义链的5’末端也在本发明的范围之内。此外，突出部分只位于双链结构的反义链上，更优选地位于双链结构的反义链的3’末端上也在本发明的范围之内。

关于突出部分，要指出的是，突出部分加上片段优选地形成链，且此处的片段提供的长度也用于这些实施方案。单个的突出部分可，不依赖于其位置，由至少一个核苷酸构成。然而，单个突出部分可包含多至10个核苷酸且优选地长度为两个核苷酸。在所述第一链和所述编码RTP801的核酸序列互补且突出部分位于反义链的3’或5’末端的情况下，形成突出部分的各核苷酸也和编码RTP801的核酸序列互补，或在所述第一链和编码RTP801的核酸序列相同的情况下，突出部分和编码RTP801的核酸序列相同。相同的考虑适用于位于本发明的核酸的基本设计的第二片段的任何突出部分，其中承认第二片段上的突出部分设计可不依赖于第一片段的突出部分的设计。

形成突出部分的核苷酸和编码RTP801的核酸序列的对应核苷酸既不互补也不同一也在本发明的范围之内。如此处所用的，且优选地在该实施方案中，“对应”表示在片段的5’末端和/或3’末端之后的各核苷酸，所述核苷酸在编码RTP801的核酸上具有核苷酸对应物。

优选地，第一链在其3’末端包含2个核苷酸，优选地脱氧核糖核苷酸和更优选地两个TT和/或在第二链的3’末端也存在该类型的核苷酸，其中更优选地第一片段和第二片段的长度是19个核苷酸。因此所述链由所述片段和所述突出部分组成。在该实施方案中，双链结构由19个碱基对和在单个片段的3’末端的各末端上的两个核苷酸的突出部分组成。

在优选的实施方案中，第一片段和/或第一链包含核糖核苷酸，其中特别优选地第一片段全部由核糖核苷酸组成。相同的考虑分别用于第二片段和第二链。然而，与此有关的是，在优选的实施方案中修饰第一片段和第二片段的各核苷酸和任一核苷酸。相同的考虑分别用于第一链和第二链。特别地，末端核苷酸，无论其是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，可具有可被这样修饰的OH基。该OH基可来源于核苷酸的糖部分、更优选地在5’OH基的情况下来自5’位置和/或在3’OH基的情况下来自3’位置，或来自附着至各末端核苷酸的糖部分的磷酸基。磷酸基原则上可附着至核苷酸的糖部分的任何OH基。优选地，在游离5’OH基的情况下磷酸基附着至糖部分的5’OH基和/或在游离3’OH基的情况下附着至糖部分的3’OH基，但仍提供此处称为游离5’或3’OH基的基团。

如此处所用的，对于RNAi的设计的任何策略或此处公开的RNAi的任何实施方案，术语末端修饰表示被加入至第一和/或第二链的最5’或3’核苷酸分子的化学实体。该末端修饰的实例包括，但不限于，3’或5’磷酸、倒置的(脱氧)脱碱基物、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸、硫酯(thioate)、C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃；杂环烷基;杂环烷芳基;氨烷基氨基;聚烷基氨基或取代甲硅烷基，如描述于欧洲专利EP 0586520B1或EP 0618925B1。

如此处所用的，烷基或包含“烷基”的任何术语优选地表示包含1至12个，优选地1至6个和更优选地1至2个C原子的任何碳原子链。

其他末端修饰是生物素基团。该生物素基优选地可附着至第一和/或第二链的最5’末端或最3’末端或两个末端。在更优选的实施方案中，生物素基团被偶联至多肽或蛋白。多肽或蛋白通过其他上述末端修饰的任一种末端修饰附着也在本发明的范围之内。多肽或蛋白可为本发明的核酸分子提供其他特征。除其他以外，多肽或蛋白可用作另一种分子的配体。如果所述其他分子是受体，那么受体的功能和活性可通过结合配体来激活。受体可显示内化活性，所述活性使得能够有效地转染配体结合的本发明的核酸分子。配体被偶联至发明的核酸分子的实例是VEGF且对应的受体是VEGF受体。

在下列的表1中呈现了本发明的具有不同种类的末端修饰的RNA i的各种可能的实施方案。

表1:本发明的干扰核糖核酸的各种实施方案

此处描述的各种末端修饰优选地位于本发明的核酸的核苷酸的核糖部分。更明确地，所述末端修饰可附着至或取代核糖部分的OH基中的任一OH基，所述OH基包括，但不限于2’OH、3’OH和5’OH位置，前提是这样修饰的核苷酸是末端核苷酸。倒置的脱碱基物是核苷酸，即不具有核碱基部分的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该种化合物描述于Sternberger,M.,Schmiedeknecht,A.,Kretschmer,A.,Gebhardt,F.,Leenders,F.,Czauderna,F.,Von Carlowitz,I.,Engle,M.,Giese,K.,Beigelman,L.&Klippel,A.(2002).Antisensz Nucleic Acid DrugDev,12,131-43等。

上述的末端修饰中的任一种可用于表1中描述的RNAi的各种实施方案；要指出的是上述5’末端修饰通常只存在于siRNA分子的有义链中。

其他修饰可涉及单个核苷酸的核碱基部分，糖部分或磷酸部分。

可这样修饰核碱基部分使得可分别修饰腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及胸苷和尿嘧啶的衍生物。特别优选的修饰的核碱基选自肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代的鸟嘌呤、其他氮杂和脱氮腺嘌呤、其他氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

在另一个优选的实施方案中，核苷酸的糖部分被修饰，其中该修饰优选地分别在核苷酸的核糖和脱氧核糖部分的2’位置。更优选地，2’OH基被选自氨基、氟、烷氧基和烷基的基团或部分取代。优选地，烷氧基是甲氧基或乙氧基。优选地烷基也指甲基、乙基、丙基、异丁基、丁基和异丁基。更优选地，无论何种修饰的类型，所述核苷酸优选地是核糖核苷酸。

磷酸部分的修饰优选地选自硫代磷酸酯。

本领域技术人员承认，由多个核苷酸构成的本发明的核酸可由通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键或其组合连接的核苷酸沿着单条链和片段的核苷酸序列的长度形成。

所用的核苷酸的其他形式事实上可以是描述于国际专利申请WO03/070918的siNA等。

分别形成本发明的核酸的第一片段和第一链的核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，其中单个修饰的核苷酸具有优选地为此处公开的修饰的修饰。除了特定的修饰外，修饰可以是或包含一些种类的标记，其中所述标记选自化学发光标记、荧光标记和放射标记。这些种类的标记对于本领域技术人员来说是已知的且描述于例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland,1998中。从而本发明的标记的核酸也可用于诊断目的或用于监测作用的位点和用于优选地涉及此处公开的任何疾病的任何治疗的分期。

在优选的实施方案中，修饰本发明的核酸使有义片段或链中的嘧啶核苷酸是2’O-甲基嘧啶核苷酸和，额外地或可选择地，使有义片段或链中的嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸。在其他实施方案中存在于有义片段或有义链中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸。

在可选择的实施方案中，所述修饰不基于核苷酸的化学(即所述修饰依赖于要被修饰的核苷酸是嘌呤核苷酸还是嘧啶核苷酸)，但主要基于单个核苷酸在本发明的核酸的基本设计的总体双链结构中的空间排布。

更明确地，第一链和第一片段分别地，或第二链和第二片段分别地显示分别形成所述片段和链的核苷酸的修饰的空间模式。

首先关注第一片段，存在修饰的核苷酸簇和未修饰的核苷酸簇的模式。这些未修饰的核苷酸簇在此处也称作侧翼核苷酸簇。更优选地，所述模式由修饰的核苷酸簇和未修饰的核苷酸簇构成。更优选地，所述模式是有规律的模式和更优选地是沿着本发明的核酸的第一片段的长度的交替模式。经修饰的核苷酸簇可由一个或几个修饰的核苷酸和优选地为在2’位置被修饰（即具有在糖部分上的修饰）的核苷酸的核苷酸组成。更优选地，该修饰是2’-O-Me修饰。

未修饰的核苷酸簇可由一个或几个未修饰的核苷酸组成，其中未修饰的核苷酸优选地是核糖核苷酸，或未修饰的核苷酸是具有修饰的核苷酸，其中该修饰和形成修饰的核苷酸簇的核苷酸所显示的修饰不同。更优选地，未修饰的核苷酸是核糖核苷酸。要指出的是，如果未另外指出，术语未修饰的和非修饰的核苷酸可以可互换的方式使用。本发明的核酸的第一片段可始于修饰的核苷酸簇或始于此处定义的非修饰核苷酸簇。然而，优选地第一片段始于修饰的核苷酸簇。最优选地，修饰的核苷酸簇由单个核苷酸组成。关于该实施方案，所述第一片段优选地对编码RTP801的核酸以反义方向排列。对于存在于第一片段上的所有修饰的核苷酸簇，由形成修饰的核苷酸簇的核苷酸显示的修饰都是相同的也在本发明的范围之内。然而，一些修饰的核苷酸簇和存在于第一片段上的一个或几个修饰的核苷酸簇相比，可以具有不同的修饰。

在本发明的核酸的第二链上，也可获得和对于第一片段所描述的模式相同的模式。也可在实施方案中在第二片段上获得和对于第一片段所描述的特征相同的特征，其中优选地，在第二片段相对于编码RTP801的核酸序列以有义方向排列的条件下，本发明的核酸的第二链始于非修饰的核苷酸簇。

包含双链结构的本发明的核酸可包含具有此处描述的修饰模式的第一片段。可选择地，本发明的双链核酸可包含具有上述修饰模式的第二片段。然而，最优选的是本发明的双链核酸由第一片段和第二片段构成，其中第一片段和第二片段具有此处描述的空间修饰模式。

空间修饰模式的特征在两个片段上在修饰的核苷酸簇和非修饰的核苷酸簇的大小和实际使用的修饰的种类方面都相同，这也在本发明的范围之内。优选地，第一片段上的修饰的空间模式发生移位，这使得第一片段上的修饰的核苷酸簇和第二片段上的非修饰的核苷酸簇相对，反之亦然。然而，所述模式正好对齐(align)，即第一片段上的修饰的核苷酸簇和第二片段上的未修饰的核苷酸簇相对且所述第一片段上的未修饰的核苷酸簇和所述第二片段上的非修饰的核苷酸簇相对也在本发明的范围之内。第一片段和第二片段上的修饰的空间模式相互之间相对发生了偏移，这样只有一个片段上的修饰的核苷酸簇的第一部分和另一个片段上的未修饰的核苷酸簇的部分相对，而修饰的核苷酸簇的第二部分和另一个修饰的核苷酸簇相对，仍在本发明的范围之内。此处提供的关于本发明的核酸的片段的空间修饰模式的公开内容也用于本发明的核酸的链。然而，优选地，所述核酸的片段包含所述空间修饰模式且所述链包含这些片段和此处公开的一个或多个突出部分。特别优选地，所述突出部分是反义链或有义链或同时两条链的3’末端上的磷酸基团，其中更优选地所述磷酸基团在反义链和有义链两者的3’末端。在更优选的实施方案中，磷酸基团是此处定义的磷酸基团。

本发明的核酸可展示连接所述第一链和第二链的连接体。该连接体优选地是聚合物。所述聚合物可以是任何合成的或天然的聚合物。可能的合成的连接体是PEG或多核苷酸等。优选地设计这样的连接体以使第一片段部分地或完全地折叠回至第二片段上，反之亦然。

最后，本发明的核酸可以是合成的核酸、化学合成的核酸、分离的核酸或来源于任何天然来源的核酸例如，通过重组技术制备的核酸。关于本发明的任何核酸的制备，如本领域技术人员已知的，可在本发明的各核酸的制备之前、期间或之后引入此处公开的任何修饰。

本发明的载体包含本发明的核酸。此外，所述载体可包含以细胞选择的方式（这在本领域是已知的）控制所述核酸的寻靶、表达和转录的元件。所述质粒可包含用于控制异源材料（即本发明的核苷酸）转录的启动子，所述启动子可以是组成型启动子或允许选择性转录的诱导型启动子。可任选地包含可以是获得必需的转录水平所必需的增强子。增强子通常是任何非翻译DNA序列，该序列通过靠近编码序列起作用，从而以顺式作用的方式改变由启动子控制的基础转录水平。该构建体的表达对于本领域技术人员来说是已知的，且可通过例如提供各串联构建体或通过具有分别转录本发明的核酸的第一和第二链以及第一和第二片段的不同启动子来进行。

当制备或表达本发明的核酸时，优选地在体内表达，更优选地在需要本发明的核酸的患者中表达时，该制备或表达优选地使用表达载体，优选地哺乳动物表达载体。表达载体在本领域内是已知的且优选地包括质粒、粘粒、病毒表达系统。优选的病毒表达系统包括，但不限于，腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。

将载体导入细胞或组织的方法在本领域是已知的。通常发现这些方法描述于Sambrook等人,Molecular cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbour Laboratory,New York(1983,1992),或Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland,1998中。

合适的方法包括转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染等。关于本发明，在一个实施方案中，载体的另一个特征是表达限制性特征，例如启动子和调控元件，所述启动子和调控元件分别对于想要的细胞类型是特异性的，从而允许本发明的核酸序列只在提供允许想要的表达的背景时表达。

