CN102727900B - 一种鸡球虫病疫苗助悬剂及悬浮液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡球虫病疫苗助悬剂及悬浮液，它由黄原胶和乙醇水溶液组成，其中乙醇水溶液的体积浓度大于38%~100%，黄原胶与乙醇水溶液按g/ml的比例为3%~60%。所述为黄原胶优选食品级、药物级黄原胶，所述乙醇优选为食品级、药物级乙醇。本发明还公开了由上述的助悬剂配制的助悬液。本发明的有益效果是：一、本发明助悬剂能快速溶解入水。二、制备的悬浮液能维持鸡球虫活疫苗的卵囊在水中8小时不沉降，提高鸡饮入疫苗卵囊数量的均匀度。三、可以不停水免疫鸡群，减少停水应激。四、也可以停水免疫鸡群，缩短免疫时间。五、能降低疫苗的副反应。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡球虫病疫苗助悬剂及悬浮液，具体涉及一种用于饮水免疫的鸡球虫病活卵囊疫苗的助悬剂及悬浮液，该助悬剂既能快速溶解；又能减缓疫苗卵囊的下沉达8小时，并使鸡群的不停水免疫或停水免疫都能得以实现，并且两种情况下都能降低疫苗的副反应。
背景技术
鸡球虫病是一种原生动物寄生虫病，由柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫的一种或一种以上引起。它们在鸡的肠道各部位寄生，引起肠道的炎症、出血和鸡的死亡，给养鸡业造成巨大的经济损失。
长期以来，该病的防治以药物为主。由于药物残留影响食品安全和人类健康，加上球虫对药物很容易产生抗药性，该病的防治越来越依靠免疫手段。
目前使用的鸡球虫病疫苗主要是活卵囊疫苗，例如先灵葆雅的PARACOX和COCCIVAC、加拿大维泰克的IMMUCOX、梅里亚的LIVACOX。其中COCCIVAC已有近60年的历史（R.B.Williams,Avian disease46:775—802,2002,Historical article—Fifty years ofAnticoccidial vaccines for poultry(1952--2002)）。
鸡球虫病疫苗可以以多种方式接种给鸡，如喷雾、喷料、拌料、滴口、口服凝胶、饮水等。所有上述方法都无法彻底解决免疫均匀性和副反应的问题，即每只鸡摄入的卵囊数量多少不一，产生的免疫力也高低不一，当鸡从垫料中吃到所免疫球虫疫苗的后代卵囊时，那些免疫力较低而摄入卵囊较多的鸡就容易出现疫苗免疫的副反应，出现粪便异常、血便、死亡等异常情况，影响养鸡生产和球虫疫苗的使用。
饮水免疫具有混合较均匀、疫苗活力保存较好等优点。饮水免疫可分为停水免疫和不停水免疫两种方式。停水免疫是指在免疫之前给鸡断绝水源，使鸡在一段时间内喝不到水，当开始饮水免疫时，所有鸡同时开始喝水，停水免疫能使整个免疫操作时间缩短；但对鸡会产生一定程度的应激。不停水免疫是指不给鸡断绝水源，可减少停水应激，但整个免疫过程持续时间较长，时间加长能影响疫苗的活力。现代养鸡生产中，饲养和管理人员效率很高，非常繁忙，以上两种方式各有优点，都被养鸡生产所采用。
饮水免疫时，混合后的疫苗卵囊容易沉淀，这样鸡在饮水免疫时获得的疫苗卵囊就会出现较大差异，均匀性较差。
黄原胶又称黄胶、汉生胶，黄单胞多糖，是一种由假黄单胞菌属发酵产生的单孢多糖，由甘蓝黑腐病野油菜黄单胞菌以碳水化合物为主要原料，经好氧发酵生物工程技术，切断1，6-糖苷键，打开支链后，按1，4-键合成直链组成的一种酸性胞外杂多糖。1952年由美国农业部伊利诺斯州皮奥里尔北部研究所分离得到的甘蓝黑腐病黄单胞菌，并使甘蓝提取物转化为水溶性的酸性胞外杂多糖而得到。黄原胶是目前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体．性能优越的生物胶。但由于它有极强的亲水性，如果直接加入水中，外层吸水膨胀成胶团，胶团包裹住里层的干粉，会阻止水分进入里层，从而大大减慢其溶解速度。由黄原胶、乙醇水溶液组成的混合物能够快速溶解在水中，不形成胶团。
在将由黄原胶、乙醇水溶液组成的混合物引用到球虫疫苗助悬剂这一新的领域时，首先必须解决下面的问题。1、所用助悬剂对鸡没有毒害作用；2、所用助悬剂对球虫卵囊没有杀伤作用；3、所用悬浮剂对球虫卵囊释放出的有感染性的子孢子没有伤害作用；4、所用悬浮剂不堵塞水线。
