CN102834115B - 用于治疗流感的重组人cc10蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用重组人CC10(rhCC10)(也称为重组人子宫球蛋白)来降低患者组织中病毒滴度，特别是肺组织中流感病毒滴度的方法。RhCC10可以用作治疗、治愈或预防病毒感染，特别是流感病毒感染的治疗剂。更具体地，本发明提供了宽泛地包括可以施用以治疗、治愈或预防流感病毒感染的rhCC10的临界剂量范围、静脉内和鼻内给药在内的方法。本发明还提供了在前述方法和将rhCC10施用于人中有用的组合物。

Description

用于治疗流感的重组人CC10蛋白

相关申请的交叉引用

本申请是要求2009年10月15日提交的美国临时申请No.61/252,028的权利的PCT国际申请，以引用的方式将其全部公开内容并入本文中。

技术领域

本发明的实施方式涉及降低体内病毒滴度和治疗患者的病毒性呼吸道感染的方法。本发明的实施方式还涉及治疗包括A型流感病毒在内的流感病毒感染的方法，特别是H1N1流感病毒。此外，本发明的实施方式还涉及利用重组人CC10的鼻内给药和/或静脉内给药、和/或吸入来治疗上述的方法。

背景技术

克拉拉细胞(clara cell)“10kDa”蛋白(CC10)或子宫球蛋白(UG)是一种上皮起源的多种粘膜上皮和其他器官产生的小的同型二聚体分泌蛋白(Mukherjee，1999)。CC10由两种相同的70个氨基酸残基的亚单位构成，每个亚单位具有“四螺旋束”二级结构基序，通过Cys 3和69’、3’和69之间的两个二硫键在反平行取向上连接(Matthews，1994；Morize，1997)。CC10是共有相同的二级、三级和四级结构并且认为是介导类似功能的小球蛋白的新兴家族的第一成员。含有两个二硫键的同型二聚体看起来是其初级形式。在人中，肺是CC10产生的主要部位，同时多种其他器官合成较少量的编码这种蛋白的mRNA(Singh，1987；Sandmoller，1994)。CC10是一种抗炎和免疫调节蛋白，其具有与其他蛋白、受体和细胞类型各种相互作用的特征(在Mukherjee，1999and Pilon，2000中进行了综述)。已在具有某些程度的包括肺炎在内的炎症的特征的大量临床条件的各种组织和流体样品中发现较低水平的CC10蛋白或mRNA(Nomori，1995)。

CC10蛋白在不同类型的肺部感染中的生理学已在一株CC10敲除小鼠中进行了研究。在其中CC10敲除和野生型小鼠各自用绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)或腺病毒(两种常见的人呼吸道病原体)感染的两个研究中，野生型小鼠经历更快速的病原体清除，具有更大的通过天然免疫系统的病原体杀死，表明在病毒和细菌感染期间缺失CC10的益处(Hayashida，1999；Harrod，1998)。这与其中将CC10报道为免疫抑制剂的早期观察结果一致(Dierynck，1995；1996)，表明CC10将抑制对感染的天然免疫应答，不管是细菌或病毒感染，包括流感。因此，不能预期在病毒或细菌呼吸道感染存在下给予CC10有益于患者。随后，报道了在用呼吸道融合病毒(RSV)感染之前，利用重组人CC10蛋白(rhCC10)恢复CC10功能，与未处理的敲除小鼠相比，能够更快速清除所述感染(Wang，2003)。然而，近期的研究显示，当与树突状细胞暴露于抗原同时存在时，rhCC10能够阻止获得性免疫(特别是抗原特异性T细胞)的发展(Johansson，2007)，这再次表明施用rhCC10不会有益于患有感染的患者。因此，关于在呼吸道感染期间rhCC10治疗的潜在危害或益处的知识的当前状态是矛盾的，并且关于CC10治疗不同类型呼吸道感染的安全和/或效用不能得出结论。不能获得关于CC10对于流感病毒感染的作用的信息。在本文中我们报道了，rhCC10在体内对于A型流感的效力的直接验证、细胞水平CC10的抗病毒作用的直接验证、其作用机制、以及其治疗和/或预防病毒感染(并且尤其是流感病毒感染)的潜在用途。

在过去的120年中，流感引起了四次大爆发(1889，1918，1957和1968年)，导致世界范围大概5000-10,000万人死亡。流感病毒是一种正粘病毒，一种通过气溶胶以及通过污染表面与鼻粘膜的直接接触传播并靶向呼吸道上皮细胞的RNA病毒。流感病毒感染可以引起严重症状，包括发烧、咽喉痛和肌肉痛、身体不适、体重减少、呼吸道阻塞、以及有时的呼吸衰竭和死亡。流感病毒激发获得性免疫应答(细胞毒性T细胞和抗体)，其在正常健康个体中通常在1-2周消除该感染。感染人类的多种流感病毒亚型，包括禽流感病毒(H5N1)、季节性流感病毒(H3N2)和猪流感病毒(H1N1)，可以用抗病毒剂如神经氨酸酶抑制剂来治疗。然而，流感病毒的快速突变已导致药物抗性株的形成(Moscona，2009)，用于预防和/或治疗的抗病毒剂的大量使用将导致对这些药物的抗性的加速形成。因此需要新的治疗剂以治疗、治愈和预防流感病毒感染。同样，没有用于呼吸道和其他身体系统中大量病毒感染的批准疗法。

发明内容

发明目的

上述提供了通过本发明实施方式所实现的目的的非排他性列举：

本发明实施方式的目的是降低肺部病毒滴度并由此治疗、治愈或预防流感病毒感染，特别是A型流感病毒感染，并且更特别是流感病毒H1N1株感染。

本发明实施方式进一步的目的是降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染，其通过静脉内途径、吸入途径、或鼻内途径(根据PCT 2009)、或通过这些途径的组合施用CC10。

本发明实施方式的另一个目的是降低病毒滴度并治疗、治愈或预防病毒感染，其中通过静脉内途径、吸入途径、或鼻内途径、口腔途径、阴道内途径、或通过这些途径的组合施用CC10。

本发明的又一个目的是利用CC10或分泌球蛋白家族的其他成员在细胞水平抑制病毒复制。

发明概要

这些和其他目的、特性和优点通过本发明实施方式实现，其中通过在恰当间隔时间以给定剂量范围、或以某一剂量施用rhCC10以降低病毒滴度并治疗、治愈或预防病毒感染。

这些和其他目的、特性和优点也通过本发明实施方式在恰当间隔时间以给定剂量范围或以某一剂量施用CC10来实现，其中通过特定病毒的症状特征和/或通过检测患者样本中的病毒诊断患者患有病毒感染，所述检测是利用标准方法通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或病毒核酸检测。

这些和其他目的、特性和优点也通过本发明实施方式在恰当间隔时间以给定剂量范围或某一剂量施用CC10来实现，其中通过发烧、肌痛和堵塞症状，和/或通过检测患者样本(鼻灌洗液、血液或唾液样本)中的流感病毒诊断患者患有流感病毒感染，所述检测是利用标准方法通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或检测病毒核酸。

在本发明的某些方面，以1.5微克至1.5毫克/千克体重/天范围每个鼻孔等分的剂量、或采用合在一起达到该每天剂量范围的多个剂量通过鼻内施用CC10，以降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染。

在另一方面，以高达10毫克/千克体重/天的剂量、或以合在一起达到该每天剂量范围的多个剂量通过静脉内施用CC10，以治疗、治愈或预防流感病毒感染。

在另一方面，在恰当间隔时间以给定剂量范围或以某一剂量施用非人CC10蛋白，其中通过特定病毒的症状特征，和/或通过检测患者样本中的病毒诊断患者患有病毒感染，所述检测是利用标准方法，通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或检测病毒核酸。

在又一方面，在恰当间隔时间以给定剂量范围或以某一剂量施用统称为分泌型球蛋白的CC10蛋白家族的另一个成员，其中通过特定病毒的症状特征，和/或通过检测患者样本中的病毒诊断患者患有病毒感染，所述检测是利用标准方法，通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或检测病毒核酸。

附图说明

图1是柱形图，示出了在用鼻内rhCC10治疗的感染棉鼠的肺中2天的H1N1病毒负荷。病毒滴度表示为(x 107)TCID50/克组织。

图2是柱形图，示出了在用腹膜内注射rhCC10治疗的棉鼠的肺中2天的H1N1病毒负荷。病毒滴度表示为(x 107)TCID50/克组织。

图3是柱形图，示出了通过rhCC10对培养细胞中的病毒复制的抑制作用。以100微克/ml、300微克/ml和1毫克/ml将RhCC10加入到HEp2细胞的培养基中并留置4小时。然后移除该培养基并替换，并且细胞用RSV感染1小时。然后清洗细胞以除去过量病毒并回加rhCC10并再孵育一小时。然后清洗细胞以除去过量CC10。在注射后4天检测培养基中的病毒滴度。每个CC10浓度重复三次。

图4是比较注射前和注射后给予时rhCC10的抗病毒效果的柱形图。HEp2细胞用1mg/ml rhCC10处理并如图3所示的用RSV感染。另外，在感染后1小时(治疗D0)、感染后24小时(治疗D1)以及感染后48小时(治疗D2)提供1mg/ml的rhCC10。培养基中的病毒滴度在感染后第4天进行检测。

具体实施方式

本发明的实施方式涉及利用CC10来降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染。CC10优选是通过分别在本文A和B展示部分所附的美国专利申请公开No.：20030207795和PCT/US09/43613(以引用的方式将其全部公开内容并入本文中。)中所描述的方法、或经由产生药品级rhCC10的任何其他方法所获得的重组人CC10(rhCC10)。本发明实施方式的rhCC10可以在有或没有其他鼻内、肺部或全身治疗的情况下、在它们之前或之后施用。

剂量

优选地，在治疗或预防流感病毒感染中，rhCC10以每天每个鼻孔1-3次鼻内施用，达7-14天，并且每隔一天之后进行另外的14天，以及之后根据需要进行。更优选地，在患者一开始经历发烧、肌痛和阻塞或者被诊断患有流感时就施用rhCC10。

为了实现以下进一步描述的期望成果，参考以下实施方式中描述的给药方法：

在一个实施方式中，鼻内rhCC10施用的一个或多个剂量可以等同于约1.5微克至约5毫克/千克体重/天的剂量范围。在另一个实施方式中，rhCC10可以每天以该剂量范围施用。在又一个实施方式中，rhCC10可以每天以该剂量范围连续施用至少7天。在又一个实施方式中，rhCC10可以每天以该剂量范围连续施用至少14天。在又一个实施方式中，rhCC10可以每隔一天以该剂量范围连续施用30天。在又一个实施方式中，rhCC10可以以逐日递减剂量连续施用10天，所述递减剂量包括在第一个三天每次施用高剂量、在第二个三天每次施用中间剂量，以及在后四天每次施用低剂量。在又一个实施方式中，rhCC10可以以该剂量范围或以递减剂量施用每天三次，大约每8小时一次。

在另一个实施方式中，rhCC10的上述剂量可以作为气溶胶通过鼻内喷雾或灌洗、或通过凝胶或霜剂的沉积、或在鼻道中滴注的其他方法，鼻内施用于患者。

在另一个实施方式中，rhCC10的上述剂量可以作为气溶胶通过雾化器或计量剂量吸入器、或直接用于肺和气管的其他方法，通过吸入而给予患者。

在另一个实施方式中，在治疗或预防流感病毒感染中，rhCC10以15微克至20毫克/千克体重的剂量，每天1-3次，静脉内施用7-14天，并且之后每隔一天进行另外的14天，以及之后根据需要进行。在又一个实施方式中，rhCC10可以以每日递减剂量连续施用10天，所述递减剂量包括在第一个三天每次施用高剂量、在第二个三天每次施用中间剂量、以及后四天每次施用低剂量。在又一个实施方式中，rhCC10可以以该剂量范围或以递减剂量每天施用三次，大约每8小时一次。

在另一个实施方式中，rhCC10的上述剂量可以利用鼻内、吸入、以及静脉内途径的组合施用于患者。在进一步的实施方式中，依照上述方法，rhCC10可以在抗病毒疗法、抗生素疗法、解充血剂、抗组织胺药、粘液溶解药、祛痰药、粘液抑制剂、表面活性剂、支气管扩张药、血管收缩药、窦痛止痛药、或其他典型疗法之前、期间或之后给予。在又一个实施方式中，依照上述方法，可以施用rhCC10以降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染。

上述rhCC10的剂量和应用方法可以每天、每天一次以上、每天三次、每隔一天或以递减模式进行施用，这取决于治疗的流感病毒感染的严重程度、患者总体健康状况、以及是否存在潜在病症。例如，感染越严重，有效治疗所需的rhCC10的剂量将越高。应理解，基于患者的症状和对疗法的反应并且在本发明实施方式中描述的参数和剂量范围内，医生将能够根据需要监控和调整剂量、制剂、以及施加方法。

制剂

rhCC10鼻内给药的鼻内制剂、装置和方法已在PCT/US09/43613中有描述，以引用的方式将其全部公开内容并入本文中并且在展示部分B中重现。rhCC10的静脉内制剂由在0.9％盐水中的5.5mg/ml溶液构成并且已描述在美国专利申请公开No.20030207795中，以引用的方式将其全部公开内容并入本文中并且在展示部分A中重现。

实施例1

流感病毒的增殖和滴度确定

制备A/PR/8/34A型流感病毒株(H1N1)，购自美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。以0.01的感染复数(MOI)采用流感病毒感染60％铺满的单层细胞(150cm²培养瓶)，使流感病毒在MDCK细胞(ATCC登记#CCL-34)中增殖。三至四天后，当细胞病变效应泛发并且大多数细胞脱离培养皿时，收获细胞和上清。通过离心除去细胞(800g)并在4℃下对上清过滤(0.45μm)和离心(18000g)2小时以粒化病毒。将该病毒粒重悬于DMEM培养基，等分并在-150℃下储存。通过向在0.1％牛血清白蛋白和胰蛋白酶存在下在96孔板中所培养的MDCK单层细胞施加0.1mL系列稀释的病毒原液，来确定流感病毒滴度。三天后，对细胞病变效应进行计分并利用Kaerber方法来确定半数组织培养物感染量(TCID₅₀)。

用于病毒负荷分析的肺组织的处理。无菌地取出来自被感染小鼠和棉鼠的肺的左右叶片的切片，称重并在设置5下利用组织剪切设备(型号#985-370，Biopspec Products Inc.)在1ml的DMEM培养基中均化45秒钟。匀浆物以3000g离心20分钟。收集清澈上清，并在-150℃下冷冻储存直至使用。

病毒滴度的确定。通过系列稀释，接着空斑形成试验(PFA)或病灶形成试验(FFA)，来确定扩增的病毒原液中和肺匀浆物中的病毒滴度。每毫升初始样品的空斑形成单位(PFU)和病灶形成单位(FFU)在研究开始之前进行计算。储存足以实施PFA和FFA的一组流感病毒样品并且在完成研究之后确定PFU和FFU。采用特定培养基(具有1％BSA的DMEM)制备所培养病毒的系列稀释液，其稀释范围横跨10¹至10⁸。每个稀释液通过空斑形成试验(PFA)和病灶形成试验(FFA)进行评价。对于流感病毒培养物滴度通常产生10⁷-10⁹pfu/ml。

实施例2

rhCC10鼻内施用以降低肺部流感病毒滴度

棉鼠(粗毛棉田鼠(S.hispidus))，一种田鼠，是流感病毒复制并产生中度呼吸道感染的动物模型(Ottolini，2005)。这些动物通过用流感病毒鼻内接种进行感染并且肺部病毒滴度在接种后两天(约48小时)出现峰值。这种模型被用来筛选体内抑制流感病毒复制的化合物。

无病原体棉鼠购自Virion Systems，Inc.(Rockville，MD)。共18只棉鼠(粗毛棉田鼠，6-8周龄)，通过每只鼠鼻内接种0.1ml体积的10⁷TCID₅₀的A型流感病毒(A/PR/8/34)株H1N1进行感染。六只动物接受安慰剂(0.9％NaCl)，六只动物接受0.5mg/kg的rhCC10以及六只动物接受5.0mg/kg的rhCC10(在病毒接种前2小时通过鼻内滴注)。在感染后第2天病毒滴度通常最高时处死动物并且在肺组织中确定病毒负荷时。图1示出了在两个rhCC10剂量组中观察到肺组织中病毒滴度的降低。肺中的病毒滴度表示为(x10⁷)TCID₅₀/克组织。

实施例3

rhCC10全身施用以降低肺部流感病毒滴度

共18只棉鼠(粗毛棉田鼠，6-8周龄)，通过每只鼠鼻内接种0.1ml体积的10⁷TCID₅₀的A型流感病毒(A/PR/8/34)株H1N1进行感染。六只动物接受盐水安慰剂(0.9％NaCl)，六只动物接受0.5mg/kg的rhCC10以及六只动物接受5.0mg/kg的rhCC10(通过腹膜内注射(IP))。IP途径产生大量的循环rhCC10并刺激人静脉内给药途径。每只动物接受总共六个剂量的安慰剂或rhCC10(大约每12小时)，包括在感染前一天的两个剂量(早晨和下午)、感染当天的两个剂量、以及感染后一天的两个剂量(感染前三个剂量，感染后3个剂量)。在感染后第2天当病毒滴度通常为最高时处死动物并且在肺组织中确定病毒负荷。图2示出了在5mg/kg rhCC10剂量组中观察到的肺组织中病毒滴度的统计学显著降低(p＜0.01)，并且在0.5mg/kg剂量组中趋势朝向较低病毒滴度。肺中的病毒滴度表示为(x10⁷)TCID₅₀/克组织。

基于前述，已发现rhCC10降低呼吸道感染中的病毒滴度，表明rhCC10用来治疗、治愈和/或预防流感病毒感染的用途。因此，本发明的实施方式提供有效治疗、治愈或预防流感病毒感染的鼻内、和静脉内、或其组合的基于rhCC10的疗法。

实施例4

细胞水平CC10介导的病毒复制的抑制作用

利用HEp2细胞(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)来增殖RSV株A-2(Advanced Biotechnologies，Inc.，Columbia，MD)并产生病毒原液。在48孔板中以50,000个细胞/孔将细胞进行铺板并在具有10％FB S的MEM中生长至～80％铺满。细胞用在0.5mL MEM中的CC10预处理4小时。然后更换培养基并利用1x 10⁶TCID₅₀/100mm TC皿进行RSV感染1小时。通过清洗除去未吸附的病毒，并加入0.5ml具有2％FBS的MEM、4mM L-谷氨酰胺以及rhCC10。在感染后第4天收集上清并滴定病毒。图3示出了1mg/ml CC10的浓度可视地消除RSV生产，而100和300微克/ml显示约3倍降低。

当在感染后1、24和48小时提供时，CC10还抑制细胞中的病毒复制。图4显示了不仅在感染之前加入，而且在感染后加入时，rhCC10都有效降低病毒滴度。这是在细胞水平下CC10的直接抗病毒活性的第一次报道并且说明了rhCC10作为暴露后治疗的抗病毒疗法的潜在应用。

实施例5

CC10抗病毒的作用机制

在CC10敲除小鼠中气管上皮细胞的表型说明，在没有CC10下，细胞内细胞器分布异常，存在异常堆叠的膜结构，以及通过细胞进行的其他蛋白的分泌被破坏。我们假定，这种表型意味着，CC10在从高尔基体(Golgi apparatus)至细胞的质膜的分泌小泡运输中起着积极的作用。CC10还调节抗原递呈细胞中抗原的摄取和处理。我们解释这些观察结果意味着，CC10是在进出许多细胞类型的物质运输中的一个重要因子。因此我们推断，CC10通过干扰细胞中的病毒运输而抑制病毒复制。由于所有病毒均依赖于细胞运输过程以侵入细胞并复制，所以能够预期CC10抑制所有病毒的复制。同样，也能够预期其他分泌型球蛋白(它们与CC10共有类似的结构)在细胞水平抑制病毒复制。类似地，也能够预期源于CC10的多肽以及调节细胞运输过程的其他分泌型球蛋白能够抑制病毒复制。

展示部分A(EXHIBIT A)

US 20030207795：

生产治疗炎症和纤维变性病症的纯化重组人子宫球蛋白的方法

本申请是于2001年7月2日提交的美国序列No.09/898,616的部分继续申请，该部分继续申请是于1997年5月28日提交的美国序列No.08/864,357的部分继续申请。

技术领域

本发明总体上涉及生产重组人子宫球蛋白(rhUG)，其可以用作治疗炎症和纤维变性疾病的治疗剂，具有免疫调节作用，并且调节平滑肌收缩。更具体地，本发明提供根据现行良好制造规范(cGMP)用于规模化生产rhUG的方法，广泛地包括细菌表达和蛋白纯化的步骤。本发明进一步提供用于评价经由规模化cGMP方法生产的rhUG的体内生物学活性的相对强度的分析测定方法。

背景技术

重组子宫球蛋白的治疗用途

对于用于治疗炎症以及纤维变性疾病的改善治疗剂的研究在近年来受到极大关注。新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)(一种肺表面活性物质缺陷疾病)是一种特别感兴趣的病症，因为它是未成熟婴儿死亡的主要诱因之一。尽管引入表面活性物质治疗显著改善RDS患者的存活率，但是在相当大比例的这种患者群体中出现慢性炎性和纤维变性疾病是一个主要问题。同样，当患者肾堵塞并且不再过滤血液时，肾小球肾病和肾纤维化导致末期肾衰竭。许多形式的肾小球肾病和肾纤维化的特征在于纤连蛋白沉积。在这两种疾病中，纤连蛋白和胶原蛋白沉积以及纤维化使得该器官无功能，最终不能支撑生命。因此，这些患者需要长期血液透析或肾移植。

