CN102844039B

CN102844039B - 包含植物乳杆菌素的生物质的制备方法及其在医学领域的用途

Info

Publication number: CN102844039B
Application number: CN201180013649.1A
Authority: CN
Inventors: G·朱利亚尼; A·本纳杜斯; M·戈贝蒂; R·迪家格诺; M·德安格利斯; M·加拉索
Original assignee: Giuliani SpA
Current assignee: Giuliani SpA
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2011-01-04
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2031-01-04
Also published as: WO2011086589A1; MX2012007970A; IT1399793B1; US20140348807A1; CN102844039A; RU2566999C2; JP5947220B2; JP2013516981A; ES2631459T3; CA2785634A1; WO2011086589A9; EP2523673B1; EP2523673A1; BR112012017300A2; RU2012134407A; US20130059790A1; ITRM20100004A1

Abstract

本发明涉及一种生物质的制备方法，该生物质包括一种或多种植物乳杆菌素A、N或K，连同用于制备的乳酸菌，及其用途，以刺激肠细胞或人表皮角质形成细胞的屏障功能。

Description

包含植物乳杆菌素的生物质的制备方法及其在医学领域的用途

技术领域

本发明涉及一种包含植物乳杆菌素（plantaricin）的生物质的制备方法及其在医学领域的用途。特别是，本发明涉及植物乳杆菌素A、N或K或它们的混合物的制备方法，或者包含一种或以上上面提到的植物乳杆菌素连同用于制备的乳酸菌的生物质的制备方法，及它们用于激发肠细胞或人表皮角质形成细胞的屏障功能的用途。

背景技术

已经知道，表皮和肠壁具有对抗外部环境及其中有害物质的屏障功能。由于各种各样的因素，表皮和肠壁的屏障功能可被减弱。其中一种更常导致表皮屏障功能改变的情形是暴露于各种引发环境因素中。在正常情况下，无论如何，表皮通过导致达到“稳态”和足够的耐受性等级的适应，能够适应可能的外源性损伤。表皮被刺激性洗涤剂和化学物质（有机溶剂、肥皂、洗涤剂溶液）持续侵袭，例如，不仅会破坏表皮表面膜的脂质成分，还会破坏角质层细胞间的脂质，导致屏障功能退化。

这样会导致轻度的皮炎，其特征在于水分经皮流失增加、少量脱屑和角质层弹性损失，可能随之形成小型连续表面溶解（solution）。此较轻的刺激状态（经常是亚临床的）触发修复过程，该过程通过增加脂质合成和激发基底角质形成细胞增殖活性，达到新的平衡并修复屏障功能。

当表皮屏障不再适当地执行足够的固有防御功能，由细胞因子释放触发的炎症性皮肤病症发作的风险增加，导致原位产生致炎的（flogogenic）介质和自由基。后者，除通过氧化机制对DNA和蛋白质造成损伤之外，还可对表皮细胞膜产生过氧化作用。

尽管表皮不含有血管，但是其包含少量的必不可少的水以维持生理平衡和角质组织完整性。来自表皮毛细血管的水流过真皮表皮交接处以及角质细胞行之间的通道，其水平达到与大多数组织类似的水平，即在深入区域（紧密的角质）大约为60-70%，在较浅表的区域（间断的角质）大约为10-35%。事实上，同样在更外部的部分，与空气接触的表皮能够维持水分储存是基于两个特殊的功能：防止液体蒸发的屏障作用和角质层的整体亲水作用（持水能力），这是由高吸湿性颗粒的存在导致的。基于间断（disjunct）角质层的最薄角质细胞层逐渐剥离以及湿脂类重叠膜的试验表明，屏障功能未受显著作用，同时，另一方面，通过移除底下紧密角质层的深层，屏障功能逐渐退化，众所周知紧密角质层的水泥墙结构，其具有由丝集蛋白紧密角蛋白簇（flaggrin compacted keratin clusters）和硬质蛋白质包封组成的角质细胞砖。电子显微镜显示，角质细胞被改性桥粒（desmosomial）板（角化粒（corneosomes））密封并且被嵌入在称为内角质细胞混凝土的脂质粘接剂中，产生柔性膜和几乎不能穿过的屏障。应激状态可能会急性或慢性地影响皮肤屏障，并且为对抗相同的情形，身体会产生一系列稳态机制，导致表皮具有监测能力，并且当独立于有害急性病原的产生而发生对抗失败时能够恢复效率。表皮对长期暴露于低湿度的空气（如代表性地在干燥气候出现）引起的慢性皮肤应激产生反应，其通过补偿适应性现象导致基底细胞增殖增加，以及随后角质层和表皮作为一个整体的厚度增加。角质小体（Odland bodies）和角质细胞间脂质（包括通常的成分）的产生和胞外分泌也增加了，这样表皮就能够以一种更好的方式保留水资源。在任何情况下，水分缺乏都会导致相变，以至于角质细胞间混凝土的液体-脂质分层，随后结晶。结果，对于由肌肉-关节运动和外在动态刺激引起的牵引，产生较小的可塑性和硬度，因此容易产生微小损伤。另外一个类似适应性反应的含义包括角化过度：增殖层的增加未被相应的角质细胞较高的剥脱率平衡，角质细胞不是被放大，而是保持嵌入在角质大规模集群中并且仅仅以大规模剥离。此外，慢性环境应激会激活与肥大和真皮肥大细胞脱粒相关的炎症组织学方面的细胞因子级联。这可以解释在冬天观察到的炎症性皮肤病理学恶化。对抗表皮屏障的每一个急性损伤会通过皮肤细胞的参与引起细胞因子反应应，其作用反映在角质形成细胞和下面的真皮上，导致重要的形态学和功能性结果，目的在于修复屏障功能、纹理化表皮表面，以及，最重要的是，刺激成纤维细胞的活性，基于此可改善真皮的紧密性和充盈度。

事实上为修复屏障功能所采用的方法是基于使用修复和水分调节的物质，这些物质适用于避免由屏障功能改变导致的皮肤防御不足。这些物质是具有补水和重组功能的化合物。很多真皮化妆品能使皮肤补水并且根据它的修复功能，有利于皮肤再生。然而通过对粗糙表面的简单“美容掩盖”能发挥相同作用，但这不具有任何实质上的治疗作用，治疗作用的发挥将不得不通过旨在修复皮肤形态功能完整性的修复和再生活性。

