CN102770437A

CN102770437A - 多肽的天然连接方法

Info

Publication number: CN102770437A
Application number: CN2010800553796A
Authority: CN
Inventors: 雷达·姆希迪亚; 朱利恩·德尔; 纳塔莉·奥利维耶; 奥列格·梅尔尼克
Original assignee: NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH; Institut Pasteur
Current assignee: Lille First University-Science And Technology; NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH; Universite Lille 2 Droit et Sante; Institut Pasteur
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2030-10-28
Also published as: FR2952058B1; DK2493909T3; ES2493917T3; FR2952058A1; EP2493909B1; CA2778875A1; JP5785177B2; JP2013509396A; CN102770437B; CA2778875C; US9029503B2; US20120220721A1; EP2493909A1; WO2011051906A1

Abstract

本发明主要涉及制备下式多肽的方法：(III)_X1-X″-X₂，其中X₁和X₂均为肽片段，X″是包含巯基功能基团的氨基酸残基，所述方法包括至少一个步骤，即，使式(I)多肽与式(II)多肽发生连接反应：(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂(II)H-X″-X₂。本发明还涉及式(I)多肽和获得其的方法，以及涉及适于获得其的树脂基质。

Description

多肽的天然连接方法

技术领域

本发明涉及多肽的天然连接方法。本发明还涉及可用于实施该天然连接方法的功能化多肽，以及制备这些功能化多肽的方法。本发明还涉及可用于实施所述功能化多肽制备方法的胺化合物以及功能化树脂。

背景技术

当所合成的多肽具有大尺寸时，利用常规固相方法合成多肽(逐个氨基酸地合成)受到产量低的限制。为了克服该限制，已知的是通过化学连接使两个多肽组装以产生较长的多肽。

一般地，期望通过连接所组装的多肽之间的键是天然的，即对应于多肽的天然结构。

目前，天然连接的主要方法是Kent和Dawson描述的方法，其例如描述于文献WO 96/34878和WO 98/28434中。该方法基于(C末端)硫酯肽和半胱氨酰肽之间的化学选择性反应。该方法的主要缺点在于制备硫酯肽需要复杂的化学过程。

一种替代性方法是在文献WO 01/68565和WO 01/87920中描述的所谓“Staudinger连接”。该方法包括膦硫酯与叠氮化物的反应，以及所化合试剂的水解以形成酰胺键。该方法难以在产业规模应用。

文献WO 2007/037812中描述了第三种方法，其基于脱羧缩合反应中α-酮酸与胺的反应。但是，酮酸是难以制备且难以引入肽中的分子。此外，该第三种方法难以在没有配备实施复杂有机合成手段的肽合成实验室中应用。

因此，非常需要开发一种新的多肽天然连接方法，实现既有效又更容易实施(包括产业规模的实施)。

发明内容

本发明首先涉及制备式(III)多肽的方法：

(III)X₁-X″-X₂，

X₁和X₂均表示肽片段，X″表示包含巯基功能基团的氨基酸残基，所述方法包括至少一个步骤，即，使式(I)多肽与式(II)多肽发生连接反应：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂

(II)H-X″-X₂。

根据一个实施方案，通过在存在至少一种还原二硫键之化合物的条件下将式(I′)多肽与式(II)多肽接触以进行连接反应：

根据一个实施方案，X₂表示式(IV)的肽片段：

(IV)X₂′-(X_i″-X_i′)i＝_3...n，

n是大于或等于3的整数，每个X_i″(对于i取自3至n的整数)表示包含巯基功能基团的氨基酸残基，每个X_i′(对于i取自2至n的整数)表示肽片段；该方法包括在式(I)多肽与式(II)多肽的连接反应步骤之前的一系列n-2步的连接反应，连接反应的第j步(j取自1至n-2的整数)是式(V)多肽与式(VI)多肽进行连接反应以形成式(VII)多肽：

(V)H-X_n-j″-X_n-j′-N(CH₂CH₂SH)₂(其中残基X_n-j″的胺功能基团和/或巯基功能基团被保护)

(VI)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j+1)...n}

(VII)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j)...n}，

在连接反应结束时，对式(VII)多肽之残基X_n-j″的巯基功能基团进行脱保护。

根据一个实施方案，通过使式(V′)多肽与式(VI)多肽在存在至少一种还原二硫键之化合物的条件下接触，以进行式(V)多肽和式(VI)多肽的n-2步连接反应中的一个或更多个：

(VI)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j+1)...n}(j取自1至n-2的整数)。

本发明还涉及制备式(X)环状多肽的方法：

X₂表示肽片段，X″表示包含巯基功能基团的氨基酸残基，所述方法包括至少一个步骤，即，式(XI)多肽与其自身的连接反应：

(XI)H-X″-X₂-N(CH₂CH₂SH)₂。

根据一个实施方案，通过将式(XI′)多肽与至少一种还原二硫键之化合物相接触来进行连接反应：

根据前述任一方法的一个实施方案，连接反应在含水介质中进行，优选在pH 6.5～8.5下进行，更特别优选在pH 7～8下，理想地在约pH 7.5下。

根据前述任一方法的一个实施方案，连接反应在存在至少一种还原二硫键之化合物的条件下进行，所述化合物选自三(2-羧乙基)膦、4-巯基苯乙酸、二硫苏糖醇、苄硫醇以及其混合物。

本发明还涉及式(I)多肽或式(I′)多肽：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂

其中，X₁表示肽片段。

根据一个实施方案，X₁包含2～300个氨基酸残基，优选5～100个氨基酸残基，更优选8～50个氨基酸残基。

本发明还涉及制备式(I)多肽的方法：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂，

X₁表示肽片段，包含至少一个肽合成步骤和一个C末端功能化步骤。

根据一个实施方案，肽合成步骤在功能化步骤之前；肽合成步骤提供式(IX)多肽：

(IX)X₁-OH，

优选地在其胺和羧基功能基团上(除了其C末端羧基功能基团之外)包含保护性基团；所述功能化步骤包括：

-使式(IX)多肽与式(VIII)胺化合物在液相中反应以形成式(I)多肽：

(VIII)NH(CH₂-CH₂-S-G₁)₂，

其中G₁表示保护性基团，所述保护性基团优选地形成硫醚、硫酯或二硫化物功能基团，更特别地优选是三苯甲基；

-任选地，使式(I)多肽脱保护。

本发明的一个主题还涉及多肽固相合成的聚合物树脂支持物，其包含主骨架和NH-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团或NH-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团，其中Trt表示任选地被一个或更多个取代基取代的三苯甲基，所述取代基特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基；其中NH-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团通过两个三苯甲基与主骨架结合，或者，NH-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团通过两个胺基团与主骨架结合。

本发明的一个主题还涉及多肽固相合成的聚合物树脂支持物，其包含主骨架和G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团或G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团，其中Trt表示任选地被一个或更多个取代基取代的三苯甲基，所述取代基特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基；AA表示任选地具有一个或更多个保护性基团的氨基酸残基；G₂表示氢原子或保护胺功能基团的基团；其中G₂-AA-N(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团通过两个三苯甲基与主骨架结合，或者，G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团通过两个胺基团与主骨架结合。

根据上述聚合物树脂支持物的一个实施方案，主骨架选自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物骨架及其衍生物。

本发明的一个主题还涉及制备多肽固相合成之聚合物树脂支持物的方法，其包括：

-提供聚合物树脂；

-通过与式(VIII′)胺化合物反应使聚合物树脂功能化：

(VIII′)NH(CH₂-CH₂-S-H)₂。

根据聚合物树脂支持物制备方法的一个实施方案，该方法包括在使聚合物树脂功能化的步骤之前：

-提供式(VIII)胺化合物：

(VIII)NH(CH₂-CH₂-S-G₁)₂，

其中，G₁表示保护性基团，所述保护性基团优选地形成硫醚、硫酯或二硫化物功能基团，更特别地优选是三苯甲基；

-使该胺化合物脱保护，以获得式(VIII′)的胺化合物。

根据制备式(I)多肽之方法的一个实施方案：

-功能化步骤在多肽合成步骤之前；

-功能化步骤包括：

■如上所述，将氨基酸偶联至包含主骨架和NH-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团或NH-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团的聚合物树脂支持物，以提供起始支持物(primer support)；或

■如上所述提供起始支持物，其为包含主骨架和G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团或G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团的聚合物树脂；

-肽合成步骤包括起始支持物上氨基酸的一系列偶联。

根据该方法的一个实施方案，将氨基酸偶联至聚合物树脂支持物包括将聚合物树脂支持物与氨基酸卤化物或者与氨基酸和活化剂(优选地选自PyBOP、BOP、PyBROP，更特别地优选PyBROP)接触。

本发明还涉及制备式(I′)多肽的方法：

其中，X₁表示肽片段，所述方法包括氧化式(I)多肽的步骤：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂，

优选地与空气接触，或者在I₂或二酰胺的存在下，和在缓冲液中，所述氧化步骤优选地在根据上述方法制备式(I)多肽的步骤之后。

根据制备式(III)或式(X)多肽之方法的一个实施方案，后者包括根据上文所述制备式(I)多肽的方法制备式(I)和/或式(V)或式(XI)多肽的步骤，或者包括根据上文所述制备式(I′)多肽的方法制备式(I′)和/或式(V′)或式(XI′)多肽的步骤。