重组人UG是一种具有有益抗炎、抗纤维变性、抗肿瘤、呼吸道和免疫调节性能的蛋白，其正在开发作为多种临床指征的治疗剂。重组人UG用于治疗特征为UG缺陷的病症。它特别适合于治疗肺部炎症，例如新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)和支气管肺发育不良(BPD)；用于治疗特征为局部血清PLA2活性提高的病症，如成人RDS(ARDS)、感染性休克、胰腺炎、胶原蛋白血管性疾病、类风湿性关节炎、急性肾衰竭、以及自身免疫葡萄膜炎；用于治疗特征为PLA2活性局部提高的病症，如新生儿RDS/BPD、ARDS、类风湿性关节炎、哮喘症、腹膜炎、肾小球病，包括遗传性Fn沉积肾小球肾炎，以及自身免疫葡萄膜炎；用于治疗其中纤连蛋白的沉积是诱发因素的纤维变性病症，例如特发性肺纤维化、博来霉素肺、以及囊性纤维化和肾小球肾病，特别是家族性肾小球肾病，特征为肾中Fn沉积，其最终导致肾衰竭，也能够利用外源性UG进行治疗；以及适合于用于治疗或预防特征为内源性功能UG的缺陷的炎性或纤维变性病症，通过给予补偿量的rhUG。

rhUG用于抑制对纤连蛋白的细胞粘附，抑制在已沉积的纤连蛋白上的炎性细胞和成纤维细胞迁移，以及抑制细胞和胞外基质蛋白和/或膜结合蛋白之间的相互作用。rhUG还特别用于改善和/或正常化肺功能、肺顺应性、血液充氧作用、和/或血液pH。rhUG特别用于调节各种器官系统中的平滑肌浓度，包括呼吸系统、消化系统、循环系统、生殖系统、以及泌尿系统。rhUG也可以用来调节或减少血管通透性、抑制血管内皮细胞的迁移和血管发生、以及防止血管发生。气管内rhUG可以用作干细胞因子以长期增加淋巴细胞产生和/或降低多形核白细胞增生。rhUG增加循环淋巴细胞和/或细胞毒性T细胞的浓度，同时降低循环多形核白细胞增生的浓度，这对患有自身免疫疾病或过敏症的患者特别有用。静脉内rhUG也可以用来抑制循环淋巴细胞中的ATP代谢以及短期增加活性嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、以及NK细胞中的ATP代谢。

用于生产人子宫球蛋白的现有方法

存在用于研究目的微克至毫克量的用于表达rhUG和纯化天然或重组子宫球蛋白、或尿蛋白-1的多种公开方法(Mantile，1993；Miele，1992；Singh，1987；Jackson，1989；Anderson，1994；Umland，1994；Aoki，1996)。这些方法差异很大，但是都不能很好适用于大规模生产蛋白质并且都没有解决药物生产过程所要求的控制问题。此外，这些各种制备物的生物学活性不必需是等价的。例如Nieto(1997)报道了，天然兔子宫球蛋白在冻干后失去一部分孕酮活性，而Miele和Mantile在纯化过程中利用重复尺寸排阻色谱步骤和多次冻干作为浓缩步骤。然而，相对于冻干产物，终端用户很大程度上优选即用产品，因为rhUG聚集物的百分比随着冻干和重复冰冻解冻循环而增大。高聚集度会有害地影响生物学活性、改变免疫原性、或改变最终药品的效力。根据FDA指南，不期望的聚集物构成杂质，基于药品内的高聚集度，整批药品可能被拒绝。

重组治疗剂开发中的问题

重组蛋白类药物的生产涉及依附由美国食品及药物管理局(FDA)提出的称为现性良好制造规范(cGMP)的多种工艺的开发。依附FDA cGMP指南的工艺顺应cGMP。为了在美国或别的地方销售药物组合物或药品，必需利用cGMP过程来生产药品。

重组蛋白作为药物的临床开发、以及蛋白药物的销售和使用要求该药物的良好表征且可重复生产过程以及该药物的详细表征。

重组蛋白代表一种特殊挑战，因为它们的活性不仅依赖于氨基酸组成而且还依赖于该蛋白的构象。蛋白的构象是可以在四个级别上表征的蛋白整体三维结构。第一级是其一级结构或氨基酸序列。第二级是蛋白的二级结构并且是与蛋白质中约6-30个氨基酸的短伸展(其形成局部稳定结构区如α螺旋、β折叠和ω环)相关的组织形式。第三级(三级结构)由在氨基酸的单个连续伸展内二级结构集合成单元或结构域(表示蛋白或肽单体)构成。四螺旋束或III型纤连蛋白重复是三级结构的实例。第四级(四级结构)在两个以上单独肽或蛋白单体共价或非共价地组合而形成单个功能单元时存在。

重组蛋白提出进一步的挑战，因为活性还依赖于表面特性，其中除了形状外，电荷和疏水特性显著有助于生理环境中重组蛋白特异地与其他生物学和化学物质相互作用。蛋白质的亚型由构象、表面电荷和/或疏水特性中的小变化构成。这些变化可能由于温度改变、或与周围环境中的化学物质、盐或其他生物学分子(例如蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸等)的相互作用、或者对蛋白质中的单独氨基酸的实际化学修饰引起。蛋白质的不同亚型可以通过高分辨率分析方法如疏水相互作用HPLC、质谱、毛细管电泳、肽谱、等电聚焦、以及二维电泳进行检测。

重组蛋白药物的物理形式和构象可能受例如其产生的表达系统、以及用作药物的纯化过程强烈影响。同样，所得到的重组蛋白产物的亚型还可能受其生产的表达系统和工艺的强烈影响。蛋白质的生物学活性高度依赖于它的构象和亚型，不仅仅是其化学组成。例如，蛋白质可以通过暴露于高温或低温而部分或完全变性并变为生物学惰性的，然而它仍然保留相同的氨基酸序列。因此，重组蛋白的生物学活性不仅依赖于它的化学组成，而且依赖于其表达、纯化、配制以及甚至包装的过程。

除了生物学活性化合物及其载体外，药物或药品经常具有额外的成分。这些成分源自生产该药物的原料或作为纯化、配制、或最终包装过程的一部分引入的材料。药物定义为纯化的原料药的最终形式，而药品是药物的最终包装制剂(例如，患者中使用的产品)。药物或药品的这些额外成分被认为是杂质或污染物，并且可能具有它们本身的不想要或不期望的生物学活性(单独地或与药物本身联合)。污染物可以定义为不是源自药物本身的成分，而杂质可以定义为包含药物本身的一些要素(例如片段、变形、亚型、对映体、聚集体等)的成分。因此，药物生产过程很重要，不仅因为它决定药物本身的特性，而且因为它决定药物和药品中污染物和杂质的水平和性质。因此，有必要认真限定所述工艺以维持药物、药品或药物组合物在体内的一致和可再现的生物学活性。因此，生产重组蛋白药物的过程应充分进行良好表征，以使它能够符合药物生产控制指南，以成为商业上可行的，因为不相符会产生不能在美国和其他地方销售或使用的产品。

此外，生物药剂生产过程必须充分高效和经济以在商业上可行。在实验室用来生产用于研究目的的少量蛋白质的纯化方法通常不适用于生物药剂生产。例如，小规模方法如尺寸排阻色谱对于更大规模生产通常是不实用的，因为色谱基质以用于纯化即使几克蛋白质所需的柱尺寸在其自身重量下将会被压碎。此外，尺寸排阻色谱总是增大样品的体积，导致更不可易控制的高体积纯化中间物，其必须在过程的下一步骤之前浓缩。因此，高度期望在生物药剂生产过程中避免使用尺寸排阻色谱。经常用来以适当形式保存蛋白药剂的另一种技术是冻干。这种过程涉及蛋白质的同时冰冻-干燥，将其从通常易于分解的液体形式转化为通常可以储存数月而不丧失生物学活性的干燥粉末形式。然而，重复冰冻/解冻循环增大rhUG的聚集体百分比，这可能导致生物学活性的显著变化。

发明内容

发明目的

本发明的一个主要目的是提供用于生产rhUG的细菌表达系统。

本发明的一个进一步目的是提供用于对于适合用作药物的物质的rhUG生产以及人子宫球蛋白纯化的方法。

本发明的又一个进一步目的是提供符合cGMP标准的rhUG的规模化生产。

本发明的一个进一步和相关目的是提供在体外测量人UG的生物学活性的方法。

本发明的又一个进一步目的是提供商业可行的人子宫球蛋白的药学制剂。

本发明的一个进一步和相关目的是提供一种生产rhUG研究种子库(research seed bank)、主细胞库(master cell bank)、以及生产用细胞库(production cell bank)的方法。

发明概要

本发明提供了一种用于生产rhUG的细菌表达系统，包括编码人UG的合成基因，其中该合成基因包含Seq.ID.No.1-4。本发明还提供一种用于生产rhUG的细菌表达系统，包括编码人UG的人cDNA序列，其中该基因进一步包含在该序列的N末端处的Met-Ala-Ala。

本发明进一步提供一种生产rhUG研究种子库的方法，包括：(a)在生长介质上接种包含rhUG表达系统的细菌株的至少一个菌落；(b)孵育该接种的生长介质直至达到平稳期；(c)将甘油加入到该接种的生长介质中；(d)在等分部分中冰冻培养物；以及(e)在低于约-50℃的温度下储存该冰冻等分部分。

本发明还提供一种生产rhUG主细胞库的方法，包括：(a)用rhUG研究种子库的等分部分接种合适孵育肉汤；(b)孵育该接种肉汤；(c)将冷冻保护剂加入到孵育肉汤中以形成冷冻保护溶液；(d)将该冷冻保护溶液的一部分转移至冷冻小瓶；以及(e)在低于约-60℃的温度下储存该冷冻小瓶。

本发明还提供一种生产rhUG生产用细胞库的方法，包括：(a)用一部分rhUG主细胞库接种合适孵育肉汤；(b)孵育该接种肉汤；(c)将冷冻保护剂加入到该孵育肉汤中以形成冷冻保护溶液；(d)将该冷冻保护溶液的一部分转移至冷冻小瓶；以及(e)在在低于约-60℃的温度下储存该冷冻小瓶。

本发明还提供一种表达rhUG的方法，包括以下步骤：(a)提供包含能够表达rhUG的表达载体的制种细胞库培养物；(b)用该制种细胞库培养物接种肉汤培养基以形成接种物；(c)孵育在步骤b中形成的接种物；(d)用步骤(c)中形成的接种物接种大规模发酵罐以形成发酵培养物；(e)在该大规模发酵罐内孵育发酵培养物；(f)将诱导剂加入到该发酵培养物中以诱导rhUG的表达；以及(g)在步骤(f)之后收获该发酵培养物。

本发明进一步提供一种表达rhUG的方法，包括以下步骤：(a)用包含能够表达rhUG的表达载体的接种物接种大规模发酵罐以形成发酵培养物；(b)在该大规模发酵罐内孵育发酵培养物；(c)将诱导剂加入到发酵培养物中以诱导rhUG的表达；以及(d)收获发酵培养物。

本发明进一步提供了一种纯化rhUG的方法，包括以下步骤：(a)提供包含能够过表达rhUG的细菌细胞的细菌细胞糊料；(b)使该细菌细胞糊料(paste)裂解以形成上清；(c)通过第一标称截留分子量(NMWCO)膜过滤步骤b中形成的上清液以形成第一渗透物；(d)通过利用第二NMWCO膜浓缩在步骤(c)中形成的第一渗透物以形成第一浓缩物；(e)将步骤(d)中形成的浓缩渗透物加载到阴离子交换柱上以形成第一洗脱物；(f)通过利用第三NMWCO膜浓缩步骤(e)中形成的第一洗脱物以形成第二浓缩物；(g)将步骤(f)中形成的第二渗透物加载到羟磷灰石(HA)柱上以形成第二洗脱物；(h)从步骤(g)中形成的第二洗脱物中的rhUG分离宿主源蛋白以提供纯化rhUG；以及(i)回收站步骤(h)中形成的纯化rhUG。

本发明还提供一种纯化rhUG的方法，包括以下步骤：(a)提供能够过表达rhUG的细菌细胞；(b)使该细菌细胞裂解以形成上清液体；(c)通过截留分子量(nMWCO)膜过滤该液体；(d)将该液体加载到交换柱上；(e)从rhUG分离宿主源蛋白以提供纯化rhUG；以及(f)回收纯化的rhUG。

本发明提供了一种生产药用级rhUG药物的方法，包括以下步骤：(a)提供能够表达rhUG的细菌表达系统；(b)用包含该细菌表达系统的接种物接种发酵罐以形成发酵培养物；(c)将诱导剂加入到发酵培养物中以诱导rhUG通过细菌表达系统的表达；(d)收获在步骤(c)中表达的rhUG；以及(e)纯化在步骤(d)中收获的rhUG，其中该纯化步骤包括利用至少一个过滤器和至少一个交换柱。

本发明提供了一种用于确定样品中重组人子宫球蛋白效力的测定方法，包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触；(b)将放射标记物引入所述样品；(c)分离产物与样品；以及(d)确定切割水平。

本发明进一步提供一种用于测量体外由于重组人子宫球蛋白对分泌性磷脂酶A2酶的抑制或阻断而导致的抗炎作用的方法，包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触；(b)将放射标记物引入所述样品；(c)分离产物与样品；以及(d)通过闪烁计数来确定切割水平。

本发明还提供一种用于测定重组人子宫球蛋白对分泌性磷脂酶A2活性的抑制作用的测定方法，包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品接触磷脂酶A2；(b)将放射标记底物引入所述样品；(c)分离产物与样品；以及(d)通过闪烁计数来确定切割水平。

本发明还提供一种用于确定样品中重组人子宫球蛋白效力的测定方法，包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品接触磷脂酶A2；(b)将荧光标记底物引入所述样品；(c)从样品分离未切割的底物；以及(d)通过荧光确定切割底物的量。

本发明提供用于测量重组人子宫球蛋白与纤连蛋白体外结合的方法，包括：(a)使人纤连蛋白的重组片段与重组人CC10-HRP结合物接触；(b)使该测定可视化以确定重组人子宫球蛋白与纤连蛋白片段的结合。

本发明还提供一种药物组合物，包括纯化的重组人子宫球蛋白以及药用载体或稀释剂。

附图说明

现在将参考附图更详细地描述本发明，其中：

图1示出了用于rhUG的合成细菌基因的构建。

图2示出了利用合成细菌基因：SDS-PAGE分析rhUG的表达。

10-20％Tricine凝胶：从左至右，泳道为：泳道1：尺寸标准，泳道2：未诱导的细菌裂解物，泳道3：诱导的细菌裂解物。

图3示出了质粒pCG12的遗传图谱。

图4示出了主种子细胞库和生产种子细胞库过程的流程图。

图5示出了主种子细胞库和生产种子细胞库来源的细菌培养物的生长曲线。

细胞生长是根据主种(1)和生产种子(n)在600nm处的光学密度。

图6示出了用于rhUG表达的发酵过程的流程图。

图7示出了发酵培养物的生长曲线。

培养物生长是根据600nm处的OD(O)，通气(DO，●)是根据溶解氧探针，而搅拌(■)是按照rpm的函数。

图8示出了发酵期间rhUG表达的SDS-page分析。

10-20％Tricine凝胶。从左至右，泳道为：泳道1，彩虹标准物；诱导后在指定时间所提取的发酵样品：泳道2，3.8h；泳道4，4.0h；泳道4，4.2h；泳道5，4.5h；泳道6，5.0h；泳道7，5.6h；以及泳道8，6h。

图9a和b示出了纯化方案及其较小变动的流程图。

图10示出了初始TFF和渗滤的详细流程图。

图11a示出了Macro Q阴离子交换层析步骤的详细流程图。

图11b示出了Macro Q阴离子交换层析步骤的代表性色谱图。

图12示出了第二浓缩/渗滤步骤的详细流程图。

图13a示出了羟磷灰石层析步骤的详细流程图。

图13b示出了羟磷灰石层析步骤的代表性色谱图。

图14a示出了铜螯合层析步骤的详细流程图。

图14b示出了铜螯合层析步骤的代表性色谱图。

图15示出了Sartobind Q和第三浓缩/渗滤步骤的详细流程图。

图16示出了最后渗滤和配制的详细流程图。

图17示出了rhUG通过阳离子交换色谱纯化。

图18示出了rhUG通过HIC色谱纯化。

图19示出了用于UG竞争性ELISA的标准曲线。

图20示出了SPLA2测定的色谱图。

图21示出了用于纤连蛋白结合测定的标准曲线。

图22a示出了通过SDS-PAGE对纯化步骤的评估。

10-20％Tricine凝胶，从左至右，样品为：泳道1，彩虹标准；泳道2，粗裂解物；泳道3，100K渗余物；泳道4，5K渗余物；泳道5，#1，Macro Q通过物；泳道6，Macro Q清洗I#1；泳道7，Macro Q清洗I#2；泳道8，Macro Q清洗1#3；以及泳道9，Macro Q洗脱物。

图22b：通过SDS-PAGE对纯化步骤进行分析。

10-20％Tricene凝胶，从左至右，样品为：泳道1，彩虹标准；泳道2，羟磷灰石通过物；泳道3，羟磷灰石清洗I；泳道4，羟磷灰石洗脱物；泳道5，铜CSFF通过物；泳道6，Sartobind Q通过物；泳道7，纯化的rhCC10。

图23示出了药物纯度的SDS-PAGE分析。

10-20％Tricine凝胶：从左至右，样品为：泳道1，彩虹标准；泳道3，5μg 0726泳道5，5μg还原的0726；泳道7，10μg0726；泳道9，10μg还原的0726；泳道11，55μg 0726。泳道2、4、6、8、10和12保持未填充。

图24示出了利用抗-UG多克隆抗体对药物进行蛋白质印迹。

10-20％Tricine凝胶转移到Hybond-P PVDF转移膜，从左至右，样品为：泳道1，彩虹标准；

泳道2，rhCC10(批次0726)；泳道3，rhCC10(批次0728)；泳道4，彩虹标准；泳道5，还原的rhCC10(批次0726)；泳道6，还原的rhCC10(批次0728)。

图25示出了利用抗-大肠杆菌裂解物多克隆抗体对药物进行蛋白质印迹。

10-20％Tricine凝胶转移到Hybond-P PVDF转移膜，从左至右，样品为：泳道1，标准，来自BL21(DE3)的大肠杆菌细胞裂解物；泳道2，彩虹标准；泳道3，rhCC10(批次0726)；泳道4，rhCC10(批次0728)。箭头指示泳道3和4中的大肠杆菌杂质的位置。

图26示出了rhUG药物的等电聚焦PAGE凝胶。

从左至右，样品为：泳道1，标准；泳道2，55μg的rhCC 10，批次0726；泳道3，55μg的rhCC10，批次rhCC10/。

图27示出了rhUG填充工艺的流程图。

图28示出了药品纯度的SDS-PAGE分析。

10-20％Tricine凝胶，从左至右，样品为：泳道1，彩虹标准；泳道3，5μg 0728；泳道5，5μg还原的0728；泳道7，10μg0728；泳道9，10μg还原的0728；泳道11，10μg还原的研究对照，rhCC10/7。泳道2、4、6、8、10和12保持未填充。

图29示出了利用抗-UG多克隆抗体对药品进行蛋白质印迹。

10-20％Tricine凝胶转移到Hybond-P PVDF转移膜，从左至右，样品为：泳道1，彩虹标准；

泳道2，rhCC10(批次0726)；泳道3，rhCC 10(批次0728)；泳道4，彩虹标准；泳道5，rhCC 10(批次0726)；泳道6，还原的rhCC10(批次0728)。

图30示出了利用抗-大肠杆菌裂解物多克隆抗体对药品进行蛋白质印迹。

10-20％Tricine凝胶转移到Hybond-P PVDF转移膜，从左至右，样品为：泳道1，标准，来自BL21(DE3)的大肠杆菌细胞裂解物；泳道2，彩虹标准；泳道3，rhCC10(批次0726)；泳道4，rhCC10(批次0728)。箭头指示泳道3和4中在40kD处条带的位置。

图31示出了rhUG药品的等电聚焦PAGE凝胶。

从左至右，样品为：泳道1，标准；泳道2，55μg的rhCC10，批次0728；泳道3，55μg的rhCC10，批次rhCC10/7。

图32示出了cCG12的核苷酸序列(SEQ.ID NO.9)。

图33示出了rhUG的氨基酸序列(SEQ.ID NO.10)。

具体实施方式

以引用的方式将共同未决申请序列NO.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026(WO 98/53846)、PCT/US99/16312(WO______)、PCT/US00/09979(WO______)以及PCT/US01/12126(WO______)的公开内容并入本文中。

定义

如本文使用的，″纯rhUG″是指1)通过SDS-PAGE/蛋白质印迹或用抗大肠杆菌抗体的免疫沉淀，或通过分析HPLC在rhUG制剂中没有可检测的其他蛋白质；2)通过LAL试验没有可检测的细菌内毒素；3)通过DNA印迹(DNA杂交)没有可检测的细菌核酸。

如本文使用的，″纯化的rhUG″是指满足如本文所定义的纯度相关的所有规格的rhUG。

如本文使用的，″药用级rhUG″是指满足如本文中定义的以及在申请系列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026、PCT/US99/16312、PCT/US00/09979和PCT/US01/12126中描述的所有纯度、物理和生物学活性规格的rhUG。

如本文使用的，″亚型″是指能够通过物理或化学手段区分并且可能具有不同生物学活性的蛋白的替换形式，包括不同构象、由于翻译后修饰导致的氨基酸的化学组成上的小变化、或者纯化和加工中的变化。

如本文使用的，″构象″是指蛋白质的三维结构，包括折叠方式、表面电荷和疏水性分布。任何给定的蛋白质可以具有能够影响其与周围环境、以及其他蛋白质、化学品和细胞相互作用的多种构象。

如本文使用的，″聚集体″是指由单个蛋白质的多个单独单元构成的复合物。

如本文使用的，″杂质″是指除了目的药物或生物成分和所需赋形剂的终产物中常规存在的化合物；杂质可以是产物或工艺相关的。

如本文使用的，″污染物″是指在终产物中不是常规存在的化合物或材料。

如本文使用的，″规格″是指限定药用级蛋白、药物和药品的一组标准，尤其是物理和化学参数、以及生物学活性和抗原同一性。

如本文使用的，″效力测定″是指用来检测药物或药品的生物学活性并且用来计量在体内药物生物学活性的强度的特定试验，用于将生物学活性与物理参数如蛋白质浓度相关联并对给定药物的不同制剂彼此进行比较的目的。