在其他方面，本发明涉及包含本发明的核酸和/或本发明的载体和任选地药物可接受的媒介物、稀释剂或佐剂或其他载体的药物组合物。优选地，这些媒介物、稀释剂、佐剂和载体是惰性的和无毒的。药物组合物在其不同的实施方案中适合以不同方式施用。所述施用包括全身性和局部施用以及口服、皮下、胃肠外、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鼻内和子宫内（intrategral）施用。

本领域技术人员认识到，药物组合物和各核酸和载体的量分别依赖于个体患者的临床状况、施用的部位和方法、施用方案、患者年龄、性别、体重和医生所知道的其他因素。因此通过医疗领域内已知的这些考虑因素来确定用于本发明的预防和/或治疗目的的药物有效量。优选地，所述量对于获得改善是有效的，所述改善包括但不限于改善疾病状况或提供更快的恢复、症状和由本医疗领域内的技术人员选择作为适当的量度的其他指标的改善或消除。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物可包含其他药物活性物质。优选地，这些其他药物活性物质选自允许细胞内吸收细胞递送的化合物、允许内体释放的化合物、允许更长循环时间的化合物和允许靶向内皮细胞或病原性细胞的化合物。用于内体释放的优选的化合物是氯喹和ATP依赖性H⁺泵的抑制剂。

优选地配制药物组合物以提供单一剂量的施用或多剂量施用。

将认识到，本发明的药物组合物可用于涉及不想要的血管系统的发生或生长包括血管发生的任何疾病和此处描述任一种疾病和病症。优选地，这些种类的疾病是肿瘤疾病。在肿瘤疾病中，下列肿瘤是最优选的：子宫内膜癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、腺癌、子宫内膜增生、考登综合征、遗传性非息肉病性结肠直肠癌（hereditarynon-polyposis colorectal carcinoma）、Li-Fraumene氏综合征、乳腺-卵巢癌、前列腺癌(Ali,I.U.,Journal of the National CancerInstitut e,第92卷,no.11,June 07,2000,page 861-863)、Bannayan-Zonana综合征、LDD(Lhermitte-Duklos氏综合征)(Macleod,K.,同上)、错构瘤-大头畸形疾病（hamartoma-macrocephaly diseases）包括Cowdisease(CD)和Bannayan-Ruvalcaba-Rily综合征(BRR)、粘膜损伤（mucocutaneous lesions）(例如毛膜瘤)、大头畸形、智力迟钝、胃肠错构瘤（gastrointestinal harmatomas）、脂肪瘤、甲状腺腺瘤、乳腺的纤维性囊肿病、小脑发育异常的神经节细胞瘤（cerebellardysplastic gangliocytoma）和乳腺和甲状腺恶性肿瘤(Vazquez,F.,Sellers,W.R.,同上)。

认识到，使用本发明的药物组合物治疗的任一种肿瘤疾病优选地是晚期肿瘤疾病。在另一个实施方案中，肿瘤疾病涉及肿瘤抑制剂阴性的细胞，其中更优选地所述肿瘤抑制剂是PTEN。

本发明的药物组合物也可用于预防和/或治疗此处公开的疾病的方法，其中所述方法包括施用用于此处描述的任一种疾病的本发明的核酸、本发明的载体或本发明的药物组合物或药物。

在其他方面，本发明涉及用于设计或筛选核酸的方法，所述核酸适合用于下调RTP801，更明确地下调RTP801功能。该方法包括使用此处描述的核酸序列和在合适的测定法中评估该核酸。该测定在本领域中是已知的且描述于例如本申请的实施例部分。在其他步骤中，设计，优选地根据此处阐述的设计原理设计双链核酸，所述核酸适合用于下调RTP801，优选地和转录后基因沉默机制例如RNA干扰有关。也在各测定法中评估所获得的，即设计的或筛选的核酸，并比较结果，即比较本发明的核酸和新设计的或筛选的核酸在该测定法中的作用。优选地，在设计的或筛选的核酸更稳定或更有效，优选地同时满足两者的情况下，其更合适。将认识到，如果将本发明的任一核酸用作起始点，所述方法将特别有效。因此基于此处公开的原理设计新核酸分子在本发明的范围之内，其中RTP801mRNA上的靶序列相对于本发明的对应的核酸的RTP801mRNA上的靶序列发生稍微偏移。优选地，所述新核酸在编码RTP801的mRNA的5’或3’方向相对于靶mRNA上的片段将偏移至少1或多个核苷酸。然而，偏移也可同时发生在两个方向（这表示所述新核酸包含用作起始点的本发明的核酸）。本发明的用作起始点的核酸的延伸偏向于3’末端或5’末端也在本发明的范围之内。在例如偏向的情况下，新核酸的3’或5’末端更长，即比另一末端延伸更长。当通过延伸有义链和/或反义链的3’末端或5’末端产生所述新核酸分子时，一般使用下列顺序的步骤。如果偏移是朝向RTP801的mRNA的5’末端的，那么反义链的3’末端必须延伸RTP801的mRNA的5’末端所偏移的核苷酸数目。由此被加至新核酸的反义链的3’末端的核苷酸和RTP801mRNA上的靶序列（用于用作起始点的本发明的核酸分子）的5’末端后的核苷酸互补。对有义链也必须这样。然而，要加至有义链的核苷酸必须对应于，即和新加至反义链的3’末端的核苷酸互补，这意味着其必须被加至有义链的5’末端。然而，针对有义链的后一步骤只需进行至反义链和有义链将偏移的程度，这是本发明的优选的实施方案中的情况。尽管可进行该偏移至本领域技术人员所定义的程度，更优选可进行偏移以使新核酸仍然包含此处公开的任一核酸分子展示的至少14个核苷酸、优选地14个连续核苷酸的片段。

此处描述的任何核酸的合成在本领域技术人员的范围之内。这些合成描述于例如Beaucage S.L.and Iyer R.P.,Tetrahedron 1992;48:2223-2311,Beaucage S.L.和Iyer R.P.,Tetrahedron 1993;49:6123-6194和Caruthers M.H.等人,Methods Enzymol.1987;154:287-313,硫代酸（thioate）的合成描述于例如Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.1985;54:367-402,RNA分子的合成描述于Sproat B.,inHumana Press 2005Edited by Herdewijn P.;Kap.2:17-31，各下游方法描述于例如Pingoud A.等人,in IRL Press 1989Edited by OliverR.W.A.;Kap.7:183-208和Sproat B.,in Humana Press 2005Editedby Herdewijn P.;Kap.2:17-31(同上)。

可使用此处描述的本领域已知的方法，基于已知的RTP801(SEQ IDNO:1)的序列制备针对RTP801的siRNA，且可通过此处描述的各种修饰使其稳定。关于其他信息，参见实施例9。

此外，对于此处描述的本发明的方法，可将其他RNA分子用于所述方法，所述分子是例如本发明的抑制性RNA分子，包括优选地包含存在于表A-C中详述的序列中的至少7-10个连续核苷酸的片段的单链寡核糖核苷酸，所述寡核糖核苷酸能够以特定的构象形成[和/或包含]双链区域，所述构象可被细胞内复合物识别，导致所述寡核糖核苷酸降解成更小的RNA分子，所述更小的RNA分子能够抑制其对应的内源基因和编码这些RNA分子的DNA分子。所述对应的内源基因优选地是所述801基因和另外地可以是VEGF基因和/或VEGF-R1基因。本发明也提供了在媒介物优选地药物可接受的媒介物中包含上述单链寡核糖核苷酸的组合物。

此外，本发明提供了用于此处公开的所有病症特别是涉及脉络膜新生血管病症的组合治疗法。在所述组合治疗法中，抑制RTP801和VEGFR基因以改善被治疗的疾病的状况。可使用siRNA或抗体（包括适体抗体（aptamer antibodies)）或两者的组合抑制这些基因。因此本发明也提供了包含RTP801抑制剂和VEGF或VEGFR-1抑制剂的新的药物组合物，所述RTP801抑制剂优选地是siRNA，更优选地是表A-C中描述的siRNA分子，特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50，而VEGF/VEGFR-1抑制剂任选地是抗体或适体。所述化合物（即，RTP801siRNA和VEGF抗体或此处公开的任何其他组合实例)在药物制备中的组合用途也是本发明的部分。

因此，RTP801siRNA例如表A-C中描述的siRNA分子，特别是表A的siRNA Nos:14、22、23、25、27、39、41、42、49和50可和靶向VEGF或VEGF受体1(VEGFR1)的试剂一起施用。这些试剂目前在市场上有售或处于审批的各个阶段，并通过不同的机制发挥作用。抗体和抗体片段例如ranibizumab(Lucentis,Genentech)附着至释放的VEGF以抑制VEGF对活性受体的结合。可象配体/抗体一样发挥作用的适体(Macugen,Eyetech/Pfizer,最近被FDA批准用于湿AMD)也是可能的选择。Macugen结合细胞外VEGF，从而阻止其活性。通过玻璃体内注射局部地施用这些药物。基于抗VEGF siRNA的化合物(例如VEGF的Acuity’s Cand5抑制剂或VEGFR-1的SIRNA’s 027抑制剂)也是可获得的。此外，全身性施用的小分子氨基固醇Squa l ami ne(Genaera)据报导干扰血管生成过程中的多个方面，包括在内皮细胞中抑制VEGF和其他生长因子的信号转导。

RTP801抑制剂，优选地siRNA，和上述VEGF/VEGFR-1抑制剂中的任一种的联合施用可具有协同效应，其中，无论单一治疗选择中的剂量是多少，所述组合治疗比通过任一种这些单个组合物的治疗更有效。如实施例6中描述的，该协同效应也受到由Asignee获得的初步结果支持。

RTP801i具有不同的作用机制且和VEGF-VEGFR抑制剂具有潜在的协同作用。RTP801KO小鼠中的研究显示，尽管眼睛中的VEGF mRNA的表达和WT小鼠中的一样高，但KO小鼠中的保护性表型持续存在。我们的其他初步数据表明，在视网膜病症的治疗中，RTP801的抑制可和VEGF-VEGFR调节轴（regulatory axis）的抑制协同作用。本发明的发明者在适当的实验中发现，在AMD的模型(参见下面的实施例6)中抗RTP801的siRNA的施用不仅导致RTP801自身的下调，同时作为结果，导致抗血管生成和神经保护因子PEDF的上调以及MCP1（巨噬细胞趋化蛋白）的下调。因此，RTP801的抑制同时提供了抗血管生成、神经保护和抗炎症的作用。

要理解，在本发明中，此处公开的任何siRNA分子，或通过内源细胞复合物（例如DICER-参见上面）加工形成此处公开的s iRNA分子的任何长双链RNA分子（通常长度为25-500个核苷酸）、或包含此处公开的siRNA分子的分子，可用于此处公开的疾病或病症的治疗。

可通过本发明的分子和组合物治疗的其他病症包括所有类型的脉络膜新生血管形成(CNV)，所述病症不仅在湿AMD中发生而且还在其他眼病例如眼组织胞浆菌病综合征、angiod streak、Bruch氏膜的破裂、近视性变性、眼肿瘤和一些视网膜退行性疾病中发生。

本发明的其他方面提供了治疗细胞凋亡相关性疾病的方法。提供了用于治疗和不受控制的、病理性细胞生长相关的疾病或病症例如，癌症、牛皮癣、自身免疫性疾病等的方法，和用于治疗和局部缺血和缺乏正常血流相关的疾病例如心肌梗塞(MI)和中风的方法。“癌症”或“肿瘤”是指非正常细胞不受控制的生长团块。这些术语包括原发性肿瘤，其可以是良性的或恶性的，以及已扩散至身体中的其他部位的继发性肿瘤或转移性癌。癌症类型的疾病的实例包括：癌瘤(例如：乳腺、结肠和肺)、白血病例如B细胞白血病，淋巴瘤例如B细胞淋巴瘤、胚细胞瘤例如成神经细胞瘤和黑色素瘤。

本发明也提供了在媒介物，优选地药物可接受的媒介物中包含一种或多种本发明的化合物的组合物。该组合物可包含针对不同基因的两种或更多种siRNA或针对相同基因的不同siRNA的混合物。涉及包含针对RTP801基因的siRNA和针对VEGF基因和/或VEGF-R1基因的siRNA的组合物。

本发明的其他化合物包含共价地或非共价地结合至一种或多种本发明的化合物（结构A）的本发明的上述化合物（结构A）。可在媒介物中，优选地药物可接受的媒介物中递送该化合物，可通过内源细胞复合物在细胞内加工该化合物，从而产生一种或多种本发明的siRNA。本发明的其他种化合物包含共价地或非共价地结合至其他基因，优选地VEGF基因和/或VEGF-R1基因的siRNA的本发明的上述化合物（结构A）。

本发明也包含新的化学实体，所述化学实体为RTP801抑制剂，优选地为通过化学键共价地或非共价地结合至任一种上述VEGF/VEGFR-1抑制剂的siRNA。所涉及的特定的化学实体是共价地连接至VEGF或VEGF受体1的抗体的siRNA RTP801抑制剂。产生这些新的化学实体的方法对于本领域技术人员来说是已知的。

本发明也包含串联双链结构，所述结构包含两种或更多种siRNA序列，所述结构在细胞内被加工形成两种或多种不同的siRNA，一种抑制801而第二种抑制VEGF/VEGFR-1。在相关方面，本发明也包含含有两种或更多种siRNA序列的串联双链结构，所述结构在细胞内被降解形成两种或更多种不同的都抑制801的siRNA。