本发明还涉及制备药物组合物的方法，包括：

-根据上文所述制备式(III)或式(X)多肽的方法制备多肽，以及

-将该多肽与一种或更多种可药用辅药一起配制。

本发明还涉及制备诊断装置的方法，其包括：

-根据上文所述制备式(III)或式(X)多肽的方法制备多肽，以及

-将该多肽配制成适于诊断用途的形式。

本发明的一个主题还涉及式(VIII″)胺化合物：

(VIII″)NH(CH₂-CH₂-S-Trt)₂，

其中Trt表示三苯甲基。

本发明使得克服现有技术的缺陷成为可能。更特别地，其提供了多肽的天然连接方法，这比先前的方法更有效且更易于实施(包括产业规模的实施)。

这通过开发如下反应方案来实现：使在C末端用双(巯基乙基)氨基基团修饰的多肽与在N末端具有半胱氨酸(或包含巯基功能基团的另一种氨基酸)的多肽反应，以形成天然酰胺键。

根据某些特定实施方案，本发明还具有如下列出的一个或优选多个优点：

-根据本发明的连接方法任选地使用未经保护的多肽试剂(特别是当进行单连接时)。由于经保护的多肽溶解性低并且由于其还需要连接后的脱保护步骤(导致额外的成本以及可能的降解)，因此经保护的多肽难于以使用。相反，本发明使得可能避免与经保护多肽有关的不利因素(特别是当进行单连接时)。本发明的方法在连接点直接形成天然键合，而无需在连接后进行脱保护。

-根据本发明的连接方法基于使用经化学稳定性功能基团修饰的多肽，使用常规的肽合成技术易于将其引入。

-本发明允许使用蛋白质来源的氨基酸来合成肽片段。因此，不需要制备会使合成变得非常复杂的氨基酸衍生物(例如酮酸)。

-可以用标准方式进行多肽试剂的组装，例如使用Fmoc/叔丁基化学法。因此，本发明的方法与目前可用的自动化工业合成过程相容。目前，氨基酸和合适的固体支持物均可大量获得并且成本低廉。

-本发明提供了在含水介质(因此其与肽和蛋白质的溶解性相容)中进行连接。

-本发明的连接反应可以在接近pH 7.5时(即，在与复杂多肽或蛋白质相容的条件下)有效进行。

-本发明的连接反应提供了多肽自连接的可能性，从而提供了制备环状多肽的可能性。

附图说明

图1显示，根据实施例7，通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)监测多肽1c与多肽2之间的天然连接，获得多肽3c。最下方的图对应于时间点t＝10分钟；中间的图对应于时间点t＝18小时；最上方的图对应于时间点t＝43小时。

图2a和2b显示，根据实施例7，通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)监测多肽1d与多肽2之间的天然连接，获得多肽3d。A图对应于时间点t＝0；B图对应于时间点t＝1小时；C图对应于时间点t＝3小时；D图对应于时间点t＝5小时；E图对应于时间点t＝22小时。

图2c显示在时间点t＝22小时(图2b)获得的多肽3d的峰的去卷积化质谱图。

图3a至3c显示，根据实施例7，通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)监测多肽1f与多肽2之间的天然连接，获得多肽3f。A图对应于时间点t＝0；B图对应于时间点t＝1小时；C图对应于时间点t＝3小时；D图对应于时间点t＝6小时；E图对应于时间点t＝27小时。

图3d显示在时间点t＝27小时(图3c)获得的多肽3f的峰的去卷积化质谱图。

具体实施方案

以下是对本发明更详细的非限制性描述。

在本申请背景下，“多肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸残基(数目大于或等于2)线性链。因此，本申请的“多肽”可以是例如寡肽、肽或蛋白质(取这些术语的通常定义)。本发明多肽中存在的氨基酸残基可以选自蛋白质来源或非蛋白质来源的氨基酸残基。优选地，其选自20种蛋白质来源的氨基酸残基。

从N末端至C末端对多肽进行编号。根据通常使用的单字母编码或三字母编码对沿多肽链的氨基酸残基定名。氨基酸残基是式-NH-(CH-R)-(C＝O)-所示的多肽片段，其中R表示侧链，并且不同氨基酸的侧链是不同的。

在本申请背景下，“肽片段”是指包多肽的一部分，其包含至少一个氨基酸残基。因此，本申请的肽片段可以是例如：(如果肽片段既不包含多肽的N末端也不包含多肽的C末端的话)氨基酸残基的序列(例如-AHG-或-Ala-His-Gly-)；或者，(如果肽片段包含多肽的N末端的话)在其N末端具有基团的氨基酸残基的序列(例如H-AHG-或H-Ala-His-Gly-)；或者，(如果肽片段包含多肽的C末端的话)在其C末端具有基团的氨基酸残基的序列(例如-AHG-OH或-Ala-His-Gly-OH)。

多肽的天然连接

本发明提供了多肽天然连接的方法，根据该方法，式(I)多肽与式(II)多肽反应以提供式(III)多肽：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂

(II)H-X″-X₂

(III)X₁-X″-X₂。

式(I)多肽包含肽片段X₁(所述肽片段包含多肽的N末端)以及C末端的功能基团-N(CH₂CH₂SH)₂(与C末端位置的氨基酸残基的(C＝O)末端结合)。

肽片段X₁采用Y₁-AA₁AA₂...AA_n的形式。Y₁是N末端基团，优选氢原子，但任选地也可以是本领域技术人员已知的取代伯胺或仲胺的任意基团(例如酰基，特别是乙酰基)。n是大于或等于2的整数。每个AA_i表示一个氨基酸残基。

式(I)多肽的一个实例是下式的多肽1a(参见下文实施例3)：

在本实例中，肽片段X₁是H-GFGQGFGG。

式(I)多肽优选地包含2～300个氨基酸残基，优选5～100个氨基酸残基，更优选8～50个氨基酸残基。

式(II)多肽在N末端包含氢原子和残基X″。残基X″是包含巯基功能基团的氨基酸残基。该巯基功能基团可以特别地是β-氨基巯基功能基团(此时残基X″优选地表示半胱氨酸残基)或γ-氨基巯基功能基团(此时残基X″优选地表示高半胱氨酸残基)。

在以下整个说明书中，根据一个特别的实施方案，X″可表示半胱氨酸残基(Cys)。

根据上文使用的编号方式，X₂表示这样的肽片段，其包含式(II)多肽C末端以及除N末端残基之外的该多肽所有氨基酸残基。

肽片段X₂为AA₂′AA₃′...AA_n′-Y₂的形式。Y₂是末端基团，优选-OH或-NH₂基团或者-OR或-NRR′基团，R和R′均表示烷基或芳基。n是大于或等于2的整数。每个AA_i′表示氨基酸残基。

式(II)多肽优选地包含2～300个氨基酸残基，优选地5～100个氨基酸残基，更特别优选8～50个氨基酸残基。

式(II)多肽可以例如通过常规的肽合成方法(特别是固相合成方法)获得。其还可以通过预先进行天然连接而获得(见下文)。

式(I)和式(II)的每种多肽优选仅包含选自20种蛋白质来源氨基酸残基的氨基酸残基。但是，根据一个特别的实施方案，式(I)和式(II)多肽包含一种或更多种非蛋白质来源的氨基酸残基。

式(I)和式(II)多肽的氨基酸残基可以任选地被保护侧链的基团所保护。

为了使连接反应正确进行，在式(I)多肽上存在两个自由巯基是必需的。该连接之所以被称为“天然连接”是因为肽片段X₁通过酰胺键与肽片段X″-X₂连接。

可以通过使式(II)多肽与式(I′)多肽接触来进行上述连接反应：

前提是反应中使用还原二硫键的化合物，其可以优选是巯基化合物(例如4-巯基苯乙酸(MPAA)、二硫苏糖醇(DTT)、苯硫酚(及其衍生物)、烷基硫醇(特别是苄硫醇))或者膦(例如三(2-羧乙基)膦(TCEP))。联合使用这些化合物中的几种也是有利的，例如使用MPAA和TCEP。

事实上，随后式(I′)多肽被原位还原，并提供了用于进行连接反应的式(I)多肽。

一般地，使用式(I′)多肽起始的连接反应实施起来可以比直接用式(I)多肽进行的连接反应更实际。事实上，式(I)多肽具有天然地氧化成式(I′)多肽的倾向，特别是在空气中氧的作用下。例如，当开放形式的式(I)多肽以冻干形式保存时，其可随时间被氧化。换句话说，式(I)多肽的制备物通常不可避免地部分包含式(I′)多肽。这两种形式的存在可使表征和纯化变得复杂。这就是为什么通过将式(I′)多肽与式(II)多肽接触使具有环状末端的式(I′)多肽被原位还原成开放的式(I)多肽从而使连接反应更易于实施的原因。

基于同样的理由，即使当通过直接将式(I)多肽与式(II)多肽接触而进行连接反应时，也优选在反应中使用一种或更多种还原二硫键的上述化合物。

优选地，MPAA(如果存在的话)的使用浓度为1～500mM，例如在反应中浓度约为200mM。

优选地，TCEP(如果存在的话)的使用浓度为1～200mM，例如在反应中浓度约为80mM。

在多肽(I)的N末端氨基酸残基包含巯基功能基团的情况下，该巯基功能基团必须在连接过程中被保护，否则会出现对式(I)多肽的环化竞争反应。或者，为了避免环化反应，可以保护α胺功能基团。例如，可以使用噻唑烷型保护，其能同时保护巯基和α胺基。

优选地，连接反应在液相中(特别是在含水介质中，例如在磷酸盐缓冲液中)进行。优选地，该反应在pH 6.5～8.5下进行，更特别优选地在pH 7～8下进行，理想地在接近pH 7.5下进行。

优选地，连接反应在0～50℃温度下进行，理想地在约37℃下进行。反应时间基于所选试剂和其它反应条件来调整。还可以根据反应期间的液相色谱-质谱分析来调整合适的时间。合适的时间通常为几个小时至几天。

