CN102776161A - 分离自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其编码序列的制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其编码序列的制备和用途，本发明通过从草甘膦极端污染环境中采集土壤样品，构建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA库，分离获得了一种EPSP合酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。

Description

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的制备和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分离来自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的制备与用途，具体涉及从草甘膦污染土壤微生物群体DNA库中分离的具有草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白产物的制备与用途。

背景技术

草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，阻断植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡。

应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。近年来包括美国和中国在内的国家，草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦作物品种的选育和大面积推广有直接的关系。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的编码基因及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了100余份专利，获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等系列作物品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。

抗草甘膦转基因植物的研究开发对农业发展可起到巨大推进作用，因此，为选育新的高抗草甘膦的转基因作物本领域迫切需要开发新的具有抗草甘膦用途的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其编码序列的制备和用途，本发明通过从草甘膦极端污染环境中采集土壤样品，构建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA库，分离获得了一种EPSP合酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。

本发明通过如下技术方案实现：

一种分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，用于提高植物对草甘膦的抗性。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶为如下多肽，

(a)具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性为25.57U/mg。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，编码所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列选自下组：(a)编码上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，所述编码EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸序列选自下组的一种:

(a)  具有SEQ ID NO: 1中1-1335位的序列;

(b) 具有SEQ ID NO: 1中1-1338位的序列。

一种用于提高植物对草甘膦的抗性的载体，含有如上所述的多核苷酸。

一种用于提高植物对草甘膦的抗性的宿主细胞，含有如上所述的载体。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶的制备方法，(a)培养上述含有如权利要求7所述的多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。

一种能与如上所述的高抗草甘膦EPSP合酶特异性结合的抗体。

一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个到二十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

在本发明中，术语“EPSPS”、“EPSP合酶”、“EPSP合成酶”“EPSP多肽”或“5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶”可互换使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。

如发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如发明所用，“分离的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EPSP合酶。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括EPSP合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EPSP合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSPS DNA 杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EPSP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供EPSP合酶或多肽的类似物。这些类似物与天然EPSP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。

在本发明中，“EPSP合酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表   1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
			Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
			Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
			Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro; Ala	Ala
			His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe	Leu
			Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
			Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Leu
			Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
			Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
			Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳为至少70%，更佳为至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指: (1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC, 0.1%SDS, 65℃；或(2)杂交时加有变性剂, 如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1% Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且, 可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EPSP合成酶的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的EPSPS核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO:1的序列进行全序列合成。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EPSP合酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的EPSP多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码EPSP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，EPSP合酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EPSP合酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗草甘膦抗性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

另一方面，本发明还包括对EPSP合酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与EPSP合酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影响EPSP合酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EPSP合酶基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EPSP合酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EPSP合酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用EPSP合酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与EPSP合酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗EPSP合酶的抗体可用于检测样品中的EPSP合酶。

多克隆抗体的生产可用EPSP合酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明还涉及定量和定位检测EPSP合酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测检测样品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与EPSP合酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EPSP合酶。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用EPSP合酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EPSP合酶的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用免培养技术构建草甘膦污染土壤微生物的群落水平DNA库中分离的并人工全合成的。其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1338个碱基，其开放读框位于1-1335位，编码全长为445个氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO: 2)。本发明的该EPSP合酶被简称为“XA3-EPSPS”。

本发明的EPSP合酶具有如下主要特点：

A)首次明确该EPSP合酶具有抗草甘膦能力；

B)草甘膦抗性功能明确，且显示了相对较高的抗草甘膦能力。

本发明的EPSP合酶为改变植物的抗草甘膦抗性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过将EPSP合酶的编码基因导入，改变现有优良农作物品种的抗草甘膦抗性，可获得抗草甘膦的小麦、水稻或其它农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了按照本发明的EPSPS与II类EPSPS的比对结果。其中星号代表相同的氨基酸；句号标记保守的氨基酸；冒号标记十分保守的氨基酸。

