CN102803479A - 用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物，特别是用于从中去除焦脱镁叶绿素的方法和用途。所述组合物通常是植物源性、藻源性或细菌源性产品，例如植物油。所述方法包括使所述组合物与具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶接触的步骤。本发明还提供了用于实施所述方法和用途的相关装置和产品。

Description

用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法

技术领域

本发明涉及用于处理包含焦脱镁叶绿素的组合物的方法、用途、装置及相关产品。一方面，本发明特别适用于植物源性食品和饲料产品、例如植物油的工业处理。本发明可用于减轻或消除所述产品中的焦脱镁叶绿素污染。 

背景技术

叶绿素是广泛存在于植物界的绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，是存在于地球上的最丰富的有机金属化合物之一。因此，许多源自植物的产品、包括食品和饲料均含有大量的叶绿素。 

例如，源自油料种子(例如大豆、棕榈或油菜籽(canola)、棉籽以及花生油)的植物油通常含有一些叶绿素。然而，植物油中高水平叶绿素色素的存在通常是不合乎需要的。这是因为叶绿素产生不合乎需要的绿色，并且可在储存过程中诱导油氧化，导致油变质。 

已经应用多种方法以从植物油中去除叶绿素。可在油产品加工的许多阶段去除叶绿素，包括种子压榨、油萃取、脱胶、碱处理以及漂白步骤。然而，对于将叶绿素残留物去除至可接受水平，漂白步骤通常是最重要的。在漂白过程中，加热油并使其通过吸附剂，以去除叶绿素和影响精制油外观和/或稳定性的其他带颜色的化合物。漂白步骤中使用的吸附剂通常是粘土。 

在食用油加工业中，这些步骤的应用通常将所加工的油中的叶绿素水平降低至0.02至0.05ppm之间。然而，由于漂白粘土中的雾沫夹带，漂白步骤增加了加工成本并降低了油产率。另外，粘土的使用昂贵，这特别归因于对于使用过的粘土(即废料)的处理困难、危险并且代价高昂。因此，已经尝试通过其他方法从油中去除叶绿素，例如使用叶绿素酶。 

在植物中，叶绿素酶(chlase)被认为参与叶绿素降解和催化叶绿素中酯键的水解，以产生脱植基叶绿素(chlorophyllide)和叶绿醇。WO 2006009676描述了通过使用叶绿素酶处理可降低诸如植物油之类的组合物中的叶绿素污染的工业工艺。该工艺中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色的，但可通过水 萃取或二氧化硅处理而去除。 

叶绿素通常在用于油生产的种子中以及从种子萃取油的过程中部分降解。一种常用的改良是从卟啉(二氢卟酚)环中去除镁离子，以形成称为脱镁叶绿素的衍生物(见图26)。从卟啉环去除高极性镁离子导致脱镁叶绿素与叶绿素的理化性质显著不同。在加工过程中，油中的脱镁叶绿素通常要比叶绿素更丰富。脱镁叶绿素呈绿色，可通过与用于叶绿素的类似工艺而从油中去除，例如WO 2006009676中所述通过具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，某些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，由此适于去除这两种污染物。脱镁叶绿素的水解产物是红色/褐色的脱镁叶绿酸(pheophorbide)和叶绿醇。值得关注的是，脱镁叶绿酸也可通过从脱植基叶绿素去除镁而产生，即在叶绿素水解之后进行(见图26)。WO 2006009676教导了通过类似于用于脱植基叶绿素的方法去除脱镁叶绿酸，例如通过水萃取或二氧化硅吸附。然而，值得注意的是，脱镁叶绿酸的水溶性低于脱植基叶绿素，因此不能使用水萃取(特别是使用水)容易地洗除。 

脱镁叶绿素可在油料种子的收获和储存过程中通过植物酶活性或通过在油精制过程中通过加工条件(例如热)而进一步降解为焦脱镁叶绿素(见，“Behaviour of chlorophyl Derivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS，第9卷(Sept.1993)，第837-841页)。一种可能的机制是脱镁叶绿素同素环的甲基酯键的酶促水解，及随后不稳定中间物至焦脱镁叶绿素的非酶促转化。据报道，一种称为脱镁叶绿酸酶的来自藜(Chenopodium album)的28-29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸的类似反应，从而产生称为焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)的焦脱镁叶绿素的无叶绿醇衍生物(见图26)。焦脱镁叶绿酸的极性低于脱镁叶绿酸，导致与脱镁叶绿酸相比，焦脱镁叶绿酸的水溶性降低且油溶性增加。 

加工过程中，植物油中的焦脱镁叶绿素要比脱镁叶绿素和叶绿素二者更丰富(见Bailey’s Industrial Oil and Fat Products(2005)，卷2.2，表9，第6版，Fereidoon Shahidi编辑，John Wiley & Sons)。这部分归因于在植物原料收获和储存期间叶绿素中镁的丧失。还通过在加工和萃取前加热油料种子，以及精制工艺过程中油脱胶和碱处理来降低叶绿素水平。因此，在许多植物油中，与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素是相对次要的污染物。 

焦脱镁叶绿素呈绿色且鉴于其对于颜色和稳定性的不良影响，焦脱镁叶 绿素是油中主要的不良污染物。尽管对叶绿素和(较低程度上)脱镁叶绿素去除的方面给予了关注，仍旧需要从诸如植物油之类的组合物中去除焦脱镁叶绿素及其衍生物(例如焦脱镁叶绿酸)的合适方法。特别地，现有技术中描述的叶绿素酶通常几乎没有或完全没有焦脱镁叶绿素酶活性，由此不能去除焦脱镁叶绿素污染。 

发明内容

一方面，本发明提供了用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法，该方法包括使所述组合物与能够水解焦脱镁叶绿素的酶接触。 

优选地，所述组合物源自植物、藻类或细菌。在一种实施方式中，所述组合物包括植物源性油，例如植物油。优选地，所述组合物包括选自米糠油、大豆油、菜籽(rape seed)油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、玉米油、棕榈仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油的油。 

在一种实施方式中，所述酶包括脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。所述酶可源自例如选自下述属的物种：拟南芥属(Arabidopsis)、杨属(Populus)、葡萄属(Vitis)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、烟草属(Nicotiana)、藻属(Ostreococcus)、藻属、小立碗藓属(Physcomitrella)、褐指藻属(Phaeodactylum)、衣藻属(Chlamydomonas)或微胞藻属(Micromonas)，或所述酶可源自例如选自下述物种：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、烟草(Nicotiana tabacum)、绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)或微胞藻(Micromonas sp.)RCC299。 

优选地，所述酶包含选自下述的氨基酸序列：LPGFGVG(SEQ ID NO：13)、DFLGQG(SEQ ID NO：14)、GNSLGG(SEQ ID NO：15)、LVKGVTLLNATPFW(SEQ ID NO：16)、HPAA(SEQ ID NO：17)、EDPW(SEQ ID NO：18)以及SPAGHCPH(SEQ ID NO：19)。 

在一种实施方式中，所述酶包含SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：4至12任一者或SEQ ID NO：21、23或25任一者所限定的多肽序列，或其功能性片 段或变体，例如，所述酶包含在至少20个、至少50个、至少100个或至少500个氨基酸残基或在序列的全长上与SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：4至12任一者或SEQ ID NO：21、23或25任一者具有至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的多肽序列。 

在一种实施方式中，所述酶具有小于80的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。 

所述酶可水解所述组合物中的焦脱镁叶绿素而生成焦脱镁叶绿酸。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述组合物去除焦脱镁叶绿酸的步骤。例如，可通过脱臭步骤或二氧化硅处理步骤、优选通过脱臭步骤和二氧化硅处理步骤二者去除焦脱镁叶绿酸。 

优选地，所述方法包括两个或多个二氧化硅处理步骤。在一种实施方式中，所述二氧化硅处理在高温下进行，例如在约50至150℃、在70至110℃或在约90℃。 

在一种实施方式中，在固体支持体上固定能够水解焦脱镁叶绿素的酶。所述方法还可包括使所述组合物与具有叶绿素酶活性的酶接触的步骤，任选地，还可将所述叶绿素酶固定于固体支持体上。 

优选地，所述方法还包括使所述组合物与酰基转移酶接触的步骤。 

优选地，相对于处理前存在于所述组合物中的焦脱镁叶绿素浓度，所述组合物中的焦脱镁叶绿素浓度降低至少10％、至少50％、至少75％或至少90％。 

另一方面，本发明提供了用于精制植物(例如蔬菜)油的工艺，该工艺包括使用焦脱镁叶绿素酶处理含有焦脱镁叶绿素的植物油。所述工艺可在工业规模进行，可包括如上所述的多个方法步骤。所述工艺还可包括通常用于植物油加工的步骤，例如己烷萃取和/或脱胶步骤。 

在又一方面，本发明提供了具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽用于从组合物去除焦脱镁叶绿素污染的用途。该用途可应用如上所述的多个方法步骤而实施。 

在又一方面，本发明提供了用于对含有焦脱镁叶绿素的组合物进行酶处理的装置，该装置包括：(a)植物油精制装置；和(b)可操作地并入所述植物油精制装置中的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，从而使所述多肽能够在精制 所述组合物的过程中水解所述组合物中的焦脱镁叶绿素。所述装置可包含用于实施如上所述的方法或工艺的相应装置特征。 

另一方面，本发明提供了包含固定于二氧化硅上，具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的组合物。所述多肽可为在上文所述方法的优选实施方式中所述的酶。 

另一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：3所示的核酸序列编码的多肽，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。例如，所述变体和/或片段可在至少100、至少200或至少300个氨基酸残基或全长序列上显示与SEQ ID NO：4至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。 

又一方面，本发明提供了SEQ ID NO：3所示的核酸序列，或编码功能性焦脱镁叶绿素酶的其变体或片段。例如，所述变体和/或片段可在至少300、至少500或至少1000个核苷酸残基或全长序列上显示与SEQ ID NO：3至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。在其他方面，本发明提供了一种包含SEQ ID NO：3所示核酸序列的表达载体(例如，图13所示的表达载体)和包含所述表达载体的转化(宿主)细胞。 

又一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的多肽，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。例如，所述变体和/或片段可在至少100、至少200或至少300个氨基酸残基或全长序列上显示与SEQ ID NO：25的至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。 