优选地，式(I)和式(II)的每种多肽在反应中的浓度为0.01～50mM。反应中式(I)和式(II)多肽的摩尔浓度之比优选为2∶3～3∶2。

上文所述的连接反应之后可进行对所得式(III)多肽的纯化步骤，例如通过液相色谱或通过任何其它常见技术来实现。

使用多个连续天然连接进行多肽生产

本发明还允许使用多个连续的上文所述之连接反应来生产多肽。这可适用于获得大的多肽，例如包含超过约100个氨基酸残基的多肽。事实上，在这样的情况下，直接合成制备式(I)和式(II)多肽的产量低，因此使用两个或更多个连续连接是有利的，使得只有包含例如少于约50个氨基酸残基的多肽才被直接合成。

例如，使用两个连续连接使得可以获得包含约150个氨基酸残基的多肽，而无需直接合成包含超过约50个氨基酸残基的多肽；使用3个连续连接使得可以获得包含约200个氨基酸残基的多肽，而无需直接合成包含超过约50个氨基酸残基的多肽。

因此，本发明的方法允许使用n-1个连续连接来获得式(III)多肽，其中肽片段X₂为X₂′-X₃″-X₃′-...-X_n″-X_n′的形式(n是大于或等于3的整数，每个X_i′是肽片段(i为2～n的整数)，每个X_i″是X″残基(i为3～n的整数)，即包含巯基功能基团的氨基酸残基以及根据一个特别的实施方案具体为半胱氨酸残基)。换句话说，在这种情况下获得的多肽具有式(III′)：

(III′)X₁-X″-X₂′-X₃″-X₃′-...-X_n″-X_n′。

第一个连接反应一方面包括式(Va)多肽：

(Va)H-X_n-1″-X_n-1′-N(CH₂CH₂SH)₂，

另一方面包括式(VIa)多肽：

(VIa)H-X_n″-X_n′。

该连接反应与前面部分中所述的连接反应完全相同。其产生式(VIb)多肽：

(VIb)H-X_n-1″-X_n-1′-X_n″-X_n′。

在连接过程中，式(Va)多肽中的氨基酸残基X_n-1″之巯基功能基团或N末端胺功能基团(或者巯基功能基团和胺功能基团)必须被保护，否则会出现式(Va)多肽的环化竞争反应。例如，此时可使用噻唑烷型的保护。

在连接反应结束时，式(VIb)多肽中的氨基酸残基X_n-1″之巯基功能基团必须脱保护，以允许下一连接反应的发生。

第二个连接反应一方面包括式(Vb)多肽：

(Vb)H-X_n-2″-X_n-2′-N(CH₂CH₂SH)₂，

另一方面包括先前获得的式(VIb)多肽。式(Vb)多肽中的氨基酸残基X_n-2″之巯基功能基团必须被保护，否则会出现式(Vb)多肽的环化竞争反应。例如，此时可使用噻唑烷型的保护。在式(Vb)多肽与式(VIb)多肽的连接反应之后，且在进行下一连接反应之前，对氨基酸残基X_n-2″的巯基功能基团进行脱保护。

随后的连接反应具有同样的类型。一般来说，连接反应j(j为1～n-2的整数)包括式(V)多肽和式(VI)多肽以形成式(VII)多肽：

(V)H-X_n-j″-X_n-j′-N(CH₂CH₂SH)₂

(VI)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j+1)...n}

(VII)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j)...n}。

最终，最后一个(即，第n-1个)连接反应包括式(I)多肽和式(II)多肽以形成式(III)多肽(即(III′))：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂

(II)H-X″-X₂(在此表示为H-X″-X₂′-X₃″-X₃′-...-X_n″-X_n′)

(III)X₁-X″-X₂

(III′)X₁-X″-X₂′-X₃″-X₃′-...-X_n″-X_n′。

每个连续的连接反应均可如“多肽的天然连接”一节中所述进行。特别地，有利的是，通过在存在一种或更多种上述还原二硫键之化合物的条件下使式(VI)多肽与式(V′)多肽接触、然后式(V′)多肽被原位还原并提供用于连接反应的式(V)多肽来进行连接反应j(j为1～n-2的整数)：

通过天然自连接来生产环状多肽

上文所述的天然连接所使用的原理也可用于通过多肽的天然自连接(多肽的一端与该多肽的另一端相连接)来生产环状多肽。因此，一般来说，本发明提出了用于制备式(X)环状多肽的方法：

其中X₂表示肽片段，X″表示包含巯基功能基团的氨基酸残基，该方法通过式(XI)多肽与其自身的连接反应来实现：

(XI)H-X″-X₂-N(CH₂CH₂SH)₂。

优选地，式(XI)多肽包含2～300个氨基酸残基，优选5～100个氨基酸残基，更特别优选8～50个氨基酸残基。

式(XI)多肽包含N末端的氢原子和残基X″(X″的含义如上所述)。X₂表示在这种情况下采用AA₁AA₂...AA_n形式的肽片段，其中n是大于或等于1的整数，每个AA_i表示氨基酸残基。

优选地，式(XI)多肽只包含选自20种蛋白质来源之氨基酸残基的氨基酸残基。但是，根据一个特别的实施方案，式(XI)多肽包含一个或更多个非蛋白质来源的氨基酸残基。

式(XI)多肽的氨基酸残基可任选地被保护侧链的基团所保护。

可通过使式(XI′)多肽与至少一种还原二硫键的化合物(优选如上文所述)接触来进行上述连接反应：

事实上，式(XI′)多肽随后被原位还原，并提供了用于连接反应的式(XI)多肽。

一般地，即使当直接从式(XI)多肽开始进行连接反应时，也优选在反应中使用一种或更多种还原二硫键的上述化合物。

一般地，如果反应在足够稀释的条件下进行，则式(XI)多肽的环化不受竞争性多聚化的影响。例如，可以使用0.01～50mM的式(XI)多肽浓度，通常约为1mM(或者，如果存在多聚化的严重风险，则任选地为0.01～0.1mM)。

此外，实施连接反应的优选条件与上文所述从式(I)和(II)多肽起始的连接反应相同。

在上文所述的连接反应之后，可以进行对所得式(X)多肽的纯化步骤，例如通过液相色谱或通过任何其它常规技术来实现。

制备式(I)、式(V)和式(XI)多肽的方法

式(I)、式(V)和式(XI)多肽是可用于实施上述连接反应的化合物。因此，本发明的一个主题还是式(I)(或者式(V)或式(XI))的这些多肽，以及它们的制备方法。

制备式(I)(或者式(V)或(XI))多肽的方法包括两个主要的步骤：

-肽合成步骤，以及

-C末端功能化步骤。

本发明提供了该方法的两种主要变化形式。根据第一种变化形式，在功能化之前进行肽合成。根据第二种变化形式，在功能化之后进行肽合成。第二种变化形式允许获得更高的产量，并且更易于在产业规模下实施。

根据第一种变化形式，第一步(多肽合成步骤)可以获得式(IX)多肽X₁-OH。

此多肽合成步骤可以根据本领域技术人员已知的任何方法进行。特别地，可以在液相中进行，或者优选地在固相中进行。

大致上，肽合成包括一系列从起始物(起始氨基酸或者从先前添加氨基酸得到的肽片段)开始的氨基酸偶联以及脱保护。更精确地，肽合成可以包括如下的连续步骤：

(a)提供具有未保护之N末端的肽片段和在N末端经保护的氨基酸；

(b)在所述肽片段的N末端，在所述氨基酸和肽片段之间形成肽键；

(c)对所结合氨基酸的N末端脱保护，以提供后续步骤(a)中的肽片段。

在固相肽合成的情形中，将肽片段(初始物)的C末端与固体支持物连接。所述固体支持物优选地是不溶或可溶颗粒(珠)形式的聚合物。例如，可使用基于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺的树脂及其衍生树脂。还可以使用硅胶或玻璃珠作为固体支持物。

肽片段和固体支持物通过适当的功能基团(称为“接头”)连接在一起。因此，首先将对应于待合成之多肽的C末端的氨基酸固定在固体支持物的接头功能基团上(在偶联过程中保护氨基酸的胺功能基团，然后将其脱保护以在后续反应中可用)，其构成了第一起始物，然后根据上文所述的连续反应添加后续氨基酸。

在多个偶联反应过程中，有利的是，在存在三唑(例如1-羟基-苯并三氮唑或1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)或非亲核阴离子的膦或脲盐(例如HBTU、HATU、TBTU或PyBOP)的条件下使用活化化合物(特别是碳二亚胺(例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺))；或者，使用酸卤化物(例如酸氟化物)形式的活化氨基酸。

在固相合成的情形中，最后一个氨基酸偶联反应一经进行，便实施将多肽从其固体支持物分离(或切除)的反应。

在不同的偶联反应过程中，有利的是将氨基酸的N末端用保护性基团(优选Fmoc基团(9H-芴-9-基甲氧基羰基)或t-Boc基团(叔丁氧基羰基)或NSC基团(2-(4-硝基苯磺酰基)乙氧基羰基))保护。

类似地，在多个偶联反应中，氨基酸残基的侧链优选地通过一个或更多个适当的保护性基团(例如，针对包含羧基功能基团的链使用叔丁基)保护。

在这种情况下，最后一个氨基酸偶联反应一经进行，便可实施侧链的脱保护反应。但是，应当注意的是，优选地针对所有功能化步骤均保持保护(除了任选地在C末端对COOH功能基团进行保护之外)。

在肽合成步骤结束时，将式(IX)多肽进行功能化。

功能化步骤包括如下连续步骤：

-任选地，使用保护性基团对式(IX)多肽的N末端进行保护，所述保护性基团优选地选自氨基甲酸盐类、酰胺类或烷基类，特别是叔丁氧基羰基(t-Boc)、Fmoc(9H-芴-9-基甲氧基羰基)、三氟乙酰基或三苯甲基。