图2显示了按照本发明的XA3 EPSPS与部分I类和II类EPSPS的系统发育比较图。

图3显示了XA3 EPSPS的草甘膦耐受实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：高抗草甘膦的DNA片段克隆

1、草甘膦极端污染环境中土壤样品的采集

自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中，存在种类繁多的能耐受草甘膦或其它除草剂的细菌菌株。从被草甘膦污染的土壤中(浙江新安化工集团生产草甘膦厂区)采集样品。

、采用免培养方法从草甘膦极端污染土壤样品中分离群落水平总DNA

称取草甘膦污染土壤样品2克，加入0.6g 细玻璃珠(d<0.11mm)，4000转/分振荡2 次。加入300μl 2%SDS + 12%苯酚Tris缓冲液(pH8.0)溶液冰上1小时，加入等量苯酚Tris缓冲液,pH8.0(约700ml)，充分混匀，经4℃，13,000rpm 离心5分钟。上层溶液加入0.1倍体积的3M NaAc pH5.2，混匀后加入0.6倍体积异丙醇混匀。DNA沉淀溶于200μl 1xTE (粗DNA)。称100mg氯化铯置于一个新的1.5ml Epp.离心管中，加入100μl 粗DNA 轻轻混匀，室温黑暗条件下静置1-3小时。室温，13,000rpm，离心20分钟。上清液中加入400μl无菌去离子水和300μl异丙醇，室温静置30分钟。室温，13,000rpm，离心20分钟。沉淀溶于100μl 1xTE和40μl 8M 醋酸钾(KAc)，室温静置15分钟。4℃，13,000rpm离心15分钟。上清液加入0.6倍体积异丙醇混匀。室温静置30分钟。室温，15,000rpm离心20分钟。DNA 沉淀溶于100μl 1xTE。

采用Wizard spin column clean-up分离试剂盒纯化DNA样品。纯化DNA溶于总体积为100μl的10mM Tris-EDTA(pH8.0)缓冲液中。

、群落水平总DNA粘粒文库的构建

土壤细菌DNA用Sau3AI在10μl反应体系进行部分酶切试切，Sau3AI酶按1:100稀释，37℃，分别酶切10min, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min后加入10×loading buffer 1μl终止反应，电泳检测最适酶切反应时间。而后选择相同的体系酶切30 min进行大量酶切。经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收2～6kb DNA片段备用。质粒载体pACYC184(购自NEB公司)用BamHI完全酶切后用SAP碱性磷酸脂酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的土壤细菌DNA(200ng)和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184(150ng)用2U的T4 ligase在4℃下连接16h。

上述连接产物转入E.coli ER2799(购自NEB公司)电击感受态细胞，涂布LB＋Cm^r＋ Km^r。然后将LB板上生长的克隆影印到M9＋Cm^r＋ Km^r＋50mm草甘膦的平板，37℃培养48h。将平板上生长的菌经LB平板划线培养后，将这些菌落再接种到含不同草甘膦浓度的M9平板上(100，150mm 草甘膦)。将这些重组菌中的质粒抽提后重新转化ER2799后涂布M9＋Cm^r＋Km^r平板验证(ER2799＋pACYC184为对照)，同时进行重组质粒酶切验证。

、筛选草甘膦抗性转化子

将转染细菌涂布含Cm(氯霉素)、Km(卡那霉素)的LB平板上，37℃培养20h后，约有5000个菌落生长，将这些菌落影印到含Cm^r 、Km^r和50mM草甘膦的M9平板上培养48h后，有三个菌落生长。将这三个菌落接种到含100mM、150mM的草甘膦的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含150mM的草甘膦的M9平板上生长,其所含的质粒被命名为pACYCXA3。从该克隆抽提的质粒pACYCXA3转入E.coliER2799或大肠杆菌JM109中，将转化子用无菌牙签点于含20mM草甘膦的MOPS固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入pACYCXA3引起的。

