CN102818892B

CN102818892B - 一种前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN102818892B
Application number: CN201210291449.9A
Authority: CN
Inventors: 谢兵
Original assignee: BEIJING ENJIHE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Hongji Polytron Technologies Inc. and biological; Lepu (Beijing) Diagnostic Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-08-16
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2032-08-16
Also published as: CN102818892A

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种游离前列腺特异性抗原（fPSA）化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒包括：抗-FITC抗体包被的固相载体、FITC标记的anti-PSA抗体、酶标记的anti-fPSA抗体、上述酶所作用的化学发光底物、以及阴性和阳性对照液。制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以抗-FITC抗体包被的固相载体；2)用FITC标记anti-PSA抗体，获得FITC标记的anti-PSA抗体；3)用酶标记anti-fPSA抗体，获得酶标记的anti-fPSA抗体；4)分装和组装。本发明的试剂盒成本低、灵敏度高，与已有的化学发光免疫分析检测方法相比，可以提高分析的灵敏度，重现性，减少使用抗体的量。

Description

一种前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种前列腺特异性抗原的化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

随着我国人口老龄化、饮食结构和环境因素的变化，以及医疗保健水平的提高，前列腺癌的发病率呈逐年增高趋势，已跃居男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤的第3位。前列腺癌早期一般无明显症状，一旦发现往往出现在晚期，错失了最佳治疗时机，因此，需要有敏感的早期诊断方法。

前列腺特异性抗原（PSA, prostate specific antigen），是目前临床上诊断前列腺癌最敏感的肿瘤标志物,已被公认为前列腺癌检测和评估的重要指标，具有很高的灵敏度。PSA是一种含有237个氨基酸的单链多肽, 属于具有组织特异性的有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶。在血清中主要以游离PSA和结合态PSA存在，游离态称为fPSA，结合态称为（tPSA)；PSA具有组织特异性，但它并无肿瘤特异性。在大多数有临床意义的前列腺癌中，PSA都会升高，但良性前列腺增生和前列腺炎也会出现PSA阳性的结果。目前，血清中PSA水平在4-10 μg/L之间为前列腺癌的灰色诊断区。在诊断灰色区，前列腺癌（PCa）与良性前列腺增生（BPH）和前列腺炎有较大的重叠区域。随着对前列腺疾病和PSA研究的不断深入，发现PCa病人血清中，绝大部分PSA为结合状态，f-PSA浓度水平与BPH病人以及正常人相比，明显偏低。因此，解决该问题的一个方法就是检测游离前列腺特异性抗原，并引入新的临床指标-游离前列腺特异抗原百分率。这对于提高筛查和诊断灰色区域的PCa的特异性，降低临床检验筛查的假阳性率具有重要的意义。

目前检测fPSA的方法有很多，其中以抗体-抗原特异性反应为基础的标记免疫分析技术，如放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等，由于具有操作简单、快速、适合大量样品的筛选和检测等优点，是目前临床上通用的初筛检测方法。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，它们的共同特点是灵敏度好、特异性强；不同之处是所用示踪剂及所发出的信号各异。根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为：化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等，荧光免疫分析和酶免疫分析尽管克服了放射性污染的问题，但其灵敏度受到了限制。由此发展起来的灵敏度高的化学发光免疫分析愈来愈受到人们的青睐。

化学发光免疫分析方法在检测f-PSA的原理上大多应用的是双抗体夹心法，它是将 PSA抗体通过物理吸附的方法直接包被在固相载体，然后通过洗涤除去未结合上去的分析物或样品基质。这种直接包被方法会对分析参数有一些影响：(1) 抗原通过物理吸附作用直接包被在固相上，会引起抗原在固相上结合的不均一性，因此，重现性差，温育时间长；(2) 与在液相中抗原-抗体的结合反应不同，包被在固相上的蛋白(抗体或抗原)，其结合位点更不易被接近，因此会导致蛋白的免疫活性部分失活，有时活性甚至只达到包被蛋白量的10%左右；(3) 结合到固相上抗原的量不仅与抗原自身的性质诸如疏水性、等电点等有关，还受抗原溶液的配制及保存等外在条件的影响。而本发明采用抗-FITC抗体与FITC标记的HIV抗原将HIV抗原结合到固相载体上，从而克服了物理吸附法直接包被HIV抗原的许多缺点。

