CN102716475A - 一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，它涉及一种疫苗的制备方法。本发明提供一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，方法为：制备效价为1024以上的金黄色葡萄球菌毒素，效价为128以上的金黄色葡萄球菌类毒素，金黄色葡萄球菌菌体蛋白，无乳链球菌菌苗和大肠杆菌菌苗，经配伍后得到奶牛乳房炎疫苗。本发明的奶牛乳房炎疫苗是安全、无毒的，对攻毒组小白鼠的保护率达到了91.7％。本发明应用于奶牛乳房炎防治领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法。
背景技术
奶牛乳房炎（Mastitis）是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺组织受到微生物感染而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的奶牛乳房炎占总发病率的90％以上。
当前奶牛乳房炎的治疗方法主要是采用抗生素治疗，抗生素用于治疗奶牛乳房炎已有50多年的历史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂量的不科学使用抗生素，引起了敏感性细菌的消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微。
利用疫苗来防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题；最后是操作简便，费用低廉。当前，研制成功的疫苗很少，绝大多数为第一代完整菌体疫苗，效果不明显。因此，研制一种新型的奶牛乳房炎疫苗，预防和治疗奶牛乳房炎是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法。
本发明的一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法是按照以下步骤进行的：
一、金黄色葡萄球菌毒素制备
a、用接种环挑取金黄色葡萄球菌，接种于营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养18~24h，得培养液；吸取10μL的培养液于血液琼脂平板培养基上涂布均匀，在37℃培养箱中培养18~24h后，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养琼脂斜面培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，得金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物；挑取一接种环金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于产毒培养基中，在37℃条件下振荡培养18~24h，即为种子液；b、将步骤a得到的种子液按体积百分含量为1％~3%的接种量接种于产毒培养基内，然后在温度为37℃，转速为180~250r/min的条件下培养18~24h后，在3000r/min的条件下离心30min，同时收集上清液与沉淀，收集的上清液即为金黄色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，备用；
二、金黄色葡萄球菌类毒素制备
c、取步骤一制得的金黄色葡萄球菌毒素，以1N的NaOH溶液调节pH值至6.5~8.5，然后加甲醛至甲醛体积浓度为0.2％~0.5％，置于37℃培养箱中解毒3~7d，即得金黄色葡萄球菌类毒素原液；d、将步骤c得到的金黄色葡萄球菌类毒素原液用滤纸过滤，向滤液中加入医用氯化钠至氯化钠质量浓度为10％~20％，然后以2N的HCl溶液调节pH值至2.0~4.0，静置过夜；e、将步骤d过夜处理后的金黄色葡萄球菌类毒素原液在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀再用无菌重蒸水离心洗涤沉淀1~2次，收集洗涤后的沉淀溶于pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液中，再次在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀并向沉淀中加入质量浓度为1％的硫柳汞溶液至硫柳汞质量浓度为0.01％，即得金黄色葡萄球菌类毒素；其中，磷酸缓冲液与金黄色葡萄球菌类毒素原液体积比为1:15~30；
三、金黄色葡萄球菌菌体蛋白的制备
取步骤一中收集的沉淀，用0~4℃无菌生理盐水离心洗涤3次，取上清，收集沉淀，将收集的沉淀和无菌玻璃珠按质量比为1:3~5的比例放入无菌匀浆杯中混合，再加入0~4℃无菌生理盐水至杯满，采用匀浆器在温度为5℃，转速为4000r/min的条件下振动12min，然后在转速为14000r/min，温度为5℃的条件下离心40min，收集上清液，用0.5N的HCl溶液调节上清液pH值至3.0~5.0，再次在转速为7000r/min，温度为5℃的条件下离心30min，收集沉淀，装入透析袋中，经48~96h流水透析，即得金黄色葡萄球菌菌体蛋白；
