CN102818779B - 一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法，主要步骤包括：顺次经过除去碱溶性杂质、除去酸溶性杂质、浓酸降解、稀酸水解，先将酵母葡聚糖中的水溶性葡聚糖和杂质除去，再将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量。本发明能将酵母葡聚糖中的非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，从而用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量，本发明具有可操作性强、测量结果准确度高、相对标准偏差小、重现性好等优点，为酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量检测提供了依据。

Description

一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种酵母葡聚糖含量的检测方法，具体涉及一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法。

背景技术

酵母细胞中除含有大量的蛋白质外，还含有甘露聚糖、甘露糖蛋白、β-1,3-葡聚糖、其他杂多糖和几丁质等成分。目前已被应用的酵母多糖产品主要有甘露糖系列的甘露聚糖、甘露寡糖、甘露糖蛋白，含多种多糖成分的酵母葡聚糖，非水溶性的酵母细胞壁β-1,3-D-葡聚糖等。

目前，对于酵母葡聚糖含量的检测方法有很多，都是对于酵母葡聚糖中水溶性葡聚糖含量的检测方法，如利用多糖的还原性测定还原性多糖的方法有3，5一二硝基水杨酸盐比色法；利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质的这一性质进行测定，这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其中非水溶性多糖很难彻底水解，若高温水解则会破坏目的组分，无法用于产品质量的检验、监督，使得酵母非水溶活性多糖产品的质量控制、生产过程中非水溶活性多糖的检测产生了很大的不确定性。国外常用酶法检测法检测非水溶性葡聚糖的含量，利用专一性酶对多糖底物的催化反应确认是否含有非水溶性葡聚糖，再结合其他方法测定非水溶性葡聚糖含量，但是此方法条件苛刻，对设备要求高，不适合一般实验室操作。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法，采用特殊工艺除去单糖、低聚糖、水溶性杂多糖以及蛋白的干扰，采用合理的酸降解、水解，能够将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，有效地解决了非水溶性葡聚糖难以降解或降解不完全的缺陷，减少了降解时间，降低了水解温度，为酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量检测提供了依据。 

一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，主要步骤包括：顺次经过除去碱溶性成分、除去酸溶性成分、浓酸降解、稀酸水解，将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量，并对检测方法进行精密度和回收率研究，具体步骤包括：

（1）除去碱溶性成分

取烘干粉碎的待测多糖样品，分别称取20-200mg于3-5个离心杯中，分别加入碱溶液，充分震荡5-10min，离心5-20min，弃去上清液，如此重复2次；

（2）去除酸溶性成分

向步骤（1）中弃去上清液的3-5个离心杯中，分别加入酸溶液，充分震荡5-10min，离心5-20min，弃去上清液，如此重复2次；

（3）浓酸降解

将步骤（2）中弃去上清液的3-5个离心杯中的沉淀分别转移到相应的100mL碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入酸溶液，充分震荡2-5min，室温放置20-30min；

（4）稀酸水解

向经步骤（3）酸处理后的3-5个碘量瓶中分别加入40mL-80mL水，接上冷凝管，100℃水解2-6小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到100mL容量瓶中，并定容得待测样品溶液；

（5）苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖含量

配制50g/L的苯酚溶液：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀，置冰箱中保存，备用；

配制葡聚糖标准储备溶液：精密称取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖标准品P82 0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存；

配制葡聚糖标准溶液：吸取葡聚糖标准储备液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存；

标准曲线绘制：精密吸取葡聚糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸10min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得出标准曲线的回归方程为：y=4.405x-0.0031，R²=0.9997

式中y为葡聚糖的质量浓度，单位为mg/mL，x为吸光度值，R为线性相关系数；

测定非水溶葡聚糖的含量：吸取步骤（4）所得的待测样品溶液5-25mL，用蒸馏水稀释至50-500mL，吸取该稀释液1mL-2mL，分别加入3-5个25mL比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积2mL，再分别加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，混合均匀后，加入10mL浓硫酸，然后迅速放入沸水浴中10-30min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量：