另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒大部分为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法有效广泛地应用于临床诊断和科研工作。

发明内容

为了解决上述问题提出并完成了本发明。具体地，本发明解决了现有技术中的诊断试剂盒均一性、重现性差等问题。

本发明的目的是提供一种游离前列腺特异性抗原（fPSA）化学发光免疫分析诊断试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的fPSA诊断试剂盒包括以下组分：

1)抗-FITC抗体包被的固相载体；

2)FITC标记的anti-PSA抗体；

3)酶标记的anti-fPSA抗体；

4)上述酶所作用的化学发光底物；以及

5)系列浓度的标准品。

其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。上述酶所作用的化学发光底物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2^′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP- Star、鲁米诺或异鲁米诺。

本发明还提供了一种制备上述试剂盒的方法，该方法包括以下步骤：

1)以抗-FITC抗体包被的固相载体；

2)用FITC标记anti-PSA抗体，获得FITC标记的anti-PSA抗体；

3)用酶标记anti-fPSA抗体，获得酶标记的anti-fPSA抗体；

4)分装上述获得的FITC标记的anti-PSA抗体、酶标记的anti-fPSA抗体、该酶所作用的化学发光底物、系列浓度的标准品；以及

5)组装为成品。

其中，通过以下方法用抗-FITC抗体包被的固相载体：

1)将包被用抗-FITC抗体加到pH=4.4~5.0、优选4.8的柠檬酸盐缓冲溶液中混匀，用所得混合液包被固相载体；

2)洗涤步骤1)中包被的固相载体；以及

3)使用牛血清白蛋白封闭经洗涤的固相载体。

根据本发明的方法，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。该酶所作用的化学发光底物可以为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2^′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP- Star、鲁米诺或异鲁米诺。

本发明的试剂盒可以采用如下具体形式，其包括抗-FITC抗体包被的96孔或48孔不透明微孔板、FITC标记的anti-PSA抗体、辣根过氧化物酶标记的anti-fPSA抗体、系列浓度标准品、校准品基质血清为灭活的小牛血清、20倍浓缩洗涤液为含有0.05%吐温-20的0.02M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）、化学发光底物A、B液分别为鲁米诺溶液、过氧化氢及其特效增强剂(对碘苯酚)溶液，各1瓶。

根据本发明，当使用二抗体系如FITC与抗-FITC抗体体系固定蛋白时，固定抗原蛋白的免疫活性在很大程度上可以得到保存。一个抗-FITC抗体分子也可以结合3~4个FITC分子，并且特异性和亲和力都很强。两者一经结合就极为稳定。FITC-抗-FITC抗体系统作为固相时，在固相上先预包被抗－FITC抗体，通过FITC-抗-FITC抗体反应而使FITC标记的PSA抗体固相化。这种包被方法不仅可增加固相载体上的抗原量，而且还可以使抗原上的结合点充分暴露。因此，使用二抗体系作为固相，不但会提高分析的灵敏度，均一性和重现性，还可以减少PSA抗体的使用量。并且抗-FITC抗体的包被微孔板可以作为统一的固相载体应用于许多分析检测对象。

根据本发明的试剂盒采用二抗体系作为固相载体，双抗体夹心模式原理，高灵敏度的鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶及其增强剂的化学发光体系作为信号检测体系，建立了一种高灵敏、低成本的二抗固相化学发光免疫分析方法，并制备成测定血液或血浆中游离前列腺特异性抗原（fPSA）的诊断试剂盒，与ELISA检测试剂盒相比，灵敏度提高了约100倍；与已有的化学发光免疫分析检测方法相比，可以提高分析的灵敏度，均一性和重现性，减少PSA抗体的使用量。这种检测方法具有很高的灵敏度，比传统的酶联法检测可提前数天诊断，对前列腺癌的早期诊断，提早进行干预治疗有十分重要的意义。使用本发明的试剂盒降低了成本，也使人们有限的健康投资得到更有效的利用。