、草甘膦耐受实验

将大肠杆菌ER2799(含携带有新克隆的pACYCXA3质粒)接种到含0～200mm草甘膦的M9液体培养基(Cm^r＋ Km^r)中，经过37℃、72h的 摇床培养后，测定培养物的OD₆₀₀。同时以含无插入片段的质粒的大肠杆菌ER2799为阴性对照，以含插入已知草甘膦抗性基因HTG7 aroA的大肠杆菌ER2799(含pACYCHTG7，该质粒携带有已知的草甘膦抗性基因HTG7 aroA)作为阳性对照。

结果：

将ER2799(携带pACYCXA3质粒)接种到含0～200mm草甘膦的M9液体培养基(Cm^r＋ Km^r)中，经过37℃、72h的 摇床培养后，发现阴性对照在M9中几乎不能生长；阳性ER2799(pACYCHGT7)能在仅含有100mm草甘膦的M9液体培养基中生长良好;而ER2799(pACYCXA3)则在含有150mm草甘膦的M9液体培养基中还能生长。这一结果说明pACYCXA3上携带的外源片段具有非常强的草甘膦耐受活性（见图3）。

实施例2：高抗草甘膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合成酶功能验证

1、高抗草甘膦的DNA片段的序列分析  

对实施例1中所亚克隆的高抗草甘膦DNA片段进行全核苷酸序列测定。分析结果表明，插入的片段大小为2643bp，其中包含了一个1338bp的阅读框，其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1338个碱基，其开放读框位于1-1335位，编码全长为445个氨基酸的EPSP合成酶(SEQ ID NO: 2)。

氨基酸序列同源性分析结果表明，本发明的EPSP合酶与Magnetococcus MC-1的EPSPS的氨基酸同一性为100%。多基因序列比对表明XA3-DEPSPS明显与II型的EPSPS聚为一类 (图2)。该结果说明XA3 EPSPS属于II类EPSPS。XA3 EPSPS与部分I类和II类EPSPS的系统发育比较结果如图2所示。

、高抗草甘膦的DNA片段的EPSP合酶功能验证

序列分析结果显示抗性克隆中含有EPSP合酶的ORF，为了证实其具有EPSP合酶活性，本实验以常规的大肠杆菌EPSP合酶缺陷型菌株ER2799为受体菌株，采用CaCl₂法将草甘膦抗性亚克隆pACYCXA3转入，用无菌牙签将转化子菌落点于MOPS固体培养基上，受体菌株ER2799、含有空载体质粒的ER2799为阴性对照，如抗草甘膦亚克隆含有可表达的EPSP合酶基因，互补了受体菌的缺陷，则能够利用限制性培养基的无机物合成氨基酸并生长，否则就不能生长。

试验结果表明，草甘膦抗性亚克隆中所含的DNA片段均能在功能上互补EPSP合酶缺陷型菌株，因此，可以确定亚克隆pACYCXA3中含有完整功能的EPSP合酶基因。

实施例3：高抗草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成

根据已完成的含1338bp编码区的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度约150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T4 DNA连接酶催化组装成一个完整的EPSP合酶基因。该合成的DNA片段含有SEQ ID NO:1中1-1335位的核苷酸序列，并且合成基因的上下游两端含NdeI和HindIII位点。

将上述人工合成的5'和3'端酶切位点为NdeI和HindIII位点EPSPS基因，用于表达高抗草甘膦的EPSP合酶以及构建相应的基因植物表达载体。

实施例4：高抗草甘膦的EPSPS表达

上述人工合成的5'和3'端酶切位点为NdeI和HindIII位点EPSPS基因，用NdeI和HindIII酶切后，连入相同酶切的载体pET28a(购自NOVAGEN公司)得到重组质粒pETXA3并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。将转化子先在LB＋Kan^r培养基中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值约0.5，加入IPTG(终浓度为0.75mmol/L)后转入37℃诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳检测。