式中：

x—样品中非水溶葡聚糖的含量；

w₁—测定样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，mg；

m—多糖样品的质量，mg；

v₁—样品稀酸水解中定容总体积，mL；

v₂—吸取的待测样品溶液的体积，mL；

v₃—吸取的待测样品溶液稀释后的体积，mL；

v₄—测定用样品溶液体积，mL。

其中，步骤（1）中所述碱溶液为常用的碱性试剂，优选为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或其混合物，碱性强，用来除去单糖、低聚糖、水溶性杂多糖、碱溶性蛋白及其它碱溶性成分；碱溶液的体积为10mL-30mL，浓度为20g/L-100g/L，在此范围内可以将碱溶性成分完全去除，若浓度过大，容易破坏酵母的活性成分，若浓度过小，碱溶性成分去除不完全，影响检测的精密度，如此重复步骤（1）两次，能够将碱溶性成分基本除去。

步骤（2）中所述酸溶液，从成本以及酸性强度考虑，采用盐酸溶液或硫酸溶液或其混合物，酸溶液的体积为10mL-20mL，浓度为20ml/L-40ml/L，在此范围内可以将酸溶性成分完全去除，若浓度过大，容易破坏酵母的活性成分，若浓度过小，酸溶性成分去除不完全，影响检测的精密度，如此重复步骤（2）两次，能够将酸溶性成分基本除去。

由于蛋白质会影响苯酚-硫酸法检测的稳定性，为了更好地除去蛋白质，所述步骤（1）和步骤（2）重复两次同样的操作，这样基本上可以将碱溶性蛋白和酸溶性蛋白除去，如果重复次数过多，操作复杂繁琐，不但浪费时间而且成本增加，如果只进行一次操作，则碱溶性成分和酸溶性成分难以去除干净，将影响苯酚-硫酸法检测的稳定性。

步骤（3）中所述酸溶液选用10mL、8-10moL/L的硫酸溶液，因为硫酸具有强酸性，同时还具有强氧化性，10mL、8-10moL/L的硫酸溶液可以将非水溶性多糖转化为水溶性多糖，步骤（3）之所以称之为浓酸降解，是相对于步骤（4）的稀酸降解来说的。

所述步骤（1）和步骤（2）中所用的离心机为现有设备，型号为DL-5低速大容量离心机，离心速率均为2000-4000r/min。

步骤（5）中所述精制苯酚和50g/L的苯酚溶液中的苯酚都是重蒸苯酚，这是因为苯酚在空气中容易被氧化，使之纯度降低，所以将苯酚重蒸后再根据需要配制成一定浓度的苯酚溶液使用。

本发明采用特殊工艺除去单糖、低聚糖、水溶性杂多糖以及蛋白的干扰，采用合理的酸降解、水解，有效地解决了非水溶性葡聚糖难以降解或降解不完全的缺陷，减少了降解时间以及水解温度，在较温和的工艺条件下，将酵母葡聚糖中的非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，再利用苯酚-硫酸法进行测定非水溶性葡聚糖的含量。本发明具有可操作性强、测量结果准确度高、相对标准偏差小、重现性好等优点，为酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量检测提供了依据。

具体实施方式

实施例1

（1）除去碱溶性成分

取烘干粉碎的待测多糖样品（m），称取100.0、100.2、99.8、100.1、100.2mg分别放入 5个离心杯中，分别加入30mL、20g/L的氢氧化钠溶液，充分震荡5-10分钟，以4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，如此重复2次；

（2）去除酸溶性成分

向步骤（1）中弃去上清液的5个离心杯中，分别加入20mL、20ml/L的硫酸溶液，充分震荡5-10分钟，以4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，如此重复2次；

（3）浓酸降解

将步骤（2）中弃去上清液的5个离心杯中的沉淀分别转移到5个100mL的碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入10mL、10moL/L的硫酸溶液，充分震荡2-5分钟，室温放置30分钟；

（4）稀酸水解

向经步骤（3）硫酸处理的5个碘量瓶中分别加入40mL水，接上冷凝管，100℃水解2小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到100mL（v₁）容量瓶中，并定容得待测样品溶液；

（5）苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖含量

配制50g/L的苯酚溶液：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀，置冰箱中保存，备用；

配制葡聚糖标准储备溶液：精密称取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖标准品P82 0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存，此溶液每1mL含10.0mg葡聚糖；

配制葡聚糖标准溶液：吸取葡聚糖标准储备液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存，此溶液每1mL含葡聚糖0.10mg；

标准曲线绘制：精密吸取葡聚糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸10min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得出标准曲线的回归方程为：y=4.405x-0.0031，R²=0.9997

