CN102811714B

CN102811714B - 用于减少归因于激素避孕药物治疗的氧化应激的抗氧化剂组合物

Info

Publication number: CN102811714B
Application number: CN201180013358.2A
Authority: CN
Inventors: 翁贝托·康纳利
Original assignee: COR CON INTERNATIONAL S R L
Current assignee: COR CON INTERNATIONAL S R L
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2031-03-11
Also published as: JP5852971B2; EP2364697A1; CN102811714A; EP2544675A1; ES2587255T3; MX2012010520A; AU2011226037B2; EP2544675B1; WO2011110661A1; JP2013522262A; US20130251696A1; MX342417B; AU2011226037A1

Abstract

描述了用于减少正在经历激素避孕药物治疗的受试者中的氧化应激的抗氧化剂组合物。具体地，所述组合物已经证明是特别适合且惊人有效的，因为它含有天然组分而被身体极好耐受，所述天然组分例如来自绿茶的儿茶素、硒酵母、α?硫辛酸和辅酶Q10。

Description

用于减少归因于激素避孕药物治疗的氧化应激的抗氧化剂组合物

发明领域

本发明涉及用于减少正在经历激素避孕药物治疗的受试者中的氧化应激的抗氧化剂组合物。该组合物已经证明是特别适合且惊人有效的，因为它被身体极好耐受。

现有技术

在50年代，发现孕酮抑制排卵，并且发现控制怀孕的问题产生高度复杂性和必须谨慎处理的状态(delicateaspect)，因为随时间观察到了副作用，例如血栓现象，某些肿瘤类型(即，乳腺肿瘤)的发展，以及相反地其他肿瘤类型(即，结肠肿瘤、直肠肿瘤、卵巢肿瘤)的减少。长期争论并最终被证实的因素是当使用避孕治疗(CT)时存在氧化应激(OS)[1，2]。OS实际上可以促进心血管疾病的发作和血栓发作，并且还在使用低剂量雌激素-黄体酮时存在，例如显示出与避孕治疗本身紧密关联。

尽管还没有完全阐明这些事件背后的原因，依然保持在低剂量和有效性之间实现最佳折中的原则。

实际上，优化益处/风险关系的尝试范围从高黄体酮剂量到雌激素与多种类型的黄体酮的组合。从这个意义上讲，透皮释放系统、子宫内释放系统(IUD，子宫内装置)和具有皮下或肌肉内贮库的系统是已知的。一般而言，目前可用的各种类型的避孕药是基于健康状态和生活习惯(例如吸烟)而开具的。

然而，即使在健康女性的情况下，已经在月经周期期间注意到氧化现象的增加，其虽然没有达到例如被归类为OS的水平，但指示了氧化现象在卵子成熟期(雌激素期)及其可能植入的随后时期(孕酮期)的增加。

为了理解发生OS的潜在本质，密切检查月经周期的激素状态。

与正常月经周期相关的激素状态

与女性生殖功能有关的类固醇激素由位于下丘脑弓状核和脑垂体前叶的中枢机制调节，它们的神经元与肾上腺、子宫和卵巢关联。

简言之[3]，弓状核的神经元在去甲肾上腺素能刺激下以定时方式每小时释放GnRH(促性腺激素释放激素)；相反，阿片样、多巴胺能和γ氨基丁酸能神经元使所述神经元保持在抑制状态。

因此显然的是，这些“驱动器”之间的平衡产生频率和振幅(1个峰/小时，振幅约2mIU/ml的LH)方面的中枢矢量刺激。

GnRH经由缠绕脑垂体周围的所谓的门脉循环(呈螺旋形式)到达脑垂体前叶并刺激它爆发释放FSH(促卵泡激素)和LH(促黄体生成激素)，因此与GnRH释放关联；这些FSH和LH调节卵巢雌二醇(E₂)和孕酮(Pg)的生成。

E₂是所谓增殖期的激素；它能够使卵泡成熟并刺激子宫内膜细胞增殖和分化。粘膜细胞和子宫内膜血管的细胞数目(和体积)都增加；而且，E₂诱导细胞中Pg受体的生成，使得它们在黄体开始生成它时对其存在变得更具反应性。

Pg是分泌期的激素并且源自由空卵泡的间质形成的黄体，分泌期即准备接收卵子的时期。其作用是限制增殖效应并且更准确说是刺激输卵管分化(vasaldifferentiation)和分泌物的生成与卵子(胚泡)植入更一致。在该时期，孕酮还刺激中枢水平的神经元(阿片样、多巴胺能的和γ氨基丁酸能的)，这抑制GnRH释放。

E₂和Pg两者与FSH同时调节垂体的LH生成；这种调节是通过降低LH的峰频率(一个峰/3小时替代1个峰/小时)并增加其振幅(从2mIU/ml至3-4mIU/ml的LH)来实现的。

因此，如果卵子未植入，则下一方面运行以减少LH分泌，使得E₂和Pg水平下降并因此以月经结束该周期。

然而，如果卵子植入，则滋养层及然后将形成的胎盘产生的绒毛膜促性腺激素(hGC)刺激黄体继续产生功能在于维持子宫怀孕状态的E₂和Pg。胎盘一经形成，自身将足以产生这两种雌激素。

这些雌激素还进行辅助但重要的生殖目的的活动；在输卵管中，E₂刺激增殖和分化，而Pg使之降低；E₂增加子宫肌层收缩性，而Pg使之降低；E₂增加宫颈粘液的量和流动性(以促进精子通过)，而Pg使之降低、使之更粘并改变其稠度。然而，最具争议的问题之一是E₂和Pg对氧化应激的作用。一种物质与另一种物质作用相反的该二元论似乎是不切实际的，因为两者对细胞能量利用和代谢诱导都具有刺激作用，尽管是为不同的任务。因此，就纯理论而言，两者可以是促氧化剂，但是氧化平衡取决于一种物质或另一种物质的刺激在多大程度上允许内源性抗氧化剂的生成。因此，关于该特定论题的现有技术还有待阐明，并且即将讨论一些突出的方面。