经SDS-PAGE 电泳检测，含有pETXA3的E.coli BL21(DE3)在37℃经IPTG诱导4h后表达量即达到最高值。目的蛋白为可溶性蛋白；大小约47kD，与预测值相符。

实施例5：EPSPS的酶活测定和动力学参数的测定

(a)测定方法

无机磷标准曲线：10mM无机磷标准液按1:10稀释，分别取0、1、2、3…20μl于1.5ml Eppendorf离心管中，加入milli-Q纯水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入34% SC溶液100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值。重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图得到无机磷标准曲线。

酶活测定：酶粗提物蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford, 1976)。在冰上于1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μl，10mM S3P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM (NH4)6MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl和milli-Q纯水12μl混匀，于28℃温浴5min后各管样品间隔2S加入1μl粗酶液并计时，2min后再间隔2S依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2S依次加入20μl 34% SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加酶液外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到该酶的酶活力(U/mg)。

半抑制剂量(IC50)测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度V(U/mg)为Y轴作图。

Km(PEP)测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM)下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作图。

Ki(glyphosate)测定：在不同草甘膦浓度(0、10、50、100μM)下测定PEP浓度为66.7、100、200、500μM时EPSPS的酶反应速度。采用双对数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为Ki(glyphosate)值。

(b)结果

XA3 EPSPS的酶活性为25.57U/mg。

XA3 EPSPS的动力学参数测定如下表所示： 

动力学参数	XA3 EPSPS
		IC50 (glyphosate; mM)	25.035±0.022
K m (PEP; mM)	0.0443±0.012
		K i (glyphosate; mM)	0.746±0.007

根据XA3 EPSPS的动力学参数可知，XA3 EPSPS不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为将XA3 EPSPS用于转基因作物的培育提供可能。

实施例6：高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体的构建

高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体构建的具体方法如下：

A. pBI121(购自ClonTech公司)和pCAMBIA2300(购自ClonTech公司)用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有p35S-GUS- Nos-ter的片段连入pCAMBIA2300，形成中间载体p35S-2300-GUS；

B. 用XbaI和SacI双切p35S-2300-GUS和上述人工合成的EPSPS基因，用EPSPS置换p35S-2300-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体。再将其转入农杆菌中，用于转化模式植物烟草。

实施例7：利用叶盘法转化构建抗草甘膦的转基因烟草

(1) 用无菌牙签挑取YPE选择平板上的实施例5中制备的阳性克隆，接种于2MLYPE液体(Sm+,Kan+),28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

(2)室温下4，000g离心10分钟；

(3) 弃上清，菌体用1／2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌体的OD₆₀₀在0.5左右；

(4) 取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm²见方的小叶片；

(5) 将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；把经浸染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

(6)将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/l+NAA 0.1mg/l+Kan 50mg/l+羧苄青霉素250mg/l)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

(7)约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1／2MS+NAA 0.5mg/l+Kan 25mg/l)上进行生根培养，2-7天左右生根；

(8) 待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着着的固体培养基，移入土壤中，刚开始几天用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，转移至在含10mM的草甘膦的固体培养基中筛选草甘膦抗性的植株。

(9)抗性植株经Southern 、Northern杂交以及Westhern blot验证为转基因的抗性植株。

(10)在温室中经草甘膦抗性梯度实验证明，转基因植物能耐受30mM草甘膦处理而生长正常。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。还需要说明的是，按照本发明的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途的技术方案的范畴包括本说明书各部分及其任意组合。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院生物技术研究所

 

<120>  分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的制备和用途

 

<130>  ZFSZZ110123

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1338

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgtccagca cccatcccgg acgcaccatc cgtagcggcg ccacgcaaaa cctctccggc     60