式中y为葡聚糖的质量浓度，单位为mg/mL，x为吸光度值，R为线性相关系数；

测定非水溶葡聚糖的含量：吸取步骤（4）所得的待测样品溶液10mL（v₂），用蒸馏水稀释至100mL（v₃），吸取该稀释液1mL（v₄），分别加入5个25mL比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积2mL，再分别加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，混合均匀后，加入10mL浓硫酸，然后迅速放入沸水浴中10min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量（w₁），从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量：

式中：

x—样品中非水溶葡聚糖的含量；

w₁—测定样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，mg；

m—多糖样品的质量，mg；

v₁—样品稀酸水解中定容总体积，mL；

v₂—吸取的待测样品溶液的体积，mL；

v₃—吸取的待测样品溶液稀释后的体积，mL；

v₄—测定用样品溶液体积，mL。

实施例2

（1）除去碱溶性成分

取烘干粉碎的待测多糖样品（m），称取200.0、200.2、199.8、200.2、199.8mg分别放入于5个离心杯中，分别加入10mL、100g/L的氢氧化钾溶液，充分震荡5-10分钟，以2000 r/min离心20min，弃去上清液，如此重复2次；

（2）除去酸溶性成分

向步骤（1）中弃去上清液的5个离心杯中，分别加入10mL、4%（v/v）的盐酸溶液，充分震荡5-10分钟，以2000 r/min离心20min，弃去上清液，如此重复2次；

（3）浓酸降解

将步骤（2）中弃去上清液的5个离心杯中的沉淀分别转移到5个100mL的碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入10mL、8moL/L的硫酸溶液，充分震荡2-5分钟，室温放置25min；

（4）稀酸水解

向经步骤（3）酸处理的5个碘量瓶中分别加入80mL水，接上冷凝管，100℃水解6小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到100mL（v₁）容量瓶中，并定容得待测样品溶液；

（5）苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖含量

配制50g/L的苯酚溶液：如同实施例一所述；

配制葡聚糖标准储备溶液：如同实施例一所述；

配制葡聚糖标准溶液：如同实施例一所述；

标准曲线绘制：如同实施例一所述；

测定非水溶葡聚糖的含量：吸取步骤（4）所得的待测样品溶液25mL（v₂），用蒸馏水稀释至500mL（v₃），吸取该稀释液2mL（v₄），分别加入5个25mL比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积2mL，再分别加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，混合均匀后，加入10mL浓硫酸，然后迅速放入沸水浴中30min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量（w₁），从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量：

式中：

x—样品中非水溶葡聚糖的含量；

w₁—测定样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，mg；

m—多糖样品的质量，mg；

v₁—样品稀酸水解中定容总体积，mL；

v₂—吸取的待测样品溶液的体积，mL；

v₃—吸取的待测样品溶液稀释后的体积，mL；

v₄—测定用样品溶液体积，mL。

实施例3

（1）除去碱溶性成分

取烘干粉碎的待测多糖样品（m），称取20.2、19.8、20.0mg分别放入于3个离心杯中，分别加入15mL、50g/L的氢氧化钠溶液和10mL、80g/L的氢氧化钾溶液，充分震荡5-10分钟，以3000r/min离心5min，弃去上清液，如此重复2次；

（2）除去酸溶性成分

向步骤（1）中弃去上清液的3个离心杯中，分别加入10mL、3%（v/v）的硫酸溶液和15mL、30ml/L的盐酸溶液，充分震荡5-10分钟，以3000r/min离心5min，弃去上清液，如此重复2次；

（3）浓酸降解

将步骤（2）中弃去上清液的3个离心杯中的沉淀分别转移到3个100mL的碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入10mL、9moL/L的硫酸溶液，充分震荡2-5分钟，室温放置20min；

（4）稀酸水解

向经步骤（3）酸处理的3个碘量瓶中分别加入60mL水，接上冷凝管，100℃水解4小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到100mL（v₁）容量瓶中，并定容得待测样品溶液；

（5）苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖含量

配制50g/L的苯酚溶液：如同实施例一所述；

配制葡聚糖标准储备溶液：如同实施例一所述；

配制葡聚糖标准溶液：如同实施例一所述；

标准曲线绘制：如同实施例一所述；

测定非水溶葡聚糖的含量：吸取步骤（4）所得的待测样品溶液5mL（v₂），用蒸馏水稀释至50mL（v₃），吸取该稀释液1.5mL（v₄），分别加入3个25mL比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积2mL，再分别加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，混合均匀后，加入10mL浓硫酸，然后迅速放入沸水浴中25min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量（w₁），从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量：