具体实施方式

下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。

实施例1 制备本发明的fPSA化学发光诊断试剂盒

本发明的fPSA诊断试剂盒包括：

1)抗-FITC抗体预包被的96孔或48孔发光微孔板；

2)FITC标记的anti-PSA抗体；

3)辣根过氧化物酶标记的anti-fPSA抗体；

4)系列浓度的标准品；

5)样品稀释液为灭活的小牛血清；

6)20倍浓缩洗涤液为含有0.05%吐温-20的0.02M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）；

7)化学发光底物A、B液分别为鲁米诺溶液、过氧化氢及特效增强剂(对碘苯酚)溶液。

通过以下方法制备上述试剂盒：

1、将包被用抗-FITC抗体加到柠檬酸盐缓冲溶液(pH=4.8)中混匀，加至发光微孔板孔中，每孔100 μL，4 ℃放置15 h包被。用洗涤液洗涤五次之后，使用牛

血清白蛋白(BSA)溶液室温封闭2小时。弃去孔内液体，干燥酶标板，密封，即完成预包被酶联板的制备。

2、用直接标记法将FITC与PSA抗体进行标记，即得FITC标记的PSA抗体。

直接标记法具体步骤如下：

(Ⅰ)A 液：取PSA抗体1 mg 置50 mM pH 9.3 的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中4 ℃透析24 h，最后体积控制在200 μl 之内；

(Ⅱ)B 液：取FITC (北京欣经科生物技术公司) 2 mg 溶于1 ml 50 mM pH 9.3 的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中；

(Ⅲ)将A液置于磁力搅拌器，取B液25μl 缓缓滴加至A液中，约在5-8分钟间加完，防止出现气泡，然后置4 ℃搅拌12-16小时；

(Ⅳ)将反应液取出于10000转/分的速度离心20分钟。除去微量沉淀物，上清液装透析袋，置10 mM pH =7.4 的PBS溶液中透析4天，每天更换透析液2次；

(Ⅴ)离心去沉淀物，将标记物稀释至1 ml，加入适量NaN₃ , 分装，– 20 ℃ 下保存。

3、利用改良的过碘酸钠法，将标记用fPSA抗体与辣根过氧化物酶结合在一起，即得辣根过氧化物酶标记的f-PSA抗体标记物。

改良的过碘酸钠法的具体步骤如下：

(Ι)称取2mgHRP溶于1ml双蒸水中；

(Ⅱ)加入200μl新配置的0.1mol/L的NaIO₄溶液，室温中轻轻搅拌20分钟。溶液呈棕绿色；

(Ⅲ)用pH=4.4的0.001mol/L的醋酸钠缓冲溶液于4℃下透析过夜；

(Ⅳ)加入20μl 0.2mol/L Na₂CO₃缓冲液，使溶液pH提升至约9.0-9.5；

(Ⅴ)用0.01mol/L, pH=9.5的碳酸盐缓冲液将fPSA抗体调配成8mg/ml的浓度。并将抗体溶液缓慢加入等体积的上述HRP溶液中，室温搅拌2小时；

(Ⅵ)加入新鲜配置的4mg/ml的硼酸钠溶液，置于4℃中2小时；

(Ⅶ)于4℃，在0.1 mol/L的硼酸钠缓冲液中透析24小时，其间更换缓冲液3次；

(Ⅷ)加入等量60%中性甘油溶液，混匀后分装，– 20 ℃ 下保存。

4、通过实验选择系列标准品浓度为0，0.15，0.6，1.7，3.3，8.3，20μg/L。

5、配制试剂盒其他组分：20倍浓缩洗涤液(含有0.05%吐温-20的0.02M 磷酸盐缓冲液，pH=7.4)、样品稀释液(灭活的小牛血清)、化学发光底物A、B液分别为鲁米诺溶液、过氧化氢及其特效增强剂(对碘苯酚)溶液。

6、鉴定该方法制成试剂盒的准确度、灵敏度、精密度和稳定性合格。

7、根据试剂盒的需要量将这些组分分装在小瓶中，组装为成品。

实施例 2本发明试剂盒的使用方法：

1、自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡20分钟，取一瓶浓缩洗液，加蒸馏水(1ml+19ml)备用。

2、将发光板从密封袋中取出，将100 μL FITC标记的anti-fPSA抗体溶液(1:2000) 加入到包被有抗-FITC抗体的酶标板中，37 ℃下温育1小时。