如本文使用的，″免疫测定″是指用来通过利用一种或多种抗体鉴别抗原，在这种情况下是子宫球蛋白的试验，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)。

如本文使用的，″制剂″是指包含生物学活性药物加特定赋形剂的特定药物组合物。

如本文使用的，″过程中间体″是指包含或源自过程中各个步骤产物的样品。

″原料药″-(参见“药物”)

如本文使用的，″药物″是指在最终制剂和装入最终药物容器之前的纯化药物，即rhUG。

如本文使用的，″药品″是指以用于患者群体的药物的最终形式。

如本文使用的，″RhUG药物″是指满足本文中提出的规格的rhUG的药用级制剂并且介导本文和申请序列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026、PCT/US99/16312、PCT/US00/09979和PCT/US01/12126中描述的活性。

如本文使用的，″RhUG药品″是指满足本文中提出的规格的rhUG的药用级制剂并介导本文和申请序列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026、PCT/US99/16312、PCT/US00/09979和PCT/US01/12126中描述的活性。

如本文使用的，″标准操作程序″是指根据cGMP指南用于执行特定任务的限定程序。

如本文使用的，″研究种子库″是指在GLP条件下制成的种子库。

如本文使用的，″主种子库″是指在cGMP条件下制成的种子库，种子库的目的是充当生产种子库生产和长期储存的来源。

如本文使用的，″生产种子库″是指在要用来启动cGMP发酵的cGMP条件下制成的种子库。

如本文使用的，″cGMP″是指现行良好制造规范。

如本文使用的，″cGMP生产过程″是指在如由FDA定义的cGMP下进行的生产过程。

如本文使用的，″稳定药物/药品″是指满足一系列指示生物学和物理稳定性的预先定义的标准的药物/药品。

如本文使用的，″生物学活性rhUG″是指这样的UG，其既能够抑制PLA2的活性和结合至重组人纤连蛋白片段，又能抑制申请系列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026、PCT/US99/16312、PCT/US00/09979和PCT/US01/12126中描述的活性。

优选实施方式的描述

本发明包括用于生产rhUG的细菌表达系统。在一个实施方式中，该细菌表达系统包括编码人UG的合成基因。在另一个实施方式中，该合成基因包括Seq.ID.No.1-4。本发明还提供用于生产rhUG的细菌表达系统，包括编码人UG的人cDNA序列，其中该基因进一步包括在该序列N末端处的Met-Ala-Ala。在一个进一步实施方式中，合成基因进一步包括在该合成基因N末端处的Met-Ala-Ala。在又一个实施方式中，该表达系统进一步包括大约2.8kb par序列。

本发明还包括生产rhUG研究种子库的方法。在一个实施方式中，生产rhUG研究种子库的方法包括以下步骤：a)在生长介质上接种包含rhUG表达系统的细菌株的至少一个菌落；b)孵育该接种生长介质直至达到稳定期；c)将冷冻保护剂例如甘油加入到接种生长介质；d)以等分部分冰冻培养物；以及e)在低于约-50℃，优选-50℃至-100℃的温度下储存该冰冻等分部分。在另一个实施方式中，生产rhUG研究种子库的方法包括孵育接种生长介质，通过550nm至660nm，优选在600nm处的光学密度监控生长，直至达到约0.8吸光度单位(AU)至1.5AU的光学密度。

本发明还包括生产主细胞库的方法，包括以下步骤：a)用rhUG研究种子库的等分部分接种适当孵育肉汤以形成细菌培养物；b)孵育细菌培养物；c)将冷冻保护剂加入到细菌培养物以形成冷冻保护溶液；d)将冷冻保护溶液的一部分转移到冷冻小瓶；以及e)在低于约-60℃，优选为-50℃至-100℃的温度下储存冷冻小瓶。在一个实施方式中，生产rhUG主细胞库的方法包括孵育细菌培养物，通过550nm至660nm，优选600nm处的光学密度(OD)监控生长，直至达到约0.8AU至1.5AU的光学密度。

本发明还公开了用于从一部分主细胞库生产rhUG生产细胞库的方法。

本发明包括表达rhUG的方法。在一个实施方式中，表达rhUG的方法包括以下步骤：a)提供包括能够表达rhUG的表达载体的生产种子细胞库培养物；b)用生产种子细胞库培养物接种肉汤培养基以形成接种物；c)孵育在步骤b中形成的接种物；d)用步骤(c)中形成的接种物接种大规模发酵罐以形成发酵培养物；e)在该大规模发酵罐内孵育步骤(d)中形成的发酵培养物；f)将诱导剂加入到步骤(e)中形成的发酵培养物以诱导rhUG的表达；以及收获发酵培养物。

在一个实施方式中，表达rhUG的方法利用包括Seq.ID No.1-4的表达载体。在另一个实施方式中，接种物在约28℃和约36℃之间的温度下孵育约12小时至约24小时。在又一个实施方式中，步骤(e)的孵育持续直至达到两个吸光度单位的最小OD(在550nm至660nm范围内，优选600nm)。

诱导剂可以是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。在又一个实施方式中，在诱导步骤和收获步骤之间经过约1至4小时。在又一个实施方式中，利用离心收获发酵培养物。

本发明提供进一步的表达rhUG的方法，包括以下步骤：a)用包括能够表达rhUG的表达载体的接种物接种大规模发酵罐以形成发酵培养物；b)在该大规模发酵罐内孵育发酵培养物；c)将诱导剂加入发酵培养物以诱导rhUG的表达；以及d)收获发酵培养物。

在表达rhUG的一个实施方式中，表达载体包括Seq.ID No.1-4。本发明在另一个实施方式中，提供具有至少300升容积的大规模发酵罐。在又一个实施方式中，步骤b的孵育持续直至实现550nm至660nm，优选600nm的约2.0AU的最小光学密度。在又一个实施方式中，诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。在一个进一步实施方式中，在步骤c和步骤d之间经过约1至约4小时。在一个进一步实施方式中，收获发酵培养物包括离心。

本发明进一步包括纯化rhUG的方法。在一个实施方式中，纯化rhUG的方法包括以下步骤：a)提供包括能够过表达rhUG的细菌细胞的细菌细胞糊料；b)使细菌细胞糊料裂解以形成上清；c)通过第一标称截留分子量(NMWCO)膜过滤该上清以形成第一渗透物；d)通过利用第二NMWCO膜浓缩第一渗透物以形成第一浓缩物；e)将步骤(d)中形成的浓缩渗透物加载到阴离子交换柱上以形成第一洗脱物；f)通过利用第三NMWCO膜浓缩步骤(e)中形成的第一洗脱物以形成第二浓缩物；(g)将第二浓缩物加载到羟磷灰石(HA)柱上以形成第二洗脱物；h)从rhUG分离第二洗脱物中的宿主来源蛋白质以提供纯化的rhUG；以及i)回收纯化的rhUG。

在一个实施方式中，纯化rhUG的方法利用包括Seq.ID No.1-4的细菌细胞。在另一个实施方式中，通过剪切实现裂解细菌细胞糊料。在又一个实施方式中，细胞碎片通过步骤(b)和(c)之间的离心除去。在又一个实施方式中，步骤(b)膜是约30K至100KNMWCO膜。

在另一个实施方式中，步骤(c)的过滤包括使用正切流动过滤(TFF)系统。在另一个实施方式中，步骤d的膜是约5k截留膜。在又一个实施方式中，阴离子交换柱是Macro Q阴离子交换柱。在又一个实施方式中，用螯合琼脂糖快速流动(CSFF)树脂柱分离宿主来源蛋白。在一个实施方式中，CSFF树脂柱包括铜。在又一个实施方式中，宿主来源蛋白通过30K NMWCO膜过滤rhUG而从rhUG分离。

在另一个实施方式中，带正电的膜置于CSFF柱的下游，形成基本上无宿主来源蛋白的通过物。在一个实施方式中，这种带正电的膜是Sartobind Q TFF膜。在又一个实施方式中，该通过物经约5K NMWCO膜渗滤。在另一个实施方式中，在步骤i中回收的rhUG基本上没有聚集物。

本发明提供了纯化rhUG的进一步方法。这些进一步方法之一包括以下步骤：a)提供能够过表达rhUG的细菌细胞；b)裂解细菌细胞以形成上清液体；c)通过截留分子量(NMWCO)膜过滤该液体；d)将该液体加载到交换柱上；e)分离宿主源蛋白与rhUG以提供纯化的rhUG；以及f)回收该纯化的rhUG。

在另一个实施方式中，步骤c的过滤包括使用正切流动过滤(TFF)系统。在又一个实施方式中，阴离子交换柱是Macro Q阴离子交换柱。在又一个实施方式中，用螯合琼脂糖快速流动(CSFF)树脂柱分离宿主来源蛋白质。在另一个实施方式中，回收的rhUG基本上没有聚集物。

本发明还提供生产药用级rhUG药物的方法，包括以下步骤：a)提供能够表达rhUG的细菌表达系统；b)用包含该细菌表达系统的接种物接种发酵罐以形成发酵培养物；c)将诱导剂加入到发酵培养物以诱导rhUG通过该细菌表达系统的表达；d)收获步骤c中表达的rhUG；以及e)纯化在步骤d中收获的rhUG，其中该纯化步骤包括使用至少一个过滤器和至少一个交换柱。

本发明还包括一种用于确定样品中重组人子宫球蛋白效力的测定方法，其包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触，(b)将标记的底物引入所述样品，和(c)从样品分离产物，以及(d)确定切割水平。在一个实施方式中，该测定与标准¹⁴C标记测定联合使用。在本发明的另一个实施方式中，标记的底物是1-硬脂酰-2-[1-¹⁴C]花生酰基磷脂酰胆碱。在进一步实施方式中，在步骤(a)中将重组人磷脂酶A2加入至2nM至200nM的最终浓度。在本发明另一个实施方式中，步骤(a)的样品在30℃至40℃下预孵育15分钟至30分钟。在本发明的又一个实施方式中，步骤(b)中所加入的标记底物的终浓度为0.5μg/ml  50μg/ml。

在本发明的一个实施方式中，步骤(b)中反应在加入有机相终止溶液之后5分钟至30分钟停止。有机相终止溶液的一个实例是具有Doles试剂和纯水(84∶16)的7.7稀释液。在本发明的一个实施方式中，步骤(c)中的样品通过涡旋和离心进行分离，并且步骤(c)的产物是花生四烯酸，其中步骤(c)中通过液液分离而从样品分离。

在本发明的一个实施方式中，分离样品并除去顶层以进行闪烁计数以确定在步骤(d)中的切割水平。分离可以通过涡旋和离心完成。

本发明还提供一种用于测量体外由于通过重组人子宫球蛋白对磷脂酶A2酶的抑制或阻断而导致的抗炎作用的方法，包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触，(b)将标记底物引入所述样品，(c)从样品分离产物，以及(d)通过闪烁计数确定切割水平。

本发明进一步提供一种用于测定通过重组人蛋白子宫球蛋白对分泌性磷脂酶A2活性的抑制作用的测定方法，包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触，(b)将标记底物引入所述样品，(c)从样品分离产物，以及(d)通过闪烁计数确定切割水平。

本发明提供一种用于确定样品中重组人子宫球蛋白效力的测定方法，其包括：(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触，(b)将荧光标记的底物引入所述样品，(c)从样品分离未切割的底物，以及(d)通过荧光确定切割底物的量。

在本发明的一个实施方式中，步骤(a)中重组人子宫球蛋白的样品的最终浓度为34nM至34μm。在本发明的另一个实施方式中，步骤(a)的样品在30-40℃下预孵育15-30分钟。

在本发明的进一步实施方式中，荧光标记的底物是2-癸酰基-1-(O-(11-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3丙酰基)氨基)十一烷基)-sn-丙三醇-3-磷酰胆碱。在本发明的又一个实施方式中，步骤(b)中加入到底物加入至0.5-50μg/ml的最终浓度。

在本发明的一个实施方式中，步骤(b)中的反应在加入有机相终止液的1至5倍稀释液5-30分钟后终止。在本发明的另一个实施方式中，有机相终止液是2-丙醇∶正己烷(8∶3)。在本发明的另一个实施方式中，1μL至100μL的终止测定在步骤(c)中直接加载到硅胶正相HPLC柱上。在本发明的一个进一步实施方式中，步骤(d)的荧光在460nm 至505nm处激发和在505nm至550nm处发射。

本发明提供一种用于检测重组人子宫球蛋白与纤连蛋白体外结合的方法，包括：(a)使人纤连蛋白的重组片段与重组人CC 10-HRP结合物接触，以及(b)使该测定可视化以确定重组人子宫球蛋白与该纤连蛋白片段的结合。

本发明还提供一种用于确定重组人子宫球蛋白纯度的方法，其包括：(a)对权利要求所述过程内每一个步骤处的中间体进行取样，以及(b)分析该过程中间体。

在本发明的一个实施方式中，过程中间体在步骤(b)中通过SDS-PAGE分析。在本发明的另一个实施方式中，过程中间体在步骤(b)中通过rhUG ELISA分析。在本发明的一个进一步实施方式中，过程中间体在步骤(b)中通过LAL分析。在本发明的又一个实施方式中，分析步骤(b)中中间体的蛋白质含量。

本发明提供一种药物组合物，包括本发明的纯化重组人子宫球蛋白。本发明还提供一种药物组合物，包括纯化的重组人子宫球蛋白和药用载体或稀释剂。

在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白包含低于5％的重组人子宫球蛋白聚集体。在本发明的另一个实施方式中，重组人子宫球蛋白的纯度大于95％。在本发明的一个进一步的实施方式中，重组人子宫球蛋白的内毒素水平包括低于5EU/mg rhUG。在本发明又一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在氯化钠溶液中。

在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中稳定至少4个月。在本发明的另一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中稳定至少6个月。在本发明的一个进一步实施方式中，重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中稳定至少9个月。在本发明的又一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中稳定至少12个月。在本发明的又一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中稳定至少15个月。在本发明的又一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中稳定至少18个月。在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下溶液中稳定至少1个月。在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下溶液中稳定至少2个月。在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下溶液中稳定至少4个月。在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下的溶液中稳定至少7个月。

在本发明的另一个实施方式中，重组人子宫球蛋白施用给哺乳动物是安全的。在本发明的一个进一步实施方式中，重组人子宫球蛋白施用给人是安全的。在本发明的又一个实施方式中，重组人子宫球蛋白经由气管内插管施用是安全的。在本发明的一个实施方式中，重组人子宫球蛋白施用给早产婴儿是安全的。在本发明的另一个实施方式中，重组人子宫球蛋白施用给接受人工表面活性剂的患者是安全的。在本发明的一个进一步实施方式中，重组人子宫球蛋白施用给呼吸性窘迫的患者是安全的。

重组人UG通过以下描述的步骤生产。rhUG具有超过97％的纯度，使得其尤其可以根据申请序列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026、PCT/US99/16312、PCT/US00/09979和PCT/US01/12126中描述的发明用来调节免疫应答、抑制炎症以及减少或防止纤维化和在体外和体内的未调节细胞增殖。在某些实施方式中，纯度为99％或更大。

rhUG表达附加体和rhUG生产用菌株的制备

两种类型的新型细菌表达系统被开发用于生产重组人UG。一种涉及利用优化用于细菌蛋白质合成的密码子，构建人UG的新型合成基因。另一种利用在没有抗生素选择下赋予质粒稳定遗传的细菌遗传元件。两种途径产生能够有效过表达UG的细菌宿主-载体系统。

rhUG合成细菌基因的构建

设计人UG合成细菌基因以提高细菌表达并通过合成寡核苷酸进行组装。因为成熟的天然UG在N末端具有谷氨酸残基，起始密码子甲硫氨酸必须在该N末端插入，这允许在细菌中启动从mRNA的肽合成(翻译)。优化密码子使用以用于细菌中的表达，通过将细菌中最经常使用的密码子(Anderssen and Kurland，1990)整合到蛋白编码序列。用于重组人UG表达的合成基因类似地通过剪裁密码子使用来构建以优化在昆虫细胞、酵母细胞以及其他非灵长类哺乳动物物种中的表达。密码子使用的优化导致更高的翻译效率和蛋白表达水平。使用细菌中优选的密码子还可以减少对由消耗稀少带电tRNA产生的代谢负担的胁迫应答。不受特定理论束缚，认为由于细菌带电tRNA的不平衡导致的这种胁迫应答可以改变转录模式，增大细胞蛋白分解，以及改变细胞代谢。所有这些因素可以有助于蛋白质产物被表达的发酵培养物中具有再现性的问题。生产培养物中的变化可以导致下游纯化中的更大问题，其中新型细菌蛋白在该过程的不同步骤出现。

实施例I

合成细菌基因的组装

rhUG合成细菌基因通过表1所示的寡核苷酸进行组装。(合成寡核苷酸获自Bioserve Biotechnologies，Inc.)寡核苷酸1-4(SEQ.IDNO.1-4)分别表示编码链而5-8(SEQ.ID NO.5-8)分别表示互补链。两个组分别以从5′至3′的顺序，并且通过利用图1所示的标准方法进行退火和连接以完成组装。连接混合物转化到下表2中所示的恰当菌株，并且用恰当的抗生素对带有质粒载体的菌落进行选择。转化株用在该细菌菌落上直接进行的快速PCR测定进行初步筛选以确定插入尺寸。然后对带有234bp rhUG插入体的菌落进行传代培养以进一步筛选。对来自PCR阳性菌落的10ml细菌培养物进行二次筛选，其中寻找大约10kDa的可诱导蛋白条带的表达(参见图2)。用于rhUG诱导表达的完整细胞样品，在2xSDS-PAGE凝胶加载缓冲液中直接裂解。样品在微胶装置(Novex)中在16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上运行。筛选过程在Pilon(1997)中详细描述，其通过引用并入本文中。制备来自过表达可诱导UG条带的克隆的质粒DNA并再次验证rhUG编码区的DNA序列。然后将质粒DNA和来自阳性克隆划线的单个菌落细菌分离物在-20℃和-80℃下冷冻储存。

表1

然后将分别与该合成基因的5′和3′端同源、且包含具有NcoI和BamHI限制位点的侧翼连接物的寡核苷酸，用来通过PCR扩增该合成细菌基因并将其克隆到pKK223-3(获自Pharmacia Corp.)。对pKK233-3中合成基因的DNA序列进行确认。该克隆弱表达rhUG表明，除了起始密码子甲硫氨酸(Peter，et al.，1989)之外，在N末端处需要额外的氨基酸残基，以便增加rhUG表达水平。因此，构建一组具有不同长度的N末端插入的合成细菌rhUG基因以评价对于细菌rhUG表达的最佳长度。这些额外的氨基酸可以有助于稳定细菌核糖体和胞质中的新生肽。由交替的甘氨酸和丝氨酸(由于它们都具有小侧链)构成的额外氨基酸，不是高度带电的或高度疏水性的，并因此不可能中断UG单体和二聚体的天然折叠和组装。密码子使用和连接物如上所述使用并且将这些基因克隆入pKK223-3。验证每个基因的DNA序列。对于选择获得的正确rhUG编码序列和rhUG可诱导表达的克隆体在固体介质上从菌落接种到50ml肉汤中并振荡过夜。这种起子培养物用来接种在摇瓶中250ml含抗生素的丰富介质。这些培养物在恰当条件下生长直到它们在600nm处达到0.5的光密度。然后对每个克隆体诱导rhUG的表达(参见表2)。这些培养物再振荡培养2-4小时。通过离心收获细胞，重悬，并通过SDS-PAGE分析rhUG表达。比较每个基因的rhUG表达水平并选择产生最多蛋白的基因用于进一步宿主/载体系统优化。产生最多蛋白的基因除了人子宫球蛋白序列外还具有含三个额外氨基酸残基的N末端并称为MGS-基因。

存在与使用pKK223-3相关的显著缺点。首先，pKK223-3不适用于在美国生产生物药剂，因为它需要氨苄西林选择用于从母细菌细胞至子细菌细胞的稳定质粒遗传性。大约20％的美国人口对青霉素及其衍生物(其中之一为氨苄西林)过敏。由于这个原因，FDA已禁止在用来产生重组生物药剂蛋白的过程中使用氨苄西林。在没有氨苄西林的情况下，质粒可能随着母细胞分化而从培养物的细胞丢失并且不选择包含该质粒的子细胞。质粒DNA复制代表对细菌细胞的显著代谢负担。在没有抗生素的情况下，缺少质粒的子细胞相对于仍然含有该质粒的子细胞具有竞争优势并且将快速接管培养物。

其次，合成基因的转录被lac抑制蛋白(其结合至lac启动子元件并阻止下游蛋白的未诱导表达)所抑制。因此，pKK223-3的高拷贝数可以导致比细胞中存在的lac抑制蛋白更多的启动子元件，引起“遗漏”蛋白表达。Lac启动子的基因下游的转录实际上通过加入结合至lac抑制蛋白的化学物质(异丙基硫代半乳糖苷，“IPTG”)开始，使其释放lac启动子DNA。细菌RNA聚合酶然后结合至该启动子并开始转录。启动子去抑制由此诱导mRNA转录和蛋白表达。遗漏蛋白当下游蛋白(这种情况为rhUG)在未诱导培养物中合成时发生表达。观察到来自pKK223-3的遗漏rhUG表达。

实施例II

大肠杆菌中质粒载体构建体的测试

包含MGS-合成基因以及复制子、启动子、转录抑制子和抗生素选择的不同组合的若干不同质粒载体构建体接着在若干不同的大肠杆菌菌株中进行测试。这些宿主/载体系统中的若干在表2中示出。还制备一种在N末端处带有MAA-的合成基因形式并在一些宿主-载体系统中进行测试。利用包含来自pKK223-3克隆体的rhUG合成基因的BamHI片段将合成基因亚克隆入pRK248cIts。利用含有pKK223-3基因的NcoI-BamHI片段亚克隆入pGEL101和pGELAC。