-同样任选地，对式(IX)多肽氨基酸残基之侧链的功能基团进行保护，特别是对胺功能基团(优选地利用上述保护性基团)和羧基功能基团(例如通过利用叔丁基)进行保护。

-或者，根据一个更简单的实施方案，式(IX)多肽可以直接以如下形式提供，即所有胺功能基团和羧基功能基团均被保护，而对C末端的COOH功能基团选择性地脱保护。

-使式(IX)多肽与式(VIII)化合物NH(CH₂-CH₂-S-G₁)₂偶联，G₁是保护性基团。

-任选地，对多肽进行脱保护。

对于式(VIII)胺化合物，G₁优选地选自提供硫醚、硫酯(例如乙酰基)或二硫化物(例如叔丁基硫苯)功能基团的基团。更特别优选地，G₁是三苯甲基。在这种情况下，胺化合物是二苯甲基亚磺酰乙胺(双({2-[三苯甲基)硫烷基]乙基})胺)。对于制备式(VIII)胺化合物的方法，参见下文实施例1。

在偶联反应中存在活化剂是有利的，所述活化剂例如六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基膦(PyBOP)或六氟磷酸溴-三吡咯烷基膦(PyBROP)或者活化成卤化衍生物形式(特别是氨基酸氟化物或氨基酸氯化物形式)的其C-末端氨基酸，而后一种形式可以由本领域技术人员已知的合适试剂在原位形成或预先形成。在氨基酸的卤化物中，优选氨基酸氟化物，其通过与1，3，5-三氟三嗪反应而预先形成或者在TFFH(六氟磷酸四甲基氟代甲脒)的辅助下在原位形成。

一般地，也可考虑使用本领域技术人员已知的允许活化羧酸功能基团的任何试剂，例如HBTU、TBTU、HATU、BOP等(参见例如Chemicalapproaches to the synthesis of peptides and proteins，Lloyd-Williams，P.，Albericio，F.，Giralt，E.，1997，CRC Press)。PyBOP、PyBROP、BOP或者更一般地膦均是优选的。

在功能化步骤结束时获得式(I)多肽。有利的是，在此阶段提供纯化化合物的步骤(例如通过液相色谱来实现)。

根据生产式(I)多肽之方法的第二种变化形式，功能化步骤在肽合成步骤之前。此第二种变化形式适用于固相。因此，在该实施方案中，功能化步骤包括从先前经功能化的固体支持物得到起始固体支持物。

使用可溶或不可溶的聚合物作为固体支持物，不溶性聚合物优选采用颗粒(珠)的形式。例如，可使用基于聚苯乙烯(优选)或基于聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物的树脂，或从它们衍生的树脂。

此外，固体支持物具有接头基团，所述接头基团优选地为氯三苯甲基，其中三苯甲基任选地被一个或更多个取代基(特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基)所取代。

作为固体支持物的一个实例，可以包括具有三苯甲基氯化物、2-三苯甲基氯化物、4-甲基三苯甲基氯化物或4-甲氧基三苯甲基氯化物接头基团的聚苯乙烯树脂。此类固体支持物可以从例如Glycopep购得。

根据另一实施方案，固体支持物具有三苯甲基-醇型的接头基团(即OH-Trt-CO-NH-基团)，其中三苯甲基任选地被一个或更多个取代基所取代(特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基)。具有此类接头的固体支持物描述于例如Quibell，JACS 1995，117，11656-11668中并且可以购得(例如

聚乙二醇固体支持物系列)。

使用此类固体支持物需要对固体支持物进行预先活化的步骤：

-使用溴化剂(特别是乙酰溴)修饰接头基团，形成Br-Trt-CO-NH-的形式；或者

-使用氯化剂(特别是草酰氯)修饰接头基团，形成Cl-Trt-CO-NH-的形式。

此类活化步骤描述于例如Harre等人，Reactive&FunctionalPolymers 1999，41，111-114中。

或者，根据Singh，S.等人，J.Org.Chem.2004，69，4551-4554，可以在BF₃.Et₂O存在下将树脂直接与胺NH(CH₂-CH₂-SH)₂反应。

使用此类固体支持物可允许使用聚乙二醇或聚乙二醇-聚苯乙烯型树脂骨架，其比聚苯乙烯型树脂更适于制备长的多肽。

优选地，颗粒具有1～1000μm的Dv50。Dv50定义为50％颗粒大小分布，即50％的颗粒大小低于Dv50，50％的颗粒大小高于Dv50。一般地，Dv50是颗粒的粒度测定模式(体积分布)的特征，其可通过激光粒度仪(针对低于200μm的颗粒大小)来测定，或者通过过筛(针对高于200μm的颗粒大小)来测定。

通过将式(VIII′)胺化合物NH(CH₂-CH₂-SH)₂与上述固体支持物偶联来制备功能化的固体支持物。所述胺化合物(VIII′)可以通过上述式(VIII)胺化合物本身脱保护而获得，其中G₁是保护性基团。

偶联在酸性介质中进行，以减小使仲胺显露出来(其会导致继发反应)的风险。

优选地中和过量的三苯甲基基团，例如使用甲醇来实现。然后，重要的是加入碱以中和所形成的HCl。

可以提供的是，功能化固体支持物的制备构成制备式(I)多肽之方法的第二种变化形式的组成部分。或者，可以预先地和单独地制备功能化固体支持物，从而在制备式(I)多肽之方法的第二种变化形式中直接使用。

功能化固体支持物是聚合物树脂支持物，其包含(根据需要地，聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物型或其衍生物的)主骨架以及通过两个Trt基团与主骨架结合的NH-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂基团或者当起始固体支持物是三苯甲基-醇型时通过两个NH基团与主骨架结合的NH-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂基团。

在上文中，Trt表示三苯甲基基团，其任选地被一个或更多个取代基(特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基)所取代。

因此，此聚合物树脂支持物基本上不含自由巯基功能基团，而具有仲胺功能基团(二硫烷基乙胺功能基团)。

然后，将氨基酸偶联至功能化固体支持物上。

优选地，所述氨基酸在其N末端被保护性基团保护，所述保护性基团在碱存在的条件下不稳定，优选地选自2-(4-硝基苯磺酰)乙氧羰基(NSC)基团或Fmoc。

优选地，所述氨基酸在其侧链上的某些或所有(优选所有)功能基团(特别是羧基、胺基、醇基、苯酚基、胍基(针对精氨酸)和咪唑基(针对组氨酸)功能基团)上包含保护性基团。此类保护性基团是本领域技术人员已知的。例如，可参见Protective groups in organic synthesis，第2版，T.Greene和P.Wuts，John Wiley&Sons，Inc。

优选地，氨基酸在PyBOP或BOP存在下或者更特别优选地在PyBROP存在下被活化，或者以卤化物(特别是氟化物(即，氟原子与氨基酸残基的酰基相连))形式活化。

氨基酸与功能化固体支持物上的仲胺功能基团反应形成酰胺键。氨基酸偶联后，任选地可对后者进行脱保护。

由此，在功能化步骤结束时获得了聚合物树脂支持物(所谓“起始支持物”)，其包含G₂-NH-CHR-CO-N(CH₂CH₂-S-Trt-)₂基团(R表示氨基酸侧链)(其还可表示为G₂-AA-N(CH₂CH₂-S-Trt-)₂(AA表示氨基酸残基))，这些基团通过两个Trt基团与主骨架结合；或者包含G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂基团，其通过两个NH功能基团与主骨架结合。

在上文中，Trt表示三苯甲基基团，其任选地被一个或更多个取代基(特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基)所取代。此外，G₂表示氢原子或胺功能基团保护性基团，其取决于氨基酸的α胺基是否脱保护。最后，氨基酸残基AA的侧链R的功能基团可以如上文所述有利地被保护。

由此获得的起始支持物(带有或不带有保护性基团)也是本发明的一个目的。

然后进行肽合成步骤，其类似于上述第一个实施方案中所述地，将氨基酸偶联到活化的支持物上以获得初始起始物。

最后一个氨基酸偶联反应一经进行，便实施将多肽从其固体支持物上分离(或切除)的反应以及(如果需要)适当的脱保护，从而获得式(I)多肽。对于第一种变化形式来说，有利的是在此阶段提供纯化化合物的步骤(例如通过液相色谱来实现)。

制备式(I′)、式(V′)和式(XI′)多肽的方法

上述式(I′)、式(V′)和式(XI′)多肽可以很容易地分别从式(I)、式(V)和式(XI)多肽通过在空气中氧化而获得，例如在碳酸氢铵缓冲液中、约pH 8的条件下来实现。另一有利的可能性是使用碘I₂或二酰胺H₂NCO-N＝N-CONH₂。

应用

根据本发明获得的式(I)多肽可用于生产多种多肽(例如用于筛选目的)。

它们还可用于与一种或更多种可药用添加剂(包括一种或更多种可药用载剂)一起制备药物组合物。可通过本发明获得的药物组合物的实例包括药品和疫苗制剂。

它们还可用于生产诊断试剂盒。

实施例

以下实施例举例说明本发明但不限制本发明。

实施例1涉及化合物双({2-[三苯甲基)硫烷基]乙基})胺(式(VIII)化合物)的制备。

根据上述制备式(I)多肽之方法的第一种变化形式(液相合成)，实施例2和3涉及式H-GFGQGFGG-N(CH₂CH₂SH)₂多肽1a(SEQ ID NO：1，对应于上文通式(I))的制备。

实施例4和5涉及具有二硫烷基乙胺功能基团的功能化树脂的制备。

实施例6涉及从上述功能化树脂制备所谓“起始”支持物，其上固定了第一氨基酸。

根据上述制备式(I)之方法的第二种变化形式(固相合成)，实施例7涉及对应于上述通式(I)的多肽1c(H-ILKEPVHGG-N(CH₂CH₂SH)₂)(SEQ ID NO：2)、多肽1d(H-ILKEPVHGA-N(CH₂CH₂SH)₂)(SEQ IDNO：3)、多肽1e(H-ILKEPVHGV-N(CH₂CH₂SH)₂)(SEQ ID NO：4)和多肽1f(H-ILKEPVHGY-N(CH₂CH₂SH)₂)(SEQ ID NO：5)化合物的制备。