正常月经周期期间的OS状态

如图1所示，卵泡周期和黄体周期都被图示细分成早期和晚期。这些能够使一些作者[4]描述的OS状态的进展以图表形式区分。

基于GSH(还原型谷胱甘肽)、GSSG(氧化型谷胱甘肽)、GSHpx(谷胱甘肽过氧化物酶)和最后MDA(丙二酰二醛)的分析，可以评价氧化状态的变化。然后使所述状态与激素(雌二醇、孕酮)、LH和FSH的水平相关联。

这些数据显示，OS峰出现在周期中期(卵泡晚期和黄体早期)，即，在卵子成熟和可能的卵子植入时。该时期表现为：a)GSHpx生成增加；b)GSH减少；c)GSSG增加；d)MDA基本稳定。

这意味着，随着OS增加，存在相应的补偿，使得MDA浓度(代表脂质过氧化)保持恒定；换言之，系统保持平衡。

OS峰对应于雌激素和LH的峰，而孕酮峰似乎对应于OS恢复阶段。

就这点而言，应该注意，GSHpx是利用GSH作为底物的酶系统，能够使各种类型的氢过氧化物被还原(H₂O₂，或脂质性质的氢过氧化物，例如ROOH等)形成H₂O。

存在两种类型的GSHpx，即包括红细胞在内的所有细胞的胞质中存在的GSHpx1，和包括血浆在内的胞外液中存在的GSHpx3。尽管这两种酶类型都是由各自含有硒基-半胱氨酸(SeCys)的四个相同亚基形成的，但两者实际上是不同的。就这点而言，抗GSHpx1的多克隆抗体不与GSHpx3反应。血浆中存在的GSHx3大部分由肾的近端小管细胞合成。然而，其他细胞也能够合成GSHx3(肝、肺、心、乳腺、肠、脑、肌肉)并分泌GSHx3[5]。

GSH催化的与氢过氧化物相关的反应如下：

ROOH+2GSH＝ROH+H₂O+GSSG

因此，GSHpx的增加在功能方面对应于GSH氧化的增加；因此，在生物系统中，其增加在生理上对应于GSH的减少，随之发生的是GSSG增加。所有这些预示OS；因此，认为GSHpx(任何类型的GSHpx，1或3)是抗氧化能力指数是错误的，相反，必然认为它们是对使用GSH对抗OS的需求增加的表现。

然而，如果临床状态的特征为GSHpx水平降低，这意味着使用GSH来对抗OS将是更困难的。

这出现在绝经期，例如在子宫内膜和血浆中，尽管它似乎还与年龄增长(绝经期的典型状态)有关，并因此与抗氧化系统效率降低有关。

当分析月经周期血浆中GSHpx、SOD(过氧化物歧化酶)和CAT(过氧化氢酶)系统时[6]，发现红细胞GSHpx在卵泡晚期和黄体早期相对于其他时期增加，而SOD和CAT水平保持基本不变(参见下表I)。与E₂水平相关性的分析指示，GSHpx水平是时间相关的(在极端合成中，一个的增加与另一个的增加是同时的)。

FSH、LH、孕酮、睾酮和雄烯二酮的水平未显示与红细胞GSHpx水平时间相关的模式。

根据所陈述和说明的，可孤立的E₂作用不是抗氧化作用，而更准确说是相反作用[7]，并且对应于分泌期增加的能量要求所需的细胞活化。

如果卵子还未受精，则黄体期的特征还有增加的细胞活性和组织增殖，这在周期结束和月经之前，使子宫粘膜回到周期开始时的状态。

该时期在最终活性方面表现不同(粘液粘度变化，血管组分增加，等)，但是氧化方面实际上保持相同，这是增殖期。

该时期受与E₂生成组合的Pg的生成的控制，因此是在卵子成熟期之后雌激素-孕激素类固醇表达最高的时期。

表I.与氢化有关的酶的红细胞水平的变化

这部分周期的进一步特征是NO^·自由基的大量生成。NO^·是血管舒张、子宫肌层松弛、抗聚集作用和刺激NO合酶的由VEGF(血管内皮生长因子)进行的血管生成刺激的重要介质[8]，意味着NO^·试图通过NO合酶的自动感应来维持自身。尽管后者作为eNOS(内皮的)或iNOS(可诱导的)而出现在整个月经期，但它基本上基于孕激素刺激而增加[9]。与该增加同时地，还有SOD的局部增加。歧化O₂ ^·(过氧化物)的SOD防止NO^·+O₂ ^·反应生成ONOO^-离子(过亚硝酸盐)，ONOO^-离子也具有高氧化能力，去除NO^·并限制其可用性。但是所有所述可用的NO^·与O₂ ^·反应(两者之间的反应是迄今在体内最快的(1x10^-9秒钟))，并且最后产生OS。

子宫肌层的血管通畅及其规律的血液供应也是由特定肽激素来维持的，所述肽激素即松弛肽(RLX)。

RLX是具有6kDa的MW的肽，由两个肽链组成，内部和相互间都通过S-S桥来稳定[10]。实际上，这是一个激素家族(H₁、H₂、H₃)，其循环形式H₂是最具代表性的。

RLX主要由黄体分泌并且策略地防止子宫内膜流(endometrialflow)的变化，以避免在周期的增殖期和然后可能的怀孕期间局部缺血和再灌注现象，其可能引发具有ROS生成和趋化性的反应过程。

RLX作用通过上调iNOS和eNOS以及特别是但不仅仅是子宫内膜中的血管生成而发生；该作用在动脉血管和静脉血管上都发生(因此也在无平滑肌的血管上发生)。RLX具有活性的浓度是纳摩尔水平，因此可在适合卵子植入和怀孕的子宫内膜期实现。而且，RLX的典型特征是其血管生成作用，通过释放VEGF以及bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)来进行。