以往报道的助悬剂，例如羧甲基纤维素，溶解过程很长。王江清等报道过羧甲基纤维素作为鸡球虫疫苗助悬剂的应用效果（王江清等.柔嫩艾美尔球虫早熟减毒株饮水免疫方法的研究.山东畜牧兽医,1999,04）。但羧甲基纤维素在水中溶解速度较慢，需要在水中长时间浸泡才能溶解，如在人工多次捏碎的情况下，需要十几个小时才能溶解。故该纤维素醚不是一种理想的鸡球虫病疫苗助悬剂。
在现代化养鸡业中，每个饲养员要喂养的鸡很多，劳动强度很大、工作繁忙，球虫活卵囊疫苗的助悬剂必须快速溶解才能符合高效率的现代化养鸡生产的要求。如何提高助悬剂溶解速度，是一个急待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种鸡球虫病疫苗助悬剂及悬浮液。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种鸡球虫病疫苗助悬剂，它由黄原胶和乙醇水溶液组成，其中乙醇水溶液的体积浓度为38%~100%，黄原胶与乙醇水溶液按g/ml的比例为3%~60%。
所述乙醇水溶液的体积浓度为45%~100%。
优选乙醇水溶液的体积浓度为75%。
黄原胶与乙醇水溶液的比例为3%~24%。
所述为黄原胶优选食品级、药物级黄原胶，所述乙醇优选为食品级、药物级乙醇。
本发明还提供了一种由上述的助悬剂配制的助悬液。
本发明的有益效果是：一、本发明助悬剂能快速溶解入水。二、制备的悬浮液能维持鸡球虫活疫苗的卵囊在水中8小时不沉降，提高鸡饮入疫苗卵囊数量的均匀度。三、可以不停水免疫鸡群，减少停水应激。四、也可以停水免疫鸡群，缩短免疫时间。五、能降低疫苗的副反应。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
一、该发明的助悬剂对球虫子孢子无毒害作用、不堵塞水线。
经过反复研究，本发明人发现该发明的助悬剂对鸡、鸡球虫卵囊、鸡球虫子孢子没有毒害作用并且不堵塞水线。
水线是指在养鸡生产中给鸡输送水的管道、乳头式饮水器等，它们很容易被脱落的生物膜碎片、饮水使用的治疗药物的杂质堵塞，并且不容易清理。经试验，本发明的助悬剂不会出现堵塞水线的现象。
虽然鸡球虫卵囊具有较厚的卵囊壁，能够阻挡很多化学物质的杀灭作用；但是，当球虫卵囊进入鸡体内后，卵囊中的子孢子会释放出来。按照专业常识，失去卵囊壁的保护作用后，子孢子会与鸡喝入的悬浮剂直接接触，子孢子有可能受到鸡喝入的助悬剂的伤害。
实施例1.取黄原胶3.6克、95%乙醇水溶液25毫升混合作为助悬剂，将该助悬剂倒入6公斤水中并搅拌，该助悬剂很快溶解。含有堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、柔嫩艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫4种鸡球虫孢子化卵囊液2毫升（每毫升含孢子化卵囊1万个），摇匀，均分成2份各1毫升。4日龄鸡20只，均分成2组各10只。取该发明已溶解的助悬剂溶液9毫升与1份鸡球虫孢子化卵囊液混合，按每只鸡1毫升（每毫升含孢子化卵囊1000个）的量各接种给1组鸡；第2组鸡不加助悬剂溶液，用9毫升水与1份鸡球虫孢子化卵囊液混合，按每只鸡1毫升（每毫升含孢子化卵囊1000个）的量接种给鸡。收集2组鸡的含卵囊粪便，计算粪便中的卵囊总数。结果如表1.（毒害作用试验）。两组鸡的粪便中卵囊总数基本相同。证明本发明中的助悬剂对球虫子孢子没有毒害作用。
表1.毒害作用试验
二、该发明的助悬剂能快速溶解。
我们发现，该发明的悬浮剂能够快速溶入水中。
实施例2.
取黄原胶每份3.6克。取体积浓度为38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、55%、65%、75%、85%、95%、100%的乙醇水溶液各25毫升。将一份乙醇水溶液与一份黄原胶混合，摇匀后倒入6公斤水中并搅拌，该助悬剂很快溶解,结果如表2.所示。
表2.乙醇浓度与溶解时间的关系
实验证明，随着乙醇浓度的升高，其溶解速度加快；特别是当乙醇水溶液的浓度为45%~100%时，溶解时间较短，故优选乙醇水溶液的浓度为45%~100%。乙醇水溶液的浓度取75%时，该溶液的防腐效果最好，故优选75%的乙醇水溶液。
实施例3.