3、弃去各孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置10-20秒，甩掉洗涤液；重复洗板，最后在干净的吸水纸上拍干。

4、设系列标准品浓度各2孔，每个样品孔2孔，取标准品或样品溶液各50μl于相对应板孔中，再加入酶标记物50μl，微量振荡器充分振荡混匀，用不干胶片封盖反应板，然后置反应板37℃温育30分钟。

5、小心甩去反应液，然后洗涤五次同步骤3。

6、使用前5分钟将发光底物A液与B液100:1混合后，依次在每孔中加入50 μL 化学发光底物，室温避光反应10分钟后，对发光强度进行测量。

7、用双对数坐标以RLU值对fPSA浓度作图，通过标准曲线对样品血清中fPSA实现定量分析。

本发明具有的优点：

结果特异性强、灵敏度高、稳定、方便等。本发明操作简便，所需检测仪器（化学发光仪）在各大医院和检测中心普遍使用。

Claims

1.一种制备游离前列腺特异性抗原（fPSA）化学发光免疫分析诊断试剂盒的方法，包括以下步骤：

1) 以抗-FITC 抗体包被固相载体，获得抗 -FITC 抗体包被的固相载体；

2) 通过下述步骤用 FITC 标记 anti-PSA 抗体，获得 FITC 标记的 anti-PSA抗体：

(Ⅰ)取PSA 抗体1 mg 置50 mM pH 9.3 的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中4 ℃透析24 h，最后体积控制在200 μl 之内；

(Ⅱ)取FITC 2 mg 溶于1 ml 50 mM pH 9.3 的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中；

(Ⅲ) 将上述步骤(I)中获得的液体置于磁力搅拌器，取上述步骤（II）中获得的液体25μl 缓缓滴加至A 液中，在5-8 分钟间加完，防止出现气泡，然后置4 ℃搅拌12-16 小时；

(Ⅳ) 将反应液取出于10000 转/ 分的速度离心20 分钟，除去微量沉淀物，上清液装透析袋，置10 mM pH =7.4 的PBS 溶液中透析4 天，每天更换透析液2 次；

(Ⅴ) 离心去沉淀物，将标记物稀释至1 ml，加入适量NaN₃ , 分装，-20 ℃下保存；

3) 通过下述步骤用酶标记 anti-fPSA抗体，获得酶标记的 anti-fPSA抗体：

(i) 称取2mgHRP 溶于 1ml 双蒸水中；

(ii)加入200μl新配置的0.1mol/L的NaIO₄溶液，室温中轻轻搅拌20分钟，溶液呈棕绿色；

(iii)用pH=4.4 的0.001mol/L 的醋酸钠缓冲溶液于4℃下透析过夜；

(iv)加入20μl 0.2mol/L Na₂CO₃缓冲液，使溶液 pH 提升至9.0-9.5 ；

(v)用0.01mol/L，pH=9.5的碳酸盐缓冲液将fPSA抗体调配成8mg/ml的浓度，并将抗体溶液缓慢加入等体积的上述 HRP 溶液中，室温搅拌 2 小时；

(vi) 加入新鲜配置的 4mg/ml 的硼酸钠溶液，置于4℃中 2 小时；

(vii) 于4℃，在 0.1 mol/L 的硼酸钠缓冲液中透析 24 小时，其间更换缓冲液 3 次；

(viii) 加入等量 60% 中性甘油溶液，混匀后分装，–20 ℃下保存；

4)分装上述获得的FITC标记的anti-PSA抗体、酶标记的anti-fPSA抗体、以及该酶所作用的化学发光底物、系列浓度的标准品；

5) 组装为成品。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下方法包被固相载体：

1)将包被用抗-FITC抗体加到pH = 4.4~5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中混匀，然后用所得混合液包被固相载体；

2) 洗涤被包被的固相载体；

3) 使用牛血清白蛋白封闭上述经洗涤的载体。

3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸盐缓冲溶液的pH值为4.8。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。

6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述 1,2- 二氧乙烷类衍生物为 (金刚烷)-1,2- 二氧乙烷、3-(2′- 螺旋金刚烷 )-4- 甲氧基 -4-(3″ -磷酰氧基)苯基-1， 2-二氧乙烷、CSPD或CDP- Star。