RLX作用的重要方面是抑制炎性白细胞与内皮粘连和血小板聚集。该活性与NO^·生成的上调一起预防局部缺血/再灌注病症典型特征的ROS生成和趋化吸引。

因此，总体上，RLX实质影响子宫内膜的血液灌注和供应，维持其中理想的流动状态并发挥典型的抗炎和抗血栓形成作用。

雌激素对脂蛋白氧化的作用

要考虑的最后一个因素是雌激素对脂蛋白氧化的效应。在活体外或离体进行的大部分实验已经证明了E₂的抗氧化能力，并且其对脂质过氧化的效应类似于α-生育酚或β-胡萝卜素，但是以比其代谢物雌二醇和雌酮更清楚的方式。

实际上，进行的大部分实验[11-12]是通过使用比生理浓度高得多的浓度进行的，至少约1-10nmol/ml，分别对应于273ng/ml和2730ng/ml。当雌激素在月经中期达到峰值时勉强达到这些浓度并且仅持续有限的时段；为此，它们只能艰难地对LDL产生保护性抗氧化作用[13]。

然而，在绝经女性中进行的一个实验中，动脉内或以透皮贴片形式施用E₂(持续3周)已经清楚显示分别为11％和16％的LDL氧化延迟(增加的滞后时间或被Cu²⁺氧化的时间)，治疗中断时回到基线状态[12]。然而，依然保持强烈质疑：通过这两个施用途径获得的E₂水平实际上是生理水平，因为它们仅在一个点测定；技术人员只需考虑在其分布稳定之前动脉内施用获得的血液峰值。除此之外，没有发现这两个施用类型之间的LDL保护活性的差异，尽管水平上有明显差异(使用贴片高4至7倍)。

根据进行的各项研究得出以下结果：为了观察抗氧化效应(不考虑水平问题)，E₂应该与血浆接触，因为如果只是将它加入LDL，不会发现活性[11]。这种现象已经被解释为E₂需要被确定为LCAT(卵磷脂-胆固醇酰基转移酶)的血液成分活化，LCAT使E₂被脂肪酸酯化；只有在这些状态下，它才能发挥对脂蛋白的保护效应。酯化似乎发生在C17碳上，留下C3的羟基；该酯显示出被插入脂蛋白膜，亲水部分转向外表面且亲脂部分在膜内[14]。理论上，类似构型可以相应地通过氧化E₂酯而保护膜不被氧化，但这是否能足以保护LDL还不得而知。

因此从化学计量的观点评价了该问题。

绝经前女性的E₂-酯的水平几乎不可测量，并且在卵泡液中存在最高水平，浓度约0.1μmol/l[15]。所有这些意味着脂蛋白(LDL、HDL、VLDL)之间的比例很高，因为只有LDL在血液中的存在水平达到至少0.6μmol/l(2.6x10⁶的mw对应于1.6g/l)。因此，脂蛋白中E₂-酯的存在非常少(数千个脂蛋白中一个E₂-酯分子)，因此与直接的抗氧化作用相矛盾；LDL保护的可能机制可能只有酶促类型(脂蛋白中存在的抗氧化酶的活化，例如对氧磷酶、apoA、apoJ、GSHpx)，但目前不得而知。

论及E₂-酯的类型，从卵泡液分离的那些主要是不饱和的，即96％不饱和的(亚油酸酯、花生四烯酸酯、棕榈酸酯)，而仅4％是饱和的(硬脂酸酯)[15]。

假设E₂-酯是保持E₂作为储备可用的方式，因为其在绝经前女性的网膜脂质和皮下脂质中的存在相对恒定(约1pmol/g组织)，同时它们往往在绝经期间明显下降[16]。

关于其存在于脂蛋白上所做的考虑之一是，与游离雌激素不同，以这种方式，它们不能经由肾排除并且通过LDL受体途径被释放入细胞。因为其脂溶性，游离雌激素能够以较不可控的方式容易地穿过细胞膜。

因此，总体上，E₂-酯的战略意义无疑不是作为直接抗氧剂而起作用，而如果有的话，是间接抗氧化剂并且调节E₂释放以产生在需要时被活化的储备。用于形成类固醇激素的酯的机制及其在循环中以还是受保护的形式(脂蛋白)少量存在，不与白蛋白/球蛋白或SBP(类固醇结合蛋白)或CBG(皮质类固醇结合球蛋白)结合，是需要使用它们作为准备在需要时被利用的类固醇储备的证据。

E₂容易被氧化，而E₂-酯较不容易被氧化。

MPO(髓过氧化物酶)和H₂O₂(后者也由内皮细胞分泌)的存在诱导E₂的氧化，其表现为氧化以及诱导嗜中性粒细胞生成MPO的传播者[13]。

然而，E₂的氧化方面非常特别。

其行为似乎与身体活动期间出现的类似[17]；也就是说，LDL被氧化并更容易被肝受体从循环中摄取，并且保持受肌肉中抗氧化系统的控制和部分“抑制”。然而，如果抗氧化系统不足并且其水平增加，它们则经历血管摄取(内皮下)，这引发炎性动脉硬化的过程。事实上，它们将在内皮下膜中遭受MPO活性。

这说明了绝经前女性胆固醇和LDL减少的原因，被解释为更大的肝LDL受体效率而非LDL摄取增加，这是由于其处于部分氧化状态(应该注意，存在有效的最低氧化限值，超过该限值时引发巨噬细胞反应)。

这种几乎平衡的氧化平衡可以被描述为在正常雌激素-孕酮分泌的生理状态下(因此在正常月经周期期间)可平衡的，但是当使用避孕(CT)疗法时可朝着促氧化方向变化。

该现象是可以理解的，因为任何口服雌激素-黄体酮的施用产生两者的血液峰值(取决于CT类型)，不是生理大小的，并且因此“轻微且可控的”氧化变成OS。

现在已经证明了如下事实：该OS由氧化LDL的量增加、血液Cu水平增加或iNOs上调[1]或者由其组合而产生[1，2]。产生的问题是控制OS的问题，但是为了实现此目的，首先必须认识OS在正常状态下会发生什么，以在采用避孕疗法时采取减少应激的措施。