又一方面，本发明提供了可通过如上所述的工艺或方法获得的组合物。例如，所述组合物可为植物、藻类或细菌产品，特别是精制植物油，例如精制蔬菜油。 

已经惊讶地发现某些植物酶具有焦脱镁叶绿素酶活性，例如，能够水解焦脱镁叶绿素中的酯键以生成焦脱镁叶绿酸和叶绿醇。另外，所述焦脱镁叶绿素酶特别可用于去除植物源性产品，例如植物油中的焦脱镁叶绿素污染物。 

附图说明

图1显示了使用吸光度检测(430nm)的HPLC色谱图，表示如下编号的峰：1＝脱植基叶绿素b；2＝脱植基叶绿素a；3＝新叶黄素；3’＝新叶黄 素异构体；4＝新色素；5＝堇黄质；6＝黄体呋喃素(lueoxanthin)；7＝异堇黄质；8＝花药黄质(anteraxanthin)；8’＝花药黄质异构体；9＝玉米黄质；10＝叶黄素；10’＝叶黄素异构体；10”＝叶黄素异构体；11＝脱镁叶绿酸b；12＝脱镁叶绿酸a；13＝叶绿素b；13’＝叶绿素b’；14＝叶绿素a；14’＝叶绿素a’；15＝脱镁叶绿素b；15’＝脱镁叶绿素b’；16＝β-胡萝卜素；17＝脱镁叶绿素a；17’＝脱镁叶绿素a’；18＝焦脱镁叶绿素b；19＝焦脱镁叶绿素a。 

图2显示了表5中所示的样品1(对照)在脱臭之前的HPLC分析结果。 

图3显示了表5中所示的样品1(对照)在脱臭之后的HPLC分析结果。 

图4显示了表5中所示的样品2(包含脱镁叶绿酸)在脱臭之前的HPLC分析结果。 

图5显示了表5中所示的样品2(包含脱镁叶绿酸)在脱臭之后的HPLC分析结果。 

图6显示了表5中所示的样品3(包含焦脱镁叶绿酸)在脱臭之前的HPLC分析结果。 

图7显示了表5中所示的样品3(包含焦脱镁叶绿酸)在脱臭之后的HPLC分析结果。 

图8显示了表5中所示的样品4(包含脱镁叶绿素)在脱臭之前的HPLC分析结果。 

图9显示了表5中所示的样品4(包含脱镁叶绿素)在脱臭之后的HPLC分析结果。 

图10显示了来自拟南芥的脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。叶绿体转运肽以粗体表示。 

图11显示了来自拟南芥的编码脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。SEQ ID NO：1的PPH由SEQ ID NO：2的173至1627位残基编码。 

图12显示了编码脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(脱镁叶绿素酶)的合成基因，该基因具有设计用于在丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达的密码子(核苷酸序列SEQ ID NO：3，氨基酸序列SEQ ID NO：4)。 

图13显示了含有通过kexin辛肽连接子与cbh1的催化核心融合的脱镁 叶绿素酶(PPH)合成基因的表达构建体。 

图14显示了在培养上清中表达作为分泌蛋白的PPH的里氏木霉转化体的SDS-PAGE。 

图15显示了毛果杨PPH的多肽序列(SEQ ID NO：5)。 

图16显示了葡萄PPH的多肽序列(SEQ ID NO：6)。 

图17显示了蓖麻(Ricinus communis)PPH的多肽序列(SEQ ID NO：7)。 

图18显示了水稻(日本栽培群)PPH的多肽序列(SEQ ID NO：8)。 

图19显示了玉米PPH的多肽序列(SEQ ID NO：9)。 

图20显示了烟草PPH的多肽序列(SEQ ID NO：10)。 

图21显示了水稻日本栽培群PPH的多肽序列(SEQ ID NO：11)。 

图22显示了(a)小立碗藓小立碗亚种PPH的多肽序列(SEQ ID NO：12)和(b)拟南芥叶绿素酶的多肽序列(SEQ ID NO：20)。 

图23显示了拟南芥PPH蛋白与推定PPH的氨基酸序列比对。发现了如下所示氨基酸序列的保守区：LPGFGVG(SEQ ID NO：13)、DFLGQG(SEQ ID NO：14)、GNSLGG(SEQ ID NO：15)、LVKGVTLLNATPFW(SEQ ID NO：16)、HPAA(SEQ ID NO：17)、EDPW(SEQ ID NO：18)及SPAGHCPH(SEQ ID NO：19)。 

图24是本发明的油精制工艺的图示。 

图25是本发明的植物油精制工艺和装置的图示。 

图26显示了涉及叶绿素及其衍生物的反应和本发明中使用的酶。 

图27显示了普通小麦(Triticum aestivum)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。 

图28显示了编码小麦叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。 

图29显示了莱茵衣藻叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。 

图30显示了编码莱茵衣藻叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)。 

图31显示了普通小麦叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合体的示意图。 

图32显示了含有小麦(普通小麦)叶绿素酶基因的质粒pBN-TRI_CHL的示意图。 

图33显示了莱茵衣藻叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合体的示意图。 

图34显示了含有莱茵衣藻叶绿素酶基因的质粒pBN-CHL_CHL的示意 图。 

图35显示了与野生型酶相比缺乏N末端16个氨基酸的普通小麦叶绿素酶变体(小麦Nd1-16)的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。 

图36显示了编码与野生型酶相比缺乏N末端16个氨基酸的普通小麦叶绿素酶的变体(小麦Nd1-16)的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。 

具体实施方式

一方面，本发明涉及一种用于处理含有焦脱镁叶绿素酶的组合物的方法。通常，实施所述方法以从所述组合物去除焦脱镁叶绿素，或降低所述组合物中的焦脱镁叶绿素水平，例如在焦脱镁叶绿素作为污染物存在的情况。 

焦脱镁叶绿素呈绿色，衍生自存在于分子中的卟啉(二氢卟酚)环。因此，组合物(例如植物油)中焦脱镁叶绿素的存在可赋予所述组合物不合乎需要的绿色或淡绿色。在一种实施方式中，可实施本发明的方法以去除或降低组合物中存在的绿色。因此，本发明的方法可称为漂白或脱色工艺。 

焦脱镁叶绿素水解产生叶绿醇和焦脱镁叶绿酸(见图26)。焦脱镁叶绿酸含有带颜色的卟啉环，但叶绿醇链的丧失意味着焦脱镁叶绿酸呈赤褐色，而非绿色。在某些实施方式中，还需要去除组合物中的焦脱镁叶绿酸并降低红色/褐色。因此，在本发明的一种实施方式中，所述方法还可包括去除或降低组合物中的焦脱镁叶绿酸水平的步骤。本发明的方法可涉及漂白或脱色以去除所述组合物中的绿色和/或红色/褐色。 

在一种实施方式中，本发明涉及筛选、表达以及应用对于叶绿素的无镁降解产物(特别地，至少焦脱镁叶绿素，例如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)具有活性而对叶绿素具有低活性或无活性的酶。优选地，本发明的酶对叶绿素无镁降解产物(优选对焦脱镁叶绿素)比对叶绿素的活性高80％，更优选地，本发明的酶对叶绿素无镁降解产物(优选对焦脱镁叶绿素)比对叶绿素的活性高90％。更优选地，本发明的酶对叶绿素无镁降解产物(优选对焦脱镁叶绿素)比对叶绿素的活性高95％。 

组合物 

根据本发明的方法，可对于任何包含焦脱镁叶绿素的组合物进行处理， 以去除不合乎需要的焦脱镁叶绿素污染。优选地，所述组合物是植物源性制品、藻类制品或细菌源性制品，例如，所述组合物是源自任何种类的植物、藻类或细菌(例如蓝细菌)的产品。在一种实施方式中，所述组合物包含植物原料、植物油或植物萃取物。术语“植物”包括完整植株、植株部分(例如，叶、茎、花、根等)、植物原生质体、种子以及植物细胞及其子代。可在本发明的方法中处理的产品所源自的植物种类包括高级植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。其包括具有多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体以及半合子状态。 

在优选的实施方式中，所述组合物可包含植物油，例如蔬菜油，包括由油料种子或油料果实(例如，诸如油菜籽(rapeseed)油之类的种子油和诸如棕榈之类的果实油)加工的油。合适的油的实例包括米糠油、大豆油、油菜籽油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、玉米油、棕榈仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油。本发明的方法可以与用于加工香精油(essential oil)、例如来自果实种子油(例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些油)的方法联合使用。 

可选地，所述组合物可包含：藻类制品；织物、线或纤维或布；或木制品或纸产品或副产品，例如木浆、纸浆、牛皮纸(Kraft)浆或非木纸产品或副产品，例如米纸。在所述方法的其他方面，所述组合物可包含药物制剂或化妆品制剂(例如用于药物和化妆品的脂质体)、生物柴油、食品、食用油、饲料或食品添加剂。 

本发明的方法可用于处理源自植物(例如蔬菜或藻类)来源或可选来自合成来源的粗制油或精制油。本发明的方法可用于处理油浓度较高的粗制油或精制油，或在一方面用于处理非精制油和非稀释粗制油。本发明的方法可以与用于处理高磷油(例如，大豆油)的方法联合使用。 

焦脱镁叶绿素去除 

焦脱镁叶绿素可作为污染物天然存在于所述组合物(例如，制剂、饲料、食品或油)中，或作为不合乎需要的组分存在于经加工的产品中。焦脱镁叶绿素可以以任何水平存在于所述组合物中。通常，焦脱镁叶绿素可作为天然污染物，以基于所述组合物(例如，植物油)的总重量0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10^-7至10^-1wt％)的浓度存在于所述组合物中。在其他实施方式 中，焦脱镁叶绿素可以以基于所述组合物的总重量0.1至100mg/kg、0.5至50mg/kg、1至50mg/kg、1至30mg/kg或1至10mg/kg的浓度存在于所述组合物中。 

本发明的方法通常降低所述组合物中焦脱镁叶绿素的水平。例如，与处理前存在于总组合物中的焦脱镁叶绿素浓度(按重量)相比，所述方法可将焦脱镁叶绿素的浓度降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。因此，在具体实施方式中，基于所述组合物(例如蔬菜油)的总重量，处理之后所述组合物(例如蔬菜油)中的焦脱镁叶绿素浓度可为小于100mg/kg、小于50mg/kg、小于30mg/kg、小于10mg/kg、小于5mg/kg、小于1mg/kg、小于0.5mg/kg、小于0.1mg/kg或小于0.02mg/kg。 