最近有概述称细菌适合于释放并检测作为对环境状况改变的反应的信号分子，包括其细胞密度和/或同一生态系统中存在的其它种微生物细胞种类数量的变化（Sturme等，2007.Making sense of quorum sensing in lactobacilli:a special focus on Lactobacillus plantarumWCFA1.（理解乳酸杆菌的群体感应：对Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）WCFA1的特别关注），Microbilogy（《微生物学》)第153卷3939-3947页）。对于乳酸菌，根据“群体感应”（QS）机制发生的这些反应，包括命名为2型（AI-2，主要为呋喃酮类衍生物）自诱导剂的信号分子，其利用LuxS酶活性合成（Miller e Bassler，2003.LuxS quorum sensing:morethan just a numbers game（LuxS群体感应：不仅仅是一个数字游戏），Curr Opin Microbiol（《当前生物学观点》）第6卷191-197页），或者命名为肽信息素或肽自诱导剂（AIP）的信号分子（Nakajama等，2001.Gelatinase biosynthesis-activating pheromone:a peptide lactone thatmediates a quorum sensing in Enterococcus faecalis（明胶酶生物合成激活信息素：一种在粪肠球菌中介导群体感应的肽内酯），Mol Microbiol（《分子微生物学》)第41卷145-154页）。最近已经证明了植物乳杆菌（L.plantarum）WCFS1基因组包含大量编码AIP肽的基因，和编码参与“群体感应”机制中其它功能的其它基因（Sturme等，2007.Making sense of quorumsensing in lactobacilli:a special focus on Lactobacillus plantarum WCFA1（理解乳酸杆菌的群体感应：对Lactobacillus plantarum WCFA1的特别关注），Microbilogy（《微生物学》）第153卷3939-3947页）。一些研究已经证明了旨在合成植物乳杆菌素型肽信息素的系统参与种内细胞通讯机制。在这种情况下，肽信息素作为测量分子合成物种（species）的细胞密度的工具使用（Diep等，1994.The gene encoding plantaricin A,a bacteriocin from Lactobacillus plantarumC11,is located on the same transcription unit as an agr-like regulatory system（编码植物乳杆菌素A（一种来自Lactobacillus plantarum C11的细菌素）的基因，与类agr调节系统位于相同的转录单元），Appl Environ Microbiol（《应用环境微生物学》)第60卷160-166页）。其它的研究也证明了植物乳杆菌素型肽信息素可参与种间细胞通讯机制。特别是，竞争性微生物的存在可激活参与微生物拮抗机制的调节系统（Maldonado等，2004.Production of plantaricin NC8by Lactobacillus plantarum NC8is induced in the presence of different types of Gram-positivebacteria（不同类型革兰氏阳性菌的存在诱导Lactobacillus plantarum NC8产生植物乳杆菌素NC8），Arch Microbiol（《微生物学文献集》）第181卷8-16页）。存在高细胞密度的其它微生物种类时，肽信息素有利于磷酸化反应的级联系列，包括代谢调节的复杂现象，其导致合成特别地充当细菌素型抗菌化合物（例如植物乳杆菌素A、K和N）的信号分子（Hauge等，1998.Plantaricin A is an ampkiphilic alpha-helical bacteriocin-like pheromone which exertsantimicrobial and pheromone activities through different mechanisms（植物乳杆菌素A是一种类两性（ampkiphilic）α螺旋细菌素信息素，其通过不同的机制发挥抗菌和信息素活性），Biochemistry（《生物化学》)第37卷16026-16032页）。

尽管原核细胞和真核细胞中的细胞通讯机制已经被部分阐明，但是关于细菌（例如，肽信息素）和人类肠粘膜细胞的“群体感应”机制包含的信号分子的相互作用的文献非常有限。唯一的例子是CSF五肽，其由Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）益生菌微生物合成，作为参与感受态和产孢现象的分子（Fujija等，2007.The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSFcontributes to intestinal homeostasis via OCTN2,a host cell membrane transporter（Bacillus subtilis群体感应分子CSF通过宿主细胞膜转运体OCTN2促进肠道内稳态），Cell Host Microbe（《细胞宿主微生物》）第1卷299-308页）。已经证明了所述五肽适于诱导p38MAP激酶、B激酶（Akt）和低温耐受性（cryotolerance），从而有利于在肠道级别防止氧化损伤和增强屏障功能。此外在本领域当前状态，没有出版物或者专利关注与人表皮有关的细菌细胞通讯机制包含的信号分子的作用。

发明内容

本发明的作者现在已经发现了植物乳杆菌素，特别是植物乳杆菌素A，对人表皮和肠内细胞中的角质形成细胞的屏障功能发挥积极作用。

有关用细菌单培养物（种内）制备植物乳杆菌素的方法的研究是已知的。然而，对目标微生物的培养，当扩大到为了治疗目的制备信号分子的工业级别时，所述培养将在复杂的和非常昂贵的培养基中完成。

本发明的作者现在已经开发出一种使用两种特定乳酸菌的共培养物制备植物乳杆菌素的方法，其获得的产量比依据已知技术的更高。特别是，L.plantarum（植物乳杆菌）DC400（于2009年12月21日以编号DSM 23213存放于德国布朗斯维克（Braunschweig）D-38124因荷夫街(Inhoffenstr.)7B的DSMZ）与L.rossiae（红色乳杆菌）DPPMA174（于2009年12月21日以编号DSM 23214存放于德国布朗斯维克（Braunschweig）D-38124因荷夫街(Inhoffenstr.)7B的DSMZ）的共培养物的培养适于激活植物乳杆菌素型肽信息素的合成（特别是植物乳杆菌素A），得到的浓度比L.plantarum DC400单培养物（DSM 23213）存在时高大约50倍。此外，已经证明L.plantarum DC400（DSM 23213）与同样由“天然酵头（naturalsourdough）”分离得到的其它种的乳酸菌的培养物，在与L.Rossiae一起时不适于刺激肽信息素的合成。本发明方法的另一个重要方面是，植物乳杆菌素A的合成不仅仅在乳酸菌实验室培养经常采用的培养基中是可行的，而且在葡萄汁、乳清以及水果和蔬菜制品的水提物中也是可行的。

根据已知技术，没有出版物或专利披露了植物乳杆菌素A型（PlnA）的合成，作为存在于相同消化道生态系统中存在的两种乳酸菌（例如，L.plantarum和L.sanfranciscensis）共培养的反应机制，作为“天然酵头”用于烘焙的发酵制品的制造。此外根据文献，未报道过相对于单培养条件（种内），共培养（种间）合成的植物乳杆菌素A增加。另外，如上所述，已知的方法使用非常昂贵和复杂的培养基。

此外，惊奇地发现本发明方法得到的生物质包含与L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）乳酸菌相关的一种或多种植物乳杆菌素，在增强表皮或者肠壁级别的屏障功能时比单独的植物乳杆菌素发挥更高的效力。

本发明的乳酸菌属于Lactobacillus（乳杆菌）的种并且已经从“天然酵头”中分离，在南意大利用于传统的面包生产。

一项生物技术协议涉及所述两种细菌在CDM（化学成分确定的培养基）、WFH（小麦面粉水解物）（Gobbetti，1998.The sourdough microflora:interactions of lactic acid bacteria andsourdoughs（酵头菌群：乳酸菌和酵头的相互作用），Trends Food Sci Technol（《食品科学技术动态》）第9卷267-274页）、葡萄汁（稀释为1%的可溶性碳水化合物，加入0.5%的麦芽糖和0.5%的酵头提取物，pH5.6）、乳清（加入0.5%的麦芽糖和0.5%的酵头提取物，pH5.6）或蔬菜和水果制品的水提物（加入0.5%的麦芽糖和0.5%的酵头提取物，pH5.6）中在30-37℃共培养18-24小时，这已被标准化和优化。培养结束时，通过离心分离法细胞可以或者不从液体培养液（broth-culture）中除去，然后通过干燥或冷冻干燥使上清液经历脱水过程。

下面介绍配制基于植物乳杆菌素A的制备物的生物技术协议的方案。

乳酸菌培养物在30℃增殖

持续24小时，清洗，悬于水中

细胞密度为9.0log ufc/ml，并且

培养基联合接种（co-inoculation）（1-4%）

（CDM、WFH、葡萄汁、乳清、水果和蔬菜制品的水提物）

↓

在30-37℃培养18-24小时

↓

通过离心除去细胞

↓

通过干燥或冷冻干燥使上清液脱水

↓

配制用于护肤产品应用的制备物

当将L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）在共培养条件下在如上所述任何一种底物上进行培养时，检测到合成的植物乳杆菌素A的浓度为2.5-4.0μg/mL。在单培养条件下，通过L.plantarum DC400（DSM 23213）合成的植物乳杆菌素A的浓度为约0.06μg/mL。在与其它乳酸菌种（例如Pediococcus pentosaceus（戊糖片球菌）、Lactobacillus pentosus（戊糖乳杆菌）、Lactobacillus brevis（短乳杆菌）、Lactobacillus rossiae（红色乳杆菌）、Lactobacillus rhamnosus（鼠李糖乳杆菌））共培养的条件下，合成的植物乳杆菌素A明显减少。在与L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养的条件下，其它肽信息素的合成，如植物乳杆菌素K和N型被检测到，尽管与植物乳杆菌素A相比浓度较低，并且特别地范围是0.02-0.06μg/ml。按照一种可能的配方，如用重建表皮模型和跨膜电阻（TEER）试验已经证明的那样，2.5μg/ml的植物乳杆菌素A刺激了屏障功能。使用适于再生肠粘膜的Caco-2/TC7肠细胞获得了类似的结果。