实施例8涉及多肽1c、1d和1f分别与对应于通式(II)之式H-CILKEPVHGV-NH₂(SEQ ID NO：6)多肽2连接，以分别提供多肽3c(SEQ ID NO：9)、3d(SEQ ID NO：10)和3f(SEQ ID NO：11)。

根据上述制备通式(XI)多肽之方法的第二种变化形式(固相合成)，实施例9涉及多肽1g(H-CHHLEPGG-N(CH₂CH₂SH)₂)(SEQ ID NO：7)(对应于上述通式(XI)的化合物)的合成；以及该多肽环化形成对应于上述通式(X)的环状多肽。

实施例10涉及多肽1c、1d、1e和1f氧化成二硫杂氮杂环庚烷(dithiazépanes)(对应于上文所述通式(I′)化合物)。

实施例11涉及多肽1c与具有N端高半胱氨酸的多肽4(SEQ ID NO：17)连接，以提供多肽5(SEQ ID NO：18)。

实施例12、13和14分别涉及多肽6(SEQ ID NO：19)、多肽7(SEQID NO：20)和多肽8(SEQ ID NO：21)的合成。

实施例15涉及多肽7和多肽8连接形成多肽7-8(SEQ ID NO：22)，实施例16涉及在片段7-8的N末端半胱氨酸上的噻唑烷脱保护之后，多肽7-8与多肽6连接形成多肽6-7-8(SEQ ID NO：23)。因此，其是两个连续连接的构建物。最终的多肽6-7-8是具有如下序列的线性多肽：H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIK

QPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENY

RNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEV-NH₂，黑体显示的半胱氨酸参与连接。

实施例1：双({2-[三苯甲基)硫烷基]乙基})胺的制备

将1.50g二(2-氯乙基)胺(8.4mmol)和4.65g三苯甲硫醇(2当量，16.80mmol)加入烧瓶中，并置于惰性气体中。在磁力搅拌下，加入25mL无水二甲基甲酰胺(DMF)，使反应混合物在冰浴中冷却。向混合物中逐滴加入4当量的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后通过薄层层析(TLC)(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯/三乙胺：8/2/0.1)来监测反应。然后，在旋转蒸发仪中蒸干溶剂。继而将所获得的白色固体溶于50mL二氯甲烷(DCM)中，产物用5％KH₂PO₄水溶液提取3次。然后，利用硅胶柱层析(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯/三乙胺(TEA)：8/2/0.1)纯化产物，获得1.46g白色无定形固体(产率：28％)。

产品分析结果如下：

Rf＝0.37(硅胶，环己烷/乙酸乙酯/三乙胺：8/2/0.1)；¹H NMR (300MHz，CDCl₃)δ7.41-7.37(m，12H，Trt)，7.15-7.29(m，18H，Trt)，2.23-2.36(m，8H，CH₂)，1.26(s，1H，NH)；¹³C(75MHz，CDCl₃)154.1；129.8；128.1；126.9；47.9；32.6；MALDI-TOF：243.1[Trt⁺]，622.3[M+H⁺]⁺，644.3[M⁺+Na⁺]。

实施例2：多肽H-GFGQGFGG-OH (SEQ ID NO：8)的合成

将1g Wang树脂(载荷：1.1mmol/g)加入反应器，在DMF中溶解30分钟。平行地，在惰性气体下的烧瓶中，将3.27g Fmoc-Gly-OH(10当量，11mmol)溶于100mL无水二氯甲烷/DMF混合物(99/1，体积/体积)中。在惰性气体下，于0℃向氨基酸溶液中加入5mL无水二氯甲烷中的857μL二异丙基碳二亚胺(5当量，5.50mmol)溶液。在此温度下，搅拌反应混合物30分钟。然后蒸干溶剂，将所获得的白色固体溶于5mLDMF中。将溶液与1mL DMF中的0.1当量DMAP(12.2mg，0.1mmol)一起加入树脂，然后搅拌反应混合物1小时。然后过滤树脂，用5mL DMF、5mL二氯甲烷清洗，然后真空干燥。通过UV定量用20％哌啶DMF溶液使样品脱保护过程中释放的二苯富烯-哌啶加合物来测定树脂的最终载荷(0.95mmol/g；86％)。

使用Fmoc/叔丁基策略，利用Fmoc-Gly-Wang树脂(0.5mmol规模)(如先前所述利用微波肽合成仪(CEM μWAVES，Saclay，France)制备)进行多肽固相合成。使用超过5倍摩尔量的每种氨基酸进行偶联，使用超过4.5倍摩尔量的活化剂HBTU(六氟磷酸O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲)，使用超过10倍摩尔量的碱DiEA(二异丙基乙胺)。使用30mL TFA(三氟乙酸)/TIS(三异丙基硅烷)/H₂O混合物(体积比：95/2.5/2.5)处理一小时进行最终的脱保护以及将多肽从树脂上切下。然后，通过用二乙醚/庚烷混合物(体积比1/1)沉淀获得多肽，溶于水中并继而冻干。通过HPLC(液相色谱)和毛细管电泳测定多肽纯度(79％)。对主要多肽的LC-MS分析与预期多肽的结构一致(C₃₃H₄₃N₉O₁₀，计算值726.32Da[M+H]⁺，观察值726.50Da)。

实施例3：多肽1a(H-GFGQGFGG-N(CH ₂ CH ₂ SH) ₂ ))(SEQ ID NO 1) 的液相合成

将102mg多肽H-GFGQGFGG-OH(SEQ ID NO：8)(0.14mmol)溶于最少量的无水二甲酰胺(DMF)中，向该溶液中加入39μL三乙胺(TEA)(2当量，0.28mmol)。在搅拌下，向反应混合物中加入42μL二碳酸二叔丁酯(Boc₂O)(1.3当量，0.18mmol)，通过加入无水DMF使溶液混合均匀。用HPLC监测反应。

向前述反应混合物中加入174.2mg双({2-[三苯甲基)硫烷基]乙基})胺(2当量，0.28mmol)。向反应混合物中加入32μL DiEA(1.3当量，0.18mmol)和94.7mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基(PyBOP)(1.3当量，0.18mmol)。用HPLC监测偶联。然后，沉淀由此偶联步骤获得的多肽，并用大量冷二乙醚清洗。然后将多肽溶于最少量的DMF中，然后沉淀并再次用二乙醚清洗。

向经保护的多肽加入12.2mL TFA/TIS/水混合物(95/2.5/2.5)。溶液立即变黄色，并迅速褪色。30分钟后，用300mL冷的二乙醚/庚烷混合物(1/1)沉淀多肽。将溶液离心，然后用上述混合物清洗多肽两次。将多肽溶于水中，冷冻，然后冻干。然后，产物用制备型HPLC进行纯化(梯度：40分钟内0～40％的缓冲液B，流速6mL/分钟)。冻干后获得60mg纯化的多肽(总产率50％)。

产物分析结果如下：

¹H NMR(500MHz，DMF-d7)。

Phe₂(2.98，dd，1H，Hβ；3.23，dd，1H，Hβ；4.63，m，1H，Hα；7.19-7.33，m，5H，H_arom.)；Gln₄(1.98-2.15，m，2H，Hβ；2.31，m，2H，Hγ；4.37，dt，1H，Hα；6.97，s，1H，NH₂；7.57，s，1H，NH₂；8.09，d，1H，NH)；Phe₆(2.98，dd，1H，Hβ；3.23，dd，1H，Hβ；4.63，m，1H，Hα)；Gly_{1，3，5，7，8}(3.72-4.21，m，10H，Hα；8.6，broad s，3H，NH₃ ⁺term.)。

双(三苯甲基巯基乙基)氨基基团：2.22(t，1H，SH)；2.42(t，1H，SH)；2.68(q，2H，CH₂)；2.81(q，2H，CH₂)；3.5(t，2H，CH₂)；3.58(t，2H，CH₂)。

¹³C NMR(125MHz，DMF-d7)：Phe₂(39.7，Cβ；57.5，Cα；C_arom.CO)；Gln₄(30.2，Cβ；34.1，Cγ；55.9，Cα；CO)；Phe₆(39.7，Cβ；58.2，Cα；C_arom.CO)；Gly_{1，3，5，7，8}(Cα；CO)。

双(三苯甲基巯基乙基)氨基基团：24.0；25.0；52.0；53.0。

质谱：LC-MS C₃₇H₅₂N₁₀O₉S₂[M+H]⁺计算值845.34Da；观察值845.42Da。

实施例4：仲胺双({2-[三苯甲基)硫烷基]乙基})胺的脱保护

将12.5mL TFA/TIS化合物(97.5/2.5)倒入77.75mg双({2-[三苯甲基)硫烷基]乙基})胺(0.125mmol)上。反应混合物搅拌30分钟。然后，溶液在旋转蒸发仪中蒸干获得白色固体。将所获得的固体(式(VIII′)化合物)溶于环己烷中，蒸干；重复该操作两次。

实施例5：将脱保护的胺偶联到氯代三苯甲基树脂上

将893mg树脂(三苯甲基氯树脂，主骨架为苯乙烯与1％二乙烯苯的共聚物，200-400目，1.4mmol/g，Merck公司售，产品号01-64-0074)置于反应器中(1.25mmol)。在氩气下，将来自实施例4的胺溶于5mL无水DMF中，使用气密性注射器加到树脂上。反应器用铝箔包裹搅拌过夜。向树脂加入40.5μL甲醇(1mmol)和116.5μL二甲基吡啶(1mmol)。溶剂分解30分钟后，树脂用2×2分钟DMF、2×2分钟MeOH、2×2分钟DMF、2×2分钟5％DIEA的DMF溶液以及最后用2×2分钟DMF清洗。Chloranil和Ellman比色测试表明树脂上存在仲胺且不存在自由巯基。