焦脱镁叶绿酸去除 

本发明的方法可任选包括去除焦脱镁叶绿酸的步骤。由于焦脱镁叶绿素被本发明的酶水解，焦脱镁叶绿酸可存在于所述组合物中，或可作为污染物天然存在，或作为不合乎需要的组分存在于经加工的产品中。焦脱镁叶绿酸还可由于脱镁叶绿酸降解而存在于所述组合物中，脱镁叶绿酸自身可通过具有脱镁叶绿素酶活性的酶对于脱镁叶绿素的活性而产生，或者脱镁叶绿酸可在叶绿素酶对于叶绿素作用之后而由脱植基叶绿素生成(见图26)。用于油精制的加工条件，特别是热或在所述工艺中使用诸如脱镁叶绿酸酶、叶绿素酶和/或脱镁叶绿素酶均可有助于焦脱镁叶绿酸生成中的多个步骤。 

焦脱镁叶绿酸可以以任何水平存在于所述组合物中。通常，在根据本发明的方法使用焦脱镁叶绿素酶处理之前或之后，焦脱镁叶绿酸可以以基于所述组合物(例如植物油)的总重量0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10^-7至10^-1wt％)的浓度存在于所述组合物(例如植物油)中。在其他实施方式中，焦脱镁叶绿酸可以以基于所述组合物的总重量0.1至100mg/kg、0.5至50mg/kg、1至50mg/kg、1至30mg/kg或1至10mg/kg的浓度存在于所述组合物中。 

在一种实施方式中，相对于焦脱镁叶绿素酶处理之前和/或之后的水平，本发明的方法降低所述组合物中的焦脱镁叶绿酸水平。因此，在一些实施方 式中，焦脱镁叶绿酸的浓度可在焦脱镁叶绿素酶处理之后增加。通常，所述方法包括去除焦脱镁叶绿酸的步骤，使得焦脱镁叶绿酸浓度低于焦脱镁叶绿素酶处理之后的浓度。优选地，由该酶促步骤产生的焦脱镁叶绿酸从所述组合物去除，使得所述组合物中的焦脱镁叶绿酸的终水平低于焦脱镁叶绿素酶处理前的水平。 

例如，相对于焦脱镁叶绿酸去除步骤之前(例如焦脱镁叶绿素酶处理之前或之后)存在于总组合物中的焦脱镁叶绿酸浓度(按重量)，所述方法可降低焦脱镁叶绿酸的浓度至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。因此，在具体实施方式中，在焦脱镁叶绿酸去除步骤之后，所述组合物(例如植物油)中的焦脱镁叶绿酸浓度可以为基于所述组合物(例如植物油)的总重量小于100mg/kg、小于50mg/kg、小于30mg/kg、小于10mg/kg、小于5mg/kg、小于1mg/kg、小于0.5mg/kg、小于0.1mg/kg或小于0.02mg/kg。 

焦脱镁叶绿素酶 

本发明的方法包括使含有焦脱镁叶绿素的组合物与具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶接触的步骤。任何具有能够修饰焦脱镁叶绿素的活性的多肽均可用作本发明方法中的酶。对于“焦脱镁叶绿素酶活性”，优选是指该酶可水解焦脱镁叶绿素中的酯键以产生叶绿醇和焦脱镁叶绿酸。因此，所述酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地，所述酶能够在油相中、任选还在水相中具有焦脱镁叶绿素酶活性。 

可使用任何合适的测定技术来检测焦脱镁叶绿素酶活性，例如，使用焦脱镁叶绿素作为底物基于下文实施例中所述的酶活性(脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性)测定的技术。例如，可使用基于荧光的技术来检测焦脱镁叶绿素酶活性，例如，如下文实施例5所述通过监测焦脱镁叶绿酸来检测。在一种合适的测定中，在焦脱镁叶绿素存在下温育待检测焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，并通过荧光检测来监测焦脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇水平。可选地，焦脱镁叶绿素酶测定可基于添加推定酶之后对于焦脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇水平的HPLC检测和定量，例如基于具体参考下文实 施例5的实例中所述的技术。 

可使用例如Ali Khamessan等(1994)，Journal of Chemical Technology & Biotechnology，60(1)，第73-81页；Klein和Vishniac(1961)，J.Biol.Chem.236：2544-2547；以及Kiani等(2006)，Analytical Biochemistry 353：93-98中所揭示的那些方法来检测焦脱镁叶绿素酶活性。在合适的情况下，可使用焦脱镁叶绿素代替叶绿素作为底物。 

可选地，合适的测定可基于添加推定的酶之后对于焦脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿酸水平的HPLC检测和定量，例如，基于下文所述的技术。在一种实施方式中，所述测定可基于Homero-Mendez等(2005)，Food Research International 38(8-9)：1067-1072中所述的方法。在另一种实施方式中，可使用下列测定。 

向170μl mM HEPES(pH 7.0)中添加20μl 0.3mM溶于丙酮的焦脱镁叶绿素。将酶溶于50mM HEPES(pH 7.0)。将10μl酶溶液添加至190μl底物溶液，以启动反应，并在40℃温育多个时间段。通过添加350μl丙酮来终止反应。在离心(18,000g，2分钟)之后，通过HPLC分析上清，并检测焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。 

1单位的焦脱镁叶绿素酶活性被定义为在40℃下，例如在本文所述的测定方法中每分钟水解1微摩尔焦脱镁叶绿素的酶量。 

在优选的实施方式中，例如通过本文所述的测定方法所检测，基于每g纯化酶的活性单位，本发明方法中使用的酶具有至少100U/g、至少250U/g或至少500U/g的焦脱镁叶绿素酶活性。 

在一些实施方式中，除了焦脱镁叶绿素酶活性之外，所述酶还可具有其他活性，例如脱镁叶绿素酶活性和/或叶绿素酶活性。因此，所述酶无需对于焦脱镁叶绿素具有选择性，并且除了焦脱镁叶绿素之外，还能够利用脱镁叶绿素和/或叶绿素作为底物，只要所述酶对于焦脱镁叶绿素显示显著活性。对于“酶”，意图包括具有焦脱镁叶绿素酶活性的任何多肽，包括例如催化抗体、酶片段等。任何分离、重组、合成或嵌合(或合成与重组的组合)多肽(例如，酶或催化抗体)均可以使用。因此，本发明使用的术语“焦脱镁叶绿素酶”包括能够水解焦脱镁叶绿素的任何多肽。脱镁叶绿素酶和叶绿素酶活性可通过与上文所述用于焦脱镁叶绿素酶的那些方法类似的方法来测定，在合适的情况 下，使用脱镁叶绿素或叶绿素代替焦脱镁叶绿素作为底物。 

在一种实施方式中，所述酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。更优选地，所述酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素，但不能水解叶绿素。例如，所述酶可以是脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)，例如Schelbert等，The Plant Cell 21：767-785(2009)中所述的酶。 

在另一种实施方式中，优选地，所述酶具有小于80、小于70、小于60、小于50、小于40或小于30的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。例如，所述酶具有0.1至70、1至50或10至30的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比可通过使用上文所述方法检测脱镁叶绿素酶活性和焦脱镁叶绿素酶活性，并通过由脱镁叶绿素酶活性除以焦脱镁叶绿素酶活性来计算。特别优选的具有低脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比的酶源自下文所述的小麦或衣藻。 

在一种实施方式中，所述酶源自小麦，例如来自小麦属，特别是来自普通小麦Triticum aestivum。例如，所述酶可为包含SEQ ID NO：21的序列的多肽(见图27)，或可由SEQ ID NO：22的核苷酸序列编码(见图28)。 

在另一种实施方式中，所述酶源自衣藻属，特别是来自莱茵衣藻。例如，所述酶可为包含SEQ ID NO：23的序列的多肽(见图29)，或可由SEQ ID NO：24的核苷酸序列编码(见图30)。 

在一种实施方式中，所述酶为叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶的N末端截短变体，例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4至12任一者、或SEQ ID NO：21或23的N末端截短变体。在具体的实施方式中，与母序列相比，这样的N末端截短变体在N末端可缺少至少1、2、5、10或15个氨基酸(例如，1至30或5至20个氨基酸)。在一种实施方式中，所述酶包含SEQ ID NO：25的序列(见图35)，即SEQ ID NO：21的N末端截短变体。 

令人惊讶地，发现来自小麦和衣藻的叶绿素酶具有焦脱镁叶绿素酶活性，和较低的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。另外，与野生型酶相比，小麦叶绿素酶的N末端截短变体具有降低的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。 

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶 

令人惊讶地发现，除了脱镁叶绿素，PPH和相关酶还能够水解焦脱镁叶绿素。然而，PPH对叶绿素没有活性。如Schelbert等人所述的，PPH直向同源物通常存在于真核光合作用生物中。PPH表现为在种系发生上不同于叶绿素酶的α/β水解酶亚组，这两组在序列同源性和底物上存在区别。 

在本发明的具体实施方式中，所述酶可为源自任何物种的任何已知PPH，或其功能性变体或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一种实施方式中，所述酶为来自拟南芥的PPH，例如包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID NO：2核苷酸序列编码的多肽(NCBI登录号NP_196884，GenBank ID No.15240707)，或它们的功能性变体或片段。在另一种实施方式中，所述酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码的多肽，或其功能性变体或片段。 

在其他实施方式中，所述酶可为源自任何下列物种的PPH：拟南芥、毛果杨、葡萄、水稻、玉米、烟草、绿色鞭毛藻、青绿藻、小立碗藓、三角褐指藻、莱茵衣藻或微胞藻RCC299。例如，所述酶可为包含表1中所示的下列数据库条目中任一所列的氨基酸序列或由其中所列的核苷酸序列编码的多肽，或其功能性片段或变体。 

表1 

例如，所述酶可为SEQ ID NO：5至12任一者所示的多肽，或其功能性片段或变体。 

变体和片段 

已知的焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)序列的功能性变体和片段也可用于本发明。对于“功能性”，是指所述片段或变体保留可检测的焦脱镁叶绿素酶活性。通常，所述变体和片段在至少约10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多残基或全长序列上显示与已知的焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)序列具有同源性，例如，与已知的焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1、或与SEQ ID NO：4至12任一者或表1中所示的序列，或与SEQ ID NO：21、23或25)至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。 