根据使用微生物学技术、色谱的技术以及体外和离体试验对细胞培养物进行的补充分析，L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）的共培养从未在之前的研究中使用过，按照本发明，能够：（i）合成参与种间细胞通讯机制的信号分子，其浓度在单个生态系统中其它乳酸菌群体（association）存在时不能检测到；（ii）合成植物乳杆菌素A和其它植物乳杆菌素（K和N），也是采用低成本的底物；以及（iii）具有保护作用，其增强了表皮和肠细胞级别的屏障功能，从而证明了原核细胞合成的信号分子也可以被真核细胞检测到。

因此，本发明的一个具体目的是提供一种用于合成生物质的生物技术方法，该生物质包含或由以下组成：至少一种植物乳杆菌素，其选自植物乳杆菌素A、K或N，优选地为A，或者它们的混合物，以及Lactobacillus plantarum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM23214乳酸菌，或者用于制备一种或多种选自植物乳杆菌素A、K或N，优选地为A的植物乳杆菌素，或者它们的混合物的生物技术方法，所述方法包含以下步骤或由以下步骤组成：

a）培养增殖Lactobacillus plantarum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌；

b）对选自CDM、WFH、葡萄汁、乳清或水果和蔬菜制品提取物的底物，利用步骤a）中限定的乳酸菌的水性悬液，进行联合接种；

c）培育（incubation）；以及，任选地，

d）对培养液进行离心，以除去乳酸菌细胞。

具体地，来自步骤a）的悬液中，每种乳酸菌的细胞密度可为约9.0Log ufc/ml并且将其以基于底物体积的1-4%范围的百分比加入到底物中。培育步骤可在30-37℃（优选30℃）的温度下进行，持续18-24小时，优选18小时，同时可在10000×g，4℃时离心15分钟。

本发明方法可进一步包含步骤e），利用干燥或冷冻干燥对步骤d）中获得的上清液进行脱水。

本发明进一步的目的是按照上述方法可得到的或得到的生物质，包含或由以下组成：选自植物乳杆菌素A、N或K的至少一种植物乳杆菌素或它们的混合物以及Lactobacillusplantarum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌。

本发明进一步涉及药物组合物或者化妆品组合物，其包含或者由以下组成：如上所定义的生物质，作为一种活性成分，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

本发明的一个特定方面进一步指如上所定义的生物质或组合物用于制备药物以增强表皮或肠壁的屏障功能或用于伤口愈合的用途。

Lactobacillus plantarum DSM 23213或者Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌或者它们的混合物是本发明进一步的目的。

此外，本发明涉及选自植物乳杆菌素A、K或N（优选为A）中的一种或多种植物乳杆菌素的用途，所述植物乳杆菌素用于制备药物以增强表皮或肠壁的屏障功能，或用于使伤口愈合。

现将根据优选的实施方案，特别是参照包含的附图，以说明性但不是限制性的方式描述本发明。

附图说明

图1a显示了对由Lactobacillus plantarum DC400（DSM 23213）和Lactobacillus rossiaeDPPMA174（DSM 23214）共培养而获得的发酵液中游离细胞上清液的电喷雾-电离（ESI）离子阱MS（nano-ESI/MS-MS）耦合多维HPLC（MDLC）分析的结果。图1b显示了基于特定采集时间采用与植物乳杆菌素A相关的m/z比率从图1a的真实色谱图获得的色谱图。图1c显示了MS/MS图谱，其基于图1a色谱图中观察到的1493.7m/z比率检测物种。

图2显示了植物乳杆菌素A的浓度，所述植物乳杆菌素A由Lactobacillus plantarumDC400（DC400）、L.plantarum DPPMA 20（DPPMA20）、Lactobacillus pentosus 12H5（12H5）、Lactobacillus rossiae DPPMA174（DPPMA174）和Pediococcus pentosaceus 2XA￡（2XA3）单培养物以及L.plantarum DC400跟L.plantarum DPPMA 20（DC400-DPPMA20）、L.pentosus12H5（DC400-12H5）；L.rossiae DPPA174（DC400-DPPMA 174）或P.pentosaceus 2XA3（DC400-2XA3）的共培养物合成。数据是三个一式三份实验的平均值。

图3显示了Lactobacillus rossiae DPPMA174的生长动力学。单培养（●）；与Lactobacillusplantarum DC400共培养（○）；单培养，带有纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）（Δ）；以及单培养，带有化学合成的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）（▲）。纯化的植物乳杆菌素A对应于用L.plantarum DC400和L.rossiae DPPMA174共培养合成的植物乳杆菌素A。数据是三个一式三份实验的平均值。

图4显示了Lactobacillus rossiae DPPMA174经18小时培养后表达的蛋白质经电泳二维分析的部分凝胶。板A，单培养；板B，与Lactobacillus plantarum DC400共培养；以及板C，在纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）存在下的单培养。椭圆形或三角形标记的数字指的是用L.plantarum DC400或纯化的植物乳杆菌素A培养时表现出表达水平升高或降低的蛋白质。菱形或双三角标记的数字指的是只在与L.plantarum DC400共培养时表现出表达水平升高或降低的蛋白质。

图5显示了分别暴露于PBS缓冲液、植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）或包含2.5μg/ml植物乳杆菌素A的生物质，在0和24小时后重建表皮的跨膜电阻（TEER）（Ohms×cm²）。数据是三个一式三份实验的平均值。

图6显示了用纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）培育24、48和72小时后测量为中性红吸收的Caco2/TC7细胞活力（viability），所述纯化的植物乳杆菌素A由Lactobacillusplantarum DC400（DC400）单培养或与Lactobacillus rossiae DPPMA174（DC400-DPPMA174）共培养产生。按照植物乳杆菌素A的色谱条件洗脱的L.rossiae DPPMA174单培养的纯化馏分（fraction），已被用作阴性对照（DPPMA174）。另一个阴性对照是DMEM培养基（DMEM）。化学合成的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）已被用作阳性对照（PlnA）。数据是三个一式三份实验的平均值。星号表明相对于阴性对照存在显著差异（P<0.01）。

图7显示了单独用γ-干扰素（IFN-γ）（1000U/ml）和用IFN-γ+纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml)（IFN-γ+DC400-DPPMA174）培育24、48和72小时后，测量为中性红吸收的Caco2/TC7细胞活力。纯化的植物乳杆菌素A来自Lactobacillus plantarum DC400（DC400）和Lactobacillusrossiae DPPMA174的共培养。DMEM培养基被用作阴性对照（DMEM）。化学合成的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）和IFN-γ被用作阳性对照（PlnA）。数据是三个一式三份实验的平均值。星号表明相对于阴性对照存在显著差异（P<0.01）。

图8显示了Caco2/TC7细胞在培育24和48小时后的跨膜电阻（TEER）（Ohms×cm²）。培育是在以下环境中进行的：来自Lactobacillus plantarum DC400（DC400）单培养的纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）；来自L.plantarum DC400与Lactobacillus rossiae DPPMA174（DC400-DPPMA174）共培养的纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）；化学合成的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）（PlnA）；来自L.plantarum DC400和L.rossiae DPPMA174（IFN-γ+DC400-DPPMA174）共培养的γ-干扰素（IFN-γ）（1000U/ml）和纯化的植物乳杆菌素A；以及IFN-γ和化学合成的植物乳杆菌素A（PlnA+IFN-γ）。DMEM培养基（DMEM）被用作阴性对照。数据是三个一式三份实验的平均值。星号表明相对于阴性对照存在显著差异（P<0.01）。