获得实施例5之功能化树脂的方法对应于下面的总图：

实施例6：将氨基酸偶联到实施例5得到的功能化树脂上，以提供初始支持物(具有第一氨基酸的功能化树脂)

将0.5mmol Fmoc-AA-F(经Fmoc基团保护并以酸氟化物形式活化的氨基酸)溶于2mL无水DCM中，并加到实施例5得到的树脂上(0.125mmol)。然后，加入82.4μL N-甲基吗啉(0.75mmol)。反应在室温下搅拌2小时。然后，树脂用5×2分钟无水DCM和3×2分钟DMF清洗。Chloranil和Ellman比色测试显示树脂上存在仲胺且不存在自由巯基。

树脂的最终载荷通过UV-VIS测定在290nm用20％哌啶的DMF溶液脱保护过程中释放的二苯富烯-哌啶加成化合物来测定。

此实施例用4种不同的氨基酸实施：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸。

用甘氨酸获得0.15mmol/g的载荷，用丙氨酸获得0.124mmol/g的载荷，用缬氨酸获得0.115mmol/g的载荷，用酪氨酸获得0.107mmol/g的载荷。

应当指出的是，对于将第一氨基酸偶联到固体支持物，也可以使用其它偶联剂，例如PyBOP、PyBrop、HBTU等。发现PyBrop得到的结果最好，并且可以直接使用氨基酸，而不需要使用酸氟化物预先活化(其实验可操作性较低)。

实施例7：多肽1c (H-ILKEPVHGG-N(CH ₂ CH ₂ SH) ₂ )、1d (H-ILKEPVHGA-N(CH ₂ CH ₂ SH) ₂ )、1e (H-ILKEPVHGV-N(CH ₂ CH ₂ SH) ₂ ) 和1f(H-ILKEPVHGY-N(CH ₂ CH ₂ SH) ₂ )的固相合成

多肽1c(SEQ ID NO：2)从实施例6中用甘氨酸制备的初始支持物获得。

多肽1d(SEQ ID NO：3)从实施例6中用丙氨酸制备的初始支持物获得。

多肽1e(SEQ ID NO：4)从实施例6中用缬氨酸制备的初始支持物获得。

多肽1f(SEQ ID NO：5)从实施例6中用酪氨酸制备的初始支持物获得。

多肽的合成可总结如下：

实施例7中获得的多肽具有下列通式：

使用Fmoc/叔丁基策略在实施例6获得的不同树脂(0.1mmol规模)上使用微波肽合成仪(CEM μWAVES，Saclay，France)进行各多肽的固相合成。使用超过5倍摩尔量的每种氨基酸进行偶联，使用超过4.5倍摩尔量的活化剂HBTU，使用超过10倍摩尔量的碱DiEA。

使用10mL TFA/TIS/DMS/H₂O混合物(体积比92.5/2.5/2.5/2.5)处理一小时进行最终脱保护以及将多肽从树脂切下。然后通过用100mL二乙醚/庚烷混合物(体积比1/1)沉淀获得多肽，溶于水中然后冻干。

每种多肽的纯度通过HPLC测定(使用甘氨酸的多肽1c纯度为91％，多肽1d纯度为83％，多肽1e为80％，多肽1f为88％)。多肽的MALDI-TOF分析与预期多肽的结构一致(多肽1c C₄₇H₈₁N₁₃O₁₁S₂[M+H]⁺计算值1068.6Da，观察值1068.5Da。多肽1d C₄₈H₈₃N₁₃O₁₁S₂[M+H]⁺计算值1082.6Da，观察值1082.4。多肽1e C₅₀H₈₇N₁₃O₁₁S₂[M+H]⁺计算值1110.6Da，观察值1110.5。多肽1f C₅₄H₈₇N₁₃O₁₂S₂[M+H]⁺计算值1174.6Da，观察值1174.6)。

利用Nucleosil C18柱在乙腈-水(80-20)的TFA溶液中纯化多肽，对于多肽1c，梯度为30分钟内从0到30％，对于多肽1d和1e，梯度在5分钟内从0到10％，然后在25分钟内从10％到25％。

HPLC测得的纯度：对于多肽1c为96％，总产率35％；对于多肽1d为97％，产率31％；对于多肽1e为99％，产率27％。

实施例8：多肽1c、1d和1f与多肽2(H-CILKEPVHGV-NH ₂ )的连接

根据下图分别将实施例7获得的多肽1c、1d和1f与多肽2(SEQ IDNO：6)进行连接：

这些连接可以分别获得多肽3c(具有式H-ILKEPVHGGCILKEPVHGV-NH₂，SEQ ID NO：9)，3d(具有式H-ILKEPVHGACILKEPVHGV-NH₂，SEQ ID NO：10)和3f(具有式H-ILKEPVHGYCILKEPVHGV-NH₂，SEQ ID NO：11).

多肽1c的连接。

将336mg的MPAA(2mmol，200mM)和234mg的TCEP(800μmol，80mM)溶于10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液(pH调整至7.5)中。将10.2mg多肽1c溶于混合物(7.2μmol，0.72mM)中，向此溶液中加入15.3mg多肽2H-CILKEPVHGV-NH₂(10.6mmol，1.06mM)。将混合物置于氩气下，然后在37℃搅拌。然后，产物用RP-HPLC纯化获得5.9mg多肽3c(32％)。

多肽1d的连接。

首先，制备MPAA/TCEP·HCl溶液。在1.5mL聚丙烯管中称取33.52mg MPAA和57.54mg TCEP.HCl。加入1mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)，然后加入140μL的6M NaOH，使粉末完全溶解。再加入20μL的6M NaOH调整溶液pH至7.05。

对于实际的连接反应，在相同的5mL玻璃瓶中称取5.99mg多肽1d和9.05mg多肽2。加入600μL上述溶液。反应混合物置于3个真空/氩气的循环中，然后放置在油浴中控温37℃，使用磁力搅拌器搅拌。

26.5小时后，反应混合物转移到15mL聚丙烯管中。反应瓶用3.4mL缓冲液A(含0.05(体积)％TFA的水)漂洗，将其移至15mL管。用乙醚进行4次萃取(4×4mL)。进一步通过加入150μL的10％TFA水溶液对水相进行酸化。再次用乙醚进行4次萃取(4×4mL)。

然后，将水相注入制备型HPLC(室温，230nm，Nucleosil C18柱120A-5μm，缓冲液A(含0.05(体积)％TFA的水)，缓冲液B乙腈/水，体积比4/1，含0.05(体积)％TFA，流速3mL/分钟，梯度在15分钟内B从0到15％，然后在283分钟内B从15到100％，注入体积4mL)中。

冻干后，收集到8.5mg连接产物(产率77％)。

C₉₃H₁₅₆N₂₆O₂₃S[M+H]⁺计算值2038.16，观察值2038.07。

丙氨酸对映体纯度测定：1.76％D-对映体。

多肽1f的连接。

首先，制备MPAA/TCEP·HCl溶液。在1.5mL聚丙烯管中称取33.63mg MPAA和57.37mg TCEP·HCl。加入1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)，然后加入140μL的6M NaOH，使粉末完全溶解。用6MNaOH调整溶液pH至7.05。

对于合适的连接反应，在相同的5mL玻璃瓶中称取3.97mg多肽1e和5.75mg多肽2。加入374μL上述溶液。将反应混合物置于3个真空/氩气的循环中，然后放置在油浴中控温37℃，使用磁力搅拌器搅拌。

44.5小时后，将78.6μL(30当量)1M的TCEP·HCl溶液加入磷酸盐缓冲液中，加入6N苏打调整pH＝7.0。

4.5天后，将反应混合物移至15mL聚丙烯管中。反应瓶用3.5mL缓冲液A漂洗，并用150μL的10％TFA水溶液酸化，将其移至管中。用乙醚进行3次萃取(3×5.5mL)。

然后，将水相注入制备型HPLC中(室温，230nm，Nucleosil C18柱120A-5μm，缓冲液A(含0.05(体积)％TFA的水)，缓冲液B乙腈/水，体积比4/1，含0.05(体积)％TFA，流速3mL/分钟，梯度在15分钟内B从0到15％，然后在283分钟内B从15到100％，注入体积4mL)中。

冻干后，收集3.80mg连接产物(产率54％)。

C₉₉H₁₆₀N₂₆O₂₄S[M+H]⁺计算值2130.18，观察值2130.2。

酪氨酸对映体纯度测定：1.25％D-对映体。

图1到3d示意监测连接多肽1c、1d和1f的连接反应。

实施例9：多肽1g(H-CHHLEPGG-N(CH ₂ CH ₂ SH) ₂ )的固相合成与该多肽的环化

多肽1g(SEQ ID NO：7)如多肽1c一样进行合成。

使用Fmoc/叔丁基策略(50μmol规模)利用微波肽合成仪进行多肽1g的固相合成。用HTBU作为活化剂(4.5当量)进行偶联，DIEA作为碱(10当量)。在合成结束时，树脂用二氯甲烷清洗(2×5mL)，然后用二乙醚清洗(2×5mL)，继而干燥。使用5mL TFA/TIS/DMS/H₂O混合物(体积比9.25/.25/.25/.25)处理一小时进行最终脱保护以及将多肽从树脂切下。然后，用50mL乙醚/庚烷混合物(体积比1/1)沉淀多肽，溶于水而后冻干。