序列同一性百分数可通过使用序列比对算法分析或通过目测来确定。一方面，序列比对算法是BLAST算法，例如BLAST 2.2.2版算法。 

其他适用于本发明方法的具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶可通过确定存在于例如已知PPH序列中的保守序列基序的存在来鉴定。保守序列基序包括下列基序：LPGFGVG(SEQ ID NO：13)、DFLGQG(SEQ ID NO：14)、GNSLGG(SEQ ID NO：15)、LVKGVTLLNATPFW(SEQ ID NO：16)、HPAA(SEQ ID NO：17)、EDPW(SEQ ID NO：18)以及SPAGHCPH(SEQ ID NO：19)。因此，用于本发明的优选焦脱镁叶绿素酶包含这些序列中的一种或多种。GNSLGG(SEQ ID NO：15)基序含有活性位点丝氨酸残基。特别优选的是，用于本发明的方法的酶包含GNSLGG序列。可通过搜索基因组数据库、例如微生物组宏基因组数据库(JGI-DOE，USA)确定这些基序的存在来鉴定具有合适的焦脱镁叶绿素酶活性的多肽序列。 

焦脱镁叶绿素酶的分离和制备 

用于本发明的酶可从它们的天然来源分离或可例如使用重组DNA技术制备。可分离或构建编码具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列并将其用于制备相应的多肽。 

例如，可使用来自产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA构建基 因组DNA和/或cDNA文库。如果已知多肽的氨基酸序列，可合成标记的寡核苷酸探针并将其用于从由所述生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。可选地，也可使用含有与另一已知多肽基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，可使用严谨性较低的杂交和洗涤条件。 

可选地，可通过如下方法来鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入表达载体(例如质粒)、使用所产生的基因组DNA文库转化酶阴性细菌、然后将所转化的细菌铺板至含有被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此得以鉴定表达所述多肽的克隆。 

再者，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，第801-805页描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。 

所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成、基因组或cDNA来源(根据需要)的片段而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239，第487-491页)中所述。 

本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成或重组的来源，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。 

通常，使用重组DNA技术制备编码具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一种可选实施方式中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。 

酶序列的修饰 

一旦分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码推定的酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。 

可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含位于所需突变位点侧翼的核苷酸序列。Morinaga等(Biotechnology(1984)2，第646-649页)中公开了适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，第147-151页)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。 

可以随机引入突变以代替如上文所述的定点诱变，如使用可商购的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265涉及用于优化基于PCR的诱变的方法，其也可以与诸如EP 0 866 796中所述的那些DNA突变类似物结合使用。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的焦脱镁叶绿素酶变体。WO0206457提到了脂酶的分子进化。 

获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的焦脱镁叶绿素酶变体。适合进行“改组”的方法可以见EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其他形式的DNA诱变相结合。 

因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构类似性，但具有很低的氨基酸序列同源性。 

此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其他突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。 

应用上述以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下，鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶的变体，并能够产生不可预测但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。 

使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。适合地，用于本发明的编码焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)的核苷酸序列可以编码焦脱镁叶绿素酶变体(例如PPH变体)，即当与亲本酶比较时，所述焦脱镁叶绿素酶(例如PPH)可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶保持与亲本酶至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适合的亲本酶可以包括具有焦脱镁叶绿素酶活性的任何酶。 

焦脱镁叶绿素酶多肽序列 

本发明还涵盖由编码焦脱镁叶绿素酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列在本发明任一方法和/或用途中的用途。 

本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。 

一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下：可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵的50μl混合物(pH 8.4)中。在覆盖氮气并添加5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以添加5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。 

可以向以上反应混合物中添加135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在37℃氮气保护下消化24小时。可以使用溶剂A(0.1％TFA 的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新色谱分析。可以使用Applied Biosystems 476A测序仪，根据制造商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。 

序列比对 

在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。 

在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75％、85％或90％同一性，优选为至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的内容中，优选地，以序列同一性表示同源性。 

在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的内容中，优选地，以序列同一性表示同源性。 

可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其他序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。 

虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其他方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可 能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。 

然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对得到更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affine gap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分无疑将产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。 

因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI Advance^TM 11(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第18章)和FASTA(Altschul等1990 J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(见Ausubel等1999，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI Advance^TM 11程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；和FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8)。 

虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵(BLAST程序套装的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(更多细节详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI Advance^TM 11软件包的默认值。 

或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法的Vector NTI Advance^TM 11(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。一旦软件生成了最佳比对，就可以计算 同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。 

如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，则优选使用程序的默认参数进行成对比对。例如，下列参数是目前用于BLAST 2成对比对的默认参数： 

在一种实施方式中，优选地，核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可使用BLAST2(blastn)和如上所列的评分参数来确定。 

出于本发明的目的，同一性的程度基于相同的序列元件的数量来确定。本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法，如Vector NTI Advance^TM 11(Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用的评分参数优选为缺口开口罚分为11且缺口延伸罚分为1的BLOSUM62。 

适合地，在至少20个连续的核苷酸中、优选在至少30个连续的核苷酸中、优选在至少40个连续的核苷酸中、优选在至少50个连续的核苷酸中、优选在至少60个连续的核苷酸中、优选在至少100个连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。适合地，可在全长序列上测定核苷酸序列的同一性程度。 

氨基酸突变 

所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的二级结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团 的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。 

例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代： 

本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。也可以使用非天然氨基酸进行替换。 

变体氨基酸序列可以包含可以插入到序列的任何两个氨基酸残基间的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子(如甘氨酸或β-丙氨酸残基)外，还包括烷基基团(如甲基、乙基或丙基基团)。本领域的技术人员可充分理解其他形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。 

核苷酸序列 

本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’ 末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。 

本发明还涵盖与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其他生物等中相似的编码序列。 

可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其他变体。此外，可以获得其他病毒/细菌或细胞同源物，特别是存在于植物细胞中的细胞同源物，且所述同源物及其片段通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其他植物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分序列的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。 

也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用被设计为靶向变体和同源物内编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列的引物。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。 

简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其可以在严谨性低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件下使用。 

或者，也可以通过已表征的序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要改变沉默密码序列，从而根据表达多核苷酸序列的特定宿主细胞而优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其他序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。 

可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来制备引物(如PCR引物，用于可选扩增反应的引物)、探针(如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探针)；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其他片段的长度可以是至少15个、优选至少20个、例如至少25个、 30个或40个核苷酸，且其也涵盖在本文所用的术语“多核苷酸”之内。 

可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸，如DNA多核苷酸和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。 

通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。 

通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备在所需要克隆的焦脱镁叶绿素酶序列区域侧翼的一对引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物接触从植物细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以将引物设计成使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。 

焦脱镁叶绿素酶配制和用量 

用于本发明方法的酶，例如焦脱镁叶绿素酶，可被配制或修饰(例如化学修饰)成提高油溶性、稳定性、活性或用于固定。例如，用于本发明方法的酶可被配制成两亲性或更为亲脂。例如，用于本发明方法的酶可被包封在例如脂质体或凝胶(例如藻酸盐水凝胶或藻酸盐珠或等同物)中。用于本发明方法的酶可被配制在胶束系统，例如三元胶束(TMS)或反相胶束系统(RMS)介质中。用于本发明方法的酶可如Yi(2002)J.of Molecular Catalysis B：Enzymatic，第19卷，第319-325页中所描述的那样配制。 

本发明方法的酶促反应，例如使所述组合物与焦脱镁叶绿素酶接触的步骤，可在一个反应容器或多个反应容器中进行。一方面，本发明方法的酶促反应在植物油精制单元或工厂进行。在一种实施方式中，将具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶添加至所述组合物、例如植物油中。 

可以以任何合适的量将焦脱镁叶绿素酶添加到所述组合物，例如植物油中。例如，可以以约0.0001至1U/g组合物的范围、优选0.001至0.1U/g、例如0.005至0.01U/g组合物(例如植物油)的范围添加所述酶。应注意，根据 下文实施例中教导的“酶活性(脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性)测定”来定义1单位。 

本发明的方法可使用固定化酶，例如固定化焦脱镁叶绿素酶来实施。所述酶可固定于任何有机或无机支持体上。无机支持体的实例包括铝、硅藻土(celite)、Dowex-1-氯化物、玻璃珠以及硅胶。有机支持体的实例包括DEAE-纤维素、藻酸盐水凝胶或藻酸盐珠或等同物。在本发明的多个方面，脱镁叶绿素酶的固定化可通过物理吸附至无机支持体上来优化。用于实施本发明的酶可在不同介质中固定化，包括水、Tris-HCl缓冲液和含有Tris-HCl缓冲液、己烷以及表面活性剂的三元胶束系统。所述酶可固定于任何类型的基质上，例如滤器、纤维、柱、珠、胶体、凝胶、水凝胶、筛网等。 

酶反应条件 

合适地，可在约5℃至和约100℃之间、更优选10℃至约90℃之间、更优选约15℃至约80℃之间、更优选约20℃至约75℃之间、更优选约30℃至约60℃、优选约45℃至约55℃将所述组合物(例如植物油)与焦脱镁叶绿素酶一起温育(或混合)。在另一种实施方式中，合适地，本发明的方法和/或用途可在低于约60℃、优选低于约50℃、优选低于约40℃实施。优选地，在与酶混合时，所述组合物(例如植物油)的温度是期望的反应温度。 

可在酶添加之前和/或过程中将所述组合物(例如植物油)加热和/或冷却至期望的温度。因此，在一种实施方式中，本发明工艺的进一步的步骤可以是冷却和/或加热所述组合物(例如植物油)。 

合适地，反应时间(即保持混合物的时间段)，优选在搅拌下的反应时间，是足以允许水解焦脱镁叶绿素而生成焦脱镁叶绿酸和叶绿醇的时间段。例如，所述反应时间可为至少约1分钟，更优选至少约5分钟，更优选至少约10分钟。在某些实施方式中，所述反应时间可为约15分钟至约6小时之间，优选约15分钟至约60分钟之间，优选约30分钟至约120分钟。在某些实施方式中，所述反应时间可达6小时。 