图9显示了分别用对照、植物乳杆菌素A或包含植物乳杆菌素A的生物质处理角质形成细胞的伤口愈合试验的结果。

图10显示了用对照、植物乳杆菌素A或包含植物乳杆菌素A的生物质处理的伤口边缘之间的距离。

图11显示了用对照、植物乳杆菌素A或包含植物乳杆菌素A的生物质处理的伤口愈合增加百分比。

图12显示了人2544NCTC角质形成细胞单层在切割后用共培养的植物乳杆菌素（a）和合成的植物乳杆菌素（b）在经考虑的不同时间间隔处理得到的代表性图像。单层切割采用200μl的移液器吸头完成。这些细胞独立地用浓度为0.1、1和10μg/ml的共培养的和合成的植物乳杆菌素处理。

图13显示了用共培养的植物乳杆菌素（0.1、1和10μg/ml）处理后，迁移通过切割区域的细胞百分比。迁移百分比通过测量切割后0、4、8、12、24、48和72小时的两条切割线间的清晰面积（clear area）确定。横条代表两个一式三份的独立实验的平均值±S.E.M。

图14显示了用合成的植物乳杆菌素（0.1、1和10μg/ml)处理后在起始时间迁移通过切割区域的细胞百分比。迁移百分比通过测量切割后0、4、8、12、24、48和72小时的两条切割线间的清晰面积与起始的清晰面积的比较来确定。横条代表两个一式三份独立实验的平均值±S.E.M。

图15显示了用共培养的植物乳杆菌素（0.1、1和10μg/ml）处理人NCTC2544角质形成细胞单层后，清晰面积相对于起始切割面积的百分比。迁移百分比通过测量切割后0、4、8、12、24、48和72小时的两条切割线间的清晰面积与起始的清晰面积的比较来确定。横条代表两个一式三份独立实验的平均值±S.E.M。

图16显示了用合成的植物乳杆菌素（0.1、1和10μg/ml）处理人NCTC2544角质形成细胞单层后的清晰面积相对于起始切割面积的百分比。该百分比通过测量切割后0、4、8、12、24、48和72小时两条切割线间的清晰面积与起始的清晰面积的比较来确定。横条代表两个一式三份独立实验的平均值±S.EM。

图17显示了共培养的植物乳杆菌素（0.1、1和10μg/ml）、合成的植物乳杆菌素（0.1、1和10μg/ml)和连结剂（Connectivine）（200μg/ml）对人NCTC 2544角质形成细胞单层中TGFβ.1表达的作用，所述单层被切开以获得200μl移液管吸头切口。

具体实施方式

实例1：植物乳杆菌素型肽信息素的合成和纯化以及它们对表皮和Caco-2细胞的作用研究。

来自Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e MicrobiologiaApplicata dell'Universita degli Studi di Bari（巴里大学植物保护和应用微生物学系收集的培养物）的L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM），以前是从“天然酵头”中分离得到的，已经在30℃在改性的MRS培养基（mMRS）中增殖24小时，该培养基除了通常的成分，还包含5%的麦芽糖和10%的酵头水-最终pH5.6。

将细胞培养24小时，通过离心（4℃下10.000×g离心15分钟）收集细胞，用50mM pH7.0的磷酸盐缓冲液洗两次，然后再悬于水中，细胞密度为9.0log ufc/ml，将其在单培养或共培养条件下接种（4%，每种）到WFH培养基上（Gobbetti，1998.The sourdough microflora:interactions of lactic acid bacteria and sourdoughs（酵头菌群：乳酸菌和酵头的相互作用）.TrendsFood Ski Technol（《食品科学技术动态》）第9卷267274页）。采用相同的操作过程并且使用葡萄汁(稀释为1%的可溶性碳水化合物，加入0.5%的麦芽糖和0.5%的酵头提取物，pH5.6）、乳清（见之前的掺合物（integrations））或蔬菜和水果制品的水提物（见之前的掺合物）作为培养底物获得了先后描述的相同的结果。培育在30℃下进行18小时。通过离心（4℃下10.000×g离心15分钟）除去细胞后，往单培养和共培养的上清液中加入三氟乙酸（0.05%）并在10.000×g离心10分钟。使用0.22μm的微孔过滤器过滤上清液。使用配备有在214nm处操作的检测器的AKTA纯化仪（GE医疗）设备和反相C18XTerra柱（Waters，Mildford）进行HPLC分析。用水、2-丙醇和三氟乙酸（0.05%）的混合物作为流动相。所有包含A型植物乳杆菌素的馏分都使用ESI-离子阱MS质谱仪偶联多维色谱分析（MDLC）进行分析。用于鉴定和定量植物乳杆菌素A、K和N的分析条件是遵照Di Cagno等的条件（Di Cagno等，2010.Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400(DSM 23213):induction ofplantaricin A.(PlnA)under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA onbacterial and Caco-2cells（酵头Lactobacillus plantarum DC400（DSM 23213）的群体感应：在与其它乳酸菌的共培养下植物乳杆菌素A（PlnA）的诱导以及PlnA对细菌和Caco-2细胞的作用），Proteomics in press（出版中的《蛋白组学》））。

（2）Lactobacillus rossiae DPPMA174（DSM 23214）的生长动力学

L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）的生长动力学数据已用龚珀兹（Gompertz）方程进行处理，接着进行了修正（Zwietering等，1990.Modelling of bacterial growth curve（细菌生长曲线建模），Appl Environ Microbiol（《应用环境微生物学》）第56卷1875-1881页）。细胞计数通过在SDB培养基上平板接种（plating），于30℃培养48小时进行。细胞活力和受损和/或死亡细胞的数量通过活/死背光细菌活力试剂盒（Molecular Probes，INC.，Cambridge）方法进行确定。

（3）二维电泳分析和蛋白质鉴定

已使用固相-聚丙烯酰胺系统对来自单培养或共培养的L.rossiae DPPMA174（DSM23214）的细胞质蛋白进行二维电泳分析（De Angelis等，2005.Biochim.Biophys.Acta.（《生物化学与生物物理学报》）第1762卷80-93页）。对每种条件下的四块凝胶进行分析并且根据Bini等的操作过程将数据进行标准化（Bini等，1997.Protein expression profiles in human breastductal carcinoma and histologically normal tissue（人乳腺导管癌和组织学上正常的组织的蛋白质表达谱）.Electrophoresis（《电泳》).第18卷2831-2841页）。

使用LC-ESI-MS/MS分析以及将得到的序列与不同的数据库（National Center forBiotechnology Information（国家生物技术信息中心），Bethesda，MD，USA；ProFound,http://www.prowl.rockefeller.edu/cgibin/ProFound）进行比较来进行蛋白质鉴定。

（4）对重建表皮的试验和TEER（跨膜电阻）确定

重建人表皮（重建的人表皮）由来自多层人表皮的正常角质形成细胞构成。其为来自人角质形成细胞培养物的完全分化的表皮，所述人角质形成细胞培养物用未添加小牛血清（calf serum）的化学成分确定的培养基（MCDM 153）培养，在惰性多孔聚碳酸酯载体上于气-液界面培养17天。在此生长阶段，形态学分析显示多层可存活的表皮和角质层由超过十层紧密的细胞层构成。根据先前所描述的协议使用重建人表皮（Di Cagno等，2009.Synthesis ofγ-amino butyric acid(GABA)by Lactobacillus plantarum DSMZ19463:functional grape must beverage and dermatological application（通过Lactobacillus plantarumDSMZ19463合成γ-氨基丁酸（GABA）：功能性葡萄汁饮料以及皮肤学应用）.Appl BiotechnolMicrobiol（《应用微生物学生物技术》）DOI：10.1007/s00253-009-23704）。

