CN102816846A - 用于检测gstp1基因热点突变位点的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测谷胱苷肽-S-转移酶P1(glutathione-S-transferaseP1，GSTP1)基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测5外显子目的基因上下游引物F、R-Biotin、测序引物FCX。可检测出与GSTP1基因热点突变位点（I105V）多态性，特异性好，准确度高。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种用于检测谷胱苷肽-S-转移酶P1(glutathione-S-transferase P1，GSTP1)基因热点突变位点（I105V）的试剂盒，能对GSTP1基因突变位点进行检测，特异性好，准确度高，可提高突变检出率。
背景技术
谷胱甘肽S转移酶(GSTs)是一组多功能的药物代谢酶，其中GSTP1广泛存在于人体肿瘤组织中，在人体上皮来源的恶性肿瘤中表达率较高，如消化道来源的胃肠癌、食管癌，呼吸道来源的肺癌。在癌前病变和肿瘤患者中常发现GSTP1Vall05基因型过度表达。
在GSTP1基因多态性与人群健康的关系的研究中发现，GSTP1基因的Ile105Val位点的SNP导致在GSTP1蛋白密码子105位氨基酸转变，影响到GSTP1的催化功能，酶活性降低，使其抗氧化功能下降，有利患者在化疗中的生存。即GSTP1Ile105Val位点的多态性有利化疗，预后较好。
目前，GSTP1基因突变现有的检测方法包括酶切法、普通测序法以及焦磷酸测序法等。在实际应用中，用于检测结直肠癌PIK3CA基因突变的方法主要为直接测序法，尽管该法为金标准，但是如果突变率低于15%，会发生漏检的现象，且试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，因而一定程度上限制了该法的应用。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是一种新的序列分析技术，是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要。在这种情况下，Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。而焦磷酸测序技术是目前最适合这些应用的DNA序列分析技术。其特点是操作简便、大通量、自动化，适合大量样本的快速检测，根据峰值对序列的突变位点进行判读，从而实现GSTP1基因突变位点的定点检测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用一种快速，准确，高通量的GSTP1基因热点突变（Ile105Val）检测试剂盒。
用于检测GSTP1基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测GSTP1第5外显子目的基因上下游引物F、R-Biotin、测序引物FCX，其序列分别为：
F：TGGTGGACATGGTGAATGA，
R-Biotin：GGTCAGCCCAAGCCAC，
FCX：CCTCCGCTGCAAATA。
进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以该DNA为模板，用权利要求1所述用于扩增样本DNA中GSTP1基因第5外显子的对应PCR引物：F、R进行扩增，得到PCR反应产物；
(3)对PCR反应产物用测序引物FCX进行焦磷酸测序，确定是否存在突变。
优选地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃5min；98℃30s、58℃30s、68℃30s，35个循环；最后68℃5min。
本发明根据GSTP1基因热点突变位，设计了外显子5PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物。
表1.外显子5引物序列
F、R为5号外显子的扩增引物，可以扩增待检生物样品中相应的片段，其中反向引物做生物素标记；FCX为焦磷酸测序正向测序引物，对前述扩增所得片段进行测序。
本发明将测序技术应用于GSTP1基因热点突变位点的检测，设计出外显子5PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物，进行PCR扩增并进行焦磷酸测序分析。可检测出GSTP1基因热点突变位点（Ile105Val）多态性，特异性好，准确度高，其在指导肿瘤的一级预防和药物设计及临床合理用药方面都具有重大意义。
附图说明
图1是GSTP1第5外显子基因扩增后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。如图所示，目的片段约为176bp。其中，M为TAKARA2000的Marker，1-5为受检样本。
图2A为野生型样本经Exon5引物扩增后，焦磷酸测序结果。由于反向标记生物素，因此正向测序标准序列应为C
TCCCTCAT。
图2B为突变型样本经Exon5引物扩增后，焦磷酸测序结果。由图可知，该样本出现完全A→G转换，C
TCCCTCAT，即为纯合突变样本。
图2C为突变型样本经Exon5引物扩增后，焦磷酸测序结果。由图可知，该样本出现部分A→G转换，C
TCCCTCAT，即为杂合突变样本。
具体实施方式
本发明用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测5外显子目的基因上下游引物F、R-Biotin、测序引物FCX，其序列为：
F：TGGTGGACATGGTGAATGA，
R-Biotin：GGTCAGCCCAAGCCAC，
FCX：CCTCCGCTGCAAATA。
实施例1
(1)样本抽提：
1.1抽取300μl血液，加入900μL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