多肽1g：C₃₉H₆₁N₁₃O₁₀S₃，MALDI-TOF分析[M+H]⁺计算值968.19，观察值968.2。

然后使多肽1g环化得到多肽3g，根据下图所示流程：

环化使用的条件与多肽1c和多肽2连接使用的条件相同。

将33.64mg MPAA(200mM)和22.9mg TCEP(80mM)溶于1mL的0.1M磷酸盐缓冲液(用6N NaOH溶液调整pH 7.5)中。

将1.0mg(0.76μmol)多肽1g溶于混合物(764μL，1mM)中，置于氩气中，然后在37℃搅拌。反应完全形成环化多肽3g(SEQ ID NO：12)。

多肽3g：环(CHHLEPGG)；C₃₅H₄₉N₁₂O₁₀S，MALDI-TOF分析[M+H]⁺计算值831.1，观察值831.1。

实施例10：多肽1c、1d、1e和1f氧化成二硫杂氮杂环庚烷(SEQ ID NO： 13，14，15和16)

多肽1c、1d、1e和1f如实施例7所述获得。这些多肽根据如下总图被氧化：

通过TFA/DMS/TiS/H₂O溶液(92.5/2.5/2.5/2.5；体积/体积)作用将每种多肽从固体支持物切下。然后，用大量二乙醚/庚烷混合物(1/1；体积/体积)沉淀多肽，并使用此溶液清洗两次。切除步骤后的冻干的粗提多肽溶于0.1M碳酸氢铵溶液(预先通过通氮气(1mg/mL)脱气处理10分钟)中。

然后，在室温下剧烈搅拌混合物。反应进程通过MALDI-TOF质谱监测，直到目标多肽的还原形式完全消失。最后，通过RP-HPLC纯化多肽(梯度洗脱液A(H₂O/0.05％TFA)/洗脱液B(80％乙腈/20％水/0.05％TFA)：在10分钟内从0到10％，然后在25分钟内从10到25％)，然后冷冻并冻干。

下表总结了获得的结果(MALDI-TOF分析)。

实施例11：多肽1c与多肽4之间的连接

多肽1c(SEQ ID NO：2)与多肽4(SEQ ID NO：17)连接，其中，除了N末端半胱氨酸被高半胱氨酸替换之外，多肽4与多肽2相同。此反应可以获得多肽5(SEQ ID NO：18)。反应图示如下：

将33.6mg MPAA(0.2mmol，200mM)和57.4mg TCEP(0.2mmol，200mM)溶于1mL 0.1M的磷酸盐缓冲液(pH调整至7.35)中。将6.15mg多肽1c(4.4μmol，7mM)和9.35mg多肽4(H-高半胱氨酸ILKEPVHGV-NH₂)(6.55μmol，10.5mM)溶于该混合物(624μL)中。将混合物置于氩气中，然后在37℃下搅拌。而后，通过RP-HPLC纯化产物获得3.3mg多肽5(29％)。C₉₁H₁₅₂N₂₆O₂₃S。MALDI-TOF MS分析(单一同位素)[M+H]⁺计算值2010.12，观察值2009.5。

实施例12：多肽6(SEQ ID NO：19)的合成

多肽6具有如下序列：

实施例5所述树脂(0.5mmol，0.175mmol/g)在二氯甲烷中平衡。Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.342g，5mmol)溶于二氯甲烷，加入几滴DMF助溶，然后加到树脂上。PyBrop(2.331g，5mmol)溶于最少量的二氯甲烷中，然后加到树脂上。然后将DIEA(2.613mL，15mmol)加到树脂上，偶联2小时。然后，将树脂用二氯甲烷清洗3×2分钟。而后，树脂用10％Ac₂O/5％DiEA/二氯甲烷冲洗(10mL，2分钟)处理。然后，树脂用二氯甲烷清洗5×2分钟。

利用肽合成仪(CEMμWaves，Saclay，France)，采用Fmoc/叔丁基策略将多肽6组装在前述树脂(0.25mmol，0.175mmol/g)之一部分上。使用氨基酸(0.2M，4当量)、活化剂HBTU(0.5M，3.6当量)和碱DIEA(2M，8当量)进行偶联。使用TFA/TIS/DMS/茴香硫醚/H₂O混合物(体积比90/2.5/2.5/2.5/2.5，25mL)处理2.5小时进行最终脱保护以及将多肽从树脂切下。然后，用冷的二乙醚/庚烷混合物(体积比1/1)沉淀得到肽，并溶于最少量的水中并冻干。获得288mg粗提肽(产率＝32％)。C₁₂₀H₂₁₆N₃₆O₃₁S₄LC-MS[M+H]⁺计算值(平均分子量)2788.5；观察值2788.1。

然后，在纯化之前将一部分多肽6氧化。对于此，将多肽6(49.8mg)溶于AcOH/水4/1(2mL)中。逐滴加至碘的AcOH/水(4/1)溶液(25mL，10当量)中。搅拌10分钟后，将反应混合物移至含水的分液漏斗(60mL)中。用乙醚进行3次萃取(3×60mL)。将水相冷冻并冻干，获得44.1mg粗提肽。

通过RP-HPLC(柱：Atlantis dC18OBD 5μm，19×100mm，210-300nm，缓冲液A：含0.05％TFA的100％水，缓冲液B：含0.05％TFA的CH₃CN/水(4/1)，梯度：40分钟内缓冲液B从20到40％，流速25mL/分钟)纯化后，获得7.2mg纯化肽(产率＝14.5％)。C₁₂₀H₂₁₄N₃₆O₃₁S₄LC-MS[M+H]⁺计算值(平均分子量)2786.52；观察值2786.33。

实施例13：多肽7(SEQ ID NO：20)的合成

多肽7具有如下序列：

实施例5所述树脂(0.5mmol，0.175mmol/g)在二氯甲烷中平衡。Fmoc-Tyr-OH(2.298g，5mmol)溶于二氯甲烷(＜5mL)，加入几滴DMF助溶，然后加到树脂上。PyBrop(2.331g，5mmol)溶于最少量的DCM中，然后加到树脂上。然后将DIEA(2.614mL，15mmol)加到树脂上，偶联2小时。然后将树脂用二氯甲烷清洗4×2分钟。而后，树脂用10％Ac₂O/5％DiEA/DCM(10mL，2分钟)处理，然后(10mL，20分钟)。然后，将树脂用二氯甲烷清洗5×2分钟。

利用肽合成仪(CEMμWaves，Saclay，France)，采用Fmoc/叔丁基策略将多肽7组装在前述树脂(0.5mmol，0.175mmol/g)上。使用氨基酸(0.2M，4当量)、活化剂HBTU(0.5M，3.6当量)和碱DIEA(2M，8当量)进行偶联。清洗溶剂(DMF)和Fmoc-Met-OH溶剂含有1％的茴香硫醚，以最大程度地避免序列中甲硫氨酸被氧化。

当谷氨酰胺位于位置2(0.25mmol)后，将树脂分成两部分，从而手动偶联Boc-L-Thz-OH。为了实现该方案，树脂用DMF清洗4×2分钟，在DMF中称重并分为二份。将HBTU(379.3mg，1mmol)溶于DMF(1100μL)。HOBt(135mg，1mmol)溶于DMF(500μL)并加到HBTU中。Boc-L-Thz-OH(233.29mg，1mmol)溶于DMF(500μL)并加到HBTU/HOBt混合物中。然后，向混合物中加入DIEA(522.7μL，3mmol)。搅拌1分钟，然后将混合物加至树脂上，偶联45分钟。随后树脂用DMF清洗4×2分钟，用二氯甲烷清洗4×2分钟，然后用乙醚清洗3×2分钟，然后干燥。

使用TFA/TIS/DMS/茴香硫醚/H₂O(体积比90/2.5/2.5/2.5/2.5，25mL)处理2.5小时进行最终脱保护以及将肽从树脂切下。然后，用冷的二乙醚/庚烷混合物(体积比1/1)沉淀获得肽，溶于最少量的水中并冻干。获得了369mg粗提肽(产率＝37.6％)。C₁₅₃H₂₂₃N₄₁O₄₄S₄MALDI-TOF[M+H]⁺计算值(单一同位素分辨率)3467.54；观察值3466.0。

然后在纯化之前使一部分多肽7被氧化。对于此，将片段2(51.8mg)溶于CH₃CN(2.38mL)，然后加入0.2M磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)(9.50mL)。逐滴加入10mM的二酰胺水溶液(1.32mL，1当量)。搅拌15分钟后，反应混合物用缓冲液A(1.8mL)稀释并注入RP-HPLC(柱：Atlantis dC18OBD 5μm，19×100mm，210-300nm，缓冲液A：含0.05％TFA的100％水，缓冲液B：含0.05％TFA的CH₃CN/水(4/1)，梯度：40分钟内缓冲液B从25到45％，流速：25mL/分钟)中，获得11.2mg纯化肽(产率＝21.6％)。C₁₅₃H₂₂₁N₄₁O₄₄S₄LC-MS[M+H]⁺计算值(平均分子量)3467.97；观察值3467.38。

实施例14：多肽8(SEQ ID NO：21)的合成

多肽8具有如下序列：

利用肽合成仪(CEM μWaves，Saclay，France)，采用Fmoc/叔丁基策略将多肽8组装在Novasyn TGR树脂(0.5mmol，0.25mmol/g)上。使用氨基酸(0.2M，4当量)、活化剂HBTU(0.5M，3.6当量)和碱DIEA(2M，8当量)进行偶联。使用TFA/EDT/H₂O/TIS(体积比94/2.5/2.5/1，30mL)处理2.5小时进行最终脱保护和将多肽从树脂切下。用冷的二乙醚/庚烷混合物(体积比1/1)沉淀获得肽，溶于最少量的水中并冻干。RP-HPLC纯化(Vydac C18色谱柱，50cm×2cm，280nm，缓冲液A：含0.05％TFA的100％水，缓冲液B：含0.05％TFA的CH₃CN/水(4/1)，梯度：10分钟内缓冲液B从0到20％，然后缓冲液B在60分钟内从20到50％，流速30mL/分钟)，获得272mg纯化肽(产率＝13％)。C₁₅₈H₂₃₉N₄₇O₅₂S₄MALDI-TOF[M+H]⁺计算值(单一同位素分辨率)3755.6；观察值3755.7。