使用Millicell-ERS Volthommeter进行TEER确定（Di Cagno等，2010.Quorum sensing insourdough Lactobacillus plantarum DC400:induction of plantaricin A(PInA)under co-cultivationwith other lactic acid bacteria and effect of PInA on bacterial and Caco-2cells（酵头Lactobacillusplantarum DC400的群体感应：在与其它乳酸菌的共培养下植物乳杆菌素A（PlnA）的诱导以及PlnA对细菌和Caco-2细胞的作用）.Proteomics in press（出版中的《蛋白组学》））。

（5）对Caco-2/TC7细胞的试验

将人Caco-2/TC7细胞（TC7克隆）在杜氏培养基（DMEM）中进行培养，其中加入小牛血清（10%）、非必需氨基酸（1%）、庆大霉素/链霉素（50μg/rnl）、谷氨酰胺（2mM）和4-2-羟乙基-1-哌嗪-乙磺酸（4-2-hydroxyethl-1-piperazinil-etansulfonic acid）（1%）（Di Cagno等，2010.Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400:induction of plantaricin A(PInA)under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PInA on bacterial andCaco-2cells（酵头Lactobacillus plantarum DC400的群体感应：在与其它乳酸菌的共培养下植物乳杆菌素A（PlnA）的诱导以及PlnA对细菌和Caco-2细胞的作用）.Proteomics in press（出版中的《蛋白组学》））。使用中性红染料进行吸收试验以确定细胞活力（Balls等，1987.Approaches to validation alternative methods in toxicology（毒理学验证替代方法的途径）.In:GoldberA.M.(Ed).N.Y.Academic Press（在Goldber A.M.（Ed）纽约大学出版社）45-58页）。用各种制备物处理24-72小时后，用PBS缓冲液洗涤细胞并且用中性红溶液（33mg/l）在37℃培养4小时。接着，再次用PBS缓冲液洗涤这些细胞并用裂解液（溶于含1%乙酸的水中的50%的乙醇）处理这些细胞。使用Novapath读板器（Biorad,Hercules,CA）进行读板（Di Cagno等，2010.Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400:induction of plantaricin A(PInA)under co-cultivation conditions with other lactic acid bacteria and effect of PInA on bacterialand Caco-2cells（酵头Lactobacillus plantarum DC400的群体感应：在与其它乳酸菌的共培养下植物乳杆菌素A（PlnA）的诱导以及PlnA对细菌和Caco-2细胞的作用），Proteomics in press（出版中的《蛋白组学》））。

对于TEER的确定，将Caco-2/TC7细胞在24孔板和聚乙烯过滤器（0.4μm孔）中进行接种（7.5×10⁴个细胞/ml）。处理前，这些细胞已在37℃培养了21天。用各种制备物处理18、24和48小时。通过TEER测定进行细胞层完整性的确定。

结果

（1）植物乳杆菌素型肽信息素的合成与纯化

在WFH培养基中生长18小时后，L.plantarum DC400（DSM 23213）单培养物的细胞密度为9.27±0.18log ufc/ml。μ_max和λ值分别为约0.27log ufc/ml/h和3.77h。乳酸菌的细胞密度从9.0±0.05（L.brevis（短乳杆菌）CR13）变为9.43±0.31log ufc/ml（L.plantarumDPPMA20）。μ_max值从0.11±0.05（L.pentosus（戊糖乳杆菌）12H5）变为0.15±0.04log ufc/ml/h（L.plantarum DPPMA20），以及λ值从0.37±0.07（P.pentosaceus（戊糖片球菌）2XA3）变为4.20±0.36h（L.rossiae DPPMA174（DSM 23214））。与单培养相比，当此微生物与其它乳酸菌共培养时，L.plantarum DC400（DSM 23213）的细胞密度没有显著改变（P>0.05）（9.06±0.34-9.28±0.42log ufc/ml）。L.plantarum DPPMA20、Lactobacillus paralimentarius（类食品乳杆菌）8D、L.pentosus 12H5、Lactobacillus reuteri e Weissella cibaria（罗伊氏乳杆菌食窦魏斯氏菌）10XA16的细胞产量未受到共培养条件的作用。相反，L.rossiae DPPMA174（DSM23214）和P.pentosaceus 2XA3的细胞密度与单培养条件相比显著降低（P<0.05）（约8.08和8.39log cfu/ml）。通常，当与L.plantarum DC400（DSM 23213）共培养时，所有的乳酸菌的μ_max值都会降低。除了L.plantarum DPPMA20，所有的乳酸菌的λ潜伏期也会增加。在与L.plantarum DC400（DSM 23213）共培养时显示出抑制的乳酸菌菌株（L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）和P.pentosaceus 2XA）以及一些不受共培养条件影响的菌株（L.plantarumDPPMA20和L.pentosus 12H5）被用于后续的实验中。

与前面的结果一致，当从单培养转到与L.plantarum DC400（DSM 23213）共培养的条件时，L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）活细胞的数量从9.0±0.28降至8.32±0.25log细胞/ml。活细胞和可培养细胞的数量没有呈现显著差异（P>0.05）。再次参照单培养条件，当处于与L.plantarum DC400（DSM 23213）共培养的条件时，死亡或受损L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）细胞的数量显著增加（P<0.05）。同样，当乳酸菌与L.plantarum DC400（DSM23213）共培养时，可培养P.pentosaceus细胞的数量也显著（P<0.05）降低。

移除细胞后，单培养和共培养的上清液用于通过nano-ESI/MS-MS质谱法偶联MDLC分析确定植物乳杆菌素型肽信息素。图1a显示了L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiaeDPPMA174（DSM 23214）共培养样品的全扫描色图谱。由于基质复杂，有可能鉴别一些（菌）种，而相反，难以完全分离相邻的峰。然而，对应于特定的m/z值，信号过滤有可能分离共洗脱的种。图1b报道了一个鉴别菌种的实例。已经获得每个种的MS/MS图谱。例如图1c显示了对应1493.7m/z值的图谱，该值被选择用于来自L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养的样品。指定以下参数用于在NCBInr数据库进行序列搜索：种（Lactobacillus），用于离子识别的m/z公差比（0.2Da）和用于分析的仪器。L.plantarum DC400（DSM 23213）和DPPMA20单培养以及其中DC400菌株与其它乳酸菌培养的所有共培养中，都观察到植物乳杆菌素A（SEQ ID NO:1Lys-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Leu-Gln-Met-Gly-Ala-Thr-Ala-lle-Lys—Gln-Val-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Trp-Gly-Trp）的存在。

基于前面的结果，将来自单培养和共培养的样品用4个色谱运行（run）进行纯化并且用nano-ESI-MS进行进一步的分析，以排除其它肽污染。L.plantarum DC400（DSM 23213）合成的植物乳杆菌素A的浓度通过色谱分析确定，所述色谱分析采用反相C18XTerra柱（Waters,Mildford）和OPA法。图2显示了不同条件下植物乳杆菌素A的浓度。从单培养条件（约0.06μg/ml）到L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）存在下的共培养条件（约2.5μg/ml），可以观察到肽信息素的合成产量增加了。在一定的实验条件下，植物乳杆菌素A的浓度为约4.0μg/ml。尽管在与其它乳酸菌种共培养的条件下观察到植物乳杆菌素A的产生，得到的量比L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养得到的明显降低。

此结果证明，在适于诱导信号分子释放的特定微生物相互作用存在时，肽信息素的合成是特定的。植物乳杆菌素A的合成开始于中间的指数生长期（约7小时）并且一直增加至指数期结束（约12小时）。尽管浓度较低，即，约0.02-0.06μg/ml，K型和N型植物乳杆菌素也仅在L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养时被检测到。用CDM、葡萄汁、乳清或水果和蔬菜制品水提物作为共培养底物，得到相同的结果。