因此，迫切需要发现身体耐受良好并且能够减少归因于激素避孕药物治疗的氧化应激的有效疗法。因此，本发明的一个目的是提供这种疗法。

发明概述

该目的借助如权利要求1要求保护的抗氧化剂组合物来实现，所述抗氧化剂组合物包含硒酵母(seleniumyeast)、维生素B6、α-硫辛酸、辅酶Q10、β-胡萝卜素和儿茶素。

另一方面，本发明涉及所述组合物用于减少归因于激素避孕药物治疗的氧化应激的用途。

另一方面，本发明涉及用于施用所述组合物的药盒。

如将通过以下详述明显的，通过显示高身体耐受性的抗氧化剂组分的适当组合，本发明的组合物惊人地使正在经历激素避孕药物治疗的个体中的氧化应激能够被减少。

附图简述

根据以下详述、为示例而非限制目的给出的工作实施例和附图1，本发明的特征和优势将会是明显的，在图1中图解展示了月经周期的重要事件。

发明详述

因此，本发明涉及包含硒酵母、维生素B6、α-硫辛酸、辅酶Q10、β-胡萝卜素和儿茶素的抗氧化剂组合物。事实上，已经观察到，这些组分的组合惊人且有利地使与激素避孕药物使用相关的氧化应激能够被减少。该制剂有利地含有所有类型的抗氧化剂，即系统的(硒)、胞质的(维生素B6)、线粒体的(α-硫辛酸、辅酶Q10)、膜的(β-胡萝卜素)、循环的(儿茶素)。

儿茶素是属于类黄酮组的抗氧化性植物衍生代谢物。它们存在于许多植物物种中，但是人类饮食中最重要的来源是源自茶植物茶树(Camelliasinensis)的各种茶。干燥的茶叶实际上含有大约25％重量的儿茶素，但总含量可能根据植物类型、生长地点、光照差异、季节和海拔而显著变化。具体地，儿茶素存在于所有类型的茶中，包括白茶、绿茶、黑茶和乌龙茶，但是也存在于巧克力、水果、蔬菜、葡萄酒和许多其他植物物种中。根据本发明的一个优选实施方案，所述儿茶素源自绿茶提取物。

优选地，基于组合物重量，所述抗氧化剂组合物包含8-16％重量的硒酵母、0.5-5％重量的维生素B6、1-10％重量的α-硫辛酸、1-10％重量的辅酶Q10、0.05-0.5％重量的β-胡萝卜素和40-60％重量的儿茶素提取物。该优选的组合发挥全面且协同的抗氧化作用。具体地，在所述比例中，认为主要的抗氧化作用归因于循环抗氧化剂。

更优选地，基于组合物重量，所述抗氧化剂组合物包含10-14％重量的硒酵母、1-3％重量的维生素B6、3.5-6％重量的α-硫辛酸、3.5-6％重量的辅酶Q10、0.1-0.3％重量的β-胡萝卜素和42-51％重量的儿茶素。在这种情况下，以这些范围的抗氧化剂组合能够使“非循环”抗氧化剂类别更广泛地表现，并且因此在一段时间内适宜更长久的作用。

甚至更优选地，基于组合物重量，所述抗氧化剂组合物包含12-13％重量的硒酵母、1.1-2％重量的维生素B6、4-5.5％重量的α-硫辛酸、4-5.5％重量的辅酶Q10、0.2-0.3％重量的β-胡萝卜素和45-48％重量的儿茶素。在这种情况下，除了时间上更长的持续时间以外，还存在由系统抗氧化剂、细胞抗氧化剂、线粒体抗氧化剂、膜抗氧化剂和循环抗氧化剂(例如儿茶素)之间理想比例所提供的更有效的作用。

具体地，所述儿茶素是没食子酸表没食子儿茶精(EGCG)、表没食子儿茶精(EGC)、没食子酸表儿茶素(ECG)和表儿茶素(EC)。根据另一个优选实施方案，儿茶素重量的至少35％重量是EGCG。除了表现出良好的抗氧化活性外，儿茶素还表现了良好的生物利用度，特别是EGCG能够在主要器官(心、脑、肝、子宫等)中达到约8-10％血液水平的组织水平。

根据另一个优选实施方案，维生素B6是吡哆素或其盐。更优选地，它是盐酸吡哆素。

另一方面，本发明涉及用作药剂的抗氧化剂组合物。具体地，所述抗氧化剂组合物用于减少归因于激素避孕药物治疗的氧化应激。如事实上将根据随后工作实施例所看到的，本发明组合物已经显示出源于各种组分适当组合的惊人的协同效应，相反地，所述组分单独地没有表现出任何效力。

优选地，所述抗氧化剂组合物将被口服施用。

优选地，本发明的抗氧化剂组合物是包含15.8-31.5mg的硒酵母、1-9.5mg的维生素B6、2-19mg的α-硫辛酸、2-19mg的辅酶Q10、0.1-0.95mg的β-胡萝卜素和80-110mg的儿茶素的单位剂量形式的形式。

更优选地，所述单位剂量包含20-27.5mg的硒酵母、2-5.5mg的维生素B6、7-11.8mg的α-硫辛酸、7-11.8mg的辅酶Q10、0.2-0.59mg的β-胡萝卜素和85-95mg的儿茶素。

根据一个优选的实施方案，所述单位剂量包含24mg的硒酵母、2.44mg的维生素B6、10mg的α-硫辛酸、10mg的辅酶Q10、0.5mg的β-胡萝卜素和90mg的儿茶素，其中约40％是EGCG。

另一方面，本发明涉及药盒，包含：

i)包含硒酵母、维生素B6、α-硫辛酸、辅酶Q10和β-胡萝卜素的至少一种抗氧化剂组合物；和

ii)包含儿茶素的至少一种水溶液，

用于单独、按顺序或同时施用如上所述的抗氧化剂组合物。

优选地，在所述药盒中，所述抗氧化剂组合物是粉末形式以改善其经时间的保存。

应该理解，如上所述被确认为对抗氧化剂组合物优选和有利的所有方面也相应地被认为是对本发明药盒优选和有利的。

根据一个优选实施方案，粉末在施用时被所述溶液溶解。而且，所述溶液优选是去咖啡因的绿茶。

为了示例说明而非限制目的，本文下面提供了本发明的工作实施例。

实施例

实施例1.