式中：

x—样品中非水溶葡聚糖的含量；

w₁—测定样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，mg；

m—多糖样品的质量，mg；

v₁—样品稀酸水解中定容总体积，mL；

v₂—吸取的待测样品溶液的体积，mL；

v₃—吸取的待测样品溶液稀释后的体积，mL；

v₄—测定用样品溶液体积，mL。

实验例1

将实施例1-3检测酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖的含量，计算出相对标准偏差，考察检测结果的精密度，见表1。

利用本发明检测酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖的含量，从表1可以看出，相对标准偏差小，精密度高，重现性好。

表1 非水溶性葡聚糖的含量测定的精密度试验

实验例2

分别称取已知非水溶性葡聚糖含量为93.75%的5份相同的样品，分别加入一定量的葡聚糖标准品P82，按本发明方法进行操作，测定吸光值，根据标准曲线计算酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖的含量，并计算该检测方法的加样回收率，以此来考察检测方法的准确度，见表2。

表2 非水溶性葡聚糖的含量测定的准确度试验

利用本发明检测酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖的含量，从上表可以看出，该检测方法的平均加样回收率为99.25%，准确度高，重复性好。

Claims (3)

1.一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于：主要步骤包括：顺次经过除去碱溶性成分、去除酸溶性成分、浓酸降解和稀酸水解，将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量；

具体步骤包括：

(1)除去碱溶性成分

取烘干粉碎的待测多糖样品，分别称取20-200mg于3-5个离心杯中，分别加入碱溶液，充分震荡5-10min，离心5-20min，弃去上清液，如此重复2次；

(2)去除酸溶性成分

向步骤(1)中弃去上清液的3-5个离心杯中，分别加入酸溶液，充分震荡5-10min，离心5-20min，弃去上清液，如此重复2次；

(3)浓酸降解

将步骤(2)中弃去上清液的3-5个离心杯中的沉淀分别转移到相应的100mL碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入酸溶液，充分震荡2-5min，室温放置20-30min；

(4)稀酸水解

向经步骤(3)酸处理后的3-5个碘量瓶中分别加入40mL-80mL水，接上冷凝管，100℃水解2-6小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到100mL容量瓶中，并定容得待测样品溶液；

(5)苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖的含量

配制50g/L的苯酚溶液：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀，置冰箱中保存，备用；

配制葡聚糖标准储备溶液：精密称取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖标准品P820.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存；

配制葡聚糖标准溶液：吸取葡聚糖标准储备溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存；

标准曲线绘制：精密吸取葡聚糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸10min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值；以葡聚糖的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得出标准曲线的回归方程为：Y＝4.405X-0.0031，R²＝0.9997

式中Y为葡聚糖的质量浓度，单位为mg/mL，X为吸光度值，R为线性相关系数；

测定非水溶葡聚糖的含量：吸取步骤(4)所得的待测样品溶液5-25mL，用蒸馏水稀释至50-500mL，吸取该稀释液1mL-2mL，分别加入3-5个25mL比色管中，依次加入蒸馏水补至总体积2mL，再分别加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，混合均匀后，加入10mL浓硫酸，然后迅速放入沸水浴中10-30min，再用冰水浴迅速冷却至室温，摇匀，以空白样品为参比，在490nm波长下，根据标准曲线得出样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，从而按照下式获得样品中非水溶葡聚糖的含量：

$x=\frac{w_1}{m\×\frac{v_2}{v_1}\×\frac{v_4}{v_3}}\×100\%$

式中：

x—样品中非水溶葡聚糖的含量；

w₁—测定样品溶液中非水溶葡聚糖的质量，mg；

m—多糖样品的质量，mg；

v₁—样品稀酸水解中定容总体积，mL；

v₂—吸取的待测样品溶液的体积，mL；

v₃—吸取的待测样品溶液稀释后的体积，mL；

v₄—测定用样品溶液体积，mL；

所述步骤(1)中碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或其混合物；

所述步骤(1)中碱溶液的体积为10mL-30mL，浓度为20g/L-100g/L；

所述步骤(2)中酸溶液为盐酸溶液或硫酸溶液或其混合物；

所述步骤(2)中酸溶液的体积为10mL-20mL，浓度为20ml/L-40ml/L；

所述步骤(3)中酸溶液为10mL、8-10moL/L的硫酸溶液。

2.根据权利要求1所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中的离心速率均为2000-4000r/min。

3.根据权利要求1所述的酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中精制苯酚和50g/L的苯酚溶液中的苯酚都是重蒸苯酚。