特别地，涉及，包含一个或多个茎和环结构的长寡核苷酸（通常长度为大约80-500个核苷酸），其中茎区域包含本发明的寡核苷酸序列，其可通过媒介物，优选地药物可接受的媒介物递送，和可被内源细胞复合物加工（例如，通过上述的DROSHA和DICER），从而产生一种或多种更小的双链寡核苷酸(siRNA)，所述双链寡核苷酸为本发明的寡核苷酸。该寡核苷酸可被称为串联shRNA结构。涉及，该长寡核苷酸是包含一个或多个茎和环结构的单链寡核苷酸，其中各茎区域包含801基因的有义和对应的反义siRNA序列。特别地，该寡核苷酸包含表A至表C中任一表中所描述的有义和反义siRNA序列。可选择地，所述串联shRNA结构可包含801基因的有义和对应的反义siRNA序列和另外地不同基因例如VEGF或VEGF-R1的有义和对应的反义siRNA序列。

如此处所提到的，抗RTP801的siRNA可以是药物组合物中的主要活性组分，或可以是包含2种或更多种siRNA（或编码或内源性地产生两种或更多种siRNA的分子，编码两种或更多种siRNA的一种或多种串联分子的混合物）的药物组合物的一种活性组分，所述药物组合物还可包含一种或多种其他的siRNA分子，所述分子靶向一种或多种其他的基因。根据下面，RTP801和所述其他基因的同时抑制将可能对此处公开的疾病的治疗具有累加或协同效应。

急性肾功能衰竭(ARF)和其他微血管病症：用于治疗ARF的药物组合物可含有下列化合物组合：1)RTP801siRNA和p53siRNA二聚物;2)RTP801和Fas siRNA二聚物;3)RTP801和Bax siRNA二聚物;4)p53和Fas siRNA二聚物;5)RTP801和Bax siRNA二聚物;6)RTP801和Noxa siRNA二聚物;7)RTP801和Puma siRNA二聚物;8)RTP801(REDD1)和RTP801L(REDD2)siRNA二聚物;9)形成三聚物或多聚物(即，编码三种siRNA的串联分子)的RTP801siRNA、Fas siRNA与RTP801L siRNA p53siRNA、Bax siRNA、Noxa siRNA或Puma siRNA中的任一种。

黄斑变性(MD)、糖尿病性视网膜病(DR)、脊髓损伤：用于治疗MD、DR和脊髓损伤的药物组合物可包含下列化合物组合：1)RTP801 siRNA和VEGF siRNA、VEGF-R1 siRNA、VEGF R2 siRNA、PKCβ siRNA、MCP1 siRNA、eNOS siRNA、KLF2 siRNA、RTP801L siRNA中的任一分子组合(物理混合或形成串联分子)；2)RTP801 siRNA和两种或多种上面列出的siRNA组合（物理混合或形成编码三种siRNA的串联分子或其组合）。

COPD和呼吸系统病症：用于治疗呼吸系统病症的药物组合物可包含下列化合物组合：RTP801 siRNA和抗一种或多种下列基因的siRNA：弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶、磷脂酶、caspases、鞘磷脂酶和神经酰胺合酶。

此外，根据下面，可将RTP801 siRNA和包含或编码RTP801 siRNA的任何核酸分子连接（共价地或非共价地）至抗体，以获得增强的靶向此处公开的疾病的治疗：

ARF:抗Fas抗体(优选地中和抗体)。

黄斑变性、糖尿病性视网膜病、脊髓损伤：抗Fas抗体、抗MCP1抗体、抗VEGFR1和抗VEGFR2抗体。抗体应当优选地是中和抗体。

任何分子，例如，包含此处公开的siRNA序列的反义DNA分子（其具有合适的核酸修饰）是特别想要的且可以和其对应的siRNA相同的功效用于此处公开的所有应用和方法。

本发明也包括治疗患有疾病例如此处描述的病症的方法，其包括以治疗有效剂量给患者施用上述组合物或化合物以治疗患者。

术语“反义”(AS)或“反义片段”是指具有抑制性反义活性的多核苷酸片段（包括脱氧核糖核甘酸、核糖核苷酸或两者的混合），所述活性导致对应的基因（在本情况下是RTP801）的内源基因组拷贝的表达减少。RTP801AS多核苷酸是包含连续核苷酸的多核苷酸，所述连续核苷酸具有足够长度且和SEQ ID NO:1中所示的RTP801基因的序列内存在的序列同源从而允许所述AS和所述基因杂交。设计AS的序列使其和目的靶mRNA互补并形成RNA:AS双链体。该双链体形成可阻止相关mRNA的加工、剪接、转运或翻译。此外，当和其靶mRNA杂交时，某些AS核苷酸序列可引起细胞RNA酶H的活性，导致mRNA降解(Calabretta等人,1996:Antisense strategies in the treatment of leukemias.SeminOncol.23(1):78-87)。在该情况下，RNA酶H将切割双链体的RNA组分且可潜在地释放AS，从而进一步地和靶RNA的其他分子杂交。作用的其他模式产生自形成可使转录失活的三股螺旋的AS和基因组DNA的相互作用。特定的AS片段是编码此处描述的RTP801的特定片段的DNA的AS。

许多综述已涵盖了反义（AS）技术和其治疗潜能的主要方面(Wright& Anazodo,1995.Antisense Molecules and Their Potential For TheTreatment Of Cancer and AIDS.Cancer J.8：185-189.)。存在关于该技术的化学(Crooke,1995.Progress in antisense therapeutics，Hematol.Pathol.2：59；Uhlmann和Peyman,1990.AntisenseOligonucleotides:A New Therapeutic Principle.Chem Rev90(4):543-584.)、细胞(Wagner,1994.Gene inhibition usingantisense oligodeoxynucleotides.Nature272：333.)和治疗(Hanania,等人1995.Recent advances in the application of gene therapy tohuman disease.Am.J.Med.99：537.;Scanlon等人.,1995.Oligonucleotides-mediated modulation of mammalian geneexpression.FASEB J.9：1288.;Gewirtz,1993.Oligodeoxynucleotide-based therapeutics for human leukemias，Stem Cells Dayt.11：96.)方面的综述。

可通过使用合成的AS寡核苷酸序列获得特定基因的表达的反义干扰(参见Lefebvre-d'Hellencourt等人，1995.Immunomodulation bycytokine antisense oligonucleotides.Eur.Cytokine Netw.6：7.;Agrawal,1996.Antisense oligonucleotides:towards clinicaltrials，TIBTECH，14：376.;Lev-Lehman等人.,1997.AntisenseOligomers in vitro and in vivo.InAntisense Therapeutics，A.Cohenand S.Smicek，eds(Plenum Press，New York))。设计AS寡核苷酸序列以使其和目的靶mRNA互补并形成RNA:AS双链体。该双链体形式可阻止相关mRNA的加工、剪接、转运或翻译。此外，当和其靶mRNA杂交时，某些AS核苷酸序列可引发细胞RNA酶H的活性，导致mRNA降解(Calabretta,等人,1996.Antisense strategies in the treatment ofleukemias.Semin.Oncol.23：78.)。在该情况下，RNA酶H将切割双链体的RNA组分且可潜在地释放AS，从而进一步地和靶RNA的其他分子杂交。作用的其他模式产生自形成可使转录失活的三股螺旋的AS和基因组DNA的相互作用。

选择反义寡核苷酸的序列靶片段以使所述序列展示对于和其互补模板形成寡核苷酸双链体是重要的合适的能量相关性特征，且显示对自身二聚体形成或自身互补的低效能(Anazodo等人.,1996)。例如，可使用计算机程序OLIGO(Primer Analysis Software,版本3.4)确定反义序列的解链温度、自由能性质，和估计潜在的自身二聚物的形成和自身互补性质。所述程序允许确定这两个参数（潜在的自身二聚物形成和自身互补性）的定性评估和提供“无潜能”或“一些潜能”或“基本上完全的潜能”的指征。使用该程序，一般选择在这些参数中估计无潜能的靶片段。然而，在其中一个分类中可使用具有“一些潜能”的片段。在选择中使用参数的平衡，这在本领域中是已知的。此外，当需要时也选择寡核苷酸，使得类似物置换不明显地影响功能。

硫代磷酸酯反义寡核苷酸在有效的浓度上通常不显示显著的毒性并且在动物中展示足够的药效半衰期(Agrawal,1996.Antisenseoligonucleotides:towards clinical trials,TIBTECH,14:376.)，其是抗核酸酶的。已显示针对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、针对鸡中tectal plate formation的建立(Galileo等人.,1991.J.Cell.Biol.,112:1285.)和针对N-myc蛋白（负责在神经外胚层培养中维持细胞异质性）(上皮细胞对原始神经母细胞，其差异在于其集落形成能力、致肿瘤性和粘着性)(Rosolen等人.,1990.Cancer Res.50:6316.;Whitesell等人.,1991.Episome-generated N-myc antisense RNArestricts the differentiation potential of primitiveneuroectodermal cell lines.Mol.Cell.Biol.11:1360.)的和细胞发育相关的反义诱导的功能缺失表型。具有促有丝分裂和血管生成特征的碱性成纤维细胞生长因子(bFgF)的反义寡核苷酸抑制以可饱和的和特异性的方式抑制80%的神经胶质瘤的生长(Morrison,1991.Suppression of basic fibroblast growth factor expression byantisense oligonucleotides inhibits the growth of transformedhuman astrocytes.J.Biol.Chem.266:728.)。因为疏水性，反义寡核苷酸充分地和磷脂膜相互作用(Akhter等人,1991.Interactions ofantisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipidmembranes(liposomes)Nuc.Res.19:5551-5559.)。在其和细胞质膜相互作用后，通过预计涉及特异性受体的可饱和的机制(Yakubov等人,1989.PNASUSA 86:6454.)，其被主动地（或被动地）转运入活细胞(Loke等人,1989.Characterization of oligonucleotide transportinto living cells.PNAS USA 86:3474.)。

“核酶”是具有RNA催化能力（关于综述参见Cech）并切割靶RNA中的特定位置的RNA分子。

根据本发明，切割RTP801mRNA的核酶可被用作RTP801抑制剂。这在其中反义治疗受到化学计量考虑限制的情况下是必需的(Sarver等人.,1990,Gene Regulation and Aids，pp.305-325)。此时可使用将靶向RTP801序列的核酶。被核酶切割的RNA分子的数目比通过化学计量学预测的数目大。(Hampel and Tritz,1989;Uhlenbeck,1987).

核酶催化RNA的磷酸二酯键断裂。几种核酶结构家族已被鉴定，包括Group I内含子、RNA酶P、肝炎δ病毒核酶、锤头状核酶和来源于烟草环斑病毒卫星RNA(sTRSV)(Sullivan,1994;U.S.Pat.No.5,225,347,columns 4-5)负链的发夹结构核酶。后两个家族来源于类病毒和拟病毒，其中核酶据认为从滚环复制期间产生的寡聚体分离单体(Symons,1989和1992)。锤头状核酶和发夹结构核酶基元通常最适合用于基因治疗的mRNA的反式切割(Sullivan,1994)。如本领域中已知的，选择用于本发明的核酶种类。发夹结构核酶现正在临床试验中且是优选的种类。一般地，核酶在长度上为30-100个核苷酸。核酶的递送和AS片段和/或siRNA分子的递送相似。

要指出的是，用于本发明的所有多核苷酸可进行修饰以具有提高的治疗特性。可引入修饰或核苷酸的类似物以提高多核苷酸的治疗特性。提高的特性包括增加的核酸酶抗性和/或增加的渗透细胞膜的能力。核酸酶抗性，当需要时，由本领域内已知的任何方法提供，所述方法不干扰使用和递送的方法所需的AS多核苷酸、siRNA、cDNA和/或核酶的生物学活性(Iyer等人,1990;Eckstein,1985;Spitzer和Eckstein,1988;Woolf等人,1990;Shaw等人,1991)。可对寡核苷酸进行以增强核酸酶抗性的修饰，包括修饰磷酸主链中的磷或氧杂原子。这些修饰包括制备甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和吗啉代寡聚物。在一个实施方案中，通过使硫代磷酯键在4至6个3’末端核碱基之间形成连接来提供其。可选择地，硫代磷酯键连接所有核苷酸碱基。在保持生物学活性，但显著增加对核酸酶的稳定性的前提下，可使用本领域已知的其他修饰。

多核苷酸的所有类似物或对多核苷酸的修饰可用于本发明，前提是所述类似物或修饰不显著地影响所述多核苷酸的功能。所述核苷酸可选自天然发生的或合成修饰的碱基。天然发生的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。核苷酸的修饰的碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤、其他氮杂和脱氮腺嘌呤、其他氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

此外，可制备多核苷酸的类似物，其中核苷酸的结构被根本地改变而且更适合用作治疗剂或实验试剂。核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)，其中DNA（或RNA）中的脱氧核糖（或核糖）磷酸主链被和在肽中发现的聚酰胺主链相似的聚酰胺主链取代。已显示PNA类似物对酶的降解作用具有抗性且在体内和体外具有延长的周期。此外，已显示PNA比DNA分子更强地结合互补DNA序列。该观察结果归因于PNA链和DNA链之间缺乏电荷排斥作用。可对寡核苷酸进行的其他修饰包括聚合物主链、环状主链或非环状主链。