通过BAP测试(生物抗氧化能力)来测定本发明组合物的抗氧化能力选择10名月经正常的女性自愿者。下面给出了自愿者的一般特征：

特征	平均值±SD*
		年龄(岁)	28.2±3.91
体重(kg)	61.4±3.78
		身高(m)	1.66±0.04
体重指数(BMI kg/m²)	22.5±2.01

*SD＝标准偏差

如表1所示制备了以下组合物。

表1.本发明组合物

要求健康自愿者服用不同剂量的、上述制备的那些组合物中的三种不同的组合物，即1A、1B、1C，目的是确定在经时间的活性和持续时间方面最有效的组合。

通过BAP测试分析并测试了这三种组合物的活性。

儿茶素以绿茶提取物的形式提供，其中所述儿茶素是约60％重量。

在这三种组合物中，从1A到1C，儿茶素和吡哆素(以盐酸盐形式)的量逐渐减少，并且α-硫辛酸、β-胡萝卜素、硒和辅酶10的量同时增加。换言之，在从A至C的各种组合物中，可溶性抗氧化剂的量减少，脂溶性抗氧化剂的量增加。

在月经开始之后第三天开始，在其周期结束时，连续三天给自愿者施用全部三种组合物。

在此期间，不允许其他疗法。在上午进行实验，从前一天晚上开始禁食并且在7.00至13.00的时段只允许喝水。

总是以A、B、C的顺序进行组合物的施用。通过使用在肝素化微型管中收集的手指刺血(0.15-0.2ml血液)进行BAP测试(由DiacronSrl，Grosseto，Italy销售)；进行四次收集：基线，以及每种组合物施用后1小时、3小时和5小时(分别是T1、T2、T3)。

基于t检验和正交对比的方差分析(ANOVA)计算值间差异。结果提供于表2。

表2.用三种不同的本发明组合物治疗后各个观察时间的BAP值。平均值±SD(标准偏差)。

^a＝相依数据的t检验；T_n对比基线p＜0.05

从数据可以发现，全部三种组合物有利地显著增加了血浆的抗氧化能力；组合物1B和1C额外提供了比组合物1A更持久的作用；在1小时后，组合物1C出人意料地显示了比其他组合物显著更好的作用。

根据观察，由此显示全部组合物具有明显的抗氧化能力，并且因此是可生物利用的，组合物1C具有明显效力并且显示了随时间更可观和持久的作用。

实施例2.

正常月经周期期间氧化应激(OS)的测定

为该测试选择了20名月经正常的女性自愿者。它们是明显健康的自愿者，没有处于任何疗法，并且大部分是未经产的(20名中14名)。使用食物补充剂的任何疗法被认为是排除标准。

使用d-ROMs测试分析月经周期(周期A)期间的OS[18]，d-ROMs测试能够评价血液(血浆或血清)中的氢过氧化物，其可以在手指刺血之后在肝素化微型管中收集的血液(0.15-0.2ml)中检测。该测试可以从月经结束后第一天开始进行，然后在第三天和随后每三天(指示为t₁、t₃、t_n...、t₂₇)，直至月经完全停止。以这种方式测定了OS随时间的进展。

在前10名自愿者中，方案还要求评价在时间t₆、t₉、t₁₂、t₁₅、t₁₈、t₂₁的E₂水平，以及在t₁₂、t₁₈、t₂₁的Pg水平，以确定OS与月经周期的分泌期和黄体期的关联。

使用已知的试剂盒(雌二醇：目录号KE2D1；孕酮：TKPG1；InterMedicoMarkham，Ontario-Canada)测定E₂和Pg。E₂和Pg的检测限分别是5pg/mL和0.1ng/mL，E₂的变异系数是13.1％和Pg的变异系数是6.5％。从臂静脉收集血液进入肝素化测试管(2个5ml小份)。

下面给出了自愿者的一般特征：

特征	平均值±SD
		年龄(岁)	30.8±5.66
体重(kg)	63.2±6.66
		身高(m)	1.67±0.07
体重指数(BMI kg/m²)	22.6±1.58

全部的血液收集在上午8至9.30之间进行，从测试前一天晚上开始禁食，在同一天测定分析物。自愿者被告知避免在实验测试前一天吃过量食物。d-ROMs测试结果和E₂和Pg的水平的值汇集在表3。

表3.健康自愿者中各个时间的d-ROMs测试、E₂、Pg的值(平均值±SD)

^a相依数据的t检验，p＜0.05t_n对比t₁；

^b相依数据的t检验，p＜0.05t_n对比t₆；

^c相依数据的t检验，p＜0.05t₁₂对比t_n

通过检验数据推断，OS在t₆和t₂₄之间产生，并且在t₂₇时，水平落入周期开始时的基线值内。伴随的最大增加对应于相对于雌激素峰的3至6天延迟。

Pg水平的升高似乎在达到其血液峰值时(t₂₁)具有减少OS的效应，但是之前没有。

应该注意，就d-ROMs测试而言，真正的OS通常由值＞300CARR.U来定义。如通过平均值可推导的，从t₁₂至t₂₄，CARR.U.相对于周期开始时值的升高达到OS状态。

没有观察到E₂和d-ROMs测试水平之间的关联；这指示，增加的系统氧化状态不是由E₂单独引起的，还有在所述实验条件中不能被鉴定的其他因素(指LH、FSH、松弛肽等的水平)。

在任何情况下，证实了如下明确的观察：在真正的雌激素期，发现系统氧化值升高，然后随着孕酮增加而降低。

实施例3.