取黄原胶3克、6克、9克、12克、15克、18克、21克、24克、27克、30克、33克、36克、39克、42克、45克、48克、51克、54克、57克、60克分别与100毫升50%（体积比）的乙醇水溶液混合，摇匀后倒入20公斤水中并搅拌，该助悬剂都在2分钟内溶解，具体溶解时间如表3所示。实验证明，当黄原胶与乙醇水溶液的比例在24克：100毫升以下时，助悬剂在水中溶解较快，故优选3~24克黄原胶：100毫升的乙醇水溶液。
表3黄原胶克数与溶解时间的关系
取羧甲基纤维素钠（CMC）250克，少量缓慢加入100公斤水中并搅拌，其溶解速度很慢，长达十几小时。
两种方法的溶解速度结果如表4（溶解速度试验），该发明的溶解速度最快。必须说明的是，在大规模养鸡生产中，每个鸡舍饲养的鸡数多达2万只，如果按每只鸡饮水6公斤、含助悬剂0.25%计算(本发明不局限于0.25%)，每个鸡舍使用的助悬剂很多，缓慢加入将会浪费大量时间，影响鸡球虫疫苗的使用。
表4.溶解速度试验
三、该发明的助悬剂能够使疫苗卵囊维持8小时以上基本不沉降，提高疫苗卵囊分布的均匀度。
实施例5.
1、将黄原胶10.8克、45%乙醇水溶液75毫升混合作为助悬剂，将该助悬剂倒入18公斤水中并搅拌，该助悬剂很快溶解，此为溶液甲。
2、不加助悬剂的水18公斤。此为乙。
取上述甲、乙溶液各100毫升与1瓶2毫升共1000羽份的同批次的鸡球虫病四价活疫苗混合，摇匀。放置不同时间后，分别从上层取出50微升，用血球计数板计算该50微升中的孢子化卵囊数量。结果如表5.（均匀度测定试验）。
从表3可以看出，溶液甲的卵囊分布均匀度好，能够维持8小时以上基本不变。
表5.均匀度测定试验
四、该发明的助悬剂既能用于停水免疫、又能用于不停水免疫，能降低疫苗的副反应并成功应用于养鸡生产。
该发明使鸡球虫疫苗卵囊能够在水中悬浮8小时以上，可以实现鸡群的不停水免疫，减少应激反应；也可以应用于停水免疫，缩短免疫的操作时间。在两种情况下，都可以降低疫苗的副反应。
球虫疫苗的副反应是指疫苗免疫后，免疫的卵囊在鸡体内繁殖并排出较多的下一代卵囊，假如免疫鸡不能够抵抗下一代卵囊的攻击，免疫鸡就会出现球虫病症状，甚至死亡，严重影响球虫病疫苗的效果。所以，一种好的球虫病疫苗必须最大限度地减少由于球虫病疫苗免疫而引起的副反应。
实施例6.6公斤实施例5中的甲、乙两种溶液分别与1000头份的鸡球虫疫苗混匀，停水2小时后给1000只鸡饮水免疫，免疫后饲养在稻壳垫料上，免疫后12天解剖20只鸡，按照Jhonson和Raid的方法记录病变计分(Johnson,J.,and Reid,W.M.1970.Anticoccidialdrugs:lesion scoring techniques in battery and floorpen experiments with chickens.Exp.parasital.28:30~36)，该病变计分标准列在本申请书的最后，免疫后21天，取10只鸡用柔嫩艾美尔球虫强毒5万个、毒害艾美尔球虫强毒5万个、巨型艾美尔球虫强毒株5万个、堆形艾美尔球虫强毒株5万个攻击，6天后解剖并记录病变计分。将盲肠、十二指肠、小肠中段三个部位的平均计分加在一起即为计分总和。结果如表6（停水免疫的疫苗副反应和免疫效果）。.