表2

表2-脚注

¹要求抗生素选择以选择包含质粒的细菌转化体，但对于质粒维持(例如质粒的稳定遗传性)可以不是必需的。

²用100微克/毫升的固体或液体培养介质进行氨苄西林选择。

³对于pRK248cIts的四环素选择是20微克/毫升的固体或液体培养介质。四环素选择在非诱导条件下对于pRK248cIts的稳定遗传性是不需要，但在诱导rhUG合成时需要。

⁴氨苄西林选择对于pGELAC的稳定遗传性不需要。

⁵用来诱导rhUG表达的IPTG的浓度为0.5mM。

⁶从λP_L的转录通过在32℃42℃的培养温度下快速转换进行诱导。温度变化引起λ抑制蛋白的构象改变，其也从pRK248cIts载体表达，这使其不能结合λP_L启动子。然后细菌RNA聚合酶能够识别启动子并开始转录。

⁷″A″表示rhUG基因处于一种取向，而″B″表示它处于相反取向(在相同BamH1位点中)。

利用pRK248cIts的一个显著优点在于，它是具有非常稳定的源自RP4的复制原点的低拷贝数(oligo-copy number)质粒。大多数高拷贝数载体允许在未诱导状态下的“遗漏”蛋白表达并且固有地比较低拷贝数质粒更不稳定。尽管pRK248cIts不需要用于维持和子细胞中质粒的稳定遗传性的选择，但是它带有氨苄西林和四环素等抗生素抗性基因。这些抗生素可以用于克隆期间细菌转化体的方便选择。然而，当质粒编码的重组蛋白被诱导高水平表达时，质粒稳定性经常受损。如果在重组蛋白表达期间需要抗生素来维持该质粒，则四环素可以用于生物药剂生产，其是FDA所允许的。

合成基因也插入到pGEL101(Mantile，1993)和pGELAC(Mantile，2000)。对来自该合成基因的rhUG表达与来自这些质粒中人cDNA序列的表达进行比较并且该合成细菌基因获得优异结果。

使用par序列(一个来源于宽宿主范围R因子RP4的2.8kb序列)来稳定质粒遗传性已在恒化器条件下进行了描述，其中在没有抗生素作为稳定标准的条件下，在延长的长生长期之后使用氨苄西林进行选择(Mantile，2000)。然而，本发明的过程不涉及使用恒化器条件。相反，生产菌株(宿主/载体系统)需要经过一系列种子库过程，涉及在没有氨苄西林下的生长，接着是一个冰冻-解冻循环。然后该宿主/载体系统必须通过一系列发酵以在诱导蛋白表达之前达到大细胞生物量，在没有氨苄西林选择下保持稳定，在诱导蛋白表达期间必须维持稳定的遗传性以便实现最大蛋白水平。

生产用菌株CG12是一种包含类似于大肠杆菌BL21/DE3中pGELAC的质粒的宿主/载体系统。测试这种菌株的遗传稳定性(在DNA序列的水平)和在没有氨苄西林选择下的质粒稳定性。以下实施例证实，生产菌株CG12中的该宿主/载体系统在整个生产过程(从种子库至最终收获大规模诱导的发酵培养物)中在所有方面都是稳定的。

独立宿主-载体系统的构建

UG蛋白编码序列来源于从人肺mRNA产生的cDNA。用于重组人UG的cGMP表达系统类似于Mantile等人(Mantile，2000；Mantile，1993，Miele，1990)所描述的表达系统。利用T7启动子和T7DNA依赖性RNA聚合酶，该蛋白从质粒(称为pCG12)表达，这在BL21/DE3宿主菌株基因组中的IPTG可诱导lac启动子的控制下。该表达载体pCG 12编码相对于天然人蛋白在其N末端处具有三个额外氨基酸的蛋白(一个起始甲硫氨酸，接着两个丙氨酸)。虽然这些对于细菌中的有效翻译是必需的，但是甲硫氨酸在发酵过程期间被切割掉，导致产生包括在N末端处具有两个额外丙氨酸的UG蛋白的产物。

pCG12表达载体由于若干原因而适用于cGMP生产。首先，它缺少在发酵期间对于抗生素选择的要求。尽管pCG12可以利用氨苄西林进行选择，但是在细菌细胞生长和增殖期间不需要抗生素来维持稳定的质粒遗传性。通过利用质粒稳定化序列(称为par)实现无抗生素的稳定质粒遗传性。该par序列是一个来源于宽宿主范围R因子RP4的2.8kb序列(Gerlitz，1990)。par修饰质粒分配并显著增强质粒稳定性。这个序列在恒化器条件下赋予长期稳定性，在没有抗生素选择下超过250代(Mantile et al.，2000)。其次，pCG12在药物生产过程中通常是稳定的。其DNA序列不会改变，不管细胞库构建(其涉及可以破坏DNA的冰冻和解冻步骤)。第三，已经表明在细胞库构建过程、传代培养、以及分批发酵中，该par序列在没有氨苄西林选择下赋予质粒稳定性。

图3示出了pCG12中遗传元件的排列。这种表达载体类似于pGELAC(Mantile，2000：Genebank登录号HSU01102)。用于rhUG表达的细菌宿主菌株是BL21/DE3(ATCC#47092)。该2.8kb par序列来源于宽宿主范围R因子RP4，其赋予增强质粒稳定性的分配功能，并且已经表明，它在从细胞库构建至大规模发酵的整个生产过程中赋予质粒稳定性。

实施例III

研究种子细胞库的制备

从LB琼脂(含有50微克/ml的氨苄西林)上生长的包含pCG12的BL21/DE3的单个菌落接种研究种子培养物。研究种子库从在32℃不含抗生素选择的LB培养基中生长的50ml研究种子培养物进行传代。培养物生长至早期平稳期并加入甘油至2％的最终浓度。然后将培养物在1ml等分试样中冰冻并储存在-75℃下。这种研究种子的等分试样然后用于发酵开发，以及用来产生主细胞库和工作细胞库。

pCG12载体是遗传稳定的，使得DNA序列在生产rhUG药物所需的操作中保持未改变。整个pCG12质粒在克隆后和在产生研究种子库之前进行测序(SEQ.ID NO.9)。尽管pCG12在没有抗生素下是稳定的，但是它确实对其细菌宿主赋予氨苄西林抗性。从发酵生产培养物回收的pCG 12质粒的DNA序列与来自研究种子的质粒序列相同。

实施例IV

主种细胞库和生产种子细胞库的制备

主细胞库制备自菌株CG 12的研究种子。概述主细胞库和生产用细胞库构建过程的流程图在图4中呈现。生产主种和生产种子所使用的化学物质和材料的清单在表3中提供。所有化学物质和材料是USP级，符合cGMP。

表3

将CG12研究种子的等分试样加入到包含Luria肉汤(“LB”)的摇瓶中并维持在32℃振荡培养。通过550nm至660nm，优选在600nm的光密度(OD)监控生长。没有使用抗生素。随后以大致1小时间隔从摇瓶提取肉汤样品并测量各自的吸光度并且记录直至达到0.8至1.5AU的OD₆₀₀。然后将100毫升的培养物与20ml的冷冻保护剂(甘油)组合并将样品保留进行革兰氏染色以验证培养物中存在的细菌的同一性和纯度。无菌地将1毫升培养物转移到90个标记冷冻小瓶每一个中，将它们放入三个标记箱子中，每个箱子容纳30个小瓶。将两个箱子转移到维持在-80℃的冷冻设备，并且将一个箱子转移到液氮进行储存。

然后通过主细胞库制备生产用细胞库。用于制备生产用细胞库的过程与制备主细胞库的过程相同，只是代替研究种子，使用来自主细胞库的小瓶来开始培养。制备90个小瓶，每个包含1毫升的培养物，并放入三个箱子，每个容纳30个小瓶。将两个箱子转移到维持在-80℃的冷冻设备，并且将一个箱子转移到液氮进行储存。

每个培养物和细胞库广泛地进行测试并记录结果以符合cGMP指南。作为时间的函数显示在600nm的吸光度的主种和生产种子库培养物的生长曲线在图5中示出。两种培养物在几小时内达到对数生长并在中间对数生长中收获。用于初始存活率的样品在这时提取。用于测试各个库的存活率的样品在种子小瓶冰冻之后一周提取。用来定量用于cGMP的库的其他试验和测定在以下描述。主种和生产种子(批次分别为0644和0645)的这些测定结果分别在表4和表5中提供。主种和生产种子都通过所有规格。由于细胞冰冻，预期损失5-10％的细胞存活率。

以下测定用于主种细胞库/生产种子细胞库和发酵的表征。

纯度。利用无菌技术对LB平板进行划线并在37℃下孵育。在24至36小时之后检查菌落。

存活率。通过将细胞培养物的系列稀释液在有或没有氨苄西林的LB琼脂平板上进行铺板来确定细胞存活率。然后对菌落计数并记录结果。

革兰氏染色。将待测试的少量培养物转移到载玻片并允许该载玻片在热固定之前进行空气干燥。然后用结晶紫接着是革兰氏碘液对固定的细胞进行染色。然后以1000x在油浸镜头下检查细胞。对照有机体是金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌。

菌落形态。如在SOP中所述的对LB平板进行划线并如所述的进行孵育。在24-36小时后检查菌落。

菌落外观。利用无菌技术对LB板划线并在37℃下孵育。在24-36小时后检查菌落。

光密度。利用LKB分光光度计，通过550nm至660nm，优先在600nm处的吸光度来确定培养物的细胞密度。

SDS-PAGE。用于发酵的SDS-PAGE的样品以及用于纯化的过程样品在10-20％Tricine凝胶(Novex)上运行。样品与2x TricineSDS-PAGE加载缓冲液(Novex)1∶1(v∶v)混合并运行直至染料前沿距离凝胶底部大约1cm。将高或低分子量范围尺寸标记物(Amersham)用作标准。在10％乙酸/30％甲醇存在下通过加热至至少85℃达5分钟来固定凝胶，接着用获自Pierce Chemical Co.的Gel Code Blue染料进行染色。如Pierce所述在纯水中进行脱色。然后对凝胶进行照相并干燥。

表4

CFU＝菌落形成单位

表5

CFU＝菌落形成单位

生产种子细胞库用来接种用于生产rhUG的发酵并且主种细胞库用来产生当被用完时的新生产种子细胞库。这两种库提供用于长期符合规格的原料来源，例如细菌细胞糊料，从其中纯化药用级rhUG。

实施例V

发酵

发酵中使用的化学物质和设备的列表分别在表6和表7中提供。

表6

表7

概述发酵过程的流程图在图6中呈现。为了开始发酵过程，在室温下解冻生产种子细胞库的小瓶。然后100毫升生产种子被用来接种各自包含1升无菌顶级肉汤培养基(Becton-Dickinson SelectAPS Super Broth，glycerol and WFI)的六个冯巴赫瓶(fernbachflask)中的每一个。然后六个瓶子中的培养物在具有搅拌(300rpm)的New Brunswick摇床孵育器中32℃下孵育大约20小时。然后六个瓶子中的培养物用来接种在400升New Brunswick科学发酵罐系统(型号IF-400)中300升的顶级肉汤(Superbroth)。

在接种之前发酵罐的准备如下：根据标准操作程序清洗发酵罐并消毒，然后装载100kg的WFI。将顶级肉汤培养基(BectonDickinson Select APS Super Broth，甘油和WFI)加入到发酵罐并加入另外的WFI以达到最终的300kg净重量。然后发酵罐根据标准操作程序进行压力测试并在122℃下消毒30分钟。根据需要将消泡剂(Mazu DF 204)加入到发酵中。用于发酵的设定参数限定在表8中。

表8

然后将摇瓶接种物加入到发酵罐并且培养物在25℃至40℃下生长直至达到2.0的在600nm的最小光密度。在达到2.0的最小OD₆₀₀时，通过将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入发酵培养物至0.1mM至10mM的最终浓度以诱导rhUG的表达。诱导后维持发酵至少1小时，优选两小时。通过利用Sharple’s连续进料离心机离心收获细菌培养物。分离细胞糊料并在-80℃下冷冻储存用于以后纯化。

在所示的实施例中，用于发酵罐接种的六个摇瓶培养物在14.5小时之后达到2.8的平均OD₆₀₀，并且每毫升包含210x10⁶个菌落形成单位。在发酵期间，响应于发酵中3小时和4小时之间增加的细胞代谢和生物量，溶解氧水平减小。振摇范围足以将溶解氧维持在20％的最低水平。发酵培养物中rhUG的表达在4.2小时后(其中OD₆₀₀为2.7并且细胞数为40x10⁶CFU/ml)诱导。在诱导后1小时内以log期速率持续生长一段时间，在发酵大约6小时后收获细胞(图7)。样品取自发酵后的培养物并随后通过SDS-PAGE进行分析(图8)。所有其他发酵数据记录在表9中。发酵通过所有规格。

表9

CFU＝菌落形成单位

实施例VI

rhUG的纯化

在纯化rhUG中使用的化学物质、辅助材料和设备在表10和表11中示出。

表10

表11

具有普通生物学活性以及物理化学规格的多批rhUG通过相同过程的少量变形进行纯化，其中的两种遵照对于药剂生产的cGMP指南。这些过程中的两种、cGMP纯化过程之一以及生产用于动物研究的一个过程在图11中概述。cGMP过程和生产用于动物研究的rhUG中使用的这些过程及若干变形描述如下。对于图11b中概述的cGMP过程，1千克细菌细胞糊料通过剪切裂解并通过离心除去细胞碎片。裂解物(上清)然后在正切流动过滤(TFF)系统中利用100K标称截留分子量(NMWCO)膜进行处理。来自该100K步骤的渗透物利用5K NMWCO膜通过TFF浓缩并加载到Macro Q阴离子交换柱上。来自该阴离子交换柱的洗脱物在被加载到I型羟磷灰石(HA)柱上之前，利用5K NMWCO膜通过TFF浓缩和渗滤。然后将来自HA柱的洗脱物直接加载到装有螯合琼脂糖快速流动(CSFF)树脂与作为螯合剂的铜的柱上。rhUG通过该柱而HA洗脱物中存在的宿主来源蛋白结合于该柱。带正电的Sartobind QTFF膜也置于铜CSFF柱之后的下游，以确保从最终原材料除去最大量的内毒素。浓缩来自Sartobind Q的通过物然后利用5KNMWCO膜进行广泛渗滤，其中用于注射的盐水(SFI)作为置换缓冲液，以除去残留铜以及恰当地配制最终原材料。

这种过程及其少量变形都用于单独的cGMP临床批次以及用于动物试验的多个批次。这些变形包括：1)使用30K NMWCO膜或50K NMWCO膜代替100K NMWCO膜，用于分离在澄清细菌裂解产物中的rhUG与其他蛋白；2)通过30K NMWCO TFF膜过滤HA洗脱物而不是通过铜结合的CSFF柱层析进行处理；以及3)在铜结合CSFF柱层析之后除去SartoBind Q膜。在利用5K NMWCO膜相对于盐水的5至20体积渗滤的纯化中的最终步骤可以用于所有情形。

这些方法生产具有相当物理特性的rhUG并且足以满足FDA的cGMP生产要求以及对于动物研究中使用rhUG的要求。通过这个过程及其少量变形制得的rhUG制剂中所有方面都相当：表观尺寸，分子量，电荷，N末端氨基酸序列，指示半胱氨酸-半胱氨酸键正确形成的游离硫醇的量，免疫识别技术如ELISA和蛋白质印迹，以及生物学活性。通过感应耦合等离子体(QTI Inc.)测试利用铜CSFF柱纯化的蛋白中铜的存在。没有检测到铜并且该测定的检测限为0.5ppm。这翻译成1μg/2ml剂量的最大剂量，其良好低于对于婴儿的600μg/天的评估安全且充分每日饮食摄取量(Olivares，1996)。

利用标准操作程序并且根据柱子和树脂制造商推荐装填柱子。所有装填的柱子用0.5M氢氧化钠清洁最少30分钟并放入它们各自储存溶液中直至使用。用于正切流动过滤的膜在使用之前在45±5℃下用0.5M氢氧化钠清洁并去致热原达最少1小时。Sartobind Q膜在使用之前用1.0N NaOH清洁并去致热原达最少30分钟。

示出了纯化过程的实施方式中的步骤的流程图在图10至图16呈现。来自发酵的1千克的冷冻细胞糊料在室温下解冻并利用Microfluidizer.TM.(Microfluidics)或类似剪切装置通过剪切而裂解。所得粗裂解物通过以15,000xg离心而澄清。澄清的细胞裂解物利用100K NMWCO膜通过25mM Tris/40mM NaCl pH 7.0恒定体积渗滤而纯化。收集来自100K TFF步骤的渗透物并利用5KNMWCO膜浓缩。100K渗透物浓缩之后，利用25mM Tris/40mMNaCl pH 8.5实施5x恒定体积渗滤以除去低分子量杂质并且用Macro Q阴离子交换平衡缓冲液替换100K TFF缓冲液以产生5KRet#1(图10)。这然后加载到3升Macro Q阴离子交换柱上。从该柱子清洗未结合和弱结合的蛋白并且包含rhUG的部分用25mMTris、150mM氯化钠，pH8.5洗脱(图11a和图11b)。利用5KNMWCO膜，浓缩来自该Macro Q柱的洗脱物并且缓冲液同时用HA柱的平衡缓冲液进行交换，以产生5K Ret.#2(图12)。将该5K Ret.#2加载到3升I型陶瓷羟磷灰石柱上。利用10mM磷酸钠(pH 7.0)从柱子清洗未结合的蛋白并且包含rhUG的部分用75mM磷酸钠(pH 7.0)洗脱(图13a和图13b)。来自HA柱的洗脱物直接加载到装载有铜的1升螯合琼脂糖快速流动(CSFF)柱上。rhUG不结合于铜CSFF柱并且在流过物中重新找回(图14a和图14b)。然后用WFI 1∶1稀释来自铜CSFF柱的流过物并作为最后内毒素除去步骤通过Sartobind Q过滤器(图15)。来自Sartobind Q膜的通过物利用5K NMWCO TFF膜浓缩。浓缩之后，用注射用盐水作为置换缓冲液实施20x恒定体积渗滤(图16)。渗滤的材料然后进一步浓缩至7.5mg/ml的最小蛋白浓度，过滤并用注射用盐水(SFI；0.9％NaCl)稀释至5.5mg/ml的目标浓度。然后无菌过滤rhUG以产生纯化的rhUG原料药。

可以采用两种另外的纯化方法来提高rhUG生物药剂产品的质量。第一种方法涉及通过加入阳离子交换层析步骤进一步纯化rhUG。这种柱层析方法可以在过程中的各个点使用以选择性地除去残余大肠杆菌蛋白，特别是从最终产物中去除。例如，在图17中，rhUG(也称为rhCC10)利用NaCl梯度在SPSFF柱上纯化。缓冲液是乙酸钠，pH 4.0。来自羟磷灰石柱的rhUG制剂调节pH至4.0并通过SP琼脂糖快速流动(SPSFF)阳离子交换柱(Amersham.)。如图17所示仅有rhUG用氯化钠梯度从该柱洗脱，而大肠杆菌蛋白更早和更迟洗脱。因此，增加阳离子交换步骤，或者阳离子交换替代羟磷灰石层析或其他层析步骤，能够显著地提高最终rhUG生物药剂产品的纯度。

用于改善纯化的第二种方法涉及利用疏水性相互作用层析(HIC)来除去残余大肠杆菌蛋白以及残余和其他错折叠形式的蛋白rhUG。例如，将来自铜IMAC(Cu-IMAC)柱的rhUG材料加载到来自Amersham的苯基琼脂糖快速流动/高取代(PSFF/HS)柱。将硫酸铵加入到来自铜IMAC柱的rhUG制剂以增大rhUG与PSFF/HS柱的特异结合。期望的rhUG(反平行同型二聚体)通过该柱并在流过物中回收。残余大肠杆菌蛋白、rhUG聚集体和其他错折叠或错排列形式的rhUG通过如图18所示的降低流动相中的硫酸铵而从该柱洗脱。在这个实施例中，反平行rhUG(也称为rhCC10)利用硫酸铵梯度在PSFF/HS柱上纯化。缓冲液是磷酸钠pH 7.0。对来自Cu-IMAC柱的rhUG分析表明存在平行取向的同型二聚体(一种不期望的污染物)。这些数据在表12中示出，其示出了从用内切蛋白酶Lys-C对rhUG制剂的消化所产生的肽的LC/MS分析。来源于平行和反平行取向的肽存在于没有用HIC步骤处理的rhUG制剂中，尽管反平行形式是主要形式(＞90％)。因此，增加疏水性相互作用层析，或HIC替代纯化过程中的另一步骤，能够显著地提高反平行rhUG生物药剂产品的同质性。

在表12中，通过用在赖氨酸残基后进行切割的内切蛋白酶Lys-C对rhUG进行消化获得肽片段。然后利用RP-HPLC分离这些肽并通过在214nm处的吸光度和通过正离子电喷雾质谱的分析来分析片段。以下材料获自Cu-IMAC流过材料的样品。

表12

平行二聚体的水平在通过PSFF/HS柱的材料中减少或消除，表明从反平行形式完全或部分除去错排列的平行形式在生物药剂配制中是期望的。除了具有类似结果的苯基琼脂糖之外，这些结果用若干其他类型的HIC介质重复。这种类型柱子的使用提供了用于分离之前未知的rhUG形式的新型且出乎意料的手段。

以下测定作为用于生产过程以及用于药物和药品的过程测定、表征测定和释放测定被建立。将rhUG药物和药品在合适的情况下与标准研究批次rhUG/7进行比较。

蛋白质印迹。实施两种蛋白质印迹，一种利用α-rhUG抗体而一种利用α-大肠杆菌裂解物抗体(二者都来自Dako，USA)。利用针对人UG的兔多克隆抗体来实施α-rhUG蛋白质印迹，其中来自DAKO的羊α-兔IgG-HRP结合物作为二抗。α-大肠杆菌蛋白质印迹利用兔α-大肠杆菌裂解物多克隆抗体(接着羊α-兔IgG-HRP结合物作为二抗)来实施，这两种用于α-大肠杆菌测定的抗体获自DAKO。利用获自Amersham的ECL.TM.试剂盒来进行检测。