1.2加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
1.3加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.4加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
1.6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.7向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.8向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
1.9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)目的基因片段的扩增
2.1按样品数n（样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个）取预混PCR反应液每管47μL分装于反应管中。
2.2将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取3μL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系及循环扩增体系如下：
表2.外显子5PCR反应体系
表3.外显子5PCR循环体系
实施例2
电泳鉴定：1.5%琼脂糖凝胶电泳，140V，20min，凝胶成像系统观察。第9外显子目的片段分别为176bp，Marker为DL2000。
实施例3
单链模板的制备：将前述扩增所得PCR产物，每样品按照50μL加入3μL链霉亲和素包被的磁珠在室温下孵育10分钟。与磁珠结合后的PCR产物分别在75%乙醇，0.2mol/L的NaOH溶液及Tris洗脱液中各孵育10秒，充分反应后变性得到单链DNA。将与磁珠结合后的单链释放悬浮于45μL退火缓冲液中(100mM Tris-acetate pH 7.75,20mM Mg-acetate)(含10pmol测序引物)。在80℃下孵育2分钟，然后在室温下放置5分钟。
实施例4
焦磷酸测序：测序反应在28℃下自动在PYROMARKID仪器的SQA模式下进行检测，dNTP加样顺序为A→T→C→G，随着酶促的反应的进行，CCD摄像机检测并收集光信号，最终得到检测序列。
实施例5
焦磷酸测序结果分析：对PCR反应产物进行焦磷酸测序，与野生型基因序列进行比较，确定是否存在突变。第5外显子的突变类型主要为置换突变，第105位氨基酸中出现A→G转换，引起蛋白中该位点的异亮氨酸转变为缬氨酸(I105V)。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林艾迪康医学检验所有限公司
<120> 用于检测GSTP1基因热点突变位点的试剂盒
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<170> PatentIn version 3.3
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cctccgctgc aaata 15
Claims (3)
1.用于检测GSTP1基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测5外显子目的基因上下游引物F、R-Biotin、测序引物FCX，其序列为：
F：TGGTGGACATGGTGAATGA，
R：Biotin-GGTCAGCCCAAGCCAC，
FCX：CCTCCGCTGCAAATA。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1) 采集待测血液样本，提取DNA；
(2) 以该DNA为模板，用权利要求1所述用于扩增样本DNA中GSTP1基因的对应PCR引物：F、R进行扩增，得到PCR反应产物；
(3) 对PCR反应产物用测序引物FCX进行焦磷酸测序，确定是否存在突变。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃ 5min；98℃ 30s、 58℃ 30s、68℃ 30s，35个循环；最后68℃ 5min。
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|---|---|---|---|---|
| CN107267620A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-10-20 | 上海赛安生物医药科技股份有限公司 | Gstp1基因多态性检测体系及其试剂盒 |
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| CN101608225A (zh) * | 2008-06-20 | 2009-12-23 | 上海主健生物工程有限公司 | 乳腺癌遗传检测试剂盒 |
| CN102021240A (zh) * | 2010-09-21 | 2011-04-20 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种gstm1、gstt1和gstp1基因突变检测液相芯片 |
| CN102424854A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-04-25 | 解码（上海）生物医药科技有限公司 | 散发性乳腺癌易感基因无创检测试剂盒 |
-
2012
- 2012-08-15 CN CN2012102907531A patent/CN102816846A/zh active Pending
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