用于本发明的多核苷酸也可被修饰，任选地化学修饰，以提高其治疗活性。“化学修饰”-当指多肽时，表示这样的肽，其中至少一个氨基酸残基被天然过程例如加工或其他翻译后修饰，或被本领域内熟知的化学修饰技术修饰。在大量已知的修饰种类中，典型的但非排他性的实例包括：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP核糖基化、糖基化、GPI锚的形成、脂质或脂衍生物的共价附着、甲基化、myristlyation、PEG化、异戊烯化、磷酸化、泛素化（ubiqutination）或任何相似的方法。

其他的可能的多肽修饰（例如由于核酸序列的改变造成的修饰）包括下列：

“保守性置换”-是指一种类型的氨基酸被相同类型的氨基酸置换，其中类型由共同的物化氨基酸侧链性质和在天然的同源多肽中发现的高置换频率（如通过例如标准的Dayhoff频率转换矩阵或BLOSUM矩阵确定的）定义。已将氨基酸侧链分为6大类，其包括：I类(Cys);II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly);III类(Asn、Asp、Gln、Glu);IV类(His、Arg、Lys);V类(Ile、Leu、Val、Met);和VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp对另一个III类氨基酸例如Asn、Gln或Glu的置换是保守性置换。

“非保守性置换”-是指用来自另一类的氨基酸置换一类的氨基酸；例如用III类残基例如Asp、Asn、Glu或Gln对II类残基Ala的置换。

“缺失”-是核苷酸或氨基酸序列的改变，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基分别不存在。

“插入”或“加入”-是当和天然发生的序列相比时，分别导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的加入的核苷酸或氨基酸序列的改变。

“置换”-一个或多个核苷酸或氨基酸分别由不同的核苷酸或氨基酸的取代。对于氨基酸序列，所述置换可以是保守性的或非保守性的。

在本发明的其他实施方案中，RTP801多肽或多核苷酸可用于在受试者中诊断或检测黄斑变性。检测方法通常包括测定来源于受试者的样品中的RTP801mRNA或RTP801多肽。

“检测”-是指疾病的检测方法。该术语可指对疾病的易感性的检测，或指疾病的严重度的检测。

“同系物/同源性”，如本发明中所用的，是指至少大约70%，优选地至少大约75%的同源性，有利地至少大约80%的同源性，更有利地至少大约90%的同源性，更有利地至少大约95%，例如，至少大约97%、大约98%、大约99%或甚至大约100%的同源性。本发明也包括，可以和此处或上述的多核苷酸和多肽的使用方式相同的方式使用这些多核苷酸和多肽。

可选择地或另外地，“同源性”，对于序列来说，可指具有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目除以两个序列中较短序列的核苷酸或氨基酸残基的数目，其中可根据Wilbur和Lipman算法((1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726)确定两个序列的比对；例如，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和4的缺口罚分，使用商购获得的程序(例如，Intelligenetics^TM Suite,Intelligenetics Inc.,CA)可容易地进行序列数据的计算机辅助分析和解释，包括比对。当RNA序列被认为和DNA序列相似或具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。通过用尿嘧啶（U）置换DNA中的胸苷（T），可从DNA序列或其互补序列产生本发明范围内的RNA序列。

另外地或可选择地，可使用例如BlastP程序(Altschul等人.,Nucl.Acids Res.25:3389-3402)确定氨基酸序列相似性或同源性，所述程序可在NCBI获得。下列参考资料提供了用于比较两个多肽的氨基酸残基的相对同一性或同源性的算法，和另外地，或可选择地，对于上述序列，这些参考资料中的教导可用于确定百分比同源性：Smith等人,(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489;Smith等人,(1983)Nucl.Acids Res.11:2205-2220;Devereux等人,(1984)Nucl.Acids Res.12:387-395;Feng等人,(1987)J.Molec.Evol.25:351-360;Higgins等人,(1989)CABIOS 5:151-153;和Thompson等人,(1994)Nucl.Acids Res.22:4673-4680。

“具有至少X%的同一性”-对于两个氨基酸或核苷酸序列，是指当最佳地比对序列时，两个序列中相同残基的百分比。因此，90%的氨基酸序列同一性是指两个或更多个最佳比对的多肽序列中90%的氨基酸是相同的。

本发明的其他实施方案涉及药物组合物，所述药物组合物以治疗有效量包含作为活性组分的RTP801抑制剂和药物可接受的媒介物。所述抑制剂可以是生物抑制剂、有机分子、化学分子等。所述药物组合物可包含RTP801抑制剂，所述抑制剂是包含连续核苷酸的多核苷酸，所述连续核苷酸具有为图1中所示的序列(SEQ ID No:1)的反义序列的序列。此外，RTP801抑制剂可以是包含这些多核苷酸的载体。此外，所述RTP801抑制剂可以是特异性结合表位的单克隆抗体或靶向RTP801基因的mRNA的RNA分子或核酶，所述表位包含图2(SEQ ID No:2)中所示的4-25个氨基酸，所述RNA分子是例如s i RNA分子(任选地描述于表A-C中，特别是表A的s i RNA Nos:22、23、25、27、39、41、42、49和50)。

药物组合物的活性组分可包括寡核苷酸和/或核酶，所述寡核苷酸具有实施本发明或其片段（该片段显示具有相同的靶向合适的序列的效应）所需的核酸酶抗性。可使用本发明中公开的活性组分的组合，包括反义序列的组合。

本发明的其他实施方案提供了使用治疗有效剂量的RTP801抑制剂制备用于在患有脊髓病或损伤的患者中促进恢复的药物的用途。在一个实施方案中，所述抑制剂优选地是siRNA。在另一个实施方案中，所述抑制剂优选地是此处描述的结构A。

已以举例说明的方式描述了本发明，且要理解已使用的术语意在描述的词的本质而不是限制。

显然，根据上面的教导，本发明的许多改变和变化是可能的。因此要理解在所附的权利要求的范围内，可以以明确描述的方式之外的方式实施本发明。

在整个说明书中，各种出版物，包括美国专利，通过作者和年份以及专利的编号进行参考。因此这些出版物和专利以及专利申请的公开内容以其全文在本申请中引用作为参考以更全面地描述本发明所属的领域的状况。

附图概述

图1描述了RTP801基因的编码序列(SEQ ID NO:1);

图2描述了RTP801多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2);

图3是描述各种核酸分子的外显子、CDS、人SNP和位置的图表，所述核酸分子是人特异性或同时对于人、小鼠和大鼠是特异性的；

图4A-H描述在对第一人细胞系使用本发明的各种双链核酸后获得的Western印迹分析结果的图框（panel），其中进行2次所述实验，称为实验1和实验2，其中p110a和p85的表达水平表示上样对照，RTP801条带的强度（密度）是所用的特定双链核酸的抑制性活性的量度；

图5A-F描述在对第二人细胞系使用本发明的各种双链核酸后获得的Western印迹分析结果的图框，其中进行2次所述实验，称为实验1和实验2，其中p110a和p85的表达水平表示上样对照，RTP801条带的密度是所用的特定双链核酸的抑制性活性的量度；

图6A-C描述在以不同的浓度，即10nM(5A)、5nM(5B)和1nM(5C)，对第一人细胞系使用本发明的各种双链核酸后获得的Western印迹分析结果的图框，其中进行2次所述实验，称为实验1和实验2，其中p110a和p85的表达水平表示上样对照，RTP801条带的密度是所用的特定双链核酸的抑制性活性的量度；

图7描述在对小鼠细胞系使用本发明的各种双链核酸后获得的Western印迹分析结果的图框，其中进行2次所述实验，称为实验1和实验2，其中p110a和p85的表达水平表示为上样对照，RTP801条带的密度是所用的特定双链核酸的抑制性活性的量度；

图8显示小鼠AMD模型系统中的实验结果；

图9显示小鼠AMD模型系统的其他实验的结果；

图10显示非人灵长类动物AMD模型系统的实验的结果；

图11A-B显示非人灵长类动物AMD模型系统的其他实验的结果；

图12A-B显示非人灵长类动物AMD模型系统的其他实验的结果；

图13A-B显示在非人灵长类动物AMD模型中获得的实验结果的分析；

图14显示非人灵长类动物AMD模型中获得的实验结果的其他分析；

图15A-C显示涉及RTP801表达质粒至小鼠的气管内滴注的实验的结果；

图16A-C显示RTP801KO和WT小鼠中的短期（7）吸烟模型的结果；

图17A-C显示用活性抗RTP801(REDD14)和对照(REDD8)s iRNA滴注的WT小鼠的短期吸烟模型的结果；

图18显示在长期CS模型中使用RTP801KO小鼠的实验的结果；

图19显示小鼠ARF模型系统的实验的结果；

图20显示小鼠糖尿病性视网膜病模型系统的实验的结果；

图21显示小鼠糖尿病性视网膜病模型系统的其他实验的结果；

图22显示小鼠糖尿病性视网膜病模型系统的另外的实验的结果；

图23显示小鼠CNV模型系统的组合的RTP801/VEGF抑制实验的结果；

图24显示小鼠CNV模型系统的其他组合的RTP801/VEGF抑制实验的结果；

图25显示研究RTP801 siRNA对RPE和神经视网膜中的基因表达的影响的实验的结果；

图26A-B显示研究RTP801 siRNA对RPE和神经视网膜中的基因表达的影响的实验的其他结果；和

图27显示证明RT801NP和RTP801具有相同活性的实验的结果。

实施例

无需其他详尽的细节，据信本领域技术人员可，利用前面的说明，尽其充分地使用本发明。因此，下列优选的特定的实施方案解释为只是用于举例说明，而不以任何方式限定本发明。

此处未具体描述的本领域已知的标准分子生物学方案一般基本上按照Sambrook等人,Molecular cloning：A laboratory manual，ColdSprings Harbor Laboratory,New-York(1989,1992),和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988)中所描述的方案进行。

此处未明确描述的本领域已知的标准有机合成方案一般基本上按照Organic syntheses:Vol.1-79，editors vary,J.Wiley,New York,(1941-2003);Gewert等人,Organic synthesis workbook，Wiley-VCH,Weinheim(2000);Smith和March,Advanced Organic Chemistry，Wiley-Interscience;5th edition(2001)中描述的方案进行。

此处未明确描述的本领域已知的标准药物化学方法一般基本上按照由不同作者和编者编著，由Pergamon Press出版的系列"Comprehensive Medicinal Chemistry"中描述的方法进行。

本说明书、权利要求和/或草图中公开的本发明的特征可独立地和以其任何组合成为以其不同形式用于实现本发明的材料。

实施例1

一般材料和方法

如果没有另外指出，在实施例1-5中使用下列材料和方法：

细胞培养

如下培养第一人细胞系，即HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心)：如Czauderna F等人(Czauderna,F.,Fechtner,M.,Aygun,H.,Arnold,W.,Klippel,A.,Giese,K.& Kaufmann,J.(2003).NucleicAcids Res,31,670-82)中所描述的，培养Hela细胞(美国典型培养物保藏中心)。

第二人细胞是如下培养的人角质形成细胞系：将人角质形成细胞在37°C下培养在含有10%FCS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。

小鼠细胞系是37°C下培养在含有10%FCS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的B16V(美国典型培养物保藏中心)。培养条件和Methods Find Exp Clin Pharmacol.1997May;19(4):231-9:中所描述的一样。

在各情况下，以每孔大约50,000个细胞的密度将所述细胞接受此处描述的实验且以20nM加入本发明的双链核酸，其中使用1μg/ml的个人所有（propr ietary）的脂质混合所述双链核酸。

低氧样条件的诱导

如下用CoCl₂处理细胞以诱导低氧样条件：如由(Czauderna等人,2003;Kretschmer等人,2003)所描述的，在10cm板(30-50%汇合)中进行siRNA转染。简而言之，通过向完全培养基中的细胞加入在无血清培养基中形成的10x浓缩的GB和脂质的混合物来转染s i RNA。总的转染体积为10ml。除非另外指出，最终的脂质浓度为1.0μg/ml；最终的siRNA浓度为20nM。通过在裂解前24小时将CoCl₂(100μM)直接加入组织培养基来进行低氧反应的诱导。

细胞提取物的制备和免疫印迹法

基本上如由Klippe l等人(Klippe l,A.,Es cobedo,M.A.,Wachowicz,M.S.,Apel l,G.,Brown,T.W.,Giedlin,M.A.,Kavanaugh,W.M.&Williams,L.T.(1998).Mol Cell Biol,18,5699-711;Klippel,A.,Reinhard,C.,Kavanaugh,W.M.,Apell,G.,Escobedo,M.A.和Williams,L.T.(1996).Mol CellBiol,16,4117-27)所描述的进行细胞提取物的制备和免疫印迹分析。通过用从pET19-b表达载体产生重组RTP801蛋白的细菌免疫兔子来产生抗全长RTP801的多克隆抗体(Merck Biosciences GmbH,Schwalbach,Germany)。已由Klippel等人(同上)描述了鼠类单克隆抗p110a和抗p85抗体。