在与两种不同类型的抗氧化剂产品共治疗之后，避孕药(CT)对OS水平和OS变化的活性的评价

为该测试选择了10名月经正常的、明显健康的(为实施例2选择的那些的一部分)和未处于任何疗法的女性自愿者。自愿者的一般特征与实施例2相同。

对于整个测试期，自愿者每三天在上午8.00和9.30之间到达中心，从前一天晚上开始禁食。用于d-ROMs测试评价的血液从手指抽取并以0.1-0.2ml的量收集在含有肝素的微型管中(10μl血浆足以进行d-ROMs测试分析)。

分析总是在与收集同一天进行。在血液收集后即刻分配标准早餐。除了在收集前一天晚上避免吃过多食物，在其他方面没有提出其他限制。

检测自愿者的整个月经周期，血液检查在月经周期开始时(t₁)开始进行，然后在第三天，然后在月经期期间的每三天，直至t₂₇。将该时期鉴定为周期B。

结果汇集于表4。

表4.健康自愿者中各个时间的d-ROMs测试值(平均值±SD)

*＝相依数据的t检验；t_n对比t₁p＜0.05，其中n＝6、9、12、15、18

即使在这一系列数据中，可以发现作为氧化状态指数的氢过氧化物水平(依据CARR.U.)从6天后(t₆)的血液检查后增加，并且维持这样直至第t₁₈天。

该数据略微不同于实施例2中获得的那些数据(d-ROMs测试的峰值水平更低)，但是证实OS在卵子成熟期的雌激素峰期间出现，仅在真正的孕酮期(组合的雌激素和孕酮)期间减少，直至出现随后的月经。

还从这些数据得出以下结论：在雌激素期期间，受控的OS状态被引发，即，氢过氧化物生成增加，这是氧化增加的指数，其有时超过了OS的正常水平。实际上，利用d-ROMs测试，将OS状态确定为值＞300CARR.U.，这在本实验条件下仅偶尔发现。

通过分析个体案例，可以发现，在t₉和t₁₅之间获得了d-ROM测试值的最高增加，即，在E₂增加时(因此，一般略先于FSH和LH的生理峰；参见图1)。直到t₂₁才达到高水平的事实表明，伴随的孕酮增加不能实质上改变氧化状态，它趋于只有在两种激素水平都下降后消失。

然后，相同的自愿者接着进行两个28天的激素避孕药(CT)治疗周期，使用50μg乙炔基雌二醇结合125μg左炔诺孕酮(21天治疗和7天休息)。

在第二周期(周期C)期间，她们再次接受连续的氢过氧化物测试，在与之前周期A和B相同的时间，使用相同的收集方法和相同的健康和卫生方案。

d-ROMs测试结果提供于表5。

表5.在健康志愿者中进行用的CT治疗28天后的d-ROMs测试值(平均值±SD)

*＝相依数据的t检验，周期A的t_n对比周期B的t_np＜0.05

通过检查数据，平均d-ROMs值的大幅增加是明显的，高于正常值(前述为＜300U.CARR.)，这是甚至在CT疗法第三天后开始的OS存在的证据。

在t₃和t₂₁之间(CT丸剂服用的时间)分析的所有案例明显高于正常水平。考虑到CT在第t₂₁天被替换为无活性丸剂的事实，在三天暂停之后(t₂₄)可检测到OS状态的恢复并且在t₂₇结束是符合逻辑的。在t₂₇，没有一个自愿者实际上处于OS状态。

如果将这些数据与周期B(无CT疗法)的数据相比，显然从t₃至t₂₄的值显著更高。这清楚显示了用这种激素避孕药物治疗是OS的起源。

到再次基于50μg乙炔基雌二醇联合125μg左炔诺孕酮(21个治疗日和7个休息日)的第四个连续治疗周期(周期D)，则增加了已知为AR_D (AO_St)的具有公认且证实的抗氧化活性的制剂的每日施用。

该制剂包含具有抗氧化活性的化合物，如本测试中使用的其配方在表6中给出。

在之前实验中，当施用给双盲对照实验中的健康自愿者[19]和患有外周动脉病的患者[18]时，基于d-ROMs测试测定，显示该制剂具有抗氧化作用。

表6.抗氧化剂制剂组合物(AO_St).

成分	量(mg)
		硒酵母，0.2％	24.00
经保护的维生素C，97.5％	30.77
		来自柑橘的生物类黄酮，浓度40％	75.00
吡酮酸锌(Zinc pidolate)	25.00
		辅酶Q10	10.00
盐酸L-半胱氨酸	12.61
		乙酸维生素E，浓度50％	32.91
盐酸吡哆素	1.22
		乙酸维生素A，50000IU/g	0.7
β-胡萝卜素，10％	0.5

事实上，该抗氧化剂制剂(AO_St)包含全部四个类型的抗氧化剂，即膜抗氧化剂(维生素E和β-胡萝卜素)、循环抗氧化剂(维生素CL-生物类黄酮)、细胞抗氧化剂(辅酶Q和吡哆素)和系统抗氧化剂(硒和L-半胱氨酸)，系统抗氧化剂是GSH和GSHpx(分别是谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶)的组分。

在自愿者中，在与CT丸剂的同时以10ml双相瓶形式施用AO_St(在施用点混合)。该周期(周期D)的实验方法与之前周期B和C的那些相同。

连续的血液氢过氧化物值的结果提供于表7。

表7.在健康志愿者中用联合AO_St的CT治疗(持续28天)后的d-ROMs测试值(平均值±SD)

^ap＜0.05，相依数据的t检验，t₁对比t_n

如可以从各个测量时间的平均值所看到的，已经证实能够在两种性别的健康自愿者中减少d-ROMs测试值的AO_St治疗[19]出人意料地不能以任何方式作用于源自激素避孕药物(CT)治疗的OS。