优选地，在约pH 4.0至约pH 10.0之间、更优选在约pH 5.0至约pH 10.0之间、更优选在约pH6.0至约pH 10.0之间、更优选在约pH 5.0至约pH 7.0之间、更优选在约pH 5.0至约pH 6.5之间、更优选在约pH 6.5至约pH 7.5 之间、例如在约pH 7.0(即中性pH)实施所述工艺。在一种实施方式中，优选地，在约pH 5.5至约pH 6.0之间实施所述工艺。 

合适地，当与焦脱镁叶绿素酶一起温育(或混合)时，所述组合物(例如植物油)的水含量为约0.5％至约5％之间的水、更优选约1％至约3％之间，更优选约1.5％至约2％之间。 

当使用固定化酶时，合适地所述固定化酶的水活性可为约0.2至约0.98的范围、优选约0.4至约0.9之间，更优选约0.6至约0.8之间。 

植物(蔬菜)油的加工和精制 

在一种实施方式中，本发明的方法可用于植物源性油的酶促加工。在通常的植物油加工方法中，在己烷中萃取油，对粗制植物油进行脱胶(任选碱中和)、使用例如粘土吸附及随后的粘土清除来漂白，以及进行脱臭，以产生精制、漂白以及脱臭的或RBD油。对于脱胶步骤的需要取决于磷含量和其他因素(均为本领域已知)。 

在本发明的实施方式中，涉及应用焦脱镁叶绿素酶的酶促反应可在所述方法的多个阶段进行。例如，可在脱胶步骤过程中或在脱胶之后的漂白步骤(例如取代粘土漂白)中使焦脱镁叶绿素酶与粗制油接触。 

二氧化硅处理 

因此，在本发明的一种实施方式中，所述工艺包括对粗制植物油脱胶，使用具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶漂白，之后脱臭。优选地，所述方法包括二氧化硅处理步骤，特别是在焦脱镁叶绿素酶处理之后进行该步骤。例如，所述方法可包括使用无吸附剂或减少吸附剂的二氧化硅精制装置和工艺，这些为本领域已知，例如，使用TriSyl二氧化硅精制工艺(Grace Davison，Columbia，MD)或SORBSIL R^TM二氧化硅(INEOS Silicas，Joliet，IL)。 

与脱植基叶绿素不同，焦脱镁叶绿酸(和脱镁叶绿酸)的水溶性较低，不特别适于通过水萃取步骤去除。二氧化硅处理步骤特别适于去除由焦脱镁叶绿素酶作用而产生的焦脱镁叶绿酸(和脱镁叶绿酸)。焦脱镁叶绿酸(和脱镁叶绿酸)也可通过脱臭步骤去除。优选地，所述工艺包括脱臭步骤和二氧化硅处理步骤二者。 

更优选地，所述工艺包括两个阶段的二氧化硅处理，例如包括两个二氧化硅处理步骤，这两个二氧化硅处理步骤由去除二氧化硅的分离步骤(例如过滤步骤)分开。二氧化硅处理步骤优选在高温下进行，例如在约30℃以上，更优选约50至150℃，约70至110℃，约80至100℃或约85至95℃，最优选约90℃。 

脱胶和油精制 

所述方法可以与基于使用己烷萃取的工艺和/或随后将粗提物精制成食用油的工艺联合使用。例如，本发明的方法可以与酶辅助的油萃取联合使用(见Journal of Americal Oil Chemists’Society(2006)，83(11)，973-979)。精制工序的第一步是所谓的“脱胶”工艺，该过程通过添加水而分离磷脂。分离脱胶沉淀的物质并将其进一步加工成卵磷脂的混合物。可商购的卵磷脂，例如大豆卵磷脂和向日葵卵磷脂为半固体或非常粘稠的物质。它们由极性脂质(主要是磷脂)和油(主要是甘油三酯)的混合物组成。本发明的方法可在该工艺的任何步骤之前或之后、或在该工艺的各步骤的任何组合之前或之后或在其所有步骤之前或之后使用，例如在机械和/或化学萃取、脱胶和/或漂白等之前、过程中或之后使用。 

本发明的方法可用于任何任何脱胶工艺，包括水脱胶、ALCON油脱胶(例如用于大豆)、safinco脱胶、超级脱胶(″super degumning″)、超滤脱胶(UF degumming)、顶级脱胶(TOP degumming)、单脱胶(uni-degumming)、干法脱胶以及ENZYMAX^TM脱胶，见例如美国专利号6,355,693、6,162,623、6,103,505、6,001,640、5,558,781、5,264,367。 

本发明的方法可用于任何油加工方法，例如脱胶或等同工艺。例如，本发明的方法可用于美国专利号5,558,781、5,288,619、5,264,367、6,001,640、6,376,689、WO 0229022、WO 2006009676所述的工艺；例如WO 98118912所述的油脱胶等。并入本发明方法的多种脱胶工序描述在Bockisch，M.(1998)，Fats and Oils Handbook，The extraction of Vegetable Oils(第5章)，345-445，AOCS Press，Champaign，Illinois中。 

其他油加工步骤 

在一种实施方式中，在使用本发明焦脱镁叶绿素酶的酶处理步骤之后，使用诸如离心分离器之类的合适工具来分离经处理的液体(例如油)，并获得经加工的油。当完成酶处理时，如果需要的话，可再使用水或有机酸或无机酸(例如乙酸、磷酸、琥珀酸等)或使用盐溶液来洗涤经加工的油。 

还可使用美国专利号5,315,021中所描述的工艺来实施本发明的方法。例如，一方面，可通过用于从植物油去除非焦脱镁叶绿素酶的有色杂质的工艺、例如用于去除叶绿素，脱镁叶绿素及它们的衍生物的工艺来实施本发明的方法。例如，在一种实施方式中，所述工艺可包括将磷酸源分散于植物油中以形成含水量小于0.1重量％的混合物，该混合物保持在70℃至160℃的温度范围直至形成含有叶绿素颜色杂质的沉淀。随后，可通过从油中分离沉淀的物质，从而将叶绿素颜色杂质与沉淀物质一起去除，例如在传统的油加工过程中，包括从油中去除漂白的粘土。 

叶绿素酶处理 

在一种实施方式中，所述方法(例如植物油加工方法)还可包括使所述组合物与叶绿素酶接触的步骤，例如使用WO 2006009676中所描述的方法。例如，一方面，所述方法可包括通过将叶绿素水解为叶绿醇和叶绿素酸酯而酶处理含有叶绿素或被叶绿素污染的组合物的步骤。任何叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)或叶绿素-脱植基叶绿素水解酶或具有相似活性的多肽(例如，叶绿素-脱植基叶绿素水解酶1或叶绿素酶1，或叶绿素-脱植基叶绿素水解酶2或叶绿素酶2，分别见例如NCBI P59677-1和P59678)均可用于本发明方法的该步骤。 

催化叶绿素酯键而产生脱植基叶绿素和叶绿醇的任何多肽均可用于本发明方法的该步骤。在一种实施方式中，所述酶是根据酶命名分类归类的叶绿素酶(E.C.3.1.1.14)。可使用任何分离、重组、合成或嵌合(合成与重组的组合)多肽(例如酶或催化抗体)，见例如Marchler-Bauer(2003)Nucleic Acids Res.31：383-387。一方面，所述叶绿素酶可为WO 0229022或WO 2006009676中描述的酶。例如，可使用例如NCBI登录号NM_123753中所描述的拟南芥叶绿素酶。因此，所述叶绿素酶可为包含图22b中所示的SEQ ID NO：20序列的多肽。在另一种实施方式中，所述叶绿素酶源自藻类，例如三角褐指藻。 

如WO 2006009676中所描述的，脱植基叶绿素可通过水分离步骤和/或二氧化硅处理而去除。所述方法可进一步包括改变pH(例如提高pH)以促进脱植基叶绿素的水分离。因此，本发明的方法还可包括碱中和过程，例如使用碱中和的pH条件。一方面，本发明的组合物和方法包括中和步骤。 

其他酶处理 

在其他方面，本发明的工艺还包括使用脂质酰基转移酶、磷脂酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶)、葡聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、半乳糖脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶及其他植物细胞壁降解酶，以及混合的酶制剂以及细胞裂解酶。在可选的方面，本发明的工艺可以与其他工艺、例如酶处理，如使用糖酶，包括纤维素酶、半纤维素酶以及其他降解活性，或化学工艺(例如大豆油的己烷萃取)联合实施。在一种实施方式中，本发明的方法可以与WO 2006031699中所定义的方法结合实施。 

一方面，本发明的方法可通过如美国专利号6,376,689中所描述的方法来实施。例如，一方面，本发明的组合物和方法可包括从来自种子、特别是具有大量叶绿素类化合物的冻伤种子的植物油去除焦脱镁叶绿素和任选焦脱镁叶绿素衍生物、脱镁叶绿素、叶绿素以及相关化合物的单步酸脱胶/脱臭过程。一方面，本发明的方法还包括与油掺混在一起以从油中去除叶绿素类化合物的含水硫酸和磷酸的混合物。 

植物油加工装置和方法 

在又一方面，本发明提供了用于酶处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的装置，所述装置包括(a)植物(例如蔬菜)油精制装置和(b)可操作地并入所述植物(例如蔬菜)油精制装置中的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽。通常，将具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽并入所述装置中，使得其能够在加工含有焦脱镁叶绿素的组合物(例如植物油)过程中水解焦脱镁叶绿素。 

所述装置可包括任何合适的植物油精制装置或其组合，例如螺旋榨油机(例如来自Pennwalt Corp.)或重力胶分离装置。所述装置可包含固定化酶，例如，固定化焦脱镁叶绿素酶和任选固定化叶绿素酶。例如，所述装置可包含 二氧化硅固定化的焦脱镁叶绿素酶。在一种实施方式中，所述二氧化硅包括硅胶或等同物，例如TriSyl二氧化硅或SORBSIL R^TM二氧化硅。所述装置可进一步包含用于调整pH的工具，例如提高pH(碱处理)以及然后可选地中和pH的工具。 