实施例2

第一人细胞系中RTP801表达的减少

制备不同的双链核酸。在图3中描述了编码人RTP801的核酸(数据库目录号NM_019058)中mRNA和CDS以及人SNP的位置。如实施例1中描述的将所述第一人细胞系和所述双链核酸接触。在低氧样条件的诱导和用所述双链核酸处理后，裂解细胞，然后将细胞裂解物进行免疫印迹分析。将p110a（其为PI 3激酶的催化亚基）和p85用作上样对照。使用RTP801多克隆抗体显示的RTP801条带的强度是所述单种双链核酸在减少RTP801的表达水平方面的活性的量度。

已对双链核酸中的各个核酸和任一核酸进行修饰以使2’O-Me基团存在于反义链的第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位核苷酸上，其中完全相同的修饰，即2’-O-Me基团存在于有义链的第2、4、6、8、10、12、14、16和18位核苷酸上。此外，要指出的是，在本发明的这些特定核酸的情况下，所述第一片段和第一链相同，所述第二片段和所述第二链相同，且这些核酸也是平末端的。

进行2次实验，结果显示于图4A至H，其中分别称为实验1和实验2。

图4A至H中的表述h、hr和hmr表示以这样的方式设计各双链核酸，使之靶向对于人RTP801mRNA(h)是特异性的RTP801mRNA的部分、对于人和大鼠RTP801mRNA（hr）是特异的RTP801mRNA的部分和靶向对于人、小鼠和大鼠RTP801mRNA（hmr）是特异的RTP801mRNA的部分。将此处称为no.40.1的双链核酸用作阳性对照，未处理细胞(UT+)用作阴性对照。

根据结果，发现下列双链核酸在下调RTP801的表达中特别有用：no.14、no.15、no.20、no.21、no.22、no.23、no.24、no.25、no.27、no.39、no.40、no.41、no.42、no.43、no.44、no.49和no.50(参见表A)。

实施例3

第二人细胞系中RTP801表达的减少

使用实施例1中指定的第二人细胞系重复实施例2中描述的实验，结果描述于图5A至F。

如可从这些图所推导的，使用该第二人细胞系验证了按照实施例2中描述的实验获得的结果。

实施例4

RTP801-特异性双链核酸的剂量效应

在本实验中，研究RTP801-特异性双链核酸的剂量效应。

为了该目的，如实施例2和3中所述处理HeLa细胞，其中液体培养基中的双链核酸的浓度是10nM、5nM和1nM。使用双链核酸no.40.1作为正对照，使用未处理的细胞(UT+)作为负对照。读出和实施例2和3中描述的相同。所使用的特定的双链核酸是具有内部参照编号14、22、23和27的双链核酸(所述核酸针对由人、小鼠和大鼠所共有的RTP801mRNA上的片段)和具有内部参照编号39和42的双链核酸(所述核酸针对对于人RTP801是特异性的RTP801mRNA)。

结果显示于图6A至C中。从所述图中可得出，对于RTP801是特异性的双链核酸的作用存在明显的浓度依赖性，其中具有内部参照号1、15、20、21、24、40、41、43、44、22、23、27、39、42、40.1、44.1和14，优选地22、23、27、39、42、40.1和44.1和更优选地14、23和27的核酸分子和优选地具有特定修饰模式（所述修饰模式和此处的实施例部分描述的对于其的修饰模式相同）的各所述核苷酸分子是特别有效的。

实施例5

RTP801-特异性双链核酸的种特异性

已设计抗RTP801mRNA的片段（其在不同的种中是相同的或不同的）的本发明的双链核酸。为了检测是否存在RTP801-特异性双链核酸的种特异性，使用实施例1和2中描述的相同的方法和读出法在下调RTP801方面比较具有内部参照号14、22、23和27的双链核酸（所述核酸靶向在人、小鼠和大鼠RTP801mRNA中是保守的RTP801mRNA的片段）和具有内部参照号39和42的双链核酸（所述核酸靶向对于人RTP801mRNA是特异性的RTP801mRNA的片段，即靶向不存在于小鼠或大鼠中的片段）。

尽管所使用的所有双链核酸原则上具有抗人mRNA的活性，并且如前面的实施例中所显示的）其也适合下调RTP801表达，但在使用小鼠细胞系时，只有对于小鼠RTP801mRNA也是特异性的双链核酸（即双链核酸no s.14、22、23和27）能有效地减少RTP801的表达。

从该结果可得出，可能设计对于一种或几种物种是特异性的靶向RTP801的双链核酸。这使得能够在动物模型和人中使用完全相同的分子。

实施例6

涉及黄斑变性的实验模型、方法和结果

在下列脉络膜新生血管形成(CNV)的动物模型中检测本发明的化合物。通过激光处理在模型动物中诱导湿AMD的标志。

A)小鼠模型

脉络膜新生血管形成(CNV)的诱导

在第0天，通过单一随机指定药物组，通过对各小鼠的两只眼睛都进行激光照射凝血(532nm,200mW,100ms,75μm)(OcuLight GL,Iridex,Mountain View,CA)来引发脉络膜新生血管形成(CNV)（湿AMD的标志）。使用裂隙灯递送系统（slit lamp delivery system）和使用盖玻片作为接触镜，以标准的方式在视神经附近应用激光斑。

处理组

在下列小鼠（6-8周龄的雄性）的组中诱导CNV:

(1)12只WT小鼠;

(2)12只RTP801敲除小鼠;

(3)在第0天和第7天，在一只眼中用0.25μg合成的稳定的活性抗RTP801 siRNA(REDD14)注射12只WT小鼠，在另一只眼中注射失活的抗RTP801 siRNA(REDD8-阴性对照)；

(4)在第0天和第7天，在一只眼中用0.25μg合成的稳定的活性抗RTP801 siRNA(REDD14)注射12只WT小鼠，在另一只眼中注射失活的抗GFP siRNA(阴性对照)；

(5)在第0天和第7天，在一只眼中用0.1μg合成的稳定的活性抗RTP801 siRNA(REDD14)注射12只WT小鼠，在另一只眼中注射PBS(阴性对照)；

(6)在第0天和第7天，在一只眼中用0.05μg合成的稳定的活性抗RTP801s i RNA(REDD14)注射12只WT小鼠，在另一只眼中注射PBS(阴性对照)。

对各小鼠的两只眼睛都进行激光处理。注射的体积为2μl。

评估

1.在第14天结束实验。为进行评估，摘出眼睛并用4%多聚甲醛在4℃下固定30分钟。将感觉神经性视网膜从视神经剥离和断开。将剩下的RPE-脉络膜-巩膜复合体平放在Immu-Mount(VectashieldMounting Medium,Vector)中并盖上盖玻片。用扫描激光共聚焦显微镜(TCS SP,Leica,Germany)检查平放的复合物。用蓝色氩激光器激发来显现血管。从RPE-脉络膜-巩膜复合体的表面获得水平光学切片（optical section）(1μm步长)。其中可鉴定围绕连接至损伤的脉络膜血管网的最深焦平面被判断为损伤的底部。经激光处理的区域中的和该参照面表面上的血管被确定为CNV。将各切面的图象进行数字化贮存。使用Leica TCS SP软件通过计算机化的图象分析测量CNV相关性荧光的面积。各水平切片中的整个荧光面积的和用作CNV的体积的指数。

2.通过对从RPE/脉络膜或从神经视网膜提取的RNA使用实时PCR，使用分开的WT小鼠(每组5只眼)评估CNV中的RTP801mRNA的表达(和与AMD相关的其他基因的表达)(未用siRNA处理的和用siRNA处理的)。

结果

1.在CNV诱导后，相对于WT小鼠，RTP801KO小鼠展示减少30%的血管渗漏；参见图8。

2.抗RTP801的合成的稳定的siRNA（REDD14）引发了剂量依赖性的CNV体积的减少。相对于注射PBS的眼，在每眼0.25ug的REDD14（表1中的序列号14、SEQ ID No.s 16(有义)和66(反义))的剂量上获得了最大大约70%的抑制。在相同的剂量上，阴性对照siRNAs即REDD8和抗GFP siRNA都只分别地展示了27%和33%的CNV体积的减少，这支持REDD14的良好功效和其作用的特异性。

B)非人灵长类模型

CNV的诱导

将年龄2-6岁的8只雄性短尾猴(Macaca fascicularis)用于研究。在剂量给药前通过两只眼睛的黄斑周激光处理诱导脉络膜新生血管形成(CNV)。用激光[具有IRIS

Portable Slit Lamp Adaptor的OcuLight GL(532nm)Laser Photo-coagulator]在黄斑中产生9处损伤，右眼中的激光斑和左眼中的位置呈镜像对称。近似的激光参数如下：斑大小：直径50-100μm；激光强度：300-700毫瓦；照射时间：0.1秒。

处理

在激光处理后立即将所有动物的两只眼睛接受单次玻璃体内注射。左眼以350ug的50ul终体积中的合成的稳定的抗RTP801的 siRNA（和用于小鼠研究中的相同）给左眼施药，而对侧的眼接受50ul PBS(媒介物)。

评价

1．将所有动物接受每天的食物消耗和体重测量的检查。

2．在CNV诱导后第6天对2只猴子实施无痛致死术。摘出其眼睛并使后极（posterior pole）扁平。然后切断凹陷区域并分离成脉络膜和视神经视网膜，所述脉络膜和视神经视网膜被分开（对于每只动物）冷冻在液氮中以随后用于RNA提取和RTP801表达的实时PCR评估。

3．在研究前和在CNV诱导后的第1、2和3周的末期进行荧光素血管照影分析。使用眼底照相机(TRC-50EX视网膜照相机)拍摄照片。使用TOPCON IMAGEnet^TM系统捕捉图象。通过血管通路口（vascular accessport）注射荧光染料(10%荧光素钠，大约0.1mL/kg)。在注射染料后的几个时间点拍摄照片以包括动脉相、早期动静脉相和几个晚期动静脉相，以评估新生血管形成和监测和CNV损伤相关的荧光素的渗漏。由两个眼科医师独立地进行荧光素照影片的分析。

在早期血管造影照片中估计新生血管形成(NV)且根据下列方案对每个斑进行分级：

0-无NV迹象

0.5-可疑斑点

1-“热”点

2-激光烧伤中的NV

3-明显的NV

根据下列方案估计渗漏：

0-无渗漏

0.5-可疑斑点

1-明显的小斑点渗漏

2-渗漏随时间而增加

3-大于以前的边界的渗漏(明显地)

此外，使用形态测定测量法比较早期和晚期血管造影照片之间的每一个斑点的大小，并计算由渗漏导致的斑点大小的增加。

4.在研究前和在第3周末期，按照Sierra’s SOP和研究特异性SOP，使用Epic 2000视网膜电流描记器，包括使用Ganzfield装置记录视网膜电流图（Electroretinogram）(ERGs)。由兽医眼科医师评估列成表的ERG数据。

在CNV诱导后第21天结束该研究。对器官和组织包括眼睛进行大致的尸体剖检和组织学检查。

结果

1.抗RTP801的siRNA在激光处理的动物的RPE/脉络膜中减少RTP801的表达，如在CNV诱导后第6天通过实时PCR（参见图10）测量的。

2.各单个猴子的对侧眼睛之间的渗漏和新生血管形成的斑点分级的比较显示，当和对照相比（关于渗漏结果，参见表11；关于新生血管形成的结果，参见表12）时，这两个病理特征在注射RTP801siRNA的眼睛中都得到减少。

3.和所有注射PBS的眼睛相比，在所有注射siRNA的眼睛中具有更高的渗漏或新生血管形成的临床相关性分级（2和3）的斑点的总数的计算再次显示，注射siRNA的眼睛受到较小的影响(参见图13,a+b)。

4.将斑点的渗漏和新生血管形成的总的分级数据进行统计学评估。通过计算对照右（R）眼和注射siRNA的左（L）眼的平均斑点分级之间的δ(δ=R-L)来分析所述siRNA和对照处理之间的差异的存在。使用非参数统计法，Wilcoxon符号秩检验（Wilcoxon signed ranks test）-单尾检验（one tail test）计算差异的显著性。每周（1、2和3）分开地分析血管造影照片的不同相（早期动脉、动静脉和晚期静脉）。

表1显示各组的从0开始的渗漏秩差（rank difference）的显著性（单尾检验）(p值<0.05以下划线标示)。在晚期血管造影照片中，第2和第3周中，相对于右眼(安慰剂处理的)，在左眼(siRNA处理的)中发现显著的渗漏等级降低。

表1

注意，晚期血管造影照片通常用于渗漏参数的评估。

表2显示各组的从0开始的新生血管形成(NV)秩差的显著性(p值<0.05以下划线标示)。

表2

在早期的第2和3周和动静脉期的第2周中，相对于右眼在左眼中发现显著的NV级别降低。

注意，早期血管造影照片通常用于新生血管形成参数的评估。

5.由于渗漏导致的斑点面积的增加（早期(动脉相)和晚期(静脉相)血管造影照片之间产生的）的定量形态测定评估显示，和对照(右眼,OD)相比，该参数在注射siRNA的眼(左眼,OS)内的激光斑点内显著减少。两个实例显示于图14中。所述图表显示了动物#3315和3300的左眼和右眼中的每一个斑点的面积的相对增加(以%表示)。

此外，要指出的是，在整个所有上述研究中，抗RTP-801siRNA对视网膜电流图(ERG)、对眼组织学或对其他器官和系统的结构和功能没有不利的影响。

概述上面的实验和结果：

1.在湿的与年龄相关的黄斑变性(湿AMD)的激光诱导的CNV模型中RTP801表达的遗传性(RTP801-/-)和治疗性s iRNA抑制都导致CNV体积的显著减小。