细菌核酸。每个剂量的rhUG药物和药品的细菌DNA含量通过利用放射标记的细菌DNA的DNA印迹，接着杂交于印迹的浓缩rhUG样品(Charles River Laboratories-Malvern)加以确定。

质谱。通过M-Scan Inc.的电喷雾电离质谱来确定分子量。通过PAWS(用于确定平均分子质量的一种软件程序，通过Swiss Pro获得)确定理论分子量。通过PAWS程序确定了16110.6Da的值。对于cGMP批次的rhUG发现相同的值并通过作为对照的标准研究批次rhUG/7(确定的分子量：16110.6Da)的MS分析确认。

N末端序列分析。N末端的序列在Applied Biosystems(ABI)477A自动蛋白质测序仪上利用脉冲相N末端测序实施。该分析通过M-Scan Inc.进行。在标准研究批次rhUG/7作为对照的情况下，cGMP批次的rhUG确认了序列Ala-Ala-Glu-Ile。

pH。根据制造商说明进行三点校准(4.0，7.0，10.0)。在电极校准之后，确定样品的pH。

等电聚焦。利用pH范围为3至7的凝胶通过等电聚焦确定pI。该凝胶获自Novex并在如由制造商描述的条件下运行。样品相对于来自Sigma的标准和rhUG对照(研究批次rhUG/7)运行。凝胶通过在10％乙酸/30％甲醇存在下，在微波炉中加热1分钟固定，接着用来自Pierce的Gel Code Blue染料染色。如由Pierce描述的在纯水中进行脱色。

游离硫醇。利用修改的方案以增大敏感度，通过与来自Pierce的Ellman试剂的反应来确定游离硫醇的存在。在ELLman试剂存在下孵育后，在412nm处在分光光度计中确定样品的吸光度。使用14150M^-1cm^-1的消光系数来确定游离硫醇的摩尔量。游离硫醇(半胱氨酸)的标准曲线用来监控反应的线性。

LAL。rhUG过程中间体/药物和药品中细菌内毒素的存在通过如在美国药典(USP)测定No.85中描述的Limulus变形细胞裂解物分析来进行测试。试剂盒获自Associates of Cape Cod。

颜色、外观、同质性(homogeneity)。对原料药品可视地检查澄清度/颜色和可视颗粒物。

免疫反应性。利用由分离自尿液的天然人UG所产生的抗体(DAKO，α-尿蛋白-1)作为捕获剂和rhUG-HRP(辣根过氧化物酶)结合物与样品中rhUG的竞争，来实施竞争性ELISA。抗体用pH 9.5的0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液以2,500倍稀释在微量滴定孔(100微升/孔)上包被过夜。干燥这些孔并在4℃下储存直至使用。利用来自Pierce的试剂盒制备rhUG-HRP结合物。每孔使用在250微升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中大约250ng rhUG-HRP结合物。每组样品的标准曲线利用rhUG校准物(研究批次rhUG/7)运行，范围为0-500ng/ml(示于图19)。所有校准物和试验样品都一式两份地运行。样品中的UG与rhUG-HRP结合物竞争孔中的抗体结合位点。因此，随着样品中UG量的增加，测定信号减少。通过Pierce的邻苯二胺二盐酸盐(OPD)HRP分析使结果可视化。利用Biotek EL-80微板读数器在490nm处对这些板读数并利用BiotekKC4软件分析数据。

纯度和同一性：还原SDS PAGE。rhUG药物和药品在如由制造商描述的还原和非还原条件下在Novex 10-20％Tricine SDS-PAGE凝胶上运行。低分子量尺寸标准获自Amersham。通过在10％乙酸/30％甲醇的混合物中在微波炉中加热1分钟固定凝胶，并用亮蓝R250(0.5％，w/v)染色。用制造商描述的Novex Gel-Clear脱色溶液对凝胶脱色。然后利用Novex Gel-Dry系统干燥凝胶并通过扫描该凝胶确定百分比纯度(Hewlett-Packard scanner Model 5100C)，以及利用来自NIH的Scion Image软件实施密度测定。

聚集测定。通过在Superose 12或Sephadex 75尺寸排阻层析(SEC)柱(Amersham/Pharmacia)上层析，分析药品中聚集体的存在。柱子利用BioRad Biologic系统根据制造商说明运行，并利用也来自BioRad的EZLogic Chromatography Analysis软件确定峰面积。通过比较所有峰的总面积相对于在主UG峰之前洗脱峰的面积而确定百分比聚集。

内毒素。通过如美国专利No.151中描述的兔致热原性测定测试内毒素水平。相当于单个人剂量的rhUG的量在10分钟内静脉内施用。在3小时时间内监测相对于基线给药前温度的体温增高。可接受的结果由相对于基线结果没有温度升高、等于或高于0.5℃构成。

蛋白质含量。过程中间体、药物和药品的蛋白质含量利用由Mantile等人(Mantile，1993)确定的Shimadzu 120和2070M^-1cm^-1的消光系数，通过在280nm处的吸光度来确定。

无菌度。如美国专利No.71中所述实施无菌度测定。样品在液体硫乙醇酸盐培养基(FTM)和胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB)中孵育。用于TSB培养基的阳性对照是白色念珠菌(C.albicans)、黑曲霉菌(A.niger)和枯草杆菌(B.subtilis)。用于FTM的阳性对照是金黄色葡萄球菌(S.aureus)、绿脓杆菌(P.aeruginusa)、生孢梭菌(C.sporogenes)。

效力测定(Potency Assay)。关于该人蛋白及其哺乳动物同源物的所有文献有若干归属于UG的生物学活性。与根据所述生产过程制备的人rhUG制剂相关的生物学活性在本文以及美国序列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264和09/549,926中进行了描述。

UG的某些生物学活性可以利用可获得的试剂在体外进行检测并且与某些疾病的治疗有关。这些活性中的两种对于如本文所描述的UG已被验证。第一种是由于rhUG对分泌性磷脂酶A₂酶(sPLA₂)的抑制或阻断导致的抗炎作用。我们已经确认，rhUG在体外显著地抑制人sPLA₂酶，特别是在胰腺和肺中发现的Ib型酶，以及由巨噬细胞产生的和在人类风湿关节滑液中发现的IIa型酶。已经开发了用于测定rhUG对sPLA₂-Ib活性的抑制作用的新型基于荧光的HPLC并且已与更标准的¹⁴C标记测定联合使用。对于rhUG的第二种生物学活性是它结合于纤连蛋白(其阻止UG缺陷的转基因敲除小鼠模型中的促纤维化细胞外基质的不恰当沉积和随后形成(Zhang，1997))的能力。开发了利用人纤连蛋白检测rhUG的这种活性的新型体外ELISA型测定。

这两种效力测定可以用来计量rhUG未来批次的体内生物学活性的相对强度。因为生产过程，无论化学或生物学的，本身是多变的，所以效力测定在评估潜在安全性和效用中是必需的。生物学活性的相对强度可以通过效力测定来确定。

分泌性PLA₂-Ib型的抑制

效力测定是基于通过加入rhCC10对rhPLA₂活性的抑制。rhPLA₂催化在L-3-磷脂酰胆碱的2位处的酯的切割。采用两种不同的测定来检测这种活性；一种利用作为底物的1-硬脂酰基-2-[1-¹⁴C]花生酰基磷脂酰胆碱(Amersham)来产生[1-¹⁴C]花生四烯酸(产物)，然后通过液液分离对其进行分离并且通过闪烁计数确定切割水平(PLA₂测定No.1)。第二种利用荧光标记的底物2-癸酰基-1-(O-(11-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3-丙酰基)氨基)十一烷基)-sn-丙三醇-3-磷酸胆碱(MolecularProbes)来实施。如图18所示，未切割的底物与切割的底物利用正相HPLC进行分离，利用在线荧光检测器(PLA₂测定No.2)进行定量。两种测定以100μl最终测定体积在具有1mM CaCl₂的Hanks平衡盐溶液中进行。rhPLA₂获自伊利诺斯-芝加哥大学的Won HwaCho博士的实验室。新型PLA₂测定No.1测定实施如下。将rhPLA₂加入到所有试管至200nM的最终浓度。对于抑制测定，加入rhCC10至大约34μM的最终浓度，将等体积的HBSS加入到对照试管。所有试管在37℃下预孵育20分钟，通过加入放射标记的磷脂酰胆碱至5μg/ml的最终浓度而开始该测定。然后通过加入Doles试剂和纯水(84∶16)的7.7倍稀释液在15分钟后终止反应。所有试管进行涡旋然后离心以分离疏水层和亲水层。然后取出上层并加入到含有15mg硅胶(筛目大小为60-200)和800μl己烷的Eppendorf管中进行闪烁计数。

新型PLA₂测定No.2实施如下。将rhPLA₂加入到所有试管至200nM的最终浓度。对于抑制测定，加入rhCC10至大约34μM的最终浓度，将等体积的盐水加入到对照试管。所有试管在37℃下预孵育20分钟，通过加入荧光标记的磷脂酰胆碱至5μg/ml的最终浓度而开始该测定。通过加入1至5倍稀释的2-丙醇∶正己烷(8∶3)在15分钟后终止反应。将100μl的终止试样直接加载到硅胶正相HPLC柱上。用于该系统的流动相是2-正丙醇∶正己烷∶水(8∶3∶2)。切割底物的量通过具有480nm处激发和517nm处发射的荧光来确定。

每种测定的百分比抑制定义如下：

％抑制＝(1-(rhCC10存在下切割的底物÷没有rhCC10下切割的底物)x100。

表13

与人纤连蛋白的结合

rhCC10的第二种生物学活性是其结合纤连蛋白的能力，其阻止CC10缺陷的转基因敲除小鼠模型中促纤维化细胞外基质的不恰当沉积和随后形成(Zhang，1997)。利用人纤连蛋白的重组7kDa片段(Fn III.1，也称为片段-III₁-C，称为“rhFn”)来检测这种活性而开发了一种新型体外ELISA型测定，并且这种测定用来监测rhCC10的生物学活性。微滴定板用该纤连蛋白片段过夜包被并通过与rhCC10-HRP(辣根过氧化物酶)结合物的竞争来检测rhCC10的结合。将RhCC10-HRP结合物加入该板并允许在室温下孵育1小时。该结合物可以在有或没有标准或样品的情况下添加。PBS用作阴性对照。取出板并清洗四次。通过来自Pierce的邻苯基二胺(OPD)HRP测定使所述测定可视化。利用Biotek EL-80微板读数器在490nm处对板读数并利用Biotek KC4软件分析数据。图21示出了这种测定的典型标准曲线。对于所有研究和cGMP批次的rhUG，这种测定的结果对于rhUG与纤连蛋白片段的结合都是阳性的。

除了药物和药品的广泛测试和表征之外，在整个过程中提取中间体样品以跟踪纯化并确定每个步骤的效率。过程中间体通过SDS-PAGE、rhUG ELISA、LAL以及蛋白含量进行分析。蛋白含量利用牛血清白蛋白作为标准，用来自Pierce的BCA测定来确定。通过LAL测定分析所有缓冲液的内毒素含量。在缓冲液中没有检测到内毒素。

分析整体和步骤回收的纯化过程(表14)。如从100K原料确定的，整体纯化为51.9％。还考察如通过特定活性描述的纯度(表15)。特定活性定义为指定样品的UG ELISA值除以BCA蛋白测定值。除去最大量的杂质发生在100K渗滤步骤和随后的Macro Q阴离子交换步骤中。这通过来自SDS-PAGE结果的数据得到证实(图22a和图22b)。需要羟磷灰石柱和铜螯合琼脂糖快速流动柱来除去最终大肠杆菌蛋白杂质。超过100％的回收和超过1.00的特定活性是由于测定中的变化以及使用的不同标准。

通过LAL测定跟踪整个纯化的内毒素水平。在5K渗余物(Ret)#1中内毒素为2400EU/ml(总量为11x10⁶EU)。在该材料在MacroQ柱上进一步纯化后，内毒素浓度在5K渗余物#2(体积＝4000ml)中下降至0.17EU/ml，总量为680EU。这表示内毒素水平下降16,000倍。内毒素水平在整个纯化的剩余物中是检测不到的。

表14

¹步骤回收率定义为对于每个步骤的回收率。

表15

最终的无菌过滤的原料药物通过如表16中所示的所有标准。

表16

¹MAAEI和AEI形式少于总体的0.062％。

由于rhUG的结构，二聚体和单体在SDS-PAGE上以比通过序列分子量预测的更低分子量运行(图23)。该蛋白的另一个特性在于在还原剂存在下将二聚体分成单体是不完全的，如可以通过在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的泳道5和9中(图23)以及α-UG蛋白质印迹的泳道5中(图24)存在残余二聚体看出。虽然rhUG在α-rhUG蛋白质印迹(图24)的泳道5的二聚体和单体位置处是明显的，但是在α-大肠杆菌蛋白质印迹(图25)的泳道3中单体或二聚体位置没有检测到大肠杆菌蛋白。α-大肠杆菌蛋白质印迹的泳道3中仅有的可见条带具有明显的大约40kD的分子量(图25)。

rhUG的另一个特性是形成少量的聚集体，如在考马斯染色凝胶的泳道11中(图23)明显的，其中更高分子量条带很好地对应于α-rhUG蛋白质印迹(图24)的泳道2中的更高分子量条带。二聚体和聚集体看起来都比单体更强烈地与α-rhUG抗体发生反应，与在开发UG ELISA期间的观察结果一致。通过尺寸排阻色谱在214nm处分析聚集体表明，与二聚体的总量相比，rhUG聚集体最少形成(表16)。

对于rhUG的等电点利用IEF凝胶确定为4.7(图26)。结果通过将该氨基酸序列提交至Swiss Pro(www.expasy.ch)进行确认，计算的pI(4.7)与观察到的pI相同。

实施例VII

药物的稳定性

示例性药物和示例性药品处于相同浓度并且处于相同处方(即没有加入赋形剂)。测试药品稳定性。

药品的配制和包装

在示例性药品的最后装填中使用的所有材料、化学物质和设备列于表17至表19。

表17

表18

表19

药品的示例性实施方式的组成为：5.5mg/ml的rhUG，以及0.9％(w/v)的氯化钠。所有装填操作在100级环境室内进行。用于装填的房间和操作由操作者验证。Omnispense泵装配有2mm管道，起动泵并设置成装填至2.0g±5％(1.90-2.10ml)的重量。概述装填过程的流程图在图27中示出。对2ml小瓶称皮重并将原料rhUG分配到小瓶中。在装填之后，记录小瓶的重量。这个程序重复两次。如果三个小瓶的装填重量都在规格范围内，则装填所有的小瓶。如果一个小瓶落到该规格范围之外，则调整分配器体积并重复该过程。在装填之后，手工堵塞小瓶并将铝质钳口盖置于小瓶上。利用Kebby Power Crimp使这些小瓶卷边。然后标记小瓶并肉眼检查。以这种方式生产的rhUG药品提供没有可见颗粒的澄清、无色溶液。

药品的物理和化学特性的总结

rhUG是一种分子量为16110KDa的二聚体蛋白，如根据氨基酸序列计算并通过电喷雾质谱确认的。该蛋白由彼此通过两个半胱氨酸键结合的两个亚单元构成。通过还原和非还原条件下的SDS-PAGE来确定相对亚单元分子量和半胱氨酸键的存在。细菌菌株CG12的DNA序列通过Edman降解被确认为是该蛋白的N末端的氨基酸序列。该N末端的序列是如预测的Ala-Ala-Glu-Ile(SEQ.ID NO.10)。这种方法不容易检测半胱氨酸，因为固有化学性质以及半胱氨酸涉及硫键合的事实。

最终瓶装的rhUG药品通过如表20所示的所有规格。

表20

¹MAAEI和AEI形式低于总体的0.062％。

如对药物所描述的，与通过序列分子量预测的相比，药品的二聚体和单体在SDS-PAGE上运行至更低分子量(图28)。在还原剂存在下，药品的二聚体没有完全分离成单体，如通过在考马斯凝胶的泳道5、9和11中(图28)以及α-UG蛋白质印迹的泳道6中(图29)存在残余二聚体所证实的。尽管rhUG在α-rhUG蛋白质印迹的泳道6的二聚体和单体位置处很明显，但是在α-大肠杆菌蛋白质印迹的泳道4中的单体或二聚体位置中没有检测到大肠杆菌蛋白(图30)。在α-大肠杆菌蛋白质印迹的泳道4中没有可见条带(图30)。

在α-rhUG蛋白质印迹的泳道3中聚集体也很明显(图29)。二聚体和聚集体相比于单体看起来更强地与α-UG抗体发生反应；这在UG ELISA的开发中也观察到。通过尺寸排阻色谱在214nm处对聚集体的分析表明，相比于二聚体总量，最少形成rhUG聚集体。

rhUG的等电点利用IEF凝胶确定为4.7(图31)。结果通过将该氨基酸序列提交至Swiss Pro进行确认，计算的pI与观察到的pI相同。

制备用于动物测试的所有临床前开发批次利用与cGMP批次所使用的类似技术进行分析。rhCC10关键参数的范围在表21中呈现。其他关键参数如pI、分子量、N末端序列和游离硫醇对于所有批次的rhUG基本上是相同的。

表21

最终药品通过所有发布标准并且与动物研究中使用的材料相同并且可被美国FDA接受用于I/II期人临床试验。

rhUG制剂的稳定性

关于纯化的rhUG制剂的长期稳定性研究，开发用批次(GLP材料；批次号rhUG/7，储存在2-8℃)和药用级生产用批次(药品批次号0728，储存在2-8℃)分别实施18个月和15个月，以及用于药用级生产用批次的加速老化的7个月(药品批次号0728，储存在25℃和60％相对湿度下)。在规定时间，每个小瓶从2-8℃的储存取出并测试。测定在表22中描述。

表22

研究用批次的测定结果在表23中呈现并且cGMP批次的测定结果在表24(2-8℃)和表25(25℃和60％RH)中示出。

表23

¹用于这些测定的定量限。

²是指没有获得该时间点的测定。

³测定开发中的范围对这批rhUG为21％至57％。

表24

¹是指没有获得该时间点的测定。

表25

如所示的，rhUG的开发用批次和cGMP批次分别稳定超过18个月和15个月，因为它们是初始生产并装入小瓶的。对这些rhUG制剂的大量物理和化学特性，以及在两种效力测定中的生物学活性进行了测试。基于这些数据，能够预期这些制剂在体内发挥相同作用，关于它们彼此以及它们的初始强度和生物学活性类型在本文和申请序列No.08/864,357、09/087,210、09/120,264、09/549,926、09/861,688、PCT/US98/11026、PCT/US99/16312、PCT/US00/09979和PCT/US01/12126中都有描述的。

因此，本发明提供了商业上可行的用于rhUG的生产方法，以及商业上可行的药物组合物和制剂。

参考文献

Carlomagno，T.，Mantile，G.，Bazzo，R.，et  al.Resonanceassignment and secondary structure determination and stability of therecombinant human uteroglobin with heteronuclear multidimensionalNMR.J Biomol.NMR 9：35-46，1997.

Gerlitz，M.，Hrabak，O.and Schwab，H.Partitioning ofbroad-host-range plasmid RP4 is a complex system involvingsite-specific recombination.J Bacteriology 172：6194-6203，1990.Mantile，G.，Miele，L.，Cordella-Miele，E.，Singh，G.，Katyal，S.L.and Mukherjee，A.B.Human Clara cell 10-kDa protein is thecounterpart of rabbit uteroglobin.J Biol Chem 268：20343-20351，1993.

Matthews，J.H.，Pattabiraman，N.，Ward，K.B.，Mantile，G.，Miele，L.and Mukherjee，A.B.Crystallization and characterizationof the recombinant human Clara cell 10-kDa protein.Proteins20：191-196，1994.

Miele，L.，Cordella-Miele，E.and Mukherjee，A.B.High levelbacterial expression of uteroglobin，a dimeric eukaryotic protein withtwo interchain disulfide bridges，in its natural quaternary structure.JBiol Chem 265：6427-6435，1990.

Nieto et al.，Purification and quarternary structure of thehormonally induced protein uteroglobin.Arch.Biochem.Biophys.180：82-92，1977.

Olivares，M.and Uauy，R.Limits of metabliolic tolerance to copperand biological basis for present recommendations and regulations.AmJ Clin Nutr 63：846S-852S，1996.

Peter，W.，Beato，M.and Suske，G.Recombinant rabbituteroglobin expressed at high levels in E.coli forms stable dimers andbinds progesterone.Protein Eng.3：61-66，1989.

Pilon，A.；Yost，P.；Lohnas，G.；Burkett，T.；Roberts，S.；Chase，T.E.；Bentley，W.E.；Ubiquitin Fusion Technology：Bioprocessing ofPeptides.Biotechnol.Prog.，13：374-379，1997.

Singh，G.，Katyal，S.L.，Brown，W.E.，et al.Amino-acid andcDNA nucleotide sequences of human Clara cell 10 kDa protein[published erratum appears in Biochim Biophys Acta Mar.1，1989；1007(2)：243].Biochim Biophys Acta 950：329-337，1988.

Zhang，Z.，Kundu，G.C.，Yuan，C.J.，et  al.Severefibronectin-deposit renal glomerular disease in mice lackinguteroglobin.Science 276：1408-1412，1997.