在一种实施方式中，可在图24例示的油精制工艺中实施本发明的方法。该工艺的第一个阶段包括己烷萃取以生成粗制油，之后进行水脱胶、碱中和、漂白、二氧化硅处理以及脱臭。如图24所示，可在该工艺的多个阶段应用焦脱镁叶绿素酶处理，包括在水脱胶过程中或在二氧化硅处理之前应用于粗制油。脱胶可为“传统的”脱胶或酶脱胶，例如涉及磷脂水合和/或水解。 

如图24所例示的方法中，还可使用叶绿素酶，可以在与焦脱镁叶绿素酶处理相同或不同的阶段进行叶绿素酶处理。焦脱镁叶绿素酶(和任选叶绿素酶)处理可被认为是酶漂白步骤，且可取代传统的粘土吸附漂白步骤。在一方面，本发明的例示工艺包括其后的水分离步骤，以去除叶绿素酶处理的反应产物、胶质和/或皂化物(soap)。 

在一种可选的实施方式中，焦脱镁叶绿素酶处理可在进行图24所示的加工步骤之前，即在己烷萃取之前应用于油料种子制剂。 

图25描述了本发明的方法和装置的另一种实施方式。图25描述了植物油精制装置的多个方面，包括组件例如脱胶槽、静态混合器、日用油槽(day tank)、碱槽、过滤器、滞留混合器、精制离心机、水洗离心机以及真空干燥器。本发明具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶可用于一个或多个或所有的下列步骤中：在脱胶工艺中添加至粗制油中或添加至脱胶油中，添加至储存槽或贮藏槽、碱槽和/或滞留混合器。例如，在具体实施方式中，可将固定于二氧化硅上的焦脱镁叶绿素酶添加至日用油槽或滞留混合器。 

结合下列实施例进一步描述本发明，然而，应理解，本发明不限于这些实施例。 

实施例 

在下列实施例中，通过重组DNA方法表达来自拟南芥的脱镁叶绿素酶，并分离对于植物油中的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素二者均具有活性的脱镁叶绿素酶。然后，可通过诸如吸附至二氧化硅和/或通过脱臭去除油中由叶绿素 酶/焦脱镁叶绿素酶活性所产生的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。二氧化硅对于去除极性降解产物脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸非常有效。 

材料 

所使用的酶是来自拟南芥的脱镁叶绿素酶(At PPH，GenBank ID 15240707)，为含有5单位/ml脱镁叶绿素酶的水溶液。 

根据下列操作将脱镁叶绿素酶固定于二氧化硅上。将3.0g二氧化硅(来自Grace Davison的Sigma S5505或Trisyl 300)添加至6ml所得脱镁叶绿素酶(细胞提取物)中并在室温下搅拌2小时。通过在3000g离心10分钟回收二氧化硅。使用软化水洗涤沉淀的二氧化硅二次。 

使用来自Scanola DK的含有7ppm脱镁叶绿素和5ppm焦脱镁叶绿素的粗制菜籽油作为所述油。 

根据“Extraction，Purification，and Characterization of chlorophylls from Spinach Leaves.”Journal of Agricultural and Food Chemistry 40.2(1992)：215-220通过酸处理从菠菜叶绿素制备脱镁叶绿素。将脱镁叶绿素(0.98mg/ml)溶于丙酮。 

根据“Determination of chlorophylls and their derivatives in Gynostemma pentaphyllum Makino by liquid chromatography-mass spectrometry.”，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 48.1(2008)：105-12通过在100℃热处理从溶于吡啶中的脱镁叶绿素制备焦脱镁叶绿素(0.5mg/ml)。脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸获自Frontier Scientific。 

分析方法 

根据下列条件进行HPLC分析，大体如“Determination of chlorophylls and carotenoids by high-performance liquid chromatography during olive lactic fermentation”，Journal of Chromatography，585，1991，259-266中所述。 

色谱条件 

叶绿素A和B的储备液如下制备：将5mg来自组囊藻(Anacystis nidulans)的叶绿素A溶于5ml丙酮中。将5mg来自菠菜的叶绿素B(Sigma Life Science 25740)溶于5ml丙酮。将各叶绿素溶液转移至5ml量瓶，分至10个小瓶，每瓶500μl，冷冻储存。将各200μl的叶绿素A和B储备液添加至20ml丙酮，并将1μl所得溶液添加至10ml丙酮以提供用于HPLC的对照溶液。 

根据大体上如“Routine and sensitive SPE-HPLC method for quantitative determination of pheophytin a and pyropheophytin a in olive oils”，Food Research International，38，2005，1067-1072所述的固相萃取操作，使用Sep-Pak  ^*Plus tC18 Environmental Cartridge(WAT036800)，900mg，17％ Carbon Load浓缩油样品中的脱镁叶绿素。 

两个tC18筒串联装配(2×900mg，滞留体积大约3ml)。使用5ml石油醚调整tC18筒(40-60℃品质)，而不使柱干燥。将1ml油样品吸入2ml一次性注射器，并加压使样品通过tC18筒。使用12ml石油醚(使用10ml一次性注射器)洗涤药筒。 

使用6ml丙酮洗脱叶绿素衍生物(使用5ml一次性注射器)。在氮气下蒸发丙酮溶液至干燥。温度保持在50-60℃。在0.5ml丙酮中复溶萃取的样品，并在4500rpm/3260rcf下离心5分钟。将样品转移至具有插入片的小瓶中并进行分析。 

根据固相萃取操作，使用IST Isolute^TM SPE柱(460-0050-B)(二氧化硅，500mg)浓缩油样品中的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。基本如用于tC18筒的方法实施操作，但使用环己烷代替石油醚。 

图1中给出了典型的HPLC色谱(来自Journal of Chromatography，585，1991，259-266)的实例和峰值的分配。 

酶活性(脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶活性)测定 

将170μl mM HEPES(pH 7.0)添加至溶于丙酮中的20μl 0.3mM脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶于50mM HEPES(pH 7.0)。将10μl酶溶液添加至190μl底物溶液以启动反应，并在25℃温育多个时间段。通过添加350μl丙酮终止反应。在离心(18,000g，2分钟)之后，通过HPLC分析上清，测定脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。将脱镁叶绿素酶活性的1单位酶活性定义为每分钟水解1微摩尔的脱镁叶绿素。将焦脱镁叶绿素酶活性的1单位酶活性定义为每分钟水解1微摩尔的焦脱镁叶绿素。 

实施例1 

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(脱镁叶绿素酶)在里氏木霉中的表达 

从下列NCBI序列数据库搜索得到由来自拟南芥的AT5G13800基因编码的氨基酸序列(蛋白质登录号BAH19780)： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝protein&cmd＝search&term＝AT5G13800。序列显示于图10(SEQ ID NO：1)。AT5G13800基因编码484个氨基酸长的蛋白质，该蛋白质由具有438个氨基酸的成熟蛋白和具有46个残基的N末端叶绿体转运肽构成。图10中以粗体显示叶绿体转运肽。该蛋白质被表征为脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(脱镁叶绿素酶＝PPH)，Plant Cell.2009，21(3)：767-785。 

对于该基因的异源表达，合成具有被优化用于在里氏木霉中表达的密码 子的合成PPH基因(图12)。通过kexin连接子(图12中以粗体表示，辛肽TSVAVEKR)代替N末端转运肽。合成的PPH基因和多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)示于图12。 

制备由通过kexin连接子与成熟脱镁叶绿素酶蛋白融合的纤维二糖水解酶1(cbh1)催化核组成的融合构建体。通过使用限制性酶Spe1和Asc1限制性消化合成的PPH基因并分离待用作插入片段的该片段来制备示于图13中的表达构建体pSMMTrex4-kexPPH。Spe1/Asc1切段和碱性磷酸酶处理的木霉载体Trex4用于连接反应。最终的表达盒pSMMTrex4-kexPPH分别在5’和3’端含有侧邻PPH合成基因的里氏木霉纤维二糖水解酶1(cbh1)基因的启动子和终止子区。它还含有作为用于转化里氏木霉的可选择标记的组囊藻乙酰胺酶amdS基因。 

通过将编码成熟PPH蛋白的合成基因直接与两个不同的信号肽，即纤维二糖水解酶1(cbh1)信号肽和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)脂酶3前信号序列融合来制备两个其他的表达构建体。 

用于转化的菌株是里氏木霉，是从中缺失了编码两种分泌的纤维二糖水解酶CBHI和CBHII和两种分泌的葡聚糖内切酶EGI和EGII的基因的非GMM菌株RL-P37的衍生菌。 

里氏木霉四缺失(quad delete)宿主菌株的转化 

使用PDS-1000Helium系统(BioRad Cat.No.165-02257)通过基因枪转化将含有拟南芥脱镁叶绿素酶基因的表达构建体pSMMTrex4-kexPPH转化至里氏木霉。 

制备来自四缺失的里氏木霉菌株的孢子悬浮液。将200μl孢子悬浮液涂布于基本培养基(MM)乙酰胺培养板中心。MM乙酰胺板的组成如下：0.6g/l乙酰胺；1.68g/l CsCl；20g/l葡萄糖；20g/l KH₂PO₄、0.6g/l CaCl₂ 2H₂O；1ml/l 1000×微量元素溶液；20g/l Noble琼脂；以及pH5.5。1000×微量元素溶液含有5.0g/l FeSO₄ 7H₂O、1.6g/l MnSO₄、1.4g/l ZnSO₄ 7H₂O和1.0g/l CoCl₂ 6H₂O。使得孢子悬浮液在无菌操作台中的MM乙酰胺培养基表面干燥1小时。遵照制造商的说明书进行转化。将60mg钨颗粒置于微离心管中。添加1ml乙醇，使得静置15秒。去除乙醇，并使用无菌蒸馏水(dH₂O)洗涤三次，然后添加 250μl 50％(v/v)无菌甘油。将25μlg钨颗粒悬浮液置于微离心管。在连续涡旋下，添加下列物质：5μl(100-200ng/μl)质粒DNA，25μl 2.5M CaCl₂以及10μl 0.1M精脒(spermidine)。离心颗粒3秒。去除上清，使用200μl 100％乙醇洗涤，并离心3秒。去除上清。添加24μl 100％乙醇，并通过抽吸混合，然后移取8μl的颗粒等份，并将其置于保持于干燥器中的微载体盘中心。当钨/DNA溶液干燥时，将微载体盘连同具有孢子的MM乙酰胺板一起置于轰击腔内，根据制造商的说明书进行轰击过程。在使用钨DNA颗粒轰击铺板的孢子之后，在28℃下温育板。将转化的菌落转移至具有MM乙酰胺培养基的新鲜平板，并在28℃下温育。 