2.在小鼠和非人灵长类模型中获得阳性结果。

3.猴子中的病理学和ERG检查未在眼或任何其他器官或系统中显示任何siRNA介导的毒性。

C)RTP801SIRNA(REDD14)和抗VEGF抗体的组合治疗的功效

在上述小鼠CNV模型中检测RTP801 siRNA(REDD14)和抗VEGF抗体的组合治疗法在治疗其中发生CNV的疾病中的功效。

A)CNV体积的研究

如前面所述(Sakurai等人IOVS2003;44:3578-85和Sakurai等人IOVS2003;44:2743-2749)通过共聚焦荧光显微镜计算激光损伤3周后脉络膜新生血管形成(CNV)的体积。

在前面的研究中，我们发现抗VEGF-A抗体(Ab)以剂量依赖性的方式减少CNV的体积。选择1ng剂量的VEGF-A Ab进行REDD14+VEGF-A Ab组合研究，因为该剂量具有中等的抑制效果：VEGF-A Ab(1ng)减少CNV的大小达26±6%。

REDD14+VEGF-A抗体(Ab)研究的主要发现是：

·和单独的VEGF-A Ab相比，以较低的0.05μg的剂量加入REDD14减小CNV的大小达27±4%。

·和单独的VEGF-A Ab相比，以较高的0.25μg的剂量加入REDD14减少CNV的大小达55±3%。

B)CNV渗漏研究

实验1

设计本实验以鉴定VEGF和RTP801在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形成模型中的潜在的抑制的累加或协同治疗效应。

材料：

·REDD14(RTP801 siRNA)

·REDD8(负对照)

·抗VEGF抗体

·非特异性IgG(负对照)

如上所述在第0天诱导CNV；在第0天和第7天将受试材料注射入受试者。

在第1、2、3周通过荧光素血管造影术和在第3周通过CNV体积测量法评估结果，各受试组由10只眼睛组成。

实验组：

·VEGF Ab 0.5ng/眼

·VEGF Ab 1ng/眼

·VEGF Ab 2ng/眼

·VEGF Ab 4ng/眼

·REDD140.05ug/眼

·REDD140.1ug/眼

·REDD140.25ug/眼

·REDD140.05ug/眼+VEGF Ab 1ng/眼

·REDD140.1ug/眼+VEGF Ab 1ng/眼

·REDD140.25ug/眼+VEGF Ab 1ng/眼

对照组

·PBS

·非特异性IgG 2ng/眼

·REDD80.1ug/眼

·REDD80.1ug/眼+VEGF Ab 1ng/眼

结果

上述实验的结果显示于图23-24中。这些结果显示玻璃体内同时施用VEGF Ab和REDD14导致脉络膜新生血管形成和脉络膜血管渗漏的增加的剂量依赖性抑制，如以级别4的点的减少的发生率和级别1的点的增加的发生率所表示的。

使用以前发表的半定量分级（1-4）方案(Sakurai等人IOVS2003;44:2743-2749)的改进版本对血管造影照片分级。1级损伤被认为神经已经形成，即等同于完全阻止了疾病。4级损伤被认为病理显著，即等同于要在患者中进行处理的损伤。VEGF-A Ab(1ng)减少每眼4级损伤的发病率达38±8%和增加每眼的1级损伤发生率达66±43%。

REDD14+VEGF-A Ab组合的渗漏研究的主要发现是：

·和单独的VEGF-A Ab相比，以较低的0.05μg剂量加入REDD14减少4级损伤的发病率达66±12%。

·和单独的VEGF-A Ab相比，以较高的0.25μg剂量加入REDD14减少4级损伤的发病率达60±12%。

·和单独的VEGF-A Ab相比，以较高的0.25μg剂量加入REDD14使1级损伤的发生率加倍(100±34%)。

实验2

设计本实验以研究REDD14对RPE和神经视网膜中的基因表达的影响。

实验设计

分组：

·PBS

·REDD140.25mg

组的大小是5只眼睛。在第0天通过上述的激光处理诱导CNV；也在第0天注射受试材料，且在第0天和第5天通过RPE和神经视网膜中的基因表达的qPCR分析评估所述影响。

结果

上述实验的结果示于图25中。这些结果显示REDD14的施用导致：

·在RPE和神经视网膜中低于基线大约40%的RTP801表达的下调(也参见图26);

·在神经视网膜中高于基线大约70%的PEDF表达的上调(注意：在注射PBS的眼中，PEDF的表达下调至低于基线40%)；

·在RPE中VEGF164的表达下调至低于基线大约40%(注意：在注射PBS的眼中，VEGF164的表达下调20%)

·在RPE/脉络膜中MCP1的表达减少大约50%(图26)

来自两个实验的总的结论：

·RTP801和VEGF的同时抑制增强了对脉络膜新生血管形成和新血管（neovascular）渗漏的抑制作用。

·REDD14对RTP801表达的抑制不仅在CNV模型中阻止了PEDF的下调而且和基线相比增加其表达。

·RTP801表达的抑制导致应当具有抗炎症作用的MCP1的伴随下调。

·不受理论束缚，REDD14导致PEDF表达的增加也解释了观察到的VEGF和RTP801的同时抑制的协同效应

(注意：PEDF是众所周知的抗血管生成和神经保护因子。)

·不受理论束缚，REDD14导致MCP1表达的减少也解释了观察到的VEGF和RTP801的同时抑制的协同效应

(注意：MCP1是已知的参与AMD的发病机理的促炎趋化因子。)

可用于检测本发明的方法的其他AMD模型：

·Cc l-2或Ccr-2缺陷型动物-这些蛋白中的任一种的缺乏导致一些AMD的主要特征。在这些蛋白中存在缺陷的动物可用于检验本发明的方法。

关于AMD动物模型的其他信息，参见：Chader,Vision research42(2002)393-399;Ambati等人,Na ture Medicine 9(11)(2003)1390-1397;Tolentino等人,Retina 24(2004)132-138.

D)在激光诱导的CNV模型中，在各链上具有3’磷酸基团的REDD14抗RTP801 siRNA的活性和缺少3’磷酸基团的相同分子的活性的比较。

一般如上所述进行该实验并进行评估。用0.25ug REDD14 siRNA注射各小鼠（每组12只）的一只眼睛，但用REDD14NP siRNA注射另一只眼睛。

结果

两种siRNA同样有效地减小CNV的体积(图27)。

实施例7

涉及COPD和肺气肿的模型和结果

在下列动物模型中检测本发明的化合物：

*吸烟诱导的肺气肿模型：对香烟的长期暴露导致在几种动物例如小鼠、豚鼠中产生肺气肿。

*作为肺气肿的触发剂的肺蛋白酶活性。

*肺气肿的VEGFR抑制模型。

*啮齿类动物中的使用人嗜中性粒细胞/胰弹性蛋白酶的支气管滴注。

*MMP(基质金属蛋白酶)诱导的肺气肿。

*炎症诱导的肺气肿。

此外，可通过遗传方法(例如，携带TSK突变的小鼠)产生肺气肿模型，和可通过对肺气肿易感的改变例如肺损伤、肺泡发育不良、氧过多、糖皮质激素治疗和营养来产生肺气肿动物。

A.RTP801的缺乏对肺气肿小鼠模型中的疾病发展的影响的评估（使用RTP801敲除小鼠)

(1)吸烟(CS)诱导的炎症和细胞凋亡始于5只RTP801KO型的和5只对照野生型的4月龄的雄性小鼠。将小鼠接受强烈的CS(如Rangasamy等人中所描述的，参见上面)，进行7天。来自上述VEGFR抑制实验的KO和WT未处理小鼠也可用作本实验的未处理对照。随后用琼脂糖使肺膨胀，固定肺并包埋在石蜡中，通过下列评估KO小鼠中的发展性氧化应激（development oxidative stress）：

a)肺切片中的8-氧-dG的免疫化学定位和定量；

b)使用特异性抗体在肺切片中进行活性caspase 3的免疫组织化学定位和定量，或TUNEL阳性细胞的数目的定量估计；

c)肺提取物中的神经酰胺浓度的测量；

d)肺提取物中的caspase活性的测量。

(2)KO小鼠中的长期吸烟。

在6个月期间将6只KO和6只年龄匹配的WT雌性小鼠接受强烈的吸烟(每天5小时)。然后杀死小鼠，使用形态测定法估量平均隔间直径(肺气肿发展的参数)。

B.通过使用肺内递送RTP801失活性siRNA抑制内源RTP801进行的RTP801的缺乏对肺气肿小鼠模型中的疾病进展的影响的评估

在2组（每组10只小鼠）C57BL6小鼠中通过7天吸烟诱导CS-诱导的炎症。第1组：CS+对照siRNA(REDD8)siRNA的递送；第2组：CS+RTP801 siRNA(REDD14)。小鼠的对照组滴注任一种s iRNA但保持在室内空气条件下。如上述实验中那样使用基因敲除小鼠评估动物。

方法

对吸烟(CS)的暴露

使用制烟机（smoking machine）(Model TE-10,Teague Enterprises,Davis,CA,USA)燃烧2R4F参照香烟(每只烟2.45mg尼古丁;购自Tobacco Research Institute,University of Kentucky,Lexington,KY,USA)来进行（7小时/天，7天/周）暴露。以1.05L/分钟的流速从冒烟的香烟喷出烟雾，进行2秒，每分钟一次，进行总共8次喷烟，以提供35cm³的标准喷烟。通过一次燃烧5只香烟将制烟机调节至产生侧流烟雾(89%)和主流烟雾(11%)的混合物。就总的悬浮颗粒和一氧化碳（浓度分别为90mg/m3和350ppm）监控小室空气。

形态学和形态测定分析

在将小鼠暴露于CS或RTP801表达质粒的滴注后，用氟烷麻醉小鼠，如前面所述⁶在25cm的恒压下用0.5%的低熔点琼脂糖使肺膨胀。将膨胀的肺固定在10%的缓冲福尔马林中，然后包埋在石蜡中。用苏木精和伊红对切片(5μm)进行染色。使用Image Pro Plus软件(MediaCybernetics,Silver Spring,MD,USA)通过计算机辅助形态测定法确定平均肺泡直径、肺泡长度和平均线性截距（linear intercept）。对各组的肺切片进行编号，并用Nikon E800显微镜，20X透镜，通过对玻片编号不知情的研究者获得代表性图象(每肺切片15张)。

支气管肺泡灌洗(BAL)和表型确定

在暴露于CS或滴注RTP801表达质粒后，用戊巴比妥钠麻醉小鼠。离心(4°C下500′g)从小鼠的肺收集的BAL液，将细胞沉淀重悬浮于磷酸缓冲盐溶液中。确定灌洗液中细胞的总数，将2x10⁴个细胞通过细胞离心法(Shandon Southern Products,Pittsburgh,PA,USA)离心至载玻片上并用Wright-Giemsa染色法进行染色。按照标准的细胞学技术对300个细胞进行差别细胞计数（Differential cell count）。

肺中的肺泡细胞凋亡的细胞群体的鉴定。

为鉴定肺中进行细胞凋亡的不同肺泡细胞类型，在来自室内空气（RA）的小鼠和暴露于CS的小鼠的肺切片中进行活性caspase3的免疫组织化学染色。为鉴定肺中II型上皮细胞的细胞凋亡，在活性caspase3标记后，首先用抗小鼠表面活性蛋白C(SpC)抗体温育肺切片，然后再用抗兔德克萨斯红抗体温育。通过首先用抗小鼠CD31抗体温育切片，然后用生物素化的兔抗小鼠二抗温育来鉴定细胞凋亡的内皮细胞。在PBS中漂洗肺切片，然后用链霉抗生物素蛋白-德克萨斯红缀合的复合物进行温育。通过首先用大鼠抗小鼠Mac-3抗体，然后用抗大鼠德克萨斯红抗体温育切片来鉴定细胞凋亡的巨噬细胞。最后，对所有肺切片使用DAPI，温育5分钟，洗涤，并用Vectashield HardSet封固剂封片。分别在330-380nm和465-495nm下观察DAPI和荧光素。使用Nikon E800显微镜，40X透镜获得肺切片的照片。

活性caspase-3的免疫组织化学定位

使用抗活性caspase-3抗体进行活性caspase-3的免疫组织化学染色，使用macro用Image Pro Plus程序对活性caspase-3-阳性细胞进行计数。使用此处称为肺泡长度并以μm表示的肺泡特征的总数对计数进行标准化。肺泡长度和平均线性截距成反相关，即，当肺泡隔被破坏时，平均线性截距随总肺泡长度即总肺泡隔长度减少而增加。

Caspase 3的活性测定

按照厂商说明书使用荧光测定法在肺组织提取物中测量caspase-3/7的活性。用测定缓冲液匀浆急冻的肺组织(每组n=3)，然后超声处理，之后在800x g下离心。在除去细胞核和细胞碎片后，然后在室温下用前荧光底物（pro-fluorescent substrate）温育上清液(300μg蛋白)1小时，然后使用Typhoon phosphoimager(AmershamBiosciences,Inc.,Piscataway,NJ,USA)测量荧光强度。结果表示为特异性caspase-3底物切割率，caspase 3酶活性的单位表示，使用总蛋白浓度进行标准化。将活性重组caspase 3用作测定标准(0-4U)。不含底物的组织裂解物、单独的测定缓冲液和具有caspase 3抑制剂的裂解物用作负对照。