1.一种用于生产rhUG的细菌表达系统，包括编码人UG的合成基因，其中所述合成基因包括Seq.ID.No.1-4。

2.根据权利要求1所述的表达系统，其中，所述合成基因在其N末端处进一步包括Met-Ala-Ala。

3.一种用于生产rhUG的细菌表达系统，包括编码人UG的人cDNA序列，其中所述基因在所述序列的N末端处进一步包括Met-Ala-Ala。

4.根据权利要求3所述的表达系统，其中，所述表达系统进一步包括大约2.8kb的par序列。

5.一种生产rhUG研究种子库的方法，包括：

a.在生长介质上接种包含rhUG表达系统的细菌株的至少一个菌落；

b.孵育所述接种的生长介质直至达到平稳期；

c.将甘油加入到所述接种的生长介质；

d.在等分部分中冰冻所述培养物；以及

e.在低于约-50℃的温度下储存所述冰冻的等分部分。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，孵育所述接种的生长介质直至在550nm至660nm之间测得的光学密度达到约0.8AU至1.5AU。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述冷冻保护剂包括甘油。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述等分部分为约1ml。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述储存温度在约-70℃和约-90℃之间。

10.一种生产rhUG主细胞库的方法，包括：

a.用rhUG研究种子库的等分部分接种合适的孵育肉汤以形成细菌培养物；

b.孵育所述细菌培养物；

c.将冷冻保护剂加入到所述细菌培养物以形成冷冻保护溶液；

d.将所述冷冻保护溶液的一部分转移到冷冻小瓶；以及

e.在低于约-60℃的温度下储存所述冷冻小瓶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，孵育所述培养物直至在550nm至660nm之间测得的光学密度达到约0.8AU至1.5AU。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述冷冻保护剂包括甘油。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，转移至冷冻小瓶的所述部分为约1ml。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述储存温度在约-70℃和约-90℃之间。

15.一种生产rhUG生产用细胞库的方法，包括：

a.用rhUG主细胞库的等分部分接种合适的孵育肉汤以形成细菌培养物；

b.孵育所述细菌培养物；

c.将冷冻保护剂加入到所述细菌培养物以形成冷冻保护溶液；

d.将所述冷冻保护溶液的一部分转移到冷冻小瓶；以及

e.在低于约-60℃的温度下储存所述冷冻小瓶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，孵育所述细菌培养物直至在550nm至660nm之间测得的光学密度达到约0.8AU至1.5AU。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述冷冻保护剂包括甘油。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，转移至冷冻小瓶的所述部分为约1ml。

19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述储存温度在约-70℃和约-90℃之间。

20.一种表达rhUG的方法，包括以下步骤：

a.提供包括能够表达rhUG的表达载体的生产种子细胞库培养物；

b.用所述生产种子细胞库培养物接种肉汤介质以形成接种物；

c.孵育步骤b中形成的所述细菌培养物；

d.用步骤c中形成的所述接种物接种大规模发酵罐以形成发酵培养物；

e.在所述大规模发酵罐内孵育所述发酵培养物；

f.将诱导剂加入到所述发酵培养物以诱导rhUG的表达；以及

g.在步骤f之后收获所述发酵培养物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述表达载体包括Seq.ID No.1-4。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述接种物在约28℃和约36℃之间的温度下孵育约12小时至约24小时。

23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述大规模发酵罐具有至少300升容积。

24.根据权利要求20所述的方法，其中，步骤e的所述孵育持续直至光学密度550nm至660nm达到2.0AU的最小OD值。

25.根据权利要求20所述的方法，其中，所述诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。

26.根据权利要求20所述的方法，其中，在步骤f和步骤g之间经过约1至约4小时。

27.根据权利要求20所述的方法，其中，收获所述发酵培养物包括离心。

28.一种表达rhUG的方法，包括以下步骤：

a.用包括能够表达rhUG的表达载体的接种物接种大规模发酵罐以形成发酵培养物；

b.在所述大规模发酵罐内孵育所述发酵培养物；

c.将诱导剂加入到所述发酵培养物以诱导rhUG的表达；以及

d.收获所述发酵培养物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述表达载体包括Seq.ID No.1-4。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述大规模发酵罐具有至少300升容积。

31.根据权利要求28所述的方法，其中，步骤b的所述孵育持续直至光学密度550nm至660nm达到2.0AU的最小OD值。

32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。

33.根据权利要求28所述的方法，其中，在步骤c和步骤d之间经过约1至约4小时。

34.根据权利要求28所述的方法，其中，收获所述发酵培养物包括离心。

35.一种纯化rhUG的方法，包括以下步骤：

a.提供包括能够过表达rhUG的细菌细胞的细菌细胞糊料；

b.裂解所述细菌细胞糊料以形成上清；

c.通过第一标称截留分子量(NMWCO)膜过滤步骤b中形成的所述上清以形成第一渗透物；

d.通过使用第二NMWCO膜浓缩在步骤c中形成的所述第一渗透物；

e.将步骤d中形成的所述浓缩渗透物加载到阴离子交换柱上以形成第一洗脱物；

f.通过使用第三NMWCO膜浓缩步骤e中所形成的所述第一洗脱物以形成第二浓缩物；

g.将步骤f中形成的所述第二浓缩物加载到羟磷灰石(HA)柱上以形成第二洗脱物；

h.将步骤g中所形成的第二洗脱物中宿主来源的蛋白与所述rhUG分离以提供纯化的rhUG；以及

i.回收步骤h中形成的所述纯化的rhUG。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，在所述细菌细胞中表达的所述合成基因包括Seq.ID No.1-4。

37.根据权利要求35所述的方法，其中，裂解包括剪切。

38.根据权利要求35所述的方法，其中，在步骤b和步骤c之间，通过离心除去细胞碎片。

39.根据权利要求35所述的方法，其中，步骤b的所述膜是约30K至100K NMWCO膜。

40.根据权利要求39所述的方法，其中，步骤c的所述过滤包括使用正切流动过滤(TFF)系统。

41.根据权利要求35所述的方法，其中，步骤d的所述膜是约5K NMWCO膜。

42.根据权利要求35所述的方法，进一步包括阴离子交换层析步骤。

43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述阴离子交换层析步骤替代所述羟磷灰石层析步骤。

44.根据权利要求42所述的方法，其中，使用SP琼脂糖快速流动(SPSFF)阴离子交换柱。

45.根据权利要求35所述的方法，进一步包括疏水相互作用层析步骤。

46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述疏水相互作用层析步骤替代另一种层析步骤。

47.根据权利要求46所述的方法，其中，使用苯基琼脂糖快速流动/高取代(PSFFHS)柱。

48.根据权利要求41所述的方法，其中，步骤e的所述阴离子交换柱是Macro Q阴离子交换柱。

49.根据权利要求41所述的方法，其中，步骤h所述宿主来源的蛋白用螯合琼脂糖快速流动(CSFF)树脂柱进行分离。

50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述CSFF树脂柱包括铜。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，在步骤h之后，将带正电的膜置于所述CSFF柱的下游，形成基本上不含宿主来源蛋白的通道。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述带正电的膜是Sartobind Q TFF膜。

53.根据权利要求35所述的方法，其中，所述第二洗脱物通过约30K NMWCO膜进行渗滤。

54.根据权利要求35所述的方法，其中，步骤i中回收的所述rhUG基本上不含聚集体。

55.一种纯化rhUG的方法，包括以下步骤：

a.提供能够过表达rhUG的细菌细胞；

b.裂解所述细菌细胞以形成上清液；

c.通过截留分子量(NMWCO)膜过滤所述液体；

d.将所述液体加载到交换柱上；

e.将宿主来源蛋白与所述rhUG分离以提供纯化的rhUG；以及

f.回收所述纯化的rhUG。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，在所述细菌细胞中表达的所述合成基因包括Seq.ID No.1-4。

57.根据权利要求55所述的方法，其中，步骤c的所述过滤包括使用正切流动过滤(TFF)系统。

58.根据权利要求55所述的方法，其中，步骤d的所述交换柱是Macro Q阴离子交换柱。

59.根据权利要求55所述的方法，其中，步骤e的所述宿主来源蛋白用螯合琼脂糖快速流动(CSFF)树脂柱进行分离。

60.根据权利要求55所述的方法，其中，步骤f中回收的所述rhUG基本上不含聚集体。

61.一种生产药用级rhUG药物的方法，包括以下步骤：

a.提供能够表达rhUG的细菌表达系统；

b.用包括所述细菌表达系统的接种物接种发酵罐以形成发酵培养物；

c.将诱导剂加入到所述发酵培养物以诱导rhUG通过所述细菌表达系统的表达。

d.收获步骤c中表达的所述rhUG；以及

e.纯化步骤d中收获的所述rhUG，其中所述纯化步骤包括利用至少一个过滤步骤和至少一个交换柱。

62.一种用于确定样品中重组人子宫球蛋白效力的测定方法，其包括：

(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触；

(b)将标记底物引入到所述样品；

(c)将产物与样品分离；以及

(d)确定切割水平。

63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述测定与标准的14C-标记测定联合使用。

64.根据权利要求62所述的方法，其中，所述放射性标记底物是1-硬脂酰基-2-[14C]花生酰基磷脂酰胆碱。

65.根据权利要求62所述的方法，其中，所述重组人子宫球蛋白磷脂酶A2加入到2nM至200nM的终浓度。

66.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(a)的所述样品在30℃至40℃下预孵育15分钟至30分钟。

67.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(b)中的反应通过加入有机相终止溶液而终止。

68.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(c)中的所述样品通过涡旋和离心进行分离。

69.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(c)的产物通过液液分离而与样品分离。

70.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(d)中的所述切割水平通过闪烁计数确定。

71.一种用于测量体外由于重组人子宫球蛋白对分泌性磷脂酶A2酶的抑制或阻断而导致的抗炎作用的方法，包括：

(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触；

(b)将标记底物引入所述样品；

(c)分离产物与样品；以及

(d)通过闪烁计数确定切割水平。

72.一种用于测定重组人子宫球蛋白对分泌性磷脂酶A2活性的抑制作用的测定方法，包括：

(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触；

(b)将标记底物引入所述样品；

(c)分离产物与样品；以及

(d)通过闪烁计数确定切割水平。

73.一种用于确定样品中重组人子宫球蛋白效力的测定方法，其包括：

(a)使包含重组人子宫球蛋白的样品与磷脂酶A2接触；

(b)将荧光标记底物引入所述样品；

(c)分离未切割的底物与样品；以及

(d)通过荧光确定切割底物的量。

74.根据权利要求73所述的方法，其中，步骤(a)中所述重组人子宫球蛋白样品的终浓度为34nM至34μM。

75.根据权利要求73所述的方法，其中，步骤(a)的所述样品在约30℃至40℃下预孵育约15至30分钟。

76.根据权利要求73所述的方法，其中，所述荧光标记底物是2-癸酰基-1-(O-(11-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3丙酰基)氨基)十一烷基)-sn-丙三醇-3-磷脂酰胆碱。

77.根据权利要求73所述的方法，其中，步骤(b)中的反应通过加入有机相终止液终止。

78.根据权利要求73所述的方法，其中，在步骤(c)，1μL至100μL经终止的试样直接加载到硅胶正相HPLC柱。

79.一种用于测量重组人子宫球蛋白与纤连蛋白体外结合的方法，包括：

(a)使人纤连蛋白的重组片段与重组人CC10-HRP结合物接触；

(b)使所述测定可视化以确定重组人子宫球蛋白与所述纤连蛋白片段的结合。

80.一种用于确定重组人子宫球蛋白纯度的方法，其包括：

(a)对权利要求35所述过程中每个步骤处的中间体进行取样；以及

(b)分析所述过程中间体。

81.根据权利要求80所述的方法，其中，过程中间体通过SDS-PAGE进行分析。

82.根据权利要求80所述的方法，其中，过程中间体通过rhUGELISA进行分析。

83.根据权利要求80所述的方法，其中，过程中间体通过LAL进行分析。

84.根据权利要求80所述的方法，其中，分析过程中间体的蛋白含量。

85.一种药物组合物，包括权利要求35所述纯化的重组人子宫球蛋白。

86.一种药物组合物，包括纯化的重组人子宫球蛋白以及药用载体或稀释剂。

87.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白包含低于5％的重组人子宫球蛋白聚集体。

88.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白的纯度大于95％。

89.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白中内毒素水平包括低于5EU/mg rhUG。

90.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在氯化钠溶液中。

91.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中至少稳定4个月。

92.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中至少稳定6个月。

93.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中至少稳定9个月。

94.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中至少稳定12个月。

95.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中至少稳定15个月。

96.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在4℃下溶液中至少稳定18个月。

97.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下溶液中至少稳定1个月。

98.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下在溶液中至少稳定2个月。

99.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下在溶液中至少稳定4个月。

100.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白在25℃和60％室内湿度下在溶液中至少稳定7个月。

101.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白施用给哺乳动物是安全的。

102.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白施用给人是安全的。

103.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白经由气管内插管施用是安全的。

104.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白施用给早产婴儿是安全的。

105.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白施用给接收人造表面活性剂的患者是安全的。

106.根据权利要求86所述的药物组合物，其中，所述重组人子宫球蛋白施用给呼吸性窘迫的患者是安全的。

展示部分B(EXHIBIT B)

PCT/US09/43613：

在鼻炎治疗中使用的重组人CC10及其组合物

相关申请的交叉引用

本专利申请主张2008年5月13日提交的美国临时专利申请61/052861的权益和优先权，其公开内容以其整体作为参考并入本文。

技术领域

本发明涉及降低患者鼻部通道中气流阻塞、清除窦感染和减轻患者窦痛的方法。更具体地，本发明涉及治疗患者鼻炎、窦炎和鼻息肉的方法以及对上述疾病有用的组合物。更具体地，本发明涉及使用对上述疾病有用的鼻内施用的重组人CC10及其组合物治疗上述疾病的方法。

背景技术

克拉细胞(Clara Cell)“10kDa”蛋白(CC10)或子宫球蛋白(UG)是由几种粘膜上皮细胞或上皮细胞源的其它器官所产生的小型、同型二聚体分泌型蛋白(Mukherjee，1999)。CC10由含有70个氨基酸残基的两个相同亚基组成，每个亚基具有“四螺旋束”二级结构基序，其通过半胱氨酸3和69′，3′和69之间的两个二硫键反平行取向连接(Matthews，1994；Morize 1997)。含有两个二硫键的同型二聚体似乎是它的原始、细胞外活性形式。在人类中，肺是CC10产生的主要位点，但是其它几个器官也合成编码该蛋白的少量mRNA(Singh，1987；Sandmoller，1994)。CC10是抗炎和免疫调节蛋白，已对CC10与其它蛋白质、受体和细胞类型之间的相互作用进行了鉴定(在Mukherjee，2007、Mukherjee，1999和Pilon，2000中综述)。已经在具有一定程度炎症特征的多种临床病况的多种组织和液体样本中以及在患有伴复发性窦炎和鼻息肉的慢性鼻炎患者中(Liu，2004)发现了低水平的CC10蛋白或mRNA，其中所述炎症包括哮喘(Lensmar，2000；Shijubo，1999；Van Vyve，1995)、肺炎(Nomori，1995)、闭塞性细支气管炎(Nord，2002)、结节病(Shijubo，2000)。肺上皮细胞是内源CC 10的体内主要来源，它们在这些病况中经常受到不良影响，减少或甚至消除(Shijubo，1999)。的确，CC10似乎是特定组的无纤毛呼吸上皮细胞和相关结构发育所需的自分泌和/或内分泌物(Castro，2000)。因此，仍不了解CC10缺乏是炎症和/或所述病况的原因还是结果。

已知鼻部通道中的气流阻塞以及窦痛和压迫是引起患有过敏性鼻炎、非过敏性鼻炎、窦炎和鼻息肉的人明显病状的原因。鼻炎是鼻咽腔中鼻部通道和窦的炎症。有两类鼻炎，即过敏性和非过敏性鼻炎。非过敏性鼻炎是由于病毒、细菌或其它感染，由于暴露于吸入化学品或其它刺激物造成的，或者可以是自发的，而过敏性鼻炎是由于暴露于吸入变应原所造成的。过敏性鼻炎可以是季节性的，如对树木或青草花粉的过敏；或者它可以是常年性的，如对尘螨和常见霉菌的过敏。鼻炎的严重程度范围从由于瘙痒、喷嚏和鼻涕所造成的持续几小时的轻度季节性不适，到通常与复发性细菌感染有关的疼痛并且使人衰弱的慢性窦炎。有时将存在细菌感染的慢性窦炎称作慢性鼻窦炎(“CRS”)。CRS导致气道上皮细胞和窦组织不可逆地重构和瘢痕形成。鼻组织的这些永久性改变导致了恶性循环，其中抵御感染(病毒和细菌感染)的能力的降低以及清除吸入的变应原和刺激物的能力的降低导致了更严重的炎症反应，从而进一步加重了重构和纤维化以及更严重或持久的感染。理论上，不存在感染时，炎症是可逆的，并且一旦从局部组织清除刺激物、病原体或变应原后应立即消失。因此，从季节性或轻度鼻炎转变为CRS在很大程度上可以归因于长期暴露于常年性变应原和/或发炎的鼻和窦组织的复发性细菌感染，从而使得即使在原始鼻炎刺激(变应原或刺激物)消除很长时间后仍持续感染。的确，当炎症反应从变应原刺激的反应转变为感染刺激的反应时，导致慢性鼻炎的常年性过敏患者经常经历复发性细菌感染(窦炎)。这些是具有严重持续性鼻窦炎CRS疾病和具有最高发病率的患者。不论是过敏性还是非过敏性慢性鼻炎，它们均导致在鼻部通道中产生过量粘液和鼻部通道肿胀，从而损害呼吸、破坏睡眠并易患复发性细菌窦感染。在该疾病中，窦痛和压迫导致显著病况。不论是急性还是慢性细菌感染均加重了这些症状。在最严重的情况下，鼻息肉在鼻腔导气管中生长并缓慢堵塞导气管。这些息肉是窦组织的非恶性赘疣，并且只可以通过窦剥脱术去除。由于每次去除后，息肉会重新生长，因此鼻息肉患者可能要定期进行窦剥脱术。

然而，在伴有或未伴有鼻息肉的鼻炎患者，特别是慢性鼻炎和鼻窦炎患者中，以及在慢性或复发性细菌窦感染患者中，对确定rhCC10是否可以减轻炎症并且多大剂量可以减轻炎症尚难以定论。事实上，如下所示，近期工作表明在已知或常用的剂量下，rhCC10不起作用：

在评价鼻内rhCC10抑制由季节性过敏所引起的鼻部炎症和鼻炎的效力的近期临床II期研究中，与安慰剂相比，rhCC10治疗导致六种效力结果测量中的一种的症状显著恶化(Widegren等人，2009)。其余五种效力结果测量在rhCC10和安慰剂之间未表现出差异，尽管所有均趋向有利于安慰剂。RhCC10在改善(提高)最大鼻吸入气流和在缓解由空气变应原施用所引起的鼻漏方面不如安慰剂。表1显示了与接受安慰剂的相同患者的结果相比，接受rhCC10的患者的比较结果，所述结果在每个治疗期的最后三天(第5-7天)测量。

表1：五种临床结果测量中rhCC10和安慰剂之间统计差异的P值。

效力变量	rhCC10	安慰剂	P值
				早晨TNSS	1.64(0.21)	1.50(0.25)	.57
早晨PNIF	136(7)	136(8)	.78
				傍晚TNSS	1.37(0.28)	1.54(0.27)	.53
傍晚PNIF	145(8)	147(8)	.93
				激发后10分钟的TNSS	5.67(0.27)	5.17(0.32)	.09
激发后10分钟的PNIF	93(6)	102(7)	.04*

*认为P值＜0.05(小于0.05)为显著差异。

认为p值大于0.05为统计学不显著。

TNSS：总鼻症状得分

PNIF：最大鼻吸入气流

该概念验证研究不能证明在季节性过敏性鼻炎的鼻变应原激发模型中每天施用一次，连续施用7天时rhCC10的整体效力。与安慰剂相比，每天鼻内施用200μl，1.1mg的RhCC10不能有利地影响变应原引起的早晨、激发后或傍晚症状。较高的PNIF反映较大的气流，而较低的PNIF指示受限的气流。早晨和傍晚PNIF不受rhCC10的影响，但是与安慰剂相比，rhCC10治疗轻度降低了激发后PNIF，但未达到统计学显著性。安慰剂组中所达到的症状得分和PNIF水平与该模型中的历史记录非常类似。同样，与安慰剂相比，鼻灌洗液中包括嗜伊红阳离子蛋白质、绿过氧物酶和α2-巨球蛋白和rhCC10的水平在内的炎症标志物不介导这些标志物中的任何降低。在该模型中，已证明皮质类固醇抑制早晨、激发后和傍晚症状以及鼻灌洗液中的这些炎症标志物(Ahlstrom-Emanuelsson等人，2002&2007)，而抗组胺剂仅减轻激发后症状(Korsgren等人，2007)。因此，使用该剂量、剂量方案、鼻内施用的体积和喷雾方法，rhCC10在全部六种临床结果测量中或在鼻灌洗液的三种炎症标志物中不表现抗过敏、抗炎作用。

当前，大部分鼻炎和鼻窦炎是使用各种非处方和处方药物治疗的，如抗组胺剂、减充血剂、非类固醇类抗炎剂(“NSAIDS”)和各种非药理学鼻喷雾以及冲洗液。铬鼻溶液、口服抗组胺剂和白三烯受体拮抗剂治疗症状但仅能缓解几个小时。鼻羟甲唑啉溶液对打开鼻部通道非常有效，但是过度使用会导致“反跳效应”并且会导致效力快速损失，症状加重。这些类药物的副作用尤其包括咽喉痛、鼻组织脱水以及便秘。

此外，通常用口服抗生素治疗窦炎。抗生素的副作用从轻度到重度不等，并且可以包括便秘及其它消化问题、头痛、眩晕、皮疹、肝、肾和膀胱毒性、肌肉和关节疼痛等。抗生素还可以引起过敏性反应，特别是在不得不反复服用抗生素的复发性窦炎患者中，并且抗生素最终成为他们的过敏原。可能会在没有过敏警告和先兆的情况下发生抗生素过敏性反应，并且可能会突然致死。

对于严重和/或慢性鼻窦炎疾病，目前医生使用鼻皮质类固醇，它减轻了炎症，但经常在数周或数月的连续疗法后失效。口服皮质类固醇也是有效的，但长期使用时会具有多种不希望的副作用。例如，在成人中，包括高血压和中风在内的心血管并发症是皮质类固醇使用的主要副作用。在儿童中，皮质类固醇损害正常的生长和发育。在所有患者中，皮质类固醇降低了患者的免疫功能，并且使它们对所有类型的感染(细菌、病毒、真菌等)敏感。因此，安全性是选择用于治疗、预防或治愈鼻炎的药物和药物组合的主要考虑因素，特别是对慢性鼻窦炎、鼻息肉、慢性或复发性细菌窦感染、它们相关病状以及其它相似病况。