转化体的培养 

在MM乙酰胺板上培养5天之后，将通过基因枪转化并表现稳定形态学的转化体接种至50ml摇瓶的15ml NREL-木霉葡萄糖/槐糖限定培养基中。NREL-木霉葡萄糖/槐糖限定培养基(每升)的组成如下：5g(NH₄)₂SO₄，33g PIPPS缓冲剂，9g酪蛋白氨基酸，4.5g KH₂PO4，1g CaCl₂(无水)，1g MgSO₄.7H₂O，用50％NaOH调整pH至5.50，使用milli-Q H₂O定容至966.5mL。在灭菌之后，添加如下物质：5mL Mazu，26mL 60％的葡萄糖/槐糖以及2.5mL 400×里氏木霉痕量金属。摇动下在28℃温育摇瓶培养物5天。 

筛选重组PPH表达 

通过离心去除菌丝，并分析上清中是否存在重组PPH。通过SDS-PAGE使用4-12％ NuPAGE和MES作为电泳缓冲液来测定稳定转化体的蛋白谱。将上清样品与具有还原剂的合适体积的2×样品上样缓冲液一起混合。使用Simply blue Safe stain(Invitrogen)对凝胶进行染色。图14显示了示出由转化体表达的高水平PPH蛋白的条带的SDS凝胶，分子量范围在50-60kDa左右。强染色条带代表2种蛋白，融合配偶体cbh1催化核心&低分子条带代表PPH蛋白。 

其他与拟南芥脱镁叶绿素酶具有高序列同一性的推定PPH蛋白的存在 

进行试验以鉴定序列数据库中编码具有脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶 活性的酶的基因，并鉴定可用于诊断性鉴定推定PPH的标志基序。功能上得以表征的脱镁叶绿素酶蛋白序列，即Schelbert等，2009，Plant Cell 21(3)：767-85所描述的来自拟南芥的叶绿体定位蛋白用作关于美国国立生物技术信息中心(NCBI)的非冗余(nr)蛋白数据库的BLAST分析的条目。发现许多推定的PPH基因存在于杨属、葡萄属、蓖麻属、稻属、烟草属、玉米属以及小立碗藓属的不同植物中。 

基于与已知的拟南芥PPH的高氨基酸同一性将来自多种物种的蛋白质序列鉴定为推定的PPH。不同的推定PPH与拟南芥PPH的序列同一性范围为50％至63％，如下表所示： 

在推定的玉米和水稻PPH之间观察到高达78％的序列同一性。所鉴定的PPH源自下列物种(其后是NCBI数据库登录号和SEQ ID以及附图号)：毛果杨(XP_002314066，SEQ ID NO：5，图15)；葡萄(XP_002271167，SEQ ID NO：6，图16)；蓖麻(EEF48653，SEQ ID NO：7，图17)；水稻(日本栽培群)(NP_001057593，SEQ ID NO：8，图18)；玉米(NP_001141976，SEQ ID NO：9，图19)；烟草(CAO99125，SEQ ID NO：10，图20)；水稻日本栽培群(BAG91172，SEQ ID NO：11，图21)；小立碗藓小立碗亚种(XP_001761725，SEQ ID NO：12，图22a)。 

图23显示了功能上表征的来自拟南芥的脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶 与推定的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶的比对，显示了几个保守氨基酸残基区。保守区具有下列氨基酸序列：LPGFGVG(SEQ ID NO：13)、DFLGQG(SEQ ID NO：14)、GNSLGG(SEQ ID NO：15)、LVKGVTLLNATPFW(SEQ ID NO：16)、HPAA(SEQ ID NO：17)、EDPW(SEQ ID NO：18)以及SPAGHCPH(SEQ ID NO：19)。可将这些保守区用于鉴定脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶家族的新成员，通过搜索测序的基因组数据库、筛选宏基因组文库或通过使用这些氨基酸作为PCR中的简并寡核苷酸探针来鉴定存在于不同含叶绿体的生物(例如植物、藻类、蓝细菌以及含有光合叶绿素的细菌)的新PPH基因。 

可单独使用这些保守PPH基序来搜索来自基因组数据库、微生物组宏基因组数据库(JGI-DOE，USA)的序列的PPH。在搜索新PPH中，除了第一保守基序以外，还可使用第二保守基序。GNSLGG(SEQ ID NO：15)基序含有活性位点丝氨酸残基，可与其他6个基序一起用于鉴定来自植物、藻类以及细菌的新PPH候选物。 

实施例2 

根据表2的配方来检测粗制菜籽油中的脱镁叶绿素酶(例如，如实施例1中制备的具有焦脱镁叶绿素酶活性的PPH)。 

表2 

		1	2
				粗制菜籽油	g	100	100
柠檬酸，45％水溶液	ml	0.14	0.14
				NaOH，10％水溶液	ml	0.27	0.27
水	ml	2.7	2.4
				脱镁叶绿素酶3U/ml	ml	0	0.25

搅拌下将粗制菜籽油加热至30℃。将柠檬酸添加至油中，并使用高切应力混合器对样品匀化20秒。在搅拌10分钟之后，添加NaOH和水。然后添加脱镁叶绿素酶。再使用高切应力混合器对样品匀化20秒。搅拌持续2小时。 

然后在沸水浴中加热样品10分钟，并在3000rcf.离心3分钟。分离油相，通过在30℃和20hPa真空蒸馏来去除油中的残留水。将75g干燥油加热至 90℃，并添加0.75g二氧化硅(Trisyl 300)。在90℃下将油与二氧化硅一起搅拌60分钟。然后通过离心或过滤分离二氧化硅与油。 

在粗制菜籽油的酶处理中，在分别生成叶绿醇和脱镁叶绿酸/焦脱镁叶绿酸的过程中，油中大于90％的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素被水解。酶处理之后，油的二氧化硅处理及干燥去除油中90％的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。 

实施例3 

根据表3中的配方检测粗制菜籽油中的脱镁叶绿素酶。 

表3 

搅拌下将粗制菜籽油加热至30℃，并添加水。然后添加固定于二氧化硅上的脱镁叶绿素酶。在30℃下搅拌样品2小时，然后通过离心分离酶与油。通过HPLC分析，检测到90％的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素被分别水解为叶绿醇和脱镁叶绿酸/焦脱镁叶绿酸。 

将使用固定化脱镁叶绿素酶处理过的油相添加至1g二氧化硅(Trisyl 300)。在90℃下将油与二氧化硅一起搅拌60分钟。然后通过离心或过滤分离二氧化硅与油。 

酶处理之后对于油的二氧化硅处理及干燥去除油中90％的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。然后在240℃和0.5hPa对油进行脱臭1小时。在脱臭之后，99％通过酶反应产生的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸被去除。 

实施例4 

根据表4中的配方检测粗制菜籽油中的脱镁叶绿素酶。 

表4 

^*可如WO 2004/064987中所述检测脂质酰基转移酶活性。 

搅拌下将粗制菜籽油加热至55℃。将柠檬酸添加至油中，并使用高切应力混合器对样品匀化20秒。在搅拌10分钟之后，添加NaOH和水。然后添加酰基转移酶。再使用高切应力混合器对样品匀化20秒。搅拌持续1小时。 

然后在3000rcf.离心样品3分钟。分离油相，通过在60℃和20hPa真空蒸馏来去除油中的残留水。将75g干燥油冷却至30℃，并在搅拌下与固定化脱镁叶绿素酶一起温育1小时。然后去除固定化酶。将油加热至90℃，并添加0.75g二氧化硅(Trisyl 300)。在90℃下将油与二氧化硅一起搅拌30分钟。然后通过离心或过滤分离二氧化硅与油。然后，在250℃和0.5hPA对油进行脱臭60分钟。 

在使用脱镁叶绿素酶对粗制菜籽油进行的酶处理中，在分别生成叶绿醇和脱镁叶绿酸/焦脱镁叶绿酸过程中，油中大于95％的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素被水解。酶处理之后对于油的二氧化硅处理去除油中90％的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。脱臭过程去除95％残留的脱镁叶绿酸/焦脱镁叶绿酸。 

实施例5 

在此实施例中，证实了精制工艺中的脱臭步骤对于油中脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸水平的影响。通常，脱臭是油精制的最后一步。在精制菜籽油的模式系统中检测脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸，其中在所述系统中以已知浓度添加这些组分。 

向精制菜籽油中添加浓度为2mg/kg油(2ppm)的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸，并添加浓度为3ppm的脱镁叶绿素作为参照(表5)。 

表5 

脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的荧光检测 

使用精制菜籽油稀释表5的溶液2、3以及4，分别得到浓度为3至0.04ppm和2至0.03ppm的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。将200μl这些样品转移至荧光微量滴定板，并使用410nm的激发光和672nm的发射光在25℃检测荧光RFU，结果示于表6。 

表6 

基于表6中的结果，构建校准曲线，并将其用于计算未知的样品。 

在圆底玻璃烧瓶中于240℃和下0.15mBar使用蒸汽喷射对500g包含表5中所列的组分的精制菜籽油进行脱臭1小时。 

对添加了脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的油样品(表5)进行脱臭，并在荧光微量滴定板读板机上检测脱臭之前和之后的油样品。基于从 油中脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的标准混合物(表6)获得的校准曲线，检测这些组分的量，结果示于表7。 

表7：添加了脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的油在脱臭之前和之后的荧光分析 

表3中的结果表明脱臭过程降低了油中脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的水平。 

还通过HPLC分析样品，HPLC分析的色谱图示于图2至9。HPLC色谱图清楚地显示了脱臭对于脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的水平的影响。脱臭之后的脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸水平均低于这两种组分的检测水平，因此不可能计算脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的量。对含脱镁叶绿素的油进行脱臭也将该组分降低至低于检测限的水平，但样品中显现新的组分(图9)，预期为焦脱镁叶绿素。 

实施例6 

在该实施例中，证实了在本发明的方法中可通过吸附于二氧化硅上而从油中去除脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。在油加工中使用二氧化硅来去除包括磷脂、皂化物以及金属离子的极性组分，但二氧化硅对于去除叶绿素、脱镁叶绿素以及脱镁叶绿素无效。 