8-氧-dG的免疫组织化学定位

为进行8-氧-dG的免疫组织化学定位和定量，用抗8-氧-dG抗体温育来自暴露于CS的小鼠或用RTP801表达质粒滴注的小鼠的肺切片，然后利用InnoGenexTM Iso-IHC DAB试剂盒使用小鼠抗体进行染色。用macro(使用Image Pro Plus)对8-氧-dG-阳性细胞计数，使用所述的肺泡长度对所述计数进行标准化。

质粒DNA至小鼠肺的滴注

在不含内毒素的DNA分离试剂盒下制备RTP801表达载体和对照载体的质粒DNA。对于气管内滴注，在80ul无菌全氟化碳中递送50ug质粒DNA。全氟化碳的氧携带特性使其在这些体积上具有良好的耐受性，同时当进行气管内滴注时，其物化性质允许极其有效的远端肺递送。通过短暂的吸入氟烷来麻醉小鼠，用镊子轻轻地将舌向前拉出，通过钝圆的血管导管在舌的基部用全氟化碳滴注气管。

siRNA至小鼠肺的滴注

通过氯胺酮/赛拉嗪(115/22mg/kg)的腹膜内注射麻醉小鼠。通过5次连续的10μl递送，经鼻内滴注50μl体积的0.9%NaCl中的50μg的siRNA。在鼻内滴注结束时，保持小鼠的头向上1分钟以确保所有滴注的溶液流入内部。

关于其他信息，参见：Rangasamy T,Cho CY,Thimmulappa,RK,ZhenL,Srisuma SS,Kensler TW,Yamamoto M,Petrache I,Tuder RM,BiswalS.Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarettesmoke-iduced emphysema in mice.Submitted to Journal of ClinincalInvestigation；Yasunori Kasahara,Rubin M.Tuder,Carlyne D.Cool,David A.Lynch,Sonia C.Flores,和Norbert F.Voelkel.Endothelial Cell Death and Decreased Expression of VascularEndothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth FactorReceptor 2in Emphysema.Am J Respir Crit Care Med第163卷.pp737-744,2001;Yasunori  Kasahara,Rubin M.Tuder,LaimuteTaraseviciene-Stewart,Timothy D.Le Cras,Steven Abman,Peter K.Hirth,Johannes Waltenberger,和Norbert F.Voelkel.Inhibitionof VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema.j.Clin.Invest.106:1311-1319(2000);和关于主题的综述：Robin M.Tuder,Sharon McGrath和Enid Neptune,The pathological mechanisms ofemphysema models:what do they have in common？，PulmonaryPharmacology & Therpaeutics 2002.

结果

1.RTP801表达质粒的滴注在小鼠肺中导致肺气肿样表型，所述表型可通过(1)支气管肺泡灌洗细胞计数的增加(图15a);(2)肺中隔细胞的细胞凋亡(图15b)和肺泡直径的增加(图15c)来显示。

2.RTP801s i RNA(REDD14)的滴注导致肺中的RTP801表达减少(图17b)。

3.如由肺泡直径没有增大所证明的，在吸入6个月的香烟后，RTP801KO小鼠受到保护而免受肺气肿发展的损害。(图18)。

4.如由在吸入1周的香烟后炎性支气管肺泡细胞的数目减少所证明的，RTP801KO小鼠受到保护而免受吸烟诱导的炎症(图16,a-b)。

5.如由针对激活的caspase的肺切片染色所证明的，RTP801KO小鼠免受吸烟诱导的肺中隔细胞的细胞凋亡的损害(图16c)。

6.如由吸烟1周后炎症支气管肺泡细胞的数目减少所证明的，REDD14滴注的小鼠部分地免受吸烟诱导的炎症损害(图17a)。

7.如由针对激活的caspase的肺切片染色和由使用抗激活的caspase 3抗体的肺提取物的免疫印迹分析所证明的，REDD14-滴注的小鼠部分地免受吸烟诱导的肺中隔细胞的细胞凋亡的损害(图17c)。

实施例8.

涉及微血管病症的模型和结果

在许多下述的微血管疾病的动物模型中检测本发明的化合物。

1.糖尿病性视网膜病

RTP801在体外促进神经元细胞的细胞凋亡和活性氧物质的产生。本发明的发明者也发现在属于早产儿视网膜病(ROP)的模型的RTP801敲除(KO)小鼠中，在缺氧条件下，病理性新生血管形成减少，尽管VEGF升高，然而该基因的缺少不影响生理性新生视网膜NV。此外，在该模型中，RTP801的缺乏也免受缺氧性神经元细胞凋亡和高氧血管闭塞（hyperoxic vaso-obliteration）的损伤。

实验1

通过腹膜内注射STZ在8周龄的RTP801KO和C57/129s v野生型(WT)同窝出生的小鼠中诱导糖尿病。4周后，在1小时的暗适应后从左眼获得ERG(单一白色闪光（single white flash），1.4x10^4ftc,5ms)。使用伊文思蓝白蛋白渗透技术从双眼估计RVP。

结果

在糖尿病(DM)WT和DM KO(495±109对513±76mg/dl)之间，血糖没有差别,非糖尿病(NDM)WT和KO(分别为130±10对135±31mg/dl)之间也没有差别。和NDM WT(21.5±18.8μL/g/hr,n=9,p=0.055)相比，DM WT组中的RVP增加138%(51.2±37.9μL/g/hr,n=8)。相反地，当和DM WT小鼠相比时，在DM KO(9.5±8.5μL/g/hr,n=6,p=0.023)中RVP减少80%，导致糖尿病诱导的RVP减少140%。在DM WT小鼠中，和NDM WT相比，OP2(11%)、OP3(12%)和OP4(14%)的振荡效能（oscillatory potential）绝对时间以及B-波(23%)的振荡效能绝对时间延长(p<0.05)。A波没有显著地改变。当和NDM KO相比时，对于OP3和OP4，这些改变在DM KO小鼠中被标准化为大约100%，对于B波则为65%。

结论:RTP801的敲除在小鼠中改善了糖尿病诱导的RVP和ERG异常，暗示着该缺氧诱导型基因可在早期的糖尿病性视网膜病中起着重要作用。

实验2

在RTP801敲除小鼠和具有匹配的遗传背景的对照野生型小鼠中诱导糖尿病。此外，在C57Bl6小鼠中诱导其，随后将所述小鼠用于抗RTP801 siRNA和对照siRNA的玻璃体内注射。为进行糖尿病诱导，用链唑霉素(在过夜禁食后，施用STZ 90mg/kg/d，2天)注射小鼠。在整个研究过程中就血糖、体重和血细胞比容的改变监测动物生理学。注射媒介物的小鼠用作对照。通过玻璃体内注射1ug REDD14抗RTP801 siRNA或1ug抗GFP对照siRNA处理适当的动物。在研究过程中在第0天（当进行第一次STZ注射时）和在STZ注射后第14天注射2次siRNA。

在糖尿病持续4周后，通过对动物使用伊文思蓝(EB)染色技术来测量视网膜血管渗漏。在伊文思蓝(EB)测量前24小时，将导管植入小鼠的右颈静脉。按照标准的伊文思蓝方案在各动物的双眼中进行视网膜通透性测量。

结果

1.和野生型糖尿病小鼠相比，在RTP801KO糖尿病小鼠中视网膜血管渗漏减少70%(参见图20).

2.RTP801的敲除在小鼠中使ERG异常正常化：和NDM WT相比，在DM WT小鼠中，OP2(11%)、OP3(12%)和OP4(14%)的振荡效能绝对时间和B波(23%)的振荡效能绝对时间延长(p<0.05)。A波没有显著的改变。当和NDM RTP801KO相比时，在DMRTP801KO小鼠中，对于OP3和OP4这些改变被标准化为大约100%，对于B波则为65%(参见图21)。

3.和KO小鼠中的结果相似，和用抗GFP的对照siRNA进行玻璃体内注射的糖尿病小鼠相比,在用抗RTP801的REDD14siRNA进行玻璃体内注射的糖尿病小鼠中，视网膜血管渗漏减少50%(参见图22).

2.早产儿视网膜病（retinopathy of prematurity）

通过将受试动物暴露于缺氧和高氧条件诱导早产儿视网膜病，并随后检测对视网膜的影响。结果显示，RTP801KO小鼠免受早产儿视网膜病的损害，从而确认了RTP801抑制的保护作用。

3.心肌梗塞

通过左前降动脉连接（Left Anterior Descending arteryligation）在小鼠中诱导心肌梗塞（短期和长期的心肌梗塞）。结果：在RTP801KO小鼠中，在梗塞后24小时，在血液中，TnT和CPK-MB的水平降低，在梗塞后28天，获得更好的超声心动图(射血分数容积（ejection fraction volume）)。

4.微血管局部缺血性病症

用于估量局部缺血性病症的动物模型包括：

1.闭合性头部外伤(CHI)-实验性TBI产生系列促成神经学和神经代谢级联反应的事件，所述事件涉及行为缺陷的程度和范围。在麻醉的状况下诱导CHI，同时在覆盖中部额平面中的左半球的显露的颅骨的正上方从预先固定的高度让重物自由落体(Chen等人,J.Neurotrauma13,557,1996)。

2.暂时性大脑中动脉闭塞(MCAO)-在成年、雄性Sprague Dawley大鼠（300-370gr）中进行90至120分钟的暂时性局部缺血。所用的方法是管腔内缝合MCAO(Longa等人,Stroke,30,84,1989,和Dogan等人,J.Neurochem.72,765,1999)。简而言之，在氟烷麻醉下，将用聚L赖氨酸包被的3-0-尼龙缝合材料通过颈外动脉内的孔插入右颈内动脉(ICA)。将所述尼龙线推入ICA至右MCA起始处(20-23mm)。90-120分钟后，拉出线，关闭动物并让其恢复。

3.永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)-通过MCA的电凝法永久性地单侧诱导闭塞。两种方法导致大脑皮层的工作侧的局灶性大脑局部缺血，但让对侧不受损伤（对照）。如由Tamura A.等人,J Cereb Blood FlowMetab.1981;1:53-60对于大鼠所描述的，通过暂时的颅骨切除术暴露左MCA。用微双极凝固（microbipolarcoagulation）在靠近嗅束的内侧缘闭塞MCA和其豆状核纹状体分枝（lenticulostriatal branch）。缝合伤口，将动物放回26°C至28°C下的温暖室内的其家笼中。使用自动恒温器使动物的温度一直保持不变。

5.急性肾功能衰竭(ARF)

可使用脓毒症诱导的ARF或局部缺血-再灌注诱导的ARF检测用于治疗ARF的活性s i RNA。

1.脓毒症诱导的ARF

由Miyaji T,Hu X,Yuen PS,Muramatsu Y,Iyer S,Hewitt SM,Star RA,2003,Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renalfailure and multiple organ damage in aged mice，Kidney Int.Nov;64(5):1620-31描述脓毒症诱导的ARF的两个预测性动物模型。这两个模型是小鼠，优选地在年老的小鼠中的脂多糖的施用和盲肠结扎穿刺。

2.局部缺血-再灌注诱导的ARF

由Kelly KJ,Plotkin Z,Vulgamott SL,Dagher PC,2003January,.P53mediates the apoptotic response to GTP depletion after renalischemia-reperfusion:protective role of a p53inhibitor,J Am SocNephrol.;14(1):128-38描述该预测性动物模型。

在大鼠中，在45分钟的双侧肾动脉夹紧之后，随后释放钳子以进行24小时的再灌注来诱导局部缺血-再灌注损伤。在夹紧之前2小时和夹紧后30分钟，将250μg REDD14或GFP siRNA(负对照)注射入颈静脉。在夹紧后4小时和8小时通过尾静脉提供另外的250μg siRNA。抗GFP的siRNA用作负对照。通过手术前和手术后24小时的血清肌酸酐水平来监测ARF进展。在实验结束时，通过存在的股动脉管用温暖的PBS，然后用4%的多聚甲醛灌注大鼠。取出左肾并贮存在4%的多聚甲醛中以进行随后的组织学分析。急性肾功能衰竭通常定义为血清肌酸酐水平从基线的急剧增加。每dL至少0.5mg或每L 44.2μmol的血清肌酸酐的增加被当作急性肾功能衰竭的指标。在手术前0时和ARF手术后24小时测量血清肌酸酐。

为研究s i RNA在大鼠肾中的分布，静脉内施用Cy 3标记的19聚体平端siRNA分子(2mg/kg)（其在糖残基上具有交替的O-甲基修饰）3-5分钟，之后使用2光子共聚焦显微镜进行体内成像。共聚焦显微镜分析显示，肾内大多数siRNA集中在邻近肾小管细胞的内体区室中。内体和细胞质siRNA荧光在递送后第1个2小时期间都相对稳定，但在24小时时消失。

如从图19所证明的，在45分钟的肾双侧动脉夹紧处理（PBS处理）后血清肌酸酐的水平增加10倍。801siRNA(REDD14，SEQ In No.s 16和66)的4次注射(夹紧前2小时和夹紧后30分钟、4小时和8小时)显著地减少血清中的肌酸肝水平达40%(P<0.02)。这些结果表明801siRNA可使肾组织免受局部缺血性再灌注损伤的影响，从而减轻ARF的严重度。