 

accatccgcc ccgccgccga taaatccatc tcccaccgct ccgtgatctt tggcgccctg    120

 

gccgaaggcg aaacccacgt taaaggcatg ctggaaggcg aagatgtgct gcgtaccatc    180

 

accgcctttc gtaccatggg tatctctatc gaacgctgca acgaaggtga ataccgcatc    240

 

caaggccaag gactcgacgg cctaaaagaa cccgatgacg tgctggatat gggtaactcc    300

 

ggtaccgcca tgcgcctgct gtgcggcctg ctggccagcc aaccctttca ctctatcctc    360

 

accggcgatc actccctacg cagccgcccc atgggccgcg tagtgcaacc cctaaccaaa    420

 

atgggcgctc gcatccgtgg ccgcgacggt ggccgcctgg cccccctcgc catcgaaggc    480

 

actgaactgg tacccattac ctacaatagc cccatcgcct cggcccaagt gaagtccgcc    540

 

attatcctgg ccggactcaa taccgccggc gaaaccacca tcattgaacc cgccgtcagc    600

 

cgcgaccaca ccgaacgtat gctcatcgcc ttcggtgccg aagtgacccg cgatggcaac    660

 

caagtgacca tcgaaggctg gcccaacctg caaggccaag agatcgaagt gcccgccgat    720

 

atctccgccg ccgccttccc catggtggcc gcccttatca ccccaggatc tgatattatc    780

 

ctggaaaatg tgggtatgaa cccaacccgt accggtattc tcgacctgct cctggctatg    840

 

ggcggcaata tccaacgcct caacgaacgg gaagttggcg gcgaacccgt ggccgaccta    900

 

caggtgcgct actcccaact ccaaggcatc gagatagacc ccaccgtggt gccccgtgcc    960

 

attgatgagt tccccgtgtt ttttgtagcc gccgccctcg cccaaggcca aaccctggtg   1020

 

caaggcgccg aagagctgcg cgttaaagag agcgaccgca tcaccgccat ggccaacggt   1080

 

cttaaagccc taggtgccat catagaagaa cgccccgatg gcgcacttat taccggaaat   1140

 

cccgacggtc tggccggtgg ggccagcgta gactccttta ccgaccaccg tatcgccatg   1200

 

agcctgctgg tggccggcct gcgctgtaaa gagtccgtat tggtgcaacg ctgcgataat   1260

 

atcaatacct cctttcccag cttttcccaa ttaatgaaca gtcttggttt tcaattggag   1320

 

gatgtcagcc atggctga                                                 1338

 

 

<210>  2

<211>  445

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 

Met Ser Ser Thr His Pro Gly Arg Thr Ile Arg Ser Gly Ala Thr Gln

1                       5                          10                         15     

 

 

Asn Leu Ser Gly Thr Ile Arg Pro Ala Ala Asp Lys Ser Ile Ser His

                     20                          25                        30         

 

 

Arg Ser Val Ile Phe Gly Ala Leu Ala Glu Gly Glu Thr His Val Lys

          35                       40                        45             

 

 

Gly Met Leu Glu Gly Glu Asp Val Leu Arg Thr Ile Thr Ala Phe Arg

     50                        55                        60                 

 

 

Thr Met Gly Ile Ser Ile Glu Arg Cys Asn Glu Gly Glu Tyr Arg Ile

65                       70                        75                       80 

 

 

Gln Gly Gln Gly Leu Asp Gly Leu Lys Glu Pro Asp Asp Val Leu Asp

                      85                        90                        95     

 

 

Met Gly Asn Ser Gly Thr Ala Met Arg Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ala

                100                      105                       110        

 

 

Ser Gln Pro Phe His Ser Ile Leu Thr Gly Asp His Ser Leu Arg Ser

          115                     120                      125            

 

 

Arg Pro Met Gly Arg Val Val Gln Pro Leu Thr Lys Met Gly Ala Arg

     130                      135                      140                

 