有几种制剂、装置和方法，通过它们可以鼻内施用药物以治疗鼻炎、窦炎和鼻窦炎。将局部鼻内药物剂量施用到鼻部通道和窦的一个方法是使用处于喷雾瓶或喷雾泵装置中的液体药物制剂，通过迫使所述液体药物制剂通过小孔将其转化为气雾剂并通过每个鼻孔喷入鼻腔前部。

通过上述装置产生的颗粒尺寸在5-10微米的范围内，它最大程度地使药物沿鼻咽腔在鼻粘膜中输送和局部沉积。鼻粘膜由覆盖鼻咽腔的鼻部通道和窦中的湿润上皮细胞的粘液的正常薄层组成。喷入鼻孔中的大部分5-10微米颗粒将影响鼻咽腔前部中的非纤毛上皮细胞。一旦在鼻粘膜中的作用位点沉积，则药物可以在整个粘膜中分配并通过位于鼻咽腔后三分之二中的纤毛和纤毛上皮细胞的作用将其推向吞咽药物和粘液的咽，从而以各种速率清除。沉积在鼻腔中的药物的局部作用取决于所输送的颗粒尺寸、制剂以及清除速率。这些因素影响局部输送的效率以及在清除前鼻咽粘膜和上皮细胞暴露于药物的时间长度。

鼻内施用的药物的局部作用还取决于输送时鼻粘膜和组织的病况。例如，当鼻部通道被厚粘液阻挡时，如可能的话，局部药物输送也是十分困难的。

因此，发现能够长期减轻气道阻塞、窦痛和不适并且没有严重副作用的药剂以及该药剂的正确剂量是巨大的挑战。因此，需要新型、更有效或更持久的药剂及其制剂以及它们的施用和剂量方案，特别是对于慢性病患者。

发明内容

发明目的

上述内容提供了本发明所实现的目标的非排它性列表：

本发明的主要目标是使用rhCC10治疗、治愈或预防患者伴有或未伴有鼻息肉的鼻炎、窦炎，特别是慢性鼻炎和鼻窦炎。

本发明的另一个目标是使用rhCC10减轻与慢性鼻炎、窦炎和鼻窦炎有关的疼痛和窦压迫。

本发明的另一个目标是使用rhCC10使鼻炎或窦炎患者能够实现较好的睡眠质量。

本发明的另一个目标是通过鼻内滴注、鼻灌洗或作为包括使用喷雾装置的鼻内气雾剂将rhCC10施用给患者。

本发明的另一个目标是提供rhCC10的安全、良好耐受并且有效的剂量范围，其实现了上述目标并且不会显著抑制免疫反应或提高不良事件的频率或严重性。

本发明的另一个目标是提供药物-设备组合，通过该药物-设备组合可以有效地将rhCC10作为气雾剂、作为凝胶或作为液体施用到鼻咽腔。

本发明的另一个目标是提供处于特定药理学可用的鼻赋形剂中的rhCC10制剂，从而使用一次性拭子涂药器作为凝胶或乳膏应用于局部施用和长期释放。

本发明的另一个目标是提供处于特定药理学可用的赋形剂中的rhCC10制剂，从而使用喷雾泵或挤瓶以颗粒尺寸5-10微米范围的气雾剂应用于局部施用和沉积。

本发明的另一个目标是提供处于特定药理学可用的赋形剂中的rhCC10制剂，从而使用重复使用的喷雾分散器、定量吸入器(MDI)或挤瓶装置以颗粒尺寸5-10微米范围的气雾剂应用于局部施用和沉积。

本发明的另一个目标是提供处于特定药理学可用的赋形剂中的rhCC 10制剂，从而使用一次性或重复使用的喷雾分散器、定量吸入器(MDI)或挤瓶装置以颗粒尺寸1-5微米范围的气雾剂应用于肺施用和沉积。

本发明的另一个目标是提供处于特定药理学可用的鼻赋形剂中的rhCC10制剂，从而在单一或多剂量注射器装置中作为滴注形式应用。

本发明的另一个目标是提供处于特定药理学可用的鼻赋形剂中的rhCC10制剂，从而使用“涅涕洗鼻壶(Neti pot)”或类似的自流式灌洗设备在鼻灌洗液中作为滴注形式应用。

本发明的另一个目标是提供本身作为药理学可用的鼻赋形剂的rhCC10以减轻鼻咽腔中其它药物施用位点处由局部炎症反应所引起的疼痛、刺激和不适。

本发明的另一个目标是提供本身作为药理学可用的鼻赋形剂的rhCC10以提高施用到鼻咽腔或通过鼻咽腔施用的其它药物的生物利用率。

本发明的另一个目标是提供作为与其它鼻内施用药物的组合制剂中的活性成分的rhCC10。

术语“药理学可用的”旨在说明不引起有毒效应或引起有毒效应的赋形剂的制剂和组合的特征，并且所述有毒效应是已知的并且被监管当局接受或可以被监管当局接受。

发明概要

通过以适当间隔施用的剂量范围或以一次剂量施用rhCC10以治疗、治愈或预防伴有或不伴有鼻息肉的鼻炎、窦炎、鼻窦炎以及CRS从而实现了这些和其它目标、特征和优势。此外，对于慢性鼻炎患者，当以适当间隔的剂量范围或一次剂量施用时，rhCC10对慢性鼻炎的治疗、治愈或预防提供了更大的效果。因此，现在意外地发现当根据本文中所述的本发明使用时，认为对治愈、治疗或预防鼻部炎症、鼻炎、鼻部鼻炎、慢性鼻炎、窦炎和鼻窦炎无效的rhCC10事实上是有效的。

还通过以适当间隔施用的剂量范围或以一次剂量施用rhCC10实现了这些和其它目标、特征和优势，其中患者表现出下列一种或多种症状：窦痛和压迫、由于窦不适而不能睡眠、慢性鼻炎、鼻窦炎以及鼻息肉的生长或再生长。

还通过施用rhCC10实现了这些和其它目标、特征和优势从而使其不抑制血小板凝聚、不抑制如在感冒或流感中的免疫反应或不提高任何不良事件的频率或者严重性。

在本发明的某些方面，每天以1.5微克至1.1毫克的范围以在每个鼻孔之间大约等分的单次剂量，或以每天为基础以相加达到该剂量范围的多次剂量鼻内施用rhCC10以治疗、治愈或预防严重鼻炎、鼻窦炎，特别是慢性鼻窦炎和/或鼻息肉。在另一个方面，可以在适当的间隔重复每天以1.5微克至1.1毫克的范围以在每个鼻孔之间大约等分的rhCC10剂量以治疗、治愈或预防严重鼻炎、鼻窦炎、伴有复发性窦炎的慢性鼻炎，特别是鼻窦炎和/或鼻息肉。在本发明的另一个方面，以每天为基础将rhCC10连续鼻内施用7天、10天、14天或21天。

在本发明的另一个方面，以每天0.5至370微克的范围，以在每个鼻孔之间大约等分的鼻内剂量，以约8小时的间隔，每天施用rhCC 10三次。在本发明的另一个方面，以每天0.75至650微克的范围，以在每个鼻孔之间大约等分的鼻内剂量，以约12小时的间隔，每天施用rhCC10两次。

在本发明的另一个方面，以逐渐减小的方式施用rhCC10，即开始时以每天0.5至370微克的范围，以在每个鼻孔之间大约等分的鼻内剂量，以约8小时的间隔，每天施用三次，施用三天，然后以每天0.5至370微克的范围，以在每个鼻孔之间大约等分的鼻内剂量，以约12小时的间隔，每天施用两次，然后以每天0.5至370微克的范围，以在每个鼻孔之间大约等分的鼻内剂量，每天施用一次。在本发明的其它方面，根据上述方面鼻内施用rhCC10，但是其剂量相加在约15纳克至约10毫克之间。

不论是鼻内施用还是其它方式施用，可以单独施用，结合其它标准鼻炎和窦炎治疗施用，在其之前或之后施用rhCC10，其包括，但不限于，鼻内或全身皮质类固醇、NSAID(包括阿司匹林、COX-2抑制剂)、止疼药、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、减充血剂、抗组胺剂、铬溶液、鼻灌洗液、鼻灌洗盐水和顺式治疗剂。

在另一方面，rhCC10可以用作赋形剂和/或局部抗炎和/或局部免疫抑制剂以便于将局部输送或全身吸收的其它药物局部鼻输送或应用至在应用位点可能或可能不刺激或引起，或可能引起不希望的局部刺激的鼻组织。因此，rhCC10可以用作其它药物的赋形剂以减轻或避免与鼻输送有关的不适。

在另一个方面，rhCC10可以用作赋形剂或用于减轻由于局部或全身输送的其它药物的鼻内施用所引起的刺激。

另外，为了达到鼻部应用的适当粘度和在鼻咽腔中的局部分布，可以将rhCC10配制为水溶液、悬液(含有鼻表面活性剂赋形剂)或凝胶(如，使用，例如，羟甲基纤维素的水凝胶)。同样，可以结合其它活性成分配制rhCC10，所述活性成分如抗生素或其它抗菌剂、鼻灌洗盐水、减充血剂、粘液溶解剂、LTRA’s、β-激动剂、支气管扩张剂等。

在另一个方面，将rhCC10配制成装入鼻喷雾挤瓶、定量吸入器或喷雾泵装置中的水溶液。在另一个方面，将rhCC10在表面活性剂中配制成装入鼻部注射器型应用设备、定量吸入器或其它鼻部应用装置中的悬液。另外，在另一个方面，在水凝胶或其它形式的人工粘液中配制rhCC10，并将单次剂量置于鼻内应用的一次性鼻部拭子装置中。

具体实施方式

本发明涉及rhCC10施用的临界剂量和时机以治疗、治愈或预防人的鼻炎和窦炎，特别是伴有复发性窦炎的慢性鼻炎、慢性鼻窦炎和鼻息肉。通过分别在Ex.A和B中附录的美国专利申请公开No.US 2003-0109429和US 2003-0207795中所述的方法优选地获得了rhCC10，以上两篇专利均以其整体作为参考并入，或通过生产药品级(满足FDA要求)rhCC10的任何其它方法优选地获得了rhCC10。可以与其它鼻内、肺或全身疗法一起，或不与它们一起，或在它们之前或之后，施用本发明实施方式所述的rhCC10。

剂量

优选地，在治疗或预防鼻炎、窦炎、慢性鼻窦炎和鼻息肉时，将rhCC10鼻内施用到每个鼻孔中，每天1-3次，施用7-14天，并且在此之后，每隔一天再施用14天，并且在此之后，根据需要施用。更优选地，患者一开始经历窦痛和压迫就施用rhCC10。

为了实现以下进一步说明的所需结果，对下列实施方式中所述的施用方法进行参考：

在一个实施方式中，可以施用相当于从约1.5微克至约1.5毫克剂量的rhCC10剂量或者多次剂量。在另一个实施方式中，可以以每天为基础以所述剂量范围施用rhCC10。在另一个实施方式中，可以以每天为基础以所述剂量范围连续施用rhCC10至少7天。在另一个实施方式中，可以以每天为基础以所述剂量范围连续施用rhCC10至少14天。在另一个实施方式中，可以以所述剂量范围每隔一天施用rhCC10，连续施用30天。在另一个实施方式中，可以以逐渐减小的剂量每天施用rhCC10，连续施用10天，所述逐渐减小的剂量包括前三天每次施用大剂量，第二个三天每次施用中等剂量和最后四天每次施用低剂量。在另一个实施方式中，每天可以约每八小时以所述剂量范围或以逐渐减小的剂量施用rhCC10多达三次。

在另一个实施方式中，可以将rhCC10的上述剂量鼻内施用给患者。在另一个实施方式中，可以作为气雾剂通过鼻内滴注，或通过凝胶或乳膏在鼻部通道中的沉积将rhCC10的上述剂量施用给患者。在另一个实施方式中，根据上述方法，可以在口服或鼻内施用减充血剂、抗组胺剂、皮质类固醇、粘液溶解剂、化痰剂、粘液抑制剂、表面活性剂、支气管扩张剂、血管收缩剂、窦痛止痛剂或其它典型疗法之前、期间或之后施用rhCC10。在另一实施方式中，根据上述方法，可以施用rhCC10以治疗或预防患者的鼻炎、鼻窦炎、慢性鼻窦炎或鼻息肉。

根据所治疗疾病的严重性、患者整体的健康情况以及所治疗的是急性还是慢性病况，可以每天施用上述rhCC10剂量和应用方法，或每天施用超过一次，每天施用三次，每隔一天施用或以逐渐减小的方式施用。例如，疾病状况越严重，则将需要更大量的rhCC10以有效治疗疾病。对于，例如，预防鼻炎、鼻窦炎或鼻息肉加重的慢性病维持疗法，将使用较小的剂量。据了解根据患者的症状和对疗法的反应并且在本发明的实施方式所述的参数和剂量范围内，医生将能够根据需要监控和调节剂量、制剂和应用方法。

制剂

当直接应用到局部鼻上皮细胞时，例如，通过使用喷雾瓶、喷雾泵或灌洗器中的液体制剂应用时，rhCC10是最有效的。因此，在可以有效地将rhCC10应用到鼻上皮细胞前，有时需要使用快速起效的局部粘液溶解剂、抗组胺剂和/或减充血剂，以及如吸入湿热空气、应用于面部的热敷以及盐水鼻部灌洗的物理方法以打开鼻部通道。

鼻内滴注是施用rhCC10的另一种方法，其可以使用液体或凝胶制剂中的rhCC10完成。凝胶剂量制剂通过将rhCC10剂量保留在擦拭时间更长的局部鼻部区域中从而提供了在较长时间内更好局部给药的优势，然而由于正常鼻部排液从而可能会在滴注后部分吞咽液体剂量，这导致局部暴露更短并且局部剂量更小。然而，通过使用“涅涕洗鼻壶”型装置的鼻部灌洗，液体剂型的鼻内滴注具有优势，即与局部应用凝胶制剂相比，所述剂量在鼻组织和窦中的更大表面区域上的分布更快。

rhCC10可以与鼻内输送的几种鼻部赋形剂配制。这些制剂包含赋形剂以调节药物的pH，缓冲药物以保持溶解度，起到保护剂的作用或增强保护剂防止微生物生长和/或转移的能力，调节药物的张性、溶解度或粘度，提高药物的穿透性或渗透性(全身输送)，改变药物的局部生物利用率和半衰期(提高粘度)，降低毒性，使不溶的药物悬浮以及改变制剂的味道。表2包含了示例性赋形剂的非排它列表以及它们在rhCC10鼻内制剂中的功能。任何单一赋形剂或赋形剂的组合均可以用于配制鼻内施用的rhCC10。

表2：鼻内制剂的赋形剂的实例

还可以结合用于鼻内施用的其它药物、人工粘液或其它活性成分配制rhCC10。rhCC10可以与之配制用于鼻内施用的药物包括，但不限于，局部或全身抗微生物剂(抗病毒、抗菌、抗真菌)、减充血剂、抗组胺剂、粘液溶解剂、化痰剂、白三烯受体拮抗剂、支气管扩张剂、β₂-肾上腺素能受体激动剂、局部作用的血管收缩剂(如羟甲唑啉)、抗炎剂和止痛剂。rhCC10可以与之配制用于局部或全身作用的鼻内施用的其它药物包括抗炎剂、β₂-肾上腺素能受体激动剂、抗癌剂、抗血管生成剂、抗纤维化剂、免疫调节剂、疫苗、代谢剂、止痛剂、神经激肽、麻醉剂、用于抑郁和其它精神疾病(心理健康)的药剂、抗成瘾剂、顺式治疗剂、草本制剂、维生素和矿物质等。

rhCC10与大部分非活性的化学物质和药物相容，其包括亲水和疏水的化学物质、核酸和核酸类似物、蛋白质和肽、碳水化合物、脂肪和磷脂等。作为参与上皮细胞中物质运输的关键的分泌素，rhCC10理想地适合于提高通过鼻部通道的其它药物的输送。rhCC10还可以起到局部抗炎剂的作用，其可以用作赋形剂以抑制其它药物施用位点处的疼痛局部鼻反应，所述其它药物如，例如，施用后产生“烧灼感”的化疗剂和药物。

与鼻内施用rhCC10有关的药物效力的相关关键参数为rhCC10本身的浓度。rhCC10浓度过高的制剂(即，超过2mg/ml)证明是无效的或甚至是有害的，如背景技术中所述的临床结果所见。rhCC10制剂为5.6mg/ml并且直接应用到患者鼻孔(Widegren等人，2009)。相反地，在实施例4中，rhCC10的浓度为250-262毫克/毫升，其具有临床效果。在不相关的实验中，使用5.5mg/ml的rhCC10制剂通过气管内滴注以5mg/kg体重的剂量处理早产羔羊，其经受严重缺氧并且3/4的动物在药物施用后4小时内死于呼吸衰竭，然而四只安慰剂处理的动物无一死亡(未发表；Ikegami，M.，Univ of Cincinnati)。相反，当将相同的rhCC10制剂稀释到2mg/ml并通过气管内滴注施用到插管的早产羔羊中时，与安慰剂相比，这些动物表现出接受药物的各种益处(Miller，2005a，2005b，2007；Shashikant，2005)。不受任何特定理论的限制，该现象可能与rhCC10极高的水合范围有关，即CC10配位的水分子数目高于平均蛋白质。将高浓度的CC10施用到粘膜及其它体液可能导致局部体液中水分的“减少”或损失，借此导致局部脱水和局部生物环境中物质间平衡的有害破坏。作为另外一种选择，或结合上述内容，CC10的严重局部过量还可以导致细胞和组织对CC10存在的脱敏，从而显著地降低了药物效力而不是提高药理学效果。有一些情况下，涉及特定代谢产物或介体的途径或途径组的反馈抑制实际上可能会导致与所述代谢产物或介体在较低剂量下可能观察到的相反的作用(活化相对于抑制，反之亦然)。旨在通过鼻内、气管内或其它局部施用方式施用到鼻部和其它粘膜表面的rhCC10制剂的截止值为2mg/ml，超过该值，rhCC10是无效的并且甚至可能是有害的。

以下详细的实施例是实施方式的说明。显然，这些实施例不意欲限制本发明的范围。

实施例1

将rhCC10鼻内施用到过敏性鼻炎患者

通过美国专利申请公开No.US 2003-0109429和US2003-0207795中所述的的方法(Claragen，Inc.，College Park，MD)，在大肠杆菌(E.coli)中生产并纯化了rhCC10，以上两篇专利以其整体作为参考并入。以纯度＞98％的重组人CC10同型二聚体溶液形式提供了用于研究的蛋白。使用美国专利申请公开No.US2002-0169108中所述的专利保护的分泌型PLA₂抑制测定比较了每个批次的生物活性，所述专利作为参考并入本文。

在鼻变应原激发模型中，在对已知变应原具有已知季节性过敏的患者中，将变应原溶液滴注到鼻咽腔中，连续进行7天。为了使安全风险最低，对每位患者小心地校准滴注的变应原的量以引起轻度局部过敏反应，所述过敏反应使用7天激发期中的四个主要结果参数进行定量。这些参数包括：1)总鼻部症状得分，2)最大鼻吸入气流，3)鼻灌洗液中生物标志物的定量和4)对组胺激发的反应。

总计35位对树木花粉季节性过敏的患者在伦德大学医院(LundUniversity Hospital)(Lund，Sweden)完成了rhCC10相对于安慰剂的安慰剂对照、随机、盲法、交叉的鼻变应原激发研究。该研究的目的在于确定在过敏性鼻炎受试者中鼻内施用重组人克拉细胞10kDa(rhCC10)蛋白的安全性、耐受性和效力。为了研究鼻内施用rhCC10是否可以缓解由鼻变应原激发所引起的鼻炎症状。

首先测量了不存在rhCC10时患者对鼻变应原激发的反应，并记录了基本资料。对总计39位患者筛选了该研究中包含的内容。所有患者均为男性受试者，年龄在18-50岁，体重指数在18至28kg/m²之间，并且具有过去至少2年的桦木和/或梯牧草花粉引起的季节性过敏性鼻炎的病史并且其它情况健康。每位患者具有升高的特异性IgE或者对至少一种空气变应原(例如，梯牧草或桦木花粉)具有至少一种阳性皮肤点刺测试(SPT)，并且每位患者均表现出由变应原所引起的症状，并相应地具有升高的特异性IgE或阳性SPT。除受试者在未暴露于猫和狗的情况下对猫和/或狗的过敏外，如果受试者患有常年性过敏(例如，慢性鼻炎)，则将它们从该研究中排除。如果受试者患过其它鼻病(例如，鼻结构异常、鼻窦炎或鼻息肉)，在开始研究前两周内患过任何上呼吸道感染，目前正在接受或在招收前4周内接受过鼻内、吸入或全身糖皮质类固醇、β2-肾上腺素能受体激动剂或任何其它抗炎药治疗或在招收前一个月内患过细菌或真菌感染，则也将它们排除在外。表2中列出了患者特征和基本资料的总结。

表2.人群统计学和基本资料的总表

根据对树木花粉变应原的反应对患者进行初始筛选以确定基于各位患者的反应所校准的在激发期间所施用的变应原的量。进行体检，其包括耳、鼻和喉检查以及生命特征。然后，为了建立能够导致至少5次喷嚏和/或鼻充血或鼻漏症状的症状得分为至少2分(分数范围为0-3分)的变应原剂量，进行了鼻变应原激发。将鼻漏定义为鼻粘膜的分泌物并且通常为水状的。所有变应原施用均由医院工作人员在诊所中进行。为了对每位个体评价鼻激发系列的症状产生、可耐受和可重复的变应原剂量，在所有受试者中进行滴定程序。选择在皮肤点刺测试中引起最严重风团反应的变应原(桦木或梯牧草花粉)进行鼻滴定。使用鼻喷雾装置，以10分钟的间隔施用变应原(ALK，Denmark)递增的剂量。所述喷雾装置每次动作输送100μl，并且对每个鼻孔喷雾一次，从而导致对每个鼻腔施用100、300、1000和3000SQ单元的有效剂量。按照该方案进行，直到患者产生至少5次喷嚏和/或鼻塞和流鼻涕的症状的症状得分为至少2分或以上(分数范围为0-3分)的剧烈反应为止。选择产生该效果的变应原剂量以用于第一和第二治疗期(例如，群组)中的每日变应原激发系列。表3显示了施用给每位患者的变应原的类型和量。