因此，可以根据结果推断，源自CT疗法的OS通过更特别的机制产生，例如尽管施用证实的抗氧化剂制剂仍维持其实际上不变。

在其中自愿者继续只用同样的CT治疗的随后的洗出(wash-out)周期之后，她们经历了与具体在表8给出的本发明抗氧化剂组合物(AO_inv)联合的又一个CT周期(周期E)。

表8.本发明的抗氧化剂组合物(AO_inv)

	量(mg)
		硒酵母*	24.00
盐酸吡哆素	2.44
		α-硫辛酸	10.00
辅酶Q10	10.00
		β-胡萝卜素，10％	0.5
儿茶素，40％是EGCG	90.00

*硒酵母经滴定为0.2％的有机硒

儿茶素以绿茶提取物的形式提供，其中所述儿茶素是60％重量。

在与CT丸剂相同的时间施用AO_inv组合物。所述组合物是药盒形式，即粉末和10ml其中溶解了儿茶素的去咖啡因绿茶水溶液在待服用时混合在一起。该测试的收集方法和卫生与健康建议与之前测试的那些相同。

用本发明组合物治疗的结果提供于表9。

表9.CT(持续28天)和AO_inv联合治疗27天后的d-ROMs测试值(平均值±SD)

^a相依数据的t检验，p＜0.05，t_n对比t₁

^b相依数据的t检验，p＜0.05，表8的t_n对比表9的t_n

除了时间t₁和t₂₇，所有d-ROMs测试值显著低于使用单独避孕药物治疗所获得的那些值；即，与组合物AO_inv的同时治疗显示在其中使用了激素避孕药物的周期的所有时期出乎意料惊人地且显著有效地减少OS。

当考虑使用测定OS状态的相同类型测试，发现具有经证实和记载的效力的抗氧化剂产品的使用根本不令人满意时，这些结果甚至是更惊人的。

实施例4.

AO_inv显示的协同效应与单独儿茶素作用相比较的评价

为该测试选择了64名明显健康的月经正常的自愿者，全部以含有30μg乙炔基雌二醇和3mg屈螺酮的低剂量C避孕药治疗至少6个月，然后将她们分成两组：对照组和治疗组。

所有自愿者的选择标准排除伴随的长期疗法、绝经前病症、任何类型食物补充剂的使用、吸烟和烈性酒精饮料的使用、茶的过度饮用(＞750ml/天)、巧克力的过度食用(＞50g/天)和BMI＞25。最后一次怀孕必须在本测试前不少于两年。

对照组处于与控制茶饮用相关的CT方案；治疗组处于用相同CT同时使用表6给出的AO_inv组合物的方案。

根据生产商建议的标准程序采用CT的对照组(33例；平均年龄35.9±6.71岁)在三个准确时刻接受监测OS的分析：

-用于选择的第一次测定，其目的是测定CT是否已产生了OS；

-评价OS基线值的第二次测定；

-用C疗法8周之后的第三次评价。

作为实验方案的组成部分，要求所述对照组在上午饮用两杯150ml的茶；一杯在早餐，另一杯整个上午期间。此外，要求在整天中不饮用额外的茶。

茶的类型对于所有自愿者是相同的，因为提供茶的目的是用于实验研究(3盒，每盒50个茶包)。

茶中含有的儿茶素[21，23，24]提供于表10。

表10.向对照组供应的茶中的儿茶素含量

儿茶素类型	mg/杯	总计mg/天
			EGCG	21.9	43.8
EGC	9.3	18.6
			ECG	28.7	57.4
EC	10.0	20.0
			总计	69.9	139.8

饮用至少两杯茶的要求源自如下的选择：施用比用AO_inv组合物治疗的自愿者明确更高的量的儿茶素。以提出的量施用茶能够使血液中儿茶素水平和相对抗氧化能力[21]增加。

治疗组的自愿者(31例；平均年龄36±8.22岁)遵循相同的CT疗法和OS监测的方案，但是在基础检查之后(选择时的检查之后)，她们还接受连续的AO_inv治疗，持续连续8周，之后再次检查OS。要求该组避免饮用茶，或者最多将其限制在不超过1杯/天(150ml)的量，并且在8周研究期内避免食用巧克力。

根据BAP方法(生物抗氧化能力)[25]评价AO能力，来测定分配给两组自愿者的茶的体外抗氧化作用。为了进行该测试，通过用150ml沸水浸泡茶包5分钟来制备茶汤。也用沸水将重构的AO_inv(溶解于10ml水溶液的粉末)的管形瓶加至150ml。在其制备后10分钟测定BAP。比较在不同时间制成的6个茶制剂，并一式两份进行评价，还一式两份评价6个AO_inv制剂。

体外结果显示，茶的抗氧化能力比AO_inv组合物更有效；即，分别地，茶汤的维生素C是3702±347.3μmol/l，而AO_inv的维生素C是3121±136.8μmol/l(p＜0.05，独立数据t检验)。

在实验期间，允许所有自愿者在一天中根据其习惯饮用咖啡。所有自愿者在上午8.00和9.30之间到场来进行测试，从前一天晚上开始禁食。她们还被告知避免在血液测试前一晚过量进食，血液测试根据实施例2给出的方法进行。

如所述的，评价OS的方案由三个对照组成；用于选择的对照，基线测量，和8周后的测量。

对于所有案例的任何一个，测量被定时为不在即将月经的日子进行。测量结果提供于表11。

从提供的数据可以发现，所有自愿者(对照组和治疗组)在观察期开始时处于OS状态。没有自愿者实际上具有被认为是正常的d-ROMs测试值，即＜300Carr.U.，进一步证实含有低剂量雌激素的激素避孕药物也引起OS。

表11.