实施例15：多肽7和多肽8(在手套式操作箱中)连接获得多肽7-8(SEQ ID NO：22)

将MPAA(33.70mg)和TCEP.HCl(57.30mg)溶于含4M盐酸胍的0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)(1mL)中。用5N苏打(200μL)将溶液pH调整到7.2。在同样的试管中称量多肽7(8.5mg)和多肽8(18.25mg，2当量)，并用前述溶液(309μL)溶解。反应混合物置于37℃水浴。24小时后，用同样的溶液(300μL)稀释反应混合物。

25小时后，加入0.1M醋酸盐缓冲液(pH＝3.93)(1.52mL)中的56mM O-甲基羟胺。用醋酸(35μL)将反应混合物的pH调整到pH＝4.15。于37℃下，20小时后，将反应混合物从手套式操作箱中取出。用Et₂O(3×6mL)萃取MPAA。反应混合物用TCEP.HCl(28mg)处理20分钟，然后用RP-HPLC(Uptisphere 5C4柱27.5cm×1cm，215nm，缓冲液A：含0.05％TFA的100％水，缓冲液B：含0.05％TFA的CH₃CN/水(4/1)，梯度：3分钟内缓冲液B从0到20％，然后在57分钟内缓冲液B从20％到50％，流速6mL/分钟)纯化。获得4.4mg纯化的多肽7-8(产率25.4％)C₃₀₆H₄₅₁N₈₇O₉₆S₆MALDI-TOF[M+H]⁺计算值(平均分子量)7077.8；观察值7078.5。

实施例16：多肽6和多肽7-8(在手套式操作箱中)连接获得多肽6-7-8 (SEQ ID NO：23)

将MPAA(33.74mg)和TCEP.HCl(57.54mg)溶于含4M盐酸胍的0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.3)(1mL)中。用5N苏打(220μL)将溶液pH调整到7.2。在同样的试管中称量多肽7-8(3.85mg)和多肽6(2.89mg，1.7当量)，并用上述溶液(115μL)溶解。反应混合物置于37℃水浴。

24小时后，观察到形成连接产物，即多肽6-7-8，其具有如下序列：H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEV-NH₂

C₄₁₈H₆₄₈N₁₂₂O₁₂₇S₇MALDI-TOF[M+H]⁺计算值(平均分子量)9640.01；观察值9640.1。

Claims

1.制备下式多肽的方法：

(III)X₁-X″-X₂，

X₁和X₂均表示肽片段，X″表示包含巯基功能基团的氨基酸残基，所述方法包括如下至少一个步骤——使式(I)多肽与式(II)多肽发生连接反应：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂

(II)H-X″-X₂。

2.根据权利要求1的方法，其中所述连接反应通过在存在至少一种还原二硫键之化合物的条件下使式(I′)多肽与式(II)多肽相接触来进行：

所述式(I′)多肽被原位还原成用于所述连接反应的式(I)多肽。

3.根据权利要求1或2的方法，其中X₂表示式(IV)肽片段：

(IV)X₂′-(X_i″-X_i′)_i＝3...n，

n是大于或等于3的整数；对于i取自3至n的整数，每个X_i″表示包含巯基功能基团的氨基酸残基；对于i取自2至n的整数，每个X_i′表示肽片段；

所述方法包括：在所述式(I)多肽与式(II)多肽的连接反应步骤之前，进行一系列n-2步的连接反应，连接反应的第j步是式(V)多肽与式(VI)多肽进行连接反应以形成式(VII)多肽：

(V)H-X_n-j″-X_n-j′-N(CH₂CH₂SH)₂

(VI)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j+1)...n}

(VII)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j)...n}，

其中j取自1至n-2的整数，所述残基X_n-j″的胺功能基团和/或巯基功能基团被保护，在连接反应结束时，对式(VII)多肽之残基X_n-j″的巯基功能基团进行脱保护。

4.根据权利要求3的方法，通过使式(V′)多肽与式(VI)多肽在存在至少一种还原二硫键之化合物的条件下接触，以进行式(V)多肽和式(VI)多肽的n-2步连接反应中的一个或更多个：

(VI)H-(X_i″-X_i′)_{i＝(n-j+1)...n}，

其中j取自1至n-2的整数。

5.制备式(X)环状多肽的方法：

X₂表示肽片段，X″表示包含巯基功能基团的氨基酸残基，所述方法包括如下至少一个步骤：式(XI)多肽与其自身的连接反应：

(XI)H-X″-X₂-N(CH₂CH₂SH)₂。

6.根据权利要求5的方法，其中通过将式(XI′)多肽与至少一种还原二硫键之化合物相接触来进行连接反应：

所述式(XI′)多肽被原位还原成用于连接反应的式(XI)化合物。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述连接反应在含水介质中进行，优选在pH 6.5～8.5下进行，更特别优选在pH 7～8下，理想地在约pH 7.5下。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述连接反应在存在至少一种还原二硫键之化合物的条件下进行，所述化合物选自三(2-羧乙基)膦、4-巯基苯乙酸、二硫苏糖醇、苄硫醇以及其混合物。

9.式(I)多肽或式(I′)多肽：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂

其中，X₁表示肽片段，并且-N(CH₂CH₂SH)₂基团或

与肽片段X₁之C端位置氨基酸残基的C＝O末端结合。

10.根据权利要求9的多肽，其中X₁包含2～300个氨基酸残基，优选5～100个氨基酸残基，更特别优选8～50个氨基酸残基。

11.制备式(I)多肽的方法：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂，

其中，X₁表示肽片段，-N(CH₂CH₂SH)₂基团与肽片段X₁之C末端位置氨基酸残基的C＝O末端结合，该方法包括至少一个多肽合成步骤和一个C末端功能化步骤。

12.根据权利要求11的方法，其中肽合成步骤在功能化步骤之前；肽合成步骤提供式(IX)多肽：

(IX)X₁-OH，

优选地，除了其C末端羧基功能基团之外，在其胺和羧基功能基团上包含保护性基团；功能化步骤包括：

(VIII)NH(CH₂-CH₂-S-G₁)₂，

-任选地，使式(I)多肽脱保护。

13.用于多肽固相合成的聚合物树脂支持物，其包含主骨架和NH-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团或NH-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团，其中Trt表示任选地被一个或更多个取代基取代的三苯甲基，所述取代基特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基；其中NH-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团通过两个三苯甲基与主骨架结合，或者，NH-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团通过两个胺基团与主骨架结合。

14.用于多肽固相合成的聚合物树脂支持物，其包含主骨架和G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团或G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团，其中Trt表示任选地被一个或更多个取代基取代的三苯甲基，所述取代基特别地选自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基；AA表示任选地具有一个或更多个保护性基团的氨基酸残基；G₂表示氢原子或保护胺功能基团的基团；其中G₂-AA-N(CH₂CH₂-S-Trt-)₂功能基团通过两个三苯甲基与主骨架结合，或者，G₂-AA-N-(CH₂CH₂-S-Trt-CO-NH-)₂功能基团通过两个胺基团与主骨架结合。

15.根据权利要求13或14的聚合物树脂支持物，其中所述主骨架选自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物骨架及其衍生物。

16.制备用于多肽固相合成之聚合物树脂支持物的方法，其包括：

-提供聚合物树脂；

-通过与式(VIII′)胺化合物反应使聚合物树脂功能化：

(VIII′)NH(CH₂-CH₂-S-H)₂。

17.根据权利要求16的方法，该方法包括在使聚合物树脂功能化的步骤之前：

-提供式(VIII)胺化合物：

(VIII)NH(CH₂-CH₂-S-G₁)₂，

-使该胺化合物脱保护，以获得式(VIII′)的胺化合物。

18.根据权利要求11的方法，其中：

-功能化步骤在多肽合成步骤之前；

-功能化步骤包括：

■将氨基酸偶联至权利要求13或15的聚合物树脂支持物，以提供起始支持物；或

■提供起始支持物，其为权利要求14的聚合物树脂支持物；

-肽合成步骤包括起始支持物上的一系列氨基酸偶联。

19.根据权利要求18的方法，其中将氨基酸偶联至聚合物树脂支持物包括将聚合物树脂支持物与氨基酸卤化物或者与氨基酸和活化剂接触，所述活化剂优选地选自PyBOP、BOP、PyBROP，更特别地优选PyBROP。

20.制备式(I′)多肽的方法：

其中，X₁表示肽片段，

基团与肽片段X₁之C末端位置氨基酸残基的C＝O末端结合，其包括氧化式(I)多肽的步骤：

(I)X₁-N(CH₂CH₂SH)₂，

优选地与空气接触，或者在I₂或二酰胺的存在下，和在缓冲液中，所述氧化步骤优选地在根据权利要求11、12、18或19的方法制备式(I)多肽的步骤之后。

21.根据权利要求1-8中任一项的方法，其包括根据权利要求11、12、18或19的方法制备式(I)和/或式(V)或式(XI)多肽的步骤，或者包括根据权利要求20的方法制备式(I′)和/或式(V′)或式(XI′)多肽的步骤。

22.制备药物组合物的方法，其包括：

-根据权利要求1-8或21中任一项的方法制备多肽，以及

-将该多肽与一种或更多种可药用辅药一起配制。

23.制备诊断装置的方法，其包括：

-根据权利要求1-8或21中任一项的方法制备多肽，以及

-将该多肽配制成适于诊断用途的形式。