 

Ile Arg Gly Arg Asp Gly Gly Arg Leu Ala Pro Leu Ala Ile Glu Gly

145                     150                       155                     160

 

 

Thr Glu Leu Val Pro Ile Thr Tyr Asn Ser Pro Ile Ala Ser Ala Gln

                     165                     170                    175    

 

 

Val Lys Ser Ala Ile Ile Leu Ala Gly Leu Asn Thr Ala Gly Glu Thr

               180                    185                       190        

 

 

Thr Ile Ile Glu Pro Ala Val Ser Arg Asp His Thr Glu Arg Met Leu

         195                     200                      205            

 

 

Ile Ala Phe Gly Ala Glu Val Thr Arg Asp Gly Asn Gln Val Thr Ile

    210                      215                      220                

 

 

Glu Gly Trp Pro Asn Leu Gln Gly Gln Glu Ile Glu Val Pro Ala Asp

225                      230                       235                     240

 

 

Ile Ser Ala Ala Ala Phe Pro Met Val Ala Ala Leu Ile Thr Pro Gly

                    245                      250                     255    

 

 

Ser Asp Ile Ile Leu Glu Asn Val Gly Met Asn Pro Thr Arg Thr Gly

               260                     265                       270        

 

 

Ile Leu Asp Leu Leu Leu Ala Met Gly Gly Asn Ile Gln Arg Leu Asn

          275                       280                     285            

 

 

Glu Arg Glu Val Gly Gly Glu Pro Val Ala Asp Leu Gln Val Arg Tyr

     290                      295                      300                

 

 

Ser Gln Leu Gln Gly Ile Glu Ile Asp Pro Thr Val Val Pro Arg Ala

305                      310                     315                     320

 

 

Ile Asp Glu Phe Pro Val Phe Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Gln Gly

                     325                     330                      335    

 

 

Gln Thr Leu Val Gln Gly Ala Glu Glu Leu Arg Val Lys Glu Ser Asp

                340                      345                      350        

 

 

Arg Ile Thr Ala Met Ala Asn Gly Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ile Ile

          355                      360                      365            

 

 

Glu Glu Arg Pro Asp Gly Ala Leu Ile Thr Gly Asn Pro Asp Gly Leu

     370                      375                      380                 

 

 

Ala Gly Gly Ala Ser Val Asp Ser Phe Thr Asp His Arg Ile Ala Met

385                      390                      395                     400

 

 

Ser Leu Leu Val Ala Gly Leu Arg Cys Lys Glu Ser Val Leu Val Gln

                     405                      410                      415    

 

 

Arg Cys Asp Asn Ile Asn Thr Ser Phe Pro Ser Phe Ser Gln Leu Met

                420                     425                      430        

 

 

Asn Ser Leu Gly Phe Gln Leu Glu Asp Val Ser His Gly

          435                       440                      445

 

 

Claims (10)

1.一种分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，所述编码序列包含SEQ ID NO: 1，其特征在于：用于提高植物对草甘膦的抗性。

2.如权利要求1所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

3.如权利要求2所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：高抗草甘膦EPSP合酶为如下多肽，

(a)具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。

4.如权利要求3所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性为25.57U/mg。

5.如权利要求4所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：高抗草甘膦EPSP合酶的K _m值为0.0443±0.012。

6.如权利要求5所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：高抗草甘膦EPSP合酶的K _i值为0.746±0.007。

7.如权利要求6所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：编码所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列选自下组：(a)编码上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于：所述编码EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸序列选自下组的一种:

(a)   具有SEQ ID NO: 1中1-1335位的序列;

(b)   具有SEQ ID NO: 1中1-1338位的序列。

9.一种含有如权利要求8所述的多核苷酸的用于提高植物对草甘膦的抗性的载体。

10.一种含有如权利要求9所述的载体用于提高植物对草甘膦的抗性的宿主细胞。

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