在8周时段之前和之后，在避孕药与茶或与AO_inv的联合治疗之前和之后，健康自愿者中的d-ROMs测试值(平均值±SD)

p＜0.05，相依数据的t检验，对照对比治疗

在8周时段结束时，注意到AO_inv治疗组的d-ROMs测试值显著低于对照组，高百分比的案例在正常值内(75％)。

这在对照组中没有发生，尽管这些自愿者饮用了更大量儿茶素(通过计数使用的茶包，有98％服从)。

而且，发现在研究的两组中咖啡的饮用几乎相同：对照组平均1.1杯/天，治疗组1.2杯/天。平均而言，AO_inv治疗组的自愿者的茶饮用可忽略(0.1杯/天)。

这些结果是惊人的，因为它们说明，在即使是低剂量的激素避孕药物CT治疗方案期间，发挥OS限制作用的不是儿茶素，因为尽管以比AO_inv中含有的量更高的量施用儿茶素，仍然发现它不能对OS起作用。

于是，这惊人的结果归因于本发明的抗氧化剂组合物，该组合物通过适当联合具有儿茶素作用的特定组分，产生能够使OS显著减少的意想不到的协同效应。考虑如上所报道的，与单独的绿茶相比，体外抗氧化能力的评价不鼓励使用本发明组合物时，这些结果甚至是更惊人和意想不到的。

还应该注意，这种显著减少有利地导致以下事件频率的明显降低：浅表血栓发作(superficialthromboticepisode)以及归因于作为OS源的激素避孕药物的使用的所有那些心血管事件。

实施例5.

相对于单独组分(即没有儿茶素)的作用来评价AO_inv显示的协同效应

该测试对18名自愿者(实施例3的案例的一部分)进行。测试目的是确认AO_inv中含有的抗氧化剂在没有绿茶提取物的情况下是否依然有效减少由使用激素避孕药物产生的OS。

因此，形成了三组自愿者[A、B、C]，每组包括6名受试者，根据年龄、体重和身高来选择，使得所有三组尽可能平均。除了避孕的自愿者以外，所有自愿者从每次治疗经历一个月的洗出。自愿者特征显示如下：

特征*	组A	组B	组C

年龄(岁)	30.8±3.43	32.7±4.27	31.8±5.81
				体重(kg)	63.3±5.39	62.5±2.66	63.3±2.25
身高(m)	1.69±0.06	1.68±0.03	1.66±0.04
				体重指数(BMI kg/m²)	23.4±1.40	22.1±1.52	23.0±1.30

*所有的一般变量通过ANOVA分析，并且发现各组没有显著差异(p＞0.05)。

三组自愿者如下治疗：

-组A经历每天的AO_inv治疗；

-组B根据实施例4给出的方法每天用绿茶治疗(在上午饮用两杯绿茶，每杯150ml；同样，一杯在早餐，另一杯在上午。此外，要求避免在一天中饮用任何其他茶)；

-组C用表12给出的抗氧化剂组合物治疗，该抗氧化剂组合物对应于没有儿茶素的组合物AO_inv。最后这一组被要求在整个测试持续期间不饮用茶。

表12.向组C施用8周的AO组合物

成分	量(mg)
		硒酵母，浓度0.2％	24.00
盐酸吡哆素	2.44
		α-硫辛酸	10.00
辅酶Q10	10.00
		β-胡萝卜素10％	0.5

治疗开始于正在进行的避孕药疗法，并且无间断地持续8周。测试期间，允许所有自愿者根据其习惯在白天的时间中饮用咖啡。如果习惯，也允许组C自愿者饮用咖啡(条件是不用咖啡替代茶)。

在服用抗氧化剂制剂之前和服用8周之后，采集d-ROMs测试值。

所有自愿者在上午8.00和9.30之间到场来进行血液检查，从前一天晚上开始禁食。她们被告知避免在血液测试前一晚过量进食，血液测试根据实施例2给出的方法进行。

结果提供于表13。

表13.用抗氧化剂制剂治疗之前和之后，组A、B和C的自愿者的d-ROMs测试值。平均值±SD。

数据检验清楚显示，用单独抗氧化剂(组C)或单独儿茶素(组B，实施例4)制剂的治疗根本不能影响OS。因此显示，组合物AO_inv在减少源自激素避孕药物治疗的OS中的显著有效性是将儿茶素与适合的抗氧化剂组分组合而产生意想不到且惊人的协同效应的结果。

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Claims

1.用于减少归因于激素避孕药物治疗的氧化应激的抗氧化剂组合物，所述抗氧化剂组合物包含硒酵母、维生素B6、α-硫辛酸、辅酶Q10、β-胡萝卜素和儿茶素，其中所述抗氧化剂组合物是单位剂量形式，其中一个单位剂量包含15.8-31.5mg的硒酵母、1-9.5mg的维生素B6、2-19mg的α-硫辛酸、2-19mg的辅酶Q10、0.1-0.95mg的β-胡萝卜素和80-110mg的儿茶素。

2.如权利要求1所述的抗氧化剂组合物，其中所述儿茶素是没食子酸表没食子儿茶精(EGCG)、表没食子儿茶精(EGC)、没食子酸表儿茶素(ECG)和表儿茶素(EC)。

3.如权利要求2所述的抗氧化剂组合物，其中以所述儿茶素重量计，至少35%重量是没食子酸表没食子儿茶精(EGCG)。

4.如权利要求1所述的抗氧化剂组合物，其中所述儿茶素是绿茶提取物的形式。

5.如权利要求1所述的抗氧化剂组合物，其中所述维生素B6是吡哆素或其盐。

6.一种药剂，包含权利要求1所述的抗氧化剂组合物。

7.权利要求1所述的抗氧化剂组合物用于制备用于减少处于避孕疗法下的健康女性中归因于激素避孕药物治疗的氧化应激的药剂的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其中一个单位剂量包含20-27.5mg的硒酵母、2-5.5mg的维生素B6、7-11.8mg的α-硫辛酸、7-11.8mg的辅酶Q10、0.2-0.59mg的β-胡萝卜素和85-95mg的儿茶素。

9.如权利要求8所述的用途，其中一个单位剂量包含24mg的硒酵母、2.44mg的维生素B6、10mg的α-硫辛酸、10mg的辅酶Q10、0.5mg的β-胡萝卜素和90mg的儿茶素，其中以所述儿茶素重量计，40%重量是没食子酸表没食子儿茶精(EGCG)。