在Wheaton玻璃瓶中量取10g油(表5)，并添加0.1g Trisyl 300二氧化硅。搅拌样品10分钟。然后通过在4000rcf离心5分钟去除二氧化硅。 

在wheaton玻璃瓶中量取5g离心后的油相，并添加0.050g Trisyl 300。搅拌样品10分钟，然后通过在4000rcf离心5分钟去除二氧化硅。 

在25℃和90℃两个温度下进行二氧化硅处理。 

还对于添加了脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸的油样品(表5)使用二氧化硅(Trisyl 300)处理。在该试验中，还研究了温度的影响。根据操作程序进行二氧化硅处理，并对于二氧化硅处理前及二氧化硅处理一次和两次后的样品通过荧光进行分析，并基于组分的标准混合物(表6)的校准曲线计算组分的量。 

二氧化硅处理的结果示于表8。 

表8 

表8中的结果证实了温度对于脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸吸附于二氧化硅是非常重要的。特别地，在90℃下二氧化硅处理对于去除脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸比在25℃处理更有效。结果清楚地证实两步二氧化硅处理比单步二氧化硅处理要有效地多。结果还表明脱镁叶绿素并非有效地吸附至二氧化硅上。基于这些结果，得出如下结论：脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿素更容易吸附至二氧化硅上。 

这些结果表明二氧化硅吸附和脱臭的组合用于在油精制过程中取出脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸中的应用。 

实施例7： 

来自普通小麦(小麦)的叶绿素酶在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达 

将编码小麦叶绿素酶(SEQ.ID No.21)的核苷酸序列(SEQ ID No.22)与枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)的信号肽一起在枯草芽孢杆菌中表达(见图31)。对于在芽孢杆菌中的最佳表达，在GenScript(GenScript Corporation，Piscataway，NJ 08854，USA)定制密码子优化的基因构建体(TRI_CHL)。 

构建体TRI_CHL含有位于小麦叶绿素酶编码区上游以与aprE信号序列融合的具有BssHII限制性位点的20个核苷酸，和用于克隆至芽孢杆菌表达载体pBNppt中的位于所述编码区之后的PacI限制性位点。 

使用BssHII和PacI消化构建体TRI_CHL，并使用T4DNA连接酶连接至BssHII和PacI消化的pBNppt中。 

将连接混合物转化至大肠杆菌(E.coli)TOP10细胞。通过DNA测序(DNA Technology A/S，Risskov，Denmark)验证含有TRI_CHL基因的BssHII和Pac插入序列，将其中一个正确的质粒克隆命名为pBN-TRI_CHL(图32)。如WO 2003/099843中所述，将pBN-TRI_CHL转化至枯草芽孢杆菌菌株BG 6002(AK 2200的衍生菌)。 

筛选得到一个新霉素抗性(neoR)转化体，将其用于小麦叶绿素酶的表达。 

实施例8： 

来自莱茵衣藻(青绿藻)的叶绿素酶在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达 

将编码衣藻叶绿素酶(SEQ.ID No.23，下文称作衣藻叶绿素酶)的核苷酸序列(SEQ ID No.24)与枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)的信号肽一起在枯草芽孢杆菌中表达。对于在芽孢杆菌中的最佳表达，在GenScript(GenScript Corporation，Piscataway，NJ 08854，USA)定制密码子优化的基因构建体(CHL_CHL)。 

构建体CHL_CHL含有位于衣藻叶绿素酶编码区上游以与aprE信号序列融合的具有BssHII限制性位点的20个核苷酸，和用于克隆至芽孢杆菌表达载体pBNppt中的位于所述编码区之后的PacI限制性位点。 

使用BssHII和PacI消化构建体CHL_CHL，并使用T4DNA连接酶连接至BssHII和PacI消化的pBNppt中。 

将连接混合物转化至大肠杆菌TOP10细胞。通过DNA测序(DNA Technology A/S，Risskov，Denmark)验证含有CHL_CHL基因的BssHII和Pac插入物序列，将其中一个正确的质粒克隆命名为pBN-CHL_CHL(图20)。如WO 2003/099843中所述，将pBN-CHL_CHL转化至枯草芽孢杆菌菌株BG 6002(AK 2200的衍生菌)。 

筛选得到一个新霉素抗性(neoR)转化体，将其用于衣藻叶绿素酶的表达。 

实施例9： 

普通小麦叶绿素酶的N末端截短变体的克隆与表达 

在该实施例中，构建了与野生型酶相比缺乏N末端16个氨基酸的普通小麦叶绿素酶的变体。将该变体命名为小麦Nd1-16，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：25。在枯草芽孢杆菌中表达编码具有枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)的信号肽的该变体的核苷酸序列(SEQ ID No：26)。对于在芽孢杆菌中的最佳表达，在GenScript(GenScript Corporation，Piscataway，NJ 08854，USA)安置密码子优化的基因构建体(TRI_CHL-S)。 

构建体TRI_CHL-S含有位于小麦叶绿素酶编码区上游与与aprE信号序列融合的具有BssHII限制性位点的20个核苷酸，和用于克隆至芽孢杆菌表达载体pBNppt中的位于所述编码区之后的PacI限制性位点。 

使用BssHII和PacI消化构建体TRI_CHL-S，并使用T4 DNA连接酶连接至BssHII和PacI消化的pBNppt中。 

将连接混合物转化至大肠杆菌TOP10细胞。通过DNA测序(DNA Technology A/S，Risskov，Denmark)验证含有TRI_CHL基因的BssHII和Pac插入物序列，将其中一个正确的质粒克隆命名为pBN-TRI_CHL-S。将pBN-TRI_CHL-S转化至枯草芽孢杆菌菌株BG 6002(AK 2200的衍生菌)(见US2003/015859和WO/2003/099843)。 

筛选得到一个新霉素抗性(neoR)转化体，将其用于小麦叶绿素酶的表达。 

实施例10： 

叶绿素酶的焦脱镁叶绿素酶活性 

检测实施例7至9中所描述的酶的焦脱镁叶绿素酶和脱镁叶绿素酶活性，并与拟南芥叶绿素酶(SEQ ID NO：20)的活性进行比较。结果示于下表： 

上表所示的脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶活性是指实验中每分钟水解的底物(脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的微摩尔量。 

上表显示了多种叶绿素酶对于脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的活性，并将活性比计算为脱镁叶绿素酶活性/焦脱镁叶绿素酶活性。活性降低比表明水解焦脱镁叶绿素能力增加的转变，这对于具有显著水平的焦脱镁叶绿素的油是有利的。 

拟南芥叶绿素酶具有高脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。然而，令人惊讶地，来自衣藻和小麦的酶具有低得多的活性比，对于焦脱镁叶绿素的 活性相对增加。另外，叶绿素酶N末端截短可产生与全长酶相比较低的活性比，如对于与野生型酶相比缺乏N末端16个氨基酸的小麦叶绿素酶的变体所证实的。 

上述说明中提及的所有出版物均在此通过引用并入本文。在不偏离本发明范围和精神的情况下，对于所描述的本发明方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定优选的实施方式描述了本发明，但应理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这些特定实施方式。实际上，对于生物化学和生物技术领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述方式的各种修改预期落在下列权利要求的范围内。 

Claims (27)

1.一种用于处理含有焦脱镁叶绿素的组合物的方法，其包括使所述组合物与能够水解焦脱镁叶绿素的酶接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括植物源性油。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述酶包括脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。

4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述酶源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、烟草(Nicotiana tabacum)、绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、普通小麦(triticum aestivum)或微胞藻(Micromonas sp.)RCC299。

5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列：LPGFGVG(SEQ ID NO：13)、DFLGQG(SEQ ID NO：14)、GNSLGG(SEQ ID NO：15)、LVKGVTLLNATPFW(SEQ ID NO：16)、HPAA(SEQ IDNO：17)、EDPW(SEQ ID NO：18)以及SPAGHCPH(SEQ ID NO：19)。

6.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述酶包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4至12任一者或SEQ ID NO：21、23或25任一者所示的多肽序列或其功能性片段或变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酶包含在至少50个氨基酸残基上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4至12任一者或SEQ ID NO：21、23或25任一者具有至少75％序列同一性的多肽序列。

8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述组合物中的焦脱镁叶绿素被水解生成焦脱镁叶绿酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其还包括从所述组合物中去除焦脱镁叶绿酸的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法包括脱臭步骤。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述方法包括二氧化硅处理的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括两个或多个二氧化硅处理步骤。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述二氧化硅处理在约70至110℃下进行。

14.根据前述任一权利要求所述的方法，其中将所述能够水解焦脱镁叶绿素的酶固定于固体支持体上。

15.根据前述任一权利要求所述的方法，其还包括使所述组合物与具有叶绿素酶活性的酶接触。

16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述具有叶绿素酶活性的酶固定于固体支持体上。

17.根据权利要求2至16任一项所述的方法，其中所述组合物包括选自米糠油、大豆油、油菜籽油、棕榈油、橄榄油、棉籽油、玉米油、棕榈仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油的油。

18.根据前述任一权利要求所述的方法，其中，与处理前存在于所述组合物中的焦脱镁叶绿素的浓度相比，所述组合物中焦脱镁叶绿素的浓度降低至少10％。

19.一种用于精制植物油的工艺，其包括前述任一权利要求所述的方法。

20.根据权利要求19所述的工艺，其还包括己烷萃取和/或脱胶步骤。

21.具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽用于从组合物中去除焦脱镁叶绿素污染的用途。

22.一种用于对含有焦脱镁叶绿素的组合物进行酶处理的装置，该装置包括：(a)植物油精制装置；和(b)可操作地并入所述植物油精制装置中具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，从而使所述多肽能够在精制所述组合物的过程中水解所述组合物中的焦脱镁叶绿素。

23.一种组合物，其包含固定于二氧化硅上的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽。

24.一种多肽，其具有如SEQ ID NO：4所示的序列，或由SEQ ID NO：3所示的序列编码的序列，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。

25.可通过权利要求1至20任一项所述的工艺或方法获得的组合物。

26.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述酶具有小于80的脱镁叶绿素酶/焦脱镁叶绿素酶活性比。

27.一种多肽，其具有SEQ ID NO：25所示序列，或具有焦脱镁叶绿素酶活性的其功能性变体或片段。

Images