（2）Lactobacillus rossiae DPPMA174（DSM 23214）的生长动力学

将L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）在加入了2.5μg/ml纯化的或者化学合成的植物乳杆菌素A的WFH培养基上进行培养。在图3中观察到纯化的植物乳杆菌素A的存在导致细胞数量明显降低，即从9.18±0.26（在单培养条件下）降至8.4±0.14log ufc/ml。用化学合成的植物乳杆菌素A得到了类似的结果。在这两种情况下观察到的结果跟L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养时发现的结果类似。当在纯化的或者化学合成的植物乳杆菌素A存在下进行培养时，受损的或死亡的L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）细胞数量显著（P<0.05）高于单培养（约8.80±0.14log个细胞/ml相对于6.08±0.22log个细胞/ml）。

获得的数据表明，L.plantarum DC400（DSM 23213）对L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）的抑制作用是由植物乳杆菌素A以及（很可能地）其它属于相同化学类别的肽信息素的合成引起的。

（3）L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）中蛋白表达水平的变化

与单培养相比，L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）与L.plantarum DC400（DSM 23213）共培养或者在纯化的植物乳杆菌素A存在下进行培养时，其细胞质提取物的二维电泳分析分别显示51和27种蛋白表达水平变化。所有在植物乳杆菌素A存在下高表达（hyper-express）的蛋白在共培养条件下也高表达。通过举例的方式，图4显示了涉及单培养、与L.plantarumDC440共培养以及在纯化的植物乳杆菌素A存在下单培养的条件下的部分凝胶。对一些更高表达的蛋白质用质谱分析法进行鉴定并且发现其参与蛋白质生物合成（氨酰-tRNA合成酶）、能量代谢（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、乙醛-辅酶A脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和β-磷酸葡萄糖变位酶）、蛋白质和氨基酸的分解代谢（ATP依赖性Clp蛋白酶和R氨肽酶）、环境应激反应（GroEL、GroES、S2和S5核糖体蛋白）以及氧化还原电位平衡（NADH氧化酶）。这些蛋白质中的大多数也在其它乳酸菌中被鉴定，作为对环境压力条件和/或细胞通讯机制的反应（Di Cagno等，2007.Cell-cell communication in sourdough lactic acid bacteria:aprotomic study in Lactobacillus sanfranciscensis CB1（酵头乳酸菌的细胞-细胞通讯：Lactobacillus sanfranciscensis CB1的蛋白组学研究）.Proteomics（《蛋白组学》)第7卷2430-2446页）。特别是，葡糖-6-磷酸脱氢酶以Escherichia coli（大肠埃希氏菌）细胞程序性死亡的机制酶催化杀伤性五肽的释放（Kolodkin-Gal等，2007.A linear pentapeptide is aquorum-sensing factor required for mazef-mediated cell death in Escherichia coli（线性五肽是mazef介导的大肠埃希氏菌细胞死亡必需的群体感应因子），Science（《科学》）第318卷652-655页）。

获得的结果表明，作为植物乳杆菌素A合成的结果的L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）的抑制作用是基于细胞通讯机制并且（很可能地）适于触发反应导致目标微生物死亡。这些结果证明了信号分子的杀菌效价。

（4）对重建表皮的试验和TEER（跨膜电阻）确定

来自浓度为2.5μg/ml的植物乳杆菌素A的plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiaeDPPMA174（DSM 23214）共培养以及与相同浓度2.5μg/ml的共培养获得的纯化植物乳杆菌素A的生物质样品都根据模型进行了试验，用于重建人表皮的处理。此模型已被科学界广泛应用和接受（Di Cagno等，2009.Synthesis of γ-amino butyric acid(GABA)byLactobacillus plantarum DSMZ 19463:functional grape must beverage and dermatologicalapplication（通过Lactobacillus plantarum DSMZ19463合成γ-氨基丁酸（GABA）：功能性葡萄汁饮料以及皮肤学的应用），Appl Biotechnol Microbiol（《应用生物技术微生物学》）DOI:10.1007/s00253-009-23704）。经过24小时的处理后，进行TEER的测量。此种类型的分析已被国际科学界广泛接受，其评价组织腐蚀性作为角质层和屏障功能的完整性的参考。特别是，用此种评价可以获得有关存在于角质层级别的层状致密结构、紧密的整体连接部以及表皮厚度的信息。这些因素作为一个整体限定了有效的屏障功能。图5显示了存在包含植物乳杆菌素的生物质以及获自物质共培养的纯化的植物乳杆菌素A时，TEER值出现显著增加（P<0.05），从而证明了此分子在皮肤级别的保护作用。用化学合成的植物乳杆菌素A获得了相同的结果。

根据本领域目前的状态，这是肽信息素应用的第一个例子，其参与细菌细胞通讯机制，适于被表皮人细胞感知而导致屏障功能的激发。

（5）对Caco-2/TC7细胞的试验

Caco-2/TC7细胞的活力以中性红染料吸收能力评估。与DMEM培养基（阴性对照）相比，用纯化的植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）培育24-72小时显著增加了Caco-2/TC7细胞的活力（图6）。用化学合成的植物乳杆菌素A获得了相同的结果。用从L.rossiae DPPMA174（DSM23214）单培养纯化馏分获得的样品进行处理，未观察到诱导，所述纯化馏分依照用于植物乳杆菌素A的相同色谱条件进行洗脱。正如预期的，Caco-2/TC7细胞暴露于γ-干扰素（IFN-γ）导致活力显著降低（P<0.05）（图7）。相反，当用纯化的或化学合成的植物乳杆菌素A同时处理时，IFN-γ的负面作用被完全消除。加入纯化的植物乳杆菌素A导致Caco-2/TC7细胞的TEER值明显增加（P<0.05）（图8）。用Caco-2/TC7细胞观察到相同的结果。与DMEM培养基相比，加入IFN-γ显著地（P<0.05）降低了TEER值。然而，加入纯化的或化学合成的植物乳杆菌素A也消除此种情况中的负面作用。

Caco-2/TC7细胞是体外最常使用的用以模拟肠粘膜的系统之一。尽管它起源于肿瘤，但是所述细胞适于在成熟的肠细胞中自发地分化并且表达刷状缘酶。在培养条件下，Caco-2/TC7细胞适于发展形态和功能特征，包括紧密的细胞间连接，其完整性通过TEER测量确定（Sambuy等，2005.The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier:influence of cell andculture-related factors on Cao-2 cell functional characteristics（Caco-2细胞系作为肠道屏障功能的模型：细胞和培养相关的因素对Cao-2细胞功能特征的作用），Cell Biol Toxicol（《细胞生物学和毒理学》)第21卷1-26页）。这个研究的结果证明，纯化的L.plantarum DC400（DSM23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养得到的或化学合成的植物乳杆菌素A适于刺激肠粘膜的屏障功能并防止γ-干扰素处理引起的负面作用。

（6）用于植物乳杆菌素A的合成及其在皮肤学领域的用途的生物技术协议的发展

如本文以上其它部分描述的，已开发出用于植物乳杆菌素A的合成及其在皮肤学领域的应用的生物技术方法。所述方法包括：

a）在mMRS培养基上对L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM23214）进行纯培养；

b）细胞收集、洗涤、重悬于适当地整合作为培养基用于养分供应的WFH、CDM、葡萄汁、乳清或者蔬菜或水果水提物中；

c）共培养培育18-24小时，优选地在30-37℃（优选地30℃）培育24小时；

d）通过离心分离细胞。根据程序的变形，此制备物也可以包含乳酸菌细胞；

e）通过干燥或冷冻干燥方法进行制备物脱水；

f）生产皮肤学制备物。

实例2：关于本发明生物质和植物乳杆菌素A在伤口愈合中的作用的研究

方法

将经培养的人角质形成细胞用植物乳杆菌素A（2.5μg/ml）或包含植物乳杆菌素A的生物质培育1小时。

培育结束时，清洗细胞并恢复培养基。

伤口愈合

本试验包括对细胞单层的连续性进行机械中断，目的是对处理作用是否有利于角质形成细胞迁移超过受损边缘并因此“治愈损伤”的能力进行评估。

为此，如上所述进行处理的角质形成细胞单层在施加刺激后另外培养24小时，然后用苏木素/伊红染色法进行固定和染色。图像使用带有5X物镜的光学显微镜进行观察。

对于每个图像，分别检测和计算最大细胞迁移极限和距离或之间的间隙（图9-10）。

结果

图9中，报告了伤口愈合试验的结果。中断细胞连续性后培育24小时，未受刺激的角质形成细胞单层（对照）显示一些细胞从伤口边缘扩展。然而当细胞用透明质酸刺激后，细胞迁移特别地明显。在这种情况下，事实上伤口间隙比不进行处理的细胞（对照）变窄了，证明了细胞迁移能力对伤口愈合的作用。