表6.停水免疫的疫苗副反应和免疫效果
实施例7.6公斤实施例5中的甲、乙两种溶液分别与1000头份的某公司生产的鸡球虫疫苗混匀，在不停水的情况下各给1000只鸡饮水免疫，免疫后饲养在稻壳垫料上，免疫后13天解剖20只鸡，按照Jhonson和Raid的方法记录病变计分，免疫后21天，取10只鸡用柔嫩艾美尔球虫强毒5万个、毒害艾美尔球虫强毒5万个、巨型艾美尔球虫强毒株5万个、堆形艾美尔球虫强毒株5万个攻击，6天后解剖并记录病变计分。将盲肠、十二指肠、小肠中段三个部位的平均计分加在一起即为计分总和。结果如表7.（不停水免疫的疫苗副反应和免疫效果）。
表7.不停水免疫的疫苗副反应和免疫效果
从表6和表7的结果可以看出，该发明的助悬剂既能用于不停水免疫，又能用于停水免疫，取得了良好的免疫效果；并且两种情况下，疫苗液甲组免疫的鸡的肠道病变都较轻，降低了疫苗的副反应。
鸡球虫病活卵囊疫苗自COCCIVAC球虫病疫苗1952年出现以来，已有50多年的历史，在这个漫长的过程中，虽然有利用黄原胶悬浮鸡球虫卵囊的报道，但没有人利用该发明提到的黄原胶、乙醇水溶液组成的混合物能速溶入水的特征对鸡球虫病疫苗进行不停水的饮水免疫以减少应激或停水后的饮水免疫以缩短操作时间，并且两种情况下都能降低疫苗的副反应。
附录1病变记分
1柔嫩艾美尔球虫引起的病变感染后第5~7日之间剖检盲肠（两侧盲肠病变不一致时，以严重一侧为准）。
0分无肉眼可见病变。
+1分盲肠壁有少量散在出血点或出血斑，肠壁不增厚，肠内容物正常。
+2分出血点或出血斑数量增多，肠内容物明显带血，肠壁略增厚，有正常内容物
+3分盲肠腔内有大量血液或出现盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样香蕉型块状物）；盲肠壁极度增厚；盲肠腔没有或仅有少量的盲肠粪便。
+4分因出血量多和干酪样盲肠芯大，盲肠极度扩张；盲肠腔内没有粪便或粪便已被包在肠芯中；病死鸡记为+4分。
2巨型艾美尔球虫引起的病变感染后第6~7日之间剖检小肠。
0分无肉眼可见病变。
+1分小肠中段浆膜隐约可见小的红色出血点；肠壁不增厚，肠腔中可能有少量桔黄色粘液，没有胀气。
+2分浆膜面有许多红色出血点；肠腔中见多量的桔黄色粘液；肠壁增厚；轻度胀气或没有胀气。
+3分有胀气且肠壁增厚；粘膜面粗糙；肠内容物中充满小的血凝块和粘液。
+4分小肠大部分胀气；肠内容物含有大量血凝块和消化的红细胞而呈红褐色；肠壁显著增厚。病死鸡记为+4分。
3堆形艾美尔球虫引起的病变感染后第5~7日之间剖检十二指肠。
0分无肉眼可见病变。
+1分含有正在发育的卵囊的散在白色结节局限于十二指肠；结节长形，横向排列，外观呈梯形；浆膜面和粘膜面都可见到结节；每平方厘米最多有5个结节。
+2分病变较为密集，但未融合；3周龄仔鸡病变可能延伸至十二指肠后20厘米处；肠壁不增厚；内容物正常。
+3分病变融合成片，肠壁显得象罩了一层病变；肠壁增厚，内容物呈水样；病变可延伸至卵黄蒂处。
+4分粘膜面浅灰色，白色结节完全融合；充血状况可能表现为小的淤血点，或者在极其严重感染下整个粘膜面呈鲜红色；在小肠上段可能已经分辨不出单个病变；在小肠中段可见典型的梯形病变；肠壁极度增厚，肠腔内充满奶油状渗出物，渗出物中可能有大量卵囊；病死鸡记为+4分。
4、毒害艾美尔球虫引起的病变感染后第5~7日之间剖检小肠。
0分无肉眼可见病变。
+1分浆膜面容易见到针尖大小的散在的出血点和白点；粘膜面没有或仅有很少病变。
+2分浆膜面有大量出血点和白点；小肠中段可能会出现轻度胀气。
+3分浆膜面布满红色出血点和白点；粘膜面粗糙、增厚，并有许多针尖大小出血点；肠腔内有多量出血，没有正常的肠内容物；胀气扩展到整个小肠下段。
+4分大量出血使小肠外观呈黑紫色，小肠内容物中含有红色或棕色粘液，胀气可能扩展到小肠大部分。病死鸡记为4分。
Claims (2)
1.一种鸡球虫病疫苗助悬剂，其特征是，它由黄原胶和乙醇水溶液组成，其中乙醇水溶液的体积浓度为75%，黄原胶与乙醇水溶液按g/ml的比例为3%～24%。
2.如权利要求1所述的鸡球虫病疫苗助悬剂，其特征是，所述为黄原胶为食品级、药物级黄原胶，所述乙醇为食品级、药物级乙醇。
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