表3.变应原的选择和每位受试者在变应原滴定时的喷嚏数

在没有花粉的冬季月份进行该研究。该研究采用盲法并且是安慰剂对照的，其中医生和患者均不知道它们接受的是rhCC10还是安慰剂。随机进行研究，其中随机将患者指派到rhCC10或安慰剂治疗组。该研究为交叉设计的，其中每位患者进行两个七天群组的治疗，而所述两个群组之间相隔3-5周的清除期。每位患者完成一组接受rhCC10的群组和一组接受安慰剂的群组。根据需要，允许患者采用几种类型的非类固醇药物以缓解他们在治疗期间的鼻和窦不适。在严重的过敏症状的情况下，允许使用止痛剂(包括阿司匹林，但不包括布洛芬)和抗生素，并且允许使用(Claritin^TM)10mg，该药物由诊所提供。

将测试药剂、安慰剂和rhCC10置于10mL玻璃瓶中，用数字进行标记从而使诊所中的医生和患者不能将它们区分开。将记录每个瓶中所盛放内容的答案保留在药房中，并且只有在发生医生需要信息以治疗患者的不良事件的情况下才能告知医生每个瓶中的内容。在施用前，将Valois Pharm(France)生产的一次性医用鼻喷雾装置连接到临床位置处的10mL小瓶上。该装置由泵(VP7/100S18PH)，制动器(PR147)和盖(B25/A)组成。安慰剂由无菌、无缓冲的0.9％的氯化钠组成。rhCC10处于无菌、无缓冲的0.9％的氯化钠中，浓度为5.6mg/ml。安慰剂和rhCC10均表现为不易区别的透明、无色、无嗅的液体。在每个治疗期中，每个治疗日将总计100微升的安慰剂或rhCC10施用到每位患者的每个鼻孔中，总计连续施用7个治疗日。所有变应原和测试药剂的施用均由医院工作人员在诊所中进行。rhCC10的总的日剂量为1.1毫克/天，其以单次剂量施用，作为气雾剂以100微升的体积喷入到每个鼻孔中，或者每个鼻孔施用0.56毫克。在施用变应原之前的15-30分钟施用rhCC10。

测量结果如下所示：

1.总鼻症状得分(TNSS)

在早晨施用研究药物之前，患者对包括鼻充血、鼻漏和打喷嚏/鼻瘙痒在内的鼻症状评分并记录在患者日记中(对之前12个小时中的症状评分，但是不考虑施用研究药物后的第一个15分钟内的可能症状)。每次变应原激发后15分钟记录TNSS。此外，在傍晚对症状评分(仍反映之前12个小时中的症状，施用剂量后立即出现的症状除外)。根据下列标准分别对症状评分：0＝无症状，1＝轻度症状，2＝中度症状，3＝重度症状。将每个时间点的得分相加组成总得分，其范围在0到9之间。在统计分析中使用每个变应原激发期最后三天的各个早晨记录、变应原激发后10分钟记录以及傍晚记录的平均鼻症状得分。

2.最大鼻吸入气流(PNIF)

在早晨服药前，变应原激发后10分钟以及傍晚由患者测量PNIF。使用配备了面具的PIF计(Clements-Clarke，Harlow，U.K.)进行测量。患者在该程序期间站立，用双手将面具紧贴面部放置，闭嘴并通过鼻子吸气。他们记录数值并将读数30返回装置，然后再重复该程序2次。将三次测量的最大值记录在日记中。与鼻症状得分类似，在统计分析中使用每个变应原激发期最后三天的每个时间点的PNIF读数。

实施例2

药物的共施用

安慰剂和rhCC10组中总计有10位患者在进行方案时需要救治药物以治疗他们的不适和过敏症状。从表5中可以看出，采用了用于缓解鼻内症状的多种局部和全身药物，其包括抗炎剂、过敏药物、抗组胺剂、皮质类固醇(流感泰得(Flutide))和羟甲唑啉。

表5：接受安慰剂或rhCC10的患者中救治药物的共施用

氯雷他定是非镇静抗组胺剂，对乙酰氨基酚是止痛剂和退热剂，氟替卡松(flutikason)是皮质类固醇抗炎剂，羟甲唑啉是选择性α-1激动剂和部分α-2激动剂局部减充血剂，而依巴斯汀是非镇静H1抗组胺剂。由于这些其它药剂同时与rhCC10共施用，这些患者未经历任何严重的AE，因此rhCC10和这些药物的组合是安全的并且是药理学可用的。

实施例3

鼻内施用rhCC10的安全性和耐受性

作为在人中鼻内施用rhCC10的概念验证的安全性评价的一部分，对不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)进行监控、记录和报告。临床研究者负责对符合AE或SAE标准和定义的事件进行检测和记录。AE是受试者中任何不利的医学发生，或者无论是否认为该事件与研究药物具有因果关系，AE是暂时与研究药物的使用有关的临床研究。在该试验中，预先存在的病况(即在AE报告期开始前存在的并且在治疗前医学病史/体检表中记录的病症)不报告为AE，除非在AE报告期中该病况恶化或发作频率增加。将严重不良事件定义为任何剂量下的任何不利的医学发生，所述医学发生：1)导致死亡，2)是危急生命的，3)需要住院治疗或延长目前住院治疗的时间，4)导致残疾/功能丧失，5)是先天异常/出生缺陷，6)是重要的其它医学事件(OME)以及7)所有4级实验室异常。AE报告期从接受研究药物的第一次剂量开始至研究药物访问(随访)停止2周后结束。

在该研究期间未发生SAE。总的来说，在安慰剂和rhCC10治疗组中的受试者中，共计报告了15件不良事件。所有AE的严重性中评价为轻度。在每个组中，将15件AE中的11件评价为相对于研究药物相关性不可评价，而在每个组中，将15件AE中的4件评价为不可能与研究药物相关。表6中列出了接受安慰剂的每位患者的AE的总结，而在表7中列出了发生AE时接受rhCC10的患者。

表6.接受安慰剂的患者的不良事件列表

表7.接受rhCC10的患者的不良事件列表

因此，当作为气雾剂以1.1毫克的划分剂量，每个鼻孔0.56毫克，每天施用1次，连续施用7天时，发现鼻内rhCC10施用在人中是安全的并且是良好耐受的。

实施例4

将rhCC10鼻内施用到慢性鼻炎和复发性窦炎(也称为慢性鼻窦炎) 患者

将11mg(2ml)等份的rhCC10加入到软塑料喷射瓶中，其中含有42ml的0.65％的无菌盐水，所述盐水含有磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，以及苯甲醇(保护剂)和苯扎氯铵(保护剂)或0.1％的硫柳汞(也是保护剂)，从而产生了250毫克/毫升的rhCC10溶液。患者通过将所述瓶的涂药器端插入到鼻子中从而使得分配药物的开孔处于鼻孔内，并同时挤压和吸气以自施用rhCC10。当快速挤压所述瓶从而迫使液体通过鼻部涂药器端的顶部上的小孔时，产生了简单的气雾剂。所输送的体积和剂量取决于挤压速度和所施加的作用力。通常分配的体积在25-500微升之间，相当于6.6-131微克的rhCC10。当挤压的越狠并且输送的体积越大时，在几分钟内鼻部通道得到灌洗并且部分剂量可能被吞咽或流入气管。

在本实施例中，将rhCC10施用给由于慢性鼻窦炎(由常年性过敏引起并伴有复发性细菌窦感染)而经受偶发和/或慢性窦痛的患者。该患者的病史包括：1)在过去六年中，每年为窦感染开抗生素2至12次，2)在过去六年中，根据需要开鼻内皮质类固醇并服用，和3)每天服用非处方止痛剂、减充血剂和抗组胺剂以缓解窦痛、鼻和胸充血，并使患者能在夜晚睡眠。采用下列剂量、剂量方案、制剂和药物-装置组合，rhCC10是患者的有用替代和辅助疗法。

在第一剂量方案中，患者在用喷射瓶自施用rhCC10(每个鼻孔喷射两次，每天三次，施用三天)前患有三天的疼痛细菌窦感染。使用该方法，每天吸入的总剂量在78.6-1572微克(每个鼻孔39.3-786微克)范围内，相当于在平均70公斤体重的患者中每天施用1.1毫克/公斤-22.5毫克/公斤体重。然后，患者逐渐将剂量减少至每天两次，施用两天(每天总计52.4-1024微克(每个鼻孔26.2-512微克)，相当于在平均70公斤体重的患者中每天施用749纳克/公斤-14.6微克/公斤)，然后减少至每天一次，施用两天(每天总计26.2-524微克，相当于在平均70公斤体重的患者中每天施用374纳克/公斤-7.5微克/公斤)。在鼻内rhCC10的逐渐减少剂量方案进行一周后，患者停止使用。患者的窦痛、鼻炎和支气管炎症状(鼻充血、打喷嚏、咳嗽、气道狭窄和胸充血)以及失眠在开始治疗24小时内消失，并且在施用最后一次rhCC10剂量后至少6周内不复发。鼻内rhCC10在患者中是安全并且耐受的，尽管经历了一定程度的鼻粘膜干燥。

实施例5

将rhCC10鼻内施用给患者以预防复发性窦炎

在第二剂量方案中，患者在首次感到窦痛的12小时内开始，在早晨和傍晚每天两次接受实施例4中所述的制剂和喷雾瓶中的rhCC10。窦痛与已用强效广谱抗生素(例如，左氧氟沙星(Levaquin))治疗了14天的细菌窦感染的复发有关，在用强效广谱抗生素治疗期间疼痛减轻，但在停止使用抗生素后4天内复发。在患者中发生了与抗生素有关的已知副作用，其包括便秘和过敏性肠病、胸痛、眩晕、短暂性麻木和四肢震颤、严重晒伤以及对碰伤的易患性提高。因此，医生建议该患者避免继续使用抗生素。随后，该患者结合非处方减充血剂使用rhCC10以治疗与复发性窦感染有关的症状。在施用第一次剂量的24小时内，鼻痛和充血消失。患者继续每天施用rhCC10两次，施用一周，然后减至每天施用一次，施用一周，然后停止疗法。细菌感染在鼻内rhCC10疗法后至少六周不复发。

实施例6

鼻内施用rhCC10用于维持

使用rhCC10的维持疗法以预防通常由季节性或常年性过敏和暴露于空传变应原所引起的窦痛和感染也是可能的。每天以不超过500毫克/毫升的制剂浓度(优选不超过250毫克/毫升)，以总计26.2-524微克的剂量，以对每个鼻孔单次或多次动作施用，以相当于374纳克/公斤-7.5纳克/公斤体重的量，鼻内施用rhCC10长达两个半月将会安全地控制慢性鼻炎症状、鼻窦炎、鼻和胸充血、窦感染和疼痛以及失眠，并且防止了对抗生素、止痛剂(如阿司匹林、布洛芬的NSAID)、减充血剂、抗组胺剂和安眠药的需要。

使用这些方法、制剂、剂量、剂量方案和药物装置组合，rhCC10对减轻与慢性鼻炎和细菌窦感染(也称为慢性鼻窦炎)有关的症状有效。在严重或复发性窦感染的其它情况下，使用了几种其它抗生素(阿莫西林、希舒美、克拉霉素(Biaxin)等)来控制细菌生产而rhCC10减轻了疼痛和症状。对于轻度感染并且为了预防严重的疼痛感染，使用rhCC10而不使用抗生素，并因此使患者不受与抗生素有关的副作用的影响。没有与rhCC10、减充血剂、抗组胺剂和抗生素之间的可能相互作用有关不良事件。因此，彻底避免了通常对鼻窦炎所开的非处方减充血剂和抗组胺剂和抗生素，或者它们与rhCC10结合安全地使用以缓解中度至重度的鼻症状。

实施例7

鼻内施用rhCC10用于治疗皮质类固醇耐受的、耐抗生素的急性窦 感染

患者患有严重的持续性窦感染，其特征为疼痛、压迫、睡眠破坏、站起时血压降低以及不能行走。患者对空传变应原(季节性或常年性)不过敏，并且在无季节性变应原存在的一月发生感染。通过CT扫描验证了对窦感染的诊断及其严重性。接受rhCC10前，患者已进行了5周抗生素治疗(阿莫西林；500毫克/天；10天；接着使用沃格孟汀，4克/天，使用3周)并且进行了10天鼻内皮质类固醇治疗(氟替卡松丙酸酯)。尽管进行了这些治疗，但是患者仍感觉相当疼痛，并伴有在整个窦中存在的压迫，面部浮肿(肿胀)。在立即要接受rhCC10前，鼻中隔两侧为血红色并含有易见的扩张毛细管，这表明存在严重的局部炎症。然后，将250微克/毫升的rhCC10在0.65％的盐水(含有磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，苯甲醇(保护剂)和苯扎氯铵(保护剂))中的溶液以单次鼻内剂量，以每个鼻孔约20-50微克的剂量，作为喷雾施用到每个鼻孔中。在接受rhCC10单次鼻内剂量后约12个小时，患者鼻中隔为正常暗紫色并且没有可见的扩张毛细管，这表明了明显的局部抗炎作用。患者继续施用rhCC10，每天两次，施用7天，观察到窦痛和压迫症状减轻。rhCC10的剂量方案为逐渐减少的，即从每个鼻孔喷射两次，每天两次，施用三天减少到每个鼻孔喷射一次，每天两次，施用三天，再减少到每个鼻孔喷射一次，每天一次，施用三天。患者继续采用该方案治疗4天。然而，在第5天观察到患者在鼻喷雾难以达到的筛窦中仍具有强烈疼痛。其后，通过灌洗技术以相同的时间安排施用rhCC10以增强rhCC10对筛窦区域表面的到达。在该灌洗方法中，将总剂量250微克的rhCC10(即，250微克/毫升溶液，1ml)加入到118ml(1/2杯；4液量盎斯)的标准可商购鼻灌洗溶液中。患者以背卧位头后仰接受灌洗，从而允许rhCC10制剂在窦中保持3-5分钟。然后患者坐起，从而允许灌洗液流出并通过擤鼻排出。每天施用灌洗液两次，施用两天，然后每天施用1次，施用3天，然后停止。在rhCC10初次剂量后21天时进行CT扫描，其显示窦感染完全消除，并且没有瘢痕、上皮细胞增厚或其它保留的堵塞的迹象。rhCC10制剂介导了有效的抗炎反应，所述炎症是由细菌感染而不是由过敏引起的。当以鼻内皮质类固醇形式进行的标准抗炎疗法失败时，rhCC10进一步介导了抗炎反应。rhCC10还辅助清除细菌感染，从而在不使用额外抗生素的情况下解决了该问题。最后，rhCC10介导了鼻上皮细胞的完全恢复，从而避免了通常伴随该类严重感染出现的瘢痕、纤维化和上皮细胞增厚。

实施例8

rhCC10的鼻内制剂

鼻内输送rhCC10是有用的，例如，当治疗由常年性过敏、感染或其它一些形式的急性或慢性上呼吸道刺激所引起的上呼吸道(鼻和窦以及上气道)炎症和纤维化时。rhCC10在广泛的水溶液中，在宽pH值范围(例如，3.9-8.5)内并且在宽盐浓度范围内(例如，0.1％-4％)以及在多种乙醇/水混合物(例如，0.1％-90％的乙醇)中是可溶的。因此，rhCC10具有配合广泛的鼻内分配装置使用的溶解度和稳定性特征，所述分配装置包括，但不限于，例如，用于液体气雾剂自施用的体积剂量不可控的简单喷射瓶、用于自施用的发射剂驱动的干粉或液体气雾剂定量装置、用于局部输送到鼻部通道的装载了凝胶的鼻拭子，以及用于较深的局部施用和窦灌洗的装载了药物的注射器，其用于对有意识或无意识的患者进行自愿或非自愿施用。

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基于上述内容，已发现了对安全治疗、治愈和预防鼻炎，特别是非过敏性鼻炎、鼻窦炎、慢性鼻窦炎和鼻息肉有效的rhCC10剂量的临界范围。因此，本发明提供了安全并且良好耐受的基于鼻内rhCC10的疗法，该疗法对治疗鼻炎，特别是非过敏性鼻炎、鼻窦炎、慢性鼻窦炎和鼻息肉的症状有效，因此，降低了患有这些病况的儿童和成年患者中显著的病况，并且不引起任何危险的副作用。

权利要求书：

1、治疗患者鼻部通道中鼻窦炎的安全并且良好耐受的方法，其包括：将rhCC10施用给所述患者。

2、根据权利要求1所述的方法，其中所施用的rhCC10的量在每天约1.5微克至约1.5毫克之间。

3、根据权利要求1所述的方法，其中所施用的rhCC10的量为每天少于约1.1毫克。

4、根据权利要求1所述的方法，其中所施用的rhCC10的量为每天约0.75微克至约650微克。

5、根据权利要求1所述的方法，其中所施用的rhCC10的量为每天约0.5微克至约370微克。

6、根据权利要求1所述的方法，其中每天重复施用rhCC10约三次。

7、根据权利要求1所述的方法，其中重复施用rhCC10约两天。

8、根据权利要求1所述的方法，其中通过滴注、灌洗、拭子涂药器或喷雾器将rhCC10施用到所述鼻部通道。

9、根据权利要求1所述的方法，其中结合抗生素、抗组胺剂、减充血剂、粘液溶解剂、止痛剂、局部作用的血管收缩剂、白三烯受体拮抗剂、类固醇、鼻赋形剂或它们的任意组合施用rhCC10。

10、预防或减缓患者中鼻息肉生长或再生长的安全并且良好耐受的方法，其包括：将rhCC10施用给所述患者。

11、根据权利要求10所述的方法，其中每天施用约1.5微克至1.5毫克之间的rhCC10，施用至少2天。

12、根据权利要求10所述的方法，其中所施用的rhCC10的量为每天1.1毫克或更少。

13、根据权利要求10所述的方法，其中每天重复施用rhCC10约三次。

14、根据权利要求10所述的方法，其中通过滴注、灌洗、拭子涂药器或喷雾器将rhCC10施用到所述鼻部通道。

15、根据权利要求10所述的方法，其中结合抗生素、抗组胺剂、减充血剂、粘液溶解剂、止痛剂、局部作用的血管收缩剂、白三烯受体拮抗剂、类固醇、鼻赋形剂或它们的任意组合施用rhCC10。

16、治疗或预防患者慢性或复发性细菌窦感染的安全并且良好耐受的方法，其包括：将rhCC10施用给所述患者。

17、根据权利要求16所述的方法，其中每天施用约1.5微克至1.5毫克之间的rhCC10，施用至少2天。

18、根据权利要求16所述的方法，其中所施用的rhCC10的量为每天1.1毫克或更少。

19、根据权利要求16所述的方法，其中每天重复施用rhCC10约三次。

20、根据权利要求16所述的方法，其中通过滴注、灌洗、拭子涂药器或喷雾器将rhCC10施用到所述鼻部通道。

21、根据权利要求16所述的方法，其中结合抗生素、抗组胺剂、减充血剂、粘液溶解剂、止痛剂、局部作用的血管收缩剂、白三烯受体拮抗剂、类固醇、鼻赋形剂或它们的任意组合施用rhCC10。

22、治疗患者窦痛的安全并且良好耐受的方法，其包括：将rhCC10施用给所述患者。

23、根据权利要求22所述的方法，其中每天施用约1.5微克至1.5毫克之间的rhCC10，施用至少2天。

24、根据权利要求22所述的方法，其中所施用的rhCC10的量为每天1.1毫克或更少。

25、根据权利要求22所述的方法，其中每天重复施用rhCC10约三次。

26、根据权利要求22所述的方法，其中通过滴注、灌洗、拭子涂药器或喷雾器将rhCC10施用到所述鼻部通道。

27、根据权利要求22所述的方法，其中结合抗生素、抗组胺剂、减充血剂、粘液溶解剂、止痛剂、局部作用的血管收缩剂、白三烯受体拮抗剂、类固醇、鼻赋形剂或它们的任意组合施用rhCC10。

28、用于rhCC10鼻内施用的药物组合物，其包含含有结合鼻赋形剂的rhCC10的制剂。

29、根据权利要求28所述的药物组合物，其包含浓度不超过2毫克/毫升的rhCC10。

30、根据权利要求28所述的药物组合物，其包含处于pH 4.0-8.0之间的0.65％的氯化钠、磷酸氢二钠、苯甲醇、磷酸二氢钠和苯扎氯铵中浓度为250微克/毫升的rhCC10。

31、根据权利要求1、10、16和22所述的方法，其中以20-50微克/鼻孔的剂量，每天施用多达四次根据权利要求29所述的药物组合物中的rhCC10。

32、一种药物-装置结合的组合件，其包含根据权利要求30所述的药物组合物和能够使rhCC10局部施用到所述鼻部通道表面上的挤压式喷雾瓶、泵动喷雾装置、定量鼻制动器、注射器型滴注装置、鼻拭子涂药器或“涅涕洗鼻壶(Neti pot)”灌洗装置。

Claims (12)

1.一种将人CC10或rhCC10用于制备降低患者肺组织中流感病毒滴度药物的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述rhCC10治疗、治愈或预防患者流感病毒感染。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒是A型流感病毒。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒是流感病毒H1N1株。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人CC10或rhCC10通过鼻内给药。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人CC10或rhCC10通过鼻内给药。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人CC10或rhCC10通过鼻内和静脉内组合给药。

8.将人CC10或rhCC10用于制备降低患者组织中病毒滴度药物的方法。

9.将重组分泌型球蛋白用于制备降低患者组织中病毒滴度药物的方法。

10.将人CC10或rhCC10用于制备在细胞水平抑制患者病毒复制药物的方法。

11.将CC10或重组CC10用于制备在细胞水平抑制受感染动物病毒复制药物的方法。

12.将CC10或重组CC10用于制备在细胞水平抑制受感染细胞病毒复制药物的方法。