为了分析评估细胞迁移能力，如图10报告的，将伤口边缘进行描绘、测量并分析。

与对照细胞相比，用植物乳杆菌素A或包含植物乳杆菌素A的生物质培育的角质形成细胞减少了伤口边缘的间隙，如图11所报告的，愈合的百分比与对照相比增加了。

试验系统：人重建表皮

所用的表皮模型由Laboratories,Nice(France)（实验室，尼斯（法国））制作并且被用作分化第17天的0.5cm²的样本，其批平均厚度为120μ（角质层和活的表皮）。

完全分化的表皮获自人角质形成细胞，该人角质形成细胞在没有添加小牛血清的化学成分确定的培养基（MCDB 153）中，在多孔聚碳酸酯惰性载体上于气-液界面培养17天；在此分化阶段，形态学分析表明，多层有活力的表皮和角质层由超过十层紧密的细胞层构成。

TEER确定

跨膜电阻（TEER）是皮肤屏障功能性的直接测量：它反映了厚度和结构作为一个整体的组织电阻。它反映了紧密连接水平的细胞间接触的完整性、免受外界物质侵入的双层脂质结构的完整性。

TEER是试验鉴别参数——大鼠皮肤电阻（B40）——用于腐蚀性评估的经EU验证的测试，其被认为是角质层和屏障功能完整性的终点。

当在体内测量时，它与TEWL成反比，TEWL是对经皮失水的测量：较高的TEWL对应较高的屏障功能损伤，而较高的TEER对应较低的屏障功能损伤。

通过插入，给予1ml的PBS，并使用Millicell-ERS仪器（范围0-20kΩ）测量跨膜电阻。

对每种组织进行各种测量。图5显示了TEER值，所述TEER值是3种组织的平均值，每种组织进行了3次测定。

与TEER值有关的以下性质是重要的：存在于角质层级别的层状紧密结构、完整的紧密连接部和表皮厚度，它们作为一个整体限定了有效的屏障功能。每种组织引用自己在t=0和t=24小时的测定。

获得的结果特别有意思，事实上很明显在植物乳杆菌素A和包含植物乳杆菌素A的生物质存在下TEER都明显增加。

这种增加是表皮厚度增加和在紧密连接水平处角质层的较好的紧密型和完整性所得到的结果。

实例3：植物乳杆菌素A：其对维持和修复皮肤屏障功能的作用的研究

此研究基于获自L.plantarum DC400（DSM 23213）和L.rossiae DPPMA174（DSM 23214）共培养的植物乳杆菌素A的用途，目的在于获得以下目标：

通过与阳性对照（未处理的细胞）和商业可获得的/阴性已知活性对照进行比较，研究对人角质形成细胞单层（NCTC2544）的迁移和增殖作用，评价生物质对创伤修复的作用。用不同浓度的受试植物乳杆菌素（用细胞毒性试验进行测定后）先后三次（24、48、72小时）进行处理。

在考虑好的时间和浓度，与阳性对照（未处理的细胞）和商业可获得的/阴性已知活性对照进行比较，通过实时PCR的方法，评估介导剂调节（mediator modulation）如IL-8、KGF（角质化细胞生长因子）、TGF-β1（转化生长因子β），分析细胞损伤反应。

材料和方法

细胞培养物

所用的细胞系为人NCTC 2544角质形成细胞细胞系（Perry，V.P.，Sanford，K.K.，Evans，V.J.，Hyatt，G.W.，Earle，W.R.，1957.Establishment of clones of epithelial cells from human skin（建立人皮肤上皮细胞的无性系），J Natl Cancer Inst.（《国立癌症研究所杂志》），第18卷第5期709-717页），其在无菌烧瓶中培养，在37℃、CO₂为5%的潮湿气氛中，在加入10%牛的牛血清（bovine calf serum）（FBS）、2mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、存在1%青霉素和链霉素的MEM（最低基础培养基）培养基中进行培养。细胞在体外附着到培养板表面作为单层生长。

通过伤口愈合对组织损伤随时间推移修复情况的研究

该方法的原理：

本实验首先涉及融合细胞单层的发展（development）。接着，进行切割，并且当细胞逐渐移动修复此损伤时用显微镜观察到产生的“缺口”。

这个瘢痕（cicatrisation）形成的过程（所述的“愈合”）可持续几个小时至多于一天，这取决于细胞系、伤情和范围。

实验程序

接种NCTC 2544细胞，并在37℃、具有5%的CO₂中培养24小时。

经过24小时后，用无血清培养基替换完全生长培养基以避免血清对细胞增殖的影响，并且将细胞在37℃、5%的CO₂中进一步培育24小时。

24小时后，用温和的200μl移液器吸头划出一个约1mm宽的水平线以对细胞单层进行机械损伤。然后洗涤此单层并在加入待测物质后，将平板在37℃、5%的CO₂中培育72小时。

这些物质对细胞运动性（motility）的作用通过相位差倒置显微镜进行评估，在各种适当选择的分析时间处获取图像。

使用图像处理软件（莱卡（Leica）成套应用系统）在切割后0、4、8、12、24、48和72小时测量切割后的两条迁移前端之间的清晰面积，测定损伤修复。

每项实验的所有数据用Excel统计处理，用于0、4、8、12、24、48和72小时处的测定。

利用实时PCR评估IL-8、KGF、TGF-β基因表达进行细胞损伤反应分析

此程序由3个基本的步骤构成：

I.从细胞中提取总RNA

II.反转录成cDNA

III.实时PCR

I.从细胞中提取总RNA

使用永生NCTC 2544人角质形成细胞的细胞系，其保持在培养瓶中，在37℃、CO₂为5%的潮湿大气中，在加入10%小牛血清（FBS）、2mM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸，在1%青霉素和链霉素存在下的MEM（最低基础培养基）培养基中进行培养。用200μl的移液器吸头刮下此细胞系，并在不同的时间和不同的浓度进行处理。

II.RNA反转录成cDNA

此过程包括用“高容量的cDNA反转录试剂盒”（AppliedByosistem（应用生物系统））提取的RNA样品的扩增。

III.实时PCR

此过程包括用特定的Taqman基因试验和“TaqMan Universal PCR Master Mix withAmperase UNG 2X”试剂盒（Applied Biosystem）进行cDNA扩增。

根据^2-ΔΔCt法，通过管家基因，进行数据归一化和数据分析，使用相对类型量化以测定目标基因表达相对于阳性对照（未处理的细胞）的可能变化。

结果

伤口愈合

通过伤口愈合试验评估了共培养获得的植物乳杆菌素改善人NCTC 2544角质形成细胞迁移的能力。

此研究也涉及了合成的以及L.plantarum DC400和L.rossiae DPPMA174共培养获得的植物乳杆菌素的作用的对比评价。

用200μl的移液器吸头对细胞单层进行切割后，两条切割线之间的间隙内的细胞被完全移除，所述细胞用合成的和共培养获得的植物乳杆菌素在以下浓度进行处理：0.1-1-10μg/ml。阳性和阴性对照（100μg/ml的连结剂）也被复制测试。