实施例9

siRNA的制备

使用具有所有权的算法和已知的基因RTP801的序列(SEQ ID NO:1)，产生许多可能的siRNA的序列。基本上如此处所描述的制备上面详述的siRNA分子。

可通过本领域熟知的用于合成核糖核苷酸（或脱氧核糖核苷酸）的寡核苷酸的任何方法合成本发明的siRNA。例如，可使用商购获得的机器(可从Applied Biosystems等商购获得的)；根据此处公开的序列制备寡核苷酸。可使用本领域内熟知的方法（例如，参见美国专利6,121,426)连接化学合成的片段的交叠对。分开地合成所述链，然后在管中相互退火。然后，通过HPLC从未退火（例如因为其中的一种过量）的单链寡核苷酸分离出双链siRNA。关于本发明的siRNA或siRNA片段，可合成两种或更多种这样的序列并将其连接起来以用于本发明。

可通过本领域已知的方法例如描述于Usman等人,1987,J.Am.Chem.Soc.,109,7845;Scaringe等人,1990,Nucleic Acids Res.,18,5433;Wincott等人,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684;和Wincott等人,1997,Methods Mol.Bio.,74,59中的方法合成本发明的s i RNA分子,和可使用常用的核酸保护基团和偶联基团，例如5′末端上的二甲氧三苯甲基和3′末端上的亚磷酰胺。按想要的方式整合修饰的(例如，2′-O-甲基化)核苷酸和未修饰的核苷酸。

可选择地，可分开地合成本发明的核酸分子，然后在合成后通过，例如连接(Moore等人,1992,Science 256,9923;Draper等人,International PCT publication No.WO93/23569;Shabarova等人,1991,Nucleic Acids Research 19,4247;Bel lon等人,1997,Nucleosides & Nucleotides,16,951;Bel lon等人,1997,Bioconjugate Chem.8,204)，或在合成和/或去保护后通过杂交来将其连接在一起。

也可通过串联合成方法学，如美国专利申请公开号US2004/0019001(McSwiggen)描述的方法学合成本发明的siRNA分子，其中两条siRNA链以由可切割的连接体分开的单条连续寡核苷酸片段或链的形式合成，所述连接体随后被切割，从而提供分开的siRNA片段或链，所述siRNA片段或链可杂交从而允许所述siRNA双链体的纯化。所述连接体可以是多核苷酸连接体或非核苷酸连接体。关于其他信息，参见PCT公开号WO2004/015107(ATUGEN)。

如上所述，这样构建表A的siRNA（下面）以使交替的糖具有2’-O-甲基修饰，即从而修饰交替的核苷酸。在这些优选的实施方案中，在siRNA的一条链上，修饰的核苷酸是编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的核苷酸，在相对的链上修饰的核苷酸是编号为2、4、6、8、10、12、14、16和18的核苷酸。因此这些siRNA是具有上述的交替的2-0’-甲基修饰的平末端19聚体RNA分子。也以该方法构建表2和3的siRNA（下面）；表B的siRNA是具有交替的2-0’-甲基修饰的平末端19聚体RNA分子；表C的siRNA是具有交替的2-0’-甲基修饰的平末端21聚体RNA分子。

表A详述了产生的和随后合成的针对基因RTP801的各种siRNA分子。最后两栏显示为检查新分子活性而进行的两个实验的结果。简而言之，用要被检测的特异性新siRNA转染HeLa或Hacat细胞。然后使用抗RTP801多肽的抗体通过western印迹法确定RTP801多肽的表达。参见表A的两个右手栏，“-”表示失活或低活性的分子(其基本上不抑制RTP801基因的表达)；“+”表示具有一些抑制活性（RTP801基因表达的抑制活性）的siRNA分子，“++”表示具有更高抑制活性的分子，等等。此处公开的任一siRNA分子，特别是表A中描述的活性分子是新的分子且也被当作本发明的部分。

表A

注意在上述表A中，siRNA 1-50的有义链分别具有SEQ ID NOS:3-52，siRNA 1-50的反义链分别具有SEQ ID NOS:53-102。称为REDD 14的分子具有SEQ ID Nos 16(有义链)和66(反义链)。

注意在上面表C中，siRNA 123-171的有义链分别具有SEQ ID NOS:247-295，siRNA 123-171的反义链分别具有SEQ ID NOS:296-344。

实施例10

药物学和药物递送

可直接地或用病毒或非病毒载体递送本发明的核苷酸序列。当直接递送时，通常使序列具有核酸酶抗性。可选择地，如此处下面所描述的，可将序列整合入表达盒和构建体中以使所述序列在细胞中表达。所述构建体一般包含恰当的调控序列或启动子以使序列在被靶向的细胞中表达。

依照良好的医疗实践，考虑个体患者的临床状况、要被治疗的疾病、给药部位和方法、给药方案、患者年龄、性别、体重和医生已知的其他因素施用和剂量给药本发明的化合物或药物组合物。

因此，此处的治疗“有效量”由本领域已知的这些考虑因素确定。所述量必须对获得改善是有效的，所述改善包括但不限于提高的存活率或更快的恢复，或症状和由本领域技术人员选择作为合适的量度的其他指标的改善或消除。

治疗时间通常具有和疾病过程和药效的长度以及被治疗的患者物种成比例的长度。要注意，治疗人一般要比治疗小鼠和此处示例的其他动物的时间长。

可通过任何常规的给药途径施用本发明的化合物。应当指出，可以化合物或药物可接受盐的形式施用所述化合物，和其可单独地或作为活性组分和药物可接受的媒介物、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和载体一起施用。可口服、皮下或胃肠外包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内以及鞘内和通过输注技术施用化合物。化合物的植入体也是有用的。可制备用于注射的液体形式，该术语包括皮下、经皮肤、静脉内、肌内、鞘内和其他胃肠外施用途径。液体组合物包括含有和不含有有机增溶剂的水溶液、水或油悬浮液、含有食用油的乳剂以及相似的药物媒介物。此外，在某些环境下，可将用于本发明的新的治疗法的组合物形成用于鼻内施用等的气雾剂。被治疗的患者是温血动物，特别是哺乳动物，包括人。药物可接受的媒介物、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和载体以及植入体通常是指不和本发明的活性成分反应的惰性的、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或胶囊化材料。

当胃肠外施用本发明的化合物时，通常以单位剂量注射形式（溶液、悬浮液、乳剂）配制其。适合于注射的药剂包括无菌的水溶液或分散体和用于重构成无菌注射液或分散体的无菌粉末。媒介物可以是包含例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。

可通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂保持适当的流动性。非水媒介物例如棉子油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、向日葵油或花生油和酯例如十四烷酸异丙酯,也可用作用于化合物组合物的溶剂系统。此外，可加入增强所述组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可通过各种抗菌和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的作用。在许多情况下，想要包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶产生可注射的药物形式的延长的吸收。然而，根据本发明，使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂必须和所述化合物相容。

当想要时，可通过将用于实施本发明的化合物整合入所需量的合适的溶剂（具有各种其他组分）中来制备无菌注射液。

可以注射剂的形式给患者施用本发明的药剂，所述注射剂包含任何相容的媒介物，例如各种载体、佐剂、添加剂和稀释剂；或可以缓释皮下植入体或被靶向的递送系统的形式胃肠外施用本发明的化合物，所述被靶向的递送系统是例如单克隆抗体、载体递送（vectoreddelivery）、离子电渗、聚合物基质、脂质体和微球体。用于本发明的递送系统的实例包括美国专利5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196和4,475,196。许多其他这样的植入体、递送系统和模块对于本领域技术人员来说是熟知的。

可通过口服给患者施用用于本发明的化合物的药剂。可使用常规方法例如以片剂、混悬剂、溶液、乳剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂等施用所述化合物。通过口服或静脉内递送其且保持生物学活性的已知技术是优选的。在一个实施方案中，一开始可通过静脉内注射以使血液水平达到合适的水平来施用本发明的化合物。然后通过口服剂型保持患者的水平，尽管依赖于患者的状况和如上说明的，可使用其他施用形式。

一般地，在每天一剂或每天2次或3次或更多次，进行1-2周或更长的时期，优选地24至48小时的方案中，或在1-2周的时期或更长的时期期间连续输注的方案中，用于人的化合物的活性剂量在每天1ng/kg至大约20-100mg/kg体重、优选地每天大约0.01mg至2-10mg/kg体重的范围内变动。

本发明的化合物至眼睛的施用

可局部地或以注射的形式例如玻璃体内注射、视网膜下注射或两侧注射的方式给眼睛施用本发明的化合物。

可在Tolentino等人,Retina 24(2004)132-138;Reich等人,Molecular vision 9(2003)210-216中找到关于本发明的化合物的施用的信息。

本发明的化合物的肺部施用

优选通过包含这些组合物/化合物的气雾剂的吸入，或通过所述组合物的鼻内或气管内滴注将本发明的治疗组合物施用入肺中。在脂质体中配制所述组合物可有益于吸收。此外，所述组合物可包含PFC液体例如全氟溴烷，且所述组合物可配制为本发明的化合物和聚乙烯亚胺(PEI)的复合物。

关于药物组合物的肺部递送的其他信息，参见Weiss等人,Humangene therapy 10:2287-2293(1999);Densmore等人,Moleculartherapy 1:180-188(1999);Gautam等人,Molecular  therapy3:551-556(2001);和Shahiwala和Misra,AAPS PharmSciTech5(2004)。此外，siRNA的呼吸系统制剂描述于Davis等人的美国专利申请2004/0063654。

用于本发明的化合物的提高的递送的其他制剂可包括非配制的化合物、共价地结合至胆固醇的化合物和结合至靶向性抗体的化合物(Song等人,Antibody mediated in vivo delivery of smallinterfering RNAs via cell-surface receptors,Nat Biotechnol.2005Jun;23(6):709-17)。

Claims (28)

1.治疗患者的方法，其包括给患者施用以有效地治疗该患者的量包含RTP801抑制剂的药物组合物，所述患者患有呼吸系统病症、眼病、微血管病症、或脊髓损伤或疾病。

2.权利要求1的方法，其中所述眼病是黄斑变性。

3.权利要求1的方法，其中所述呼吸系统病症是COPD。

4.权利要求1的方法，其中所述呼吸系统病症是哮喘。

5.权利要求1的方法，其中所述呼吸系统病症是慢性支气管炎。

6.权利要求1的方法，其中所述呼吸系统病症是肺气肿。

7.权利要求1的方法，其中所述微血管病症是糖尿病性视网膜病。

8.权利要求1的方法，其中所述微血管病症是急性肾功能衰竭。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抑制剂包括包含连续核苷酸的多核苷酸，所述连续核苷酸具有足够长度的且与存在于SEQ ID NO:1所示的RTP801基因序列内的序列同源从而允许抑制剂和所述基因杂交的序列。

10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抑制剂包括特异性结合存在于多肽内的表位的抗体，所述表位包含其序列示于图2(SEQID No:2)的连续氨基酸。

11.用于治疗患有呼吸系统病症、眼病、微血管病症或脊髓损伤或疾病的方法，其包括给所述患者施用包含治疗有效量的多核苷酸RTP801抑制剂的药物组合物，从而治疗所述患者。

12.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸是siRNA。

13.权利要求12的方法，其中所述siRNA包含连续核苷酸，所述连续核苷酸具有和表A-C(SEQ ID NOs:3-344)中任一所示的任一序列同一的序列。

14.权利要求11的方法，其中所述抑制剂选自siRNA分子、包含siRNA分子的载体、可表达siRNA分子的载体和内源地加工成siRNA分子的分子。

15.治疗有效量的RTP801抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于在患有呼吸系统病症、眼病、微血管病症或脊髓损伤或疾病的患者中促进恢复。

16.权利要求15的用途，其中所述眼病是黄斑变性。

17.权利要求15的用途，其中所述呼吸系统病症是COPD。

18.权利要求15的用途，其中所述呼吸系统病症是哮喘。

19.权利要求15的用途，其中所述呼吸系统病症是慢性支气管炎。

20.权利要求15的用途，其中所述呼吸系统病症是肺气肿。

21.权利要求15的用途，其中所述微血管病症是糖尿病性视网膜病。

22.权利要求15的用途，其中所述微血管病症是急性肾功能衰竭。

23.权利要求15-22中任一项的用途，其中所述抑制剂包含含有连续核苷酸的多核苷酸，所述连续核苷酸具有足够长度的且与SEQ IDNO:1所示的RTP801基因序列内的序列同源从而允许所述抑制剂和所述基因杂交的序列。

24.权利要求15-22中任一项的用途，其中所述RTP801抑制剂是特异性结合存在于多肽内的表位的抗体，所述表位包含其序列示于图2(SEQ ID No:2)的连续氨基酸。

25.权利要求15-22中任一项的用途，其中所述多核苷酸下调基因RTP801的表达。

26.权利要求15-22中任一项的用途，其中所述多核苷酸是siRNA。

27.权利要求26的用途，其中所述siRNA包含具有和表A-C(SEQID NOs:3-344)中任一所示的任一序列同一的序列的连续核苷酸。

28.权利要求25的用途，其中所述抑制剂选自siRNA分子、包含siRNA分子的载体、可表达siRNA分子的载体和内源地加工成siRNA分子的分子。

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