在0时和4、8、12、24、48和72小时后获取相同切割区域的图像，以监测切割区域的细胞迁移。

图12-16显示了共培养的（0.1、1和μg/ml）（a）和合成的植物乳杆菌素（0.1、1和μg/ml）（b）对NCTC 2544细胞系迁移的作用的时序分析。

图12显示了两种受试活性物以及阳性和阴性对照在每个经过考虑的时间点（间隔4小时）的瘢痕形成过程（Δμm/时间）。

在细胞瘢痕形成的早期阶段，在0时不可能检测到对照和受试活性物细胞迁移之间有意义的区别。如图12a中显而易见的，与对照相比，浓度为0.1和1μg/ml的共培养的植物乳杆菌素不适合明显加速细胞迁移。切割4小时后，此作用已经显著并且保持恒定和显著直至72小时。相反，用浓度为10μg/ml的共培养的植物乳杆菌素进行处理，在所有经过考虑的时间间隔都产生了堪比阳性对照（即未处理过的细胞）的组织损伤修复。

用等量浓度的合成植物乳杆菌素在相同的时间段处理细胞所进行的类似实验证明，同样在这种情况下，与阴性对照相比，用植物乳杆菌素（合成的）处理具有更强的加速两条切割线间细胞迁移的能力。

特别地，也是在这种情况下，在细胞瘢痕形成的早期阶段不可能检测到这两个所用的对照和两个在研究中的活性物在细胞迁移方面在0时有意义的区别。

图12b显示了浓度分别为0.1和10μg/ml的合成植物乳杆菌素，在切割后4小时后引起高于阳性和阴性对照的细胞迁移的增加，并在所有经过考虑的时间间隔保持恒定直至72小时。相反，采用浓度为10μg/ml的合成植物乳杆菌素进行处理，产生了堪比于阳性和阴性对照的组织损伤的修复。为了更全面地包含并分析用共培养的和合成的植物乳杆菌素相对于阳性和阴性对照在所有经过考虑的时间间隔的处理作用，我们统计分析了来自图像分析的测量结果。

图13和14分别报告了对于用共培养的（图13）和合成的植物乳杆菌素（图14）进行处理，迁移通过两条切割线的细胞与阳性对照相比的百分比数据。此结果也分别作为两条切割线和起始区域的面积百分比进行了报告（图15-16）。

图13和14中报告的图表分别显示了对于阳性和阴性对照、共培养的（0.1-1和10μg/ml）和合成的植物乳杆菌素（0.1-1和10μg/ml），与在各个经过考虑的时间间隔过程中迁移的细胞百分比有关的数据。与从图像处理获得的数据一致，在处理的最初8小时后，阴性对照不能继续进行切口瘢痕形成活动并且呈现与阳性对照类似的迁移细胞百分比。

对于一般意义的共培养的植物乳杆菌素（图13），可以宣布，在所有三种使用的处理浓度下，可以勾画出从0至72小时处理的细胞迁移的较大增量，在最低浓度处理时也是如此。

特别是，用浓度为10μg/ml的共培养的植物乳杆菌素处理，在所有考虑的时间间隔（除了72小时处理后）显示了最高的迁移百分比，但是这些数据并不显著，迁移的细胞百分比值分别为165.56%、138.18%、134.64%、118.08%、139.07%和149.04%。

图14显示了用等量浓度合成的植物乳杆菌素在各考虑的时间间隔处理后迁移的细胞百分比。

用浓度为0.1μg/ml的合成植物乳杆菌素进行处理，在所有考虑的时间间隔产生了最高的迁移细胞百分比值，从开始时间直至处理72小时的值分别是158.30%、115.15%、124.32%、141.82%、141.91%和128.51%。用浓度为10μg/ml的合成植物乳杆菌素处理，得到所有考虑的时间间隔的迁移细胞百分比，与用浓度为0.1μg/ml的相同活性物处理的相比，但是同时与处理8至72小时后的阴性对照相比，导致的迁移细胞百分比增加较高，其百分比分别增加了+4.62%、+20.28%、+14.84%和+7.47%。相反，与阴性对照相比，用浓度为1μg/ml的合成植物乳杆菌素处理仅仅在处理12和24小时后产生较大的迁移细胞百分比增加，其百分比值分别为+9.86%和15.48%。

尽管用相同浓度的共培养的和合成的植物乳杆菌素处理细胞在所有考虑的时间间隔导致的迁移细胞百分比增加并未高于阴性对照，但是，将来自用共培养的植物乳杆菌素与来自用合成的植物乳杆菌素在可能的相同条件下处理人NCTC 2544角质形成细胞的伤口愈合试验的结果进行比较，结果证明，与考虑的阴性对照相比，共培养的植物乳杆菌素对通过产生的切割区域的细胞迁移产生较大的作用。

TGFβ.1基因是参与瘢痕形成过程最多的。

在所有考虑的用于伤口愈合监测的时间，在处理8小时后进行基因表达的评估，作为对获自瘢痕形成评价的数据的确认。

获得的结果说明并确认了连结剂对瘢痕形成的明显作用。

关于合成的植物乳杆菌素的数据指出，基因表达明显增加，甚至可证明相同浓度（1e 10μg/ml）的共培养的植物乳杆菌素刺激了较大的基因表达增加，进一步证实了生物质的作用。

<110> 吉利亚尼股份公司（GIULIANI S.p.A）

<120> 包含植物乳杆菌素的生物质的制备方法及其在医学领域的用途

<130> PCT28086

<150> RM2010A000004

<151> 2010-01-12

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400> 1

Lys Ser Ser Ala Tyr Ser Leu Gln Met Gly Ala Thr Ala Ile Lys Gln

1 5 10 15

Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Trp Gly Trp

20 25

Claims

1.生物技术方法，其用于合成由包含植物乳杆菌素A的植物乳杆菌素、Lactobacillus plantarum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌组成的生物质，或者用于制备植物乳杆菌素A或者包含植物乳杆菌素A的植物乳杆菌素，所述方法包括或者由以下步骤组成：

a）培养增殖Lactobacillus plantarum DSM 23213以及Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌；

b）对选自CDM、WFH、葡萄汁、乳清或水果和蔬菜制品提取物的底物，利用步骤a)中限定的乳酸菌的水性悬液进行联合接种；

c）培育；以及，任选地，

d）对培养液进行离心分离，以除去乳酸菌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中来自步骤a)的悬液的每种乳酸菌的细胞密度为9.0 Log ufc/ml，并且相对于底物的体积将其以1%至4%的百分比加入到底物中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中培育在30-37℃的温度下进行，持续18-24小时。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中离心在10.000×g、4℃下进行离心15分钟。

5.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括步骤e)，用于通过干燥使步骤d)中获得的上清液脱水。

6.一种生物质在制备增强表皮或者肠壁的屏障功能的药物中的用途，所述生物质通过如权利要求1-5中任何一项所限定的方法得到，所述生物质由包含植物乳杆菌素A的植物乳杆菌素、Lactobacillus plantarum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌组成。

7.一种生物质在制备使伤口愈合的药物中的用途，所述生物质通过如权利要求1-5中任何一项所限定的方法得到，所述生物质由包含植物乳杆菌素A的植物乳杆菌素、Lactobacillus plantarum DSM 23213和Lactobacillus rossiae DSM 23214乳酸菌组成。

8.一种组合物在制备增强表皮或者肠壁的屏障功能的药物中的用途，所述组合物包含或由以下组成：权利要求6所限定的生物质，其作为有效成分，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

9.一种组合物在制备使伤口愈合的药物中的用途，所述组合物包含或由以下组成：权利要求6所限定的生物质，其作为有效成分，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

10.植物乳杆菌素A或包含植物乳杆菌素A的植物乳杆菌素用于制备增强表皮的屏障功能的药物的用途。

11.植物乳杆菌素A或包含植物乳杆菌素A的植物乳杆菌素用于制备使伤口愈合的药物的用途。