四、无乳链球菌菌苗的制备
制备菌量为1.5~3.0×109的无乳链球菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；
五、大肠杆菌菌苗的制备
制备菌量为1.5~3.0×109的大肠杆菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；
六、奶牛乳房炎疫苗的制备
将步骤二得到的金黄色葡萄球菌类毒素、步骤三得到的金黄色葡萄球菌菌体蛋白、步骤四得到的无乳链球菌菌苗和步骤五得到的大肠杆菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黄色葡萄球菌类毒素的效价为10~30U，金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为200~400μg，无乳链球菌的菌数为1.5~3.0×109，大肠杆菌的菌数为1.5~3.0×109。
本发明的有益效果：
本发明采用引起奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌作为生产菌株，将提取、精制而成的有效功能成分：金黄色葡萄球菌类毒素及菌体蛋白、无乳链球菌菌苗、大肠杆菌菌苗合理配伍，构建成一种新型奶牛乳房炎疫苗。通过动物实验证实，本发明研制的疫苗具有安全、无毒、较高的免疫力等特点，对金黄色葡萄球菌攻毒组小白鼠的保护率达到了93.3％，对无乳链球菌及大肠杆菌攻毒组小白鼠的保护率也在80%以上，且新型疫苗的免疫力效果均好于单一组分疫苗的免疫力效果（金黄色葡萄球菌类毒素疫苗保护率为73.3%；金黄色葡萄球菌菌体蛋白疫苗保护率为56.7%；无乳链球菌菌苗保护率为66.7%；大肠杆菌菌苗保护率为70%）。这也充分证实了金黄色葡萄球菌类毒素和菌体蛋白配伍，可显著提高机体产生抗金黄色葡萄球菌抗体的水平，而且类毒素和菌体蛋白不仅具有特异性免疫效果（针对金黄色葡萄球菌），还具有非特异性免疫效果（通过增加白细胞的数量，对无乳链球菌和大肠杆菌产生吞噬、清理等作用）。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法是按照以下步骤进行的：
一、金黄色葡萄球菌毒素制备
a、用接种环挑取金黄色葡萄球菌，接种于营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养18~24h，得培养液；吸取10μL的培养液于血液琼脂平板培养基上涂布均匀，在37℃培养箱中培养18~24h后，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养琼脂斜面培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，得金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物；挑取一接种环金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于产毒培养基中，在37℃条件下振荡培养18~24h，即为种子液；b、将步骤a得到的种子液按体积百分含量为1％~3%的接种量接种于产毒培养基内，然后在温度为37℃，转速为180~250r/min的条件下培养18~24h后，在3000r/min的条件下离心30min，同时收集上清液与沉淀，收集的上清液即为金黄色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，备用；
二、金黄色葡萄球菌类毒素制备
c、取步骤一制得的金黄色葡萄球菌毒素，以1N的NaOH溶液调节pH值至6.5~8.5，然后加甲醛至甲醛体积浓度为0.2％~0.5％，置于37℃培养箱中解毒3~7d，即得金黄色葡萄球菌类毒素原液；d、将步骤c得到的金黄色葡萄球菌类毒素原液用滤纸过滤，向滤液中加入医用氯化钠至氯化钠质量浓度为10％~20％，然后以2N的HCl溶液调节pH值至2.0~4.0，静置过夜；e、将步骤d过夜处理后的金黄色葡萄球菌类毒素原液在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀再用无菌重蒸水离心洗涤沉淀1~2次，收集洗涤后的沉淀溶于pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液中，再次在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀并向沉淀中加入质量浓度为1％的硫柳汞溶液至硫柳汞质量浓度为0.01％，即得金黄色葡萄球菌类毒素；其中，磷酸缓冲液与金黄色葡萄球菌类毒素原液体积比为1:15~30；
三、金黄色葡萄球菌菌体蛋白的制备
取步骤一中收集的沉淀，用0~4℃无菌生理盐水离心洗涤3次，取上清，收集沉淀，将收集的沉淀和无菌玻璃珠按质量比为1:3~5的比例放入无菌匀浆杯中混合，再加入0~4℃无菌生理盐水至杯满，采用匀浆器在温度为5℃，转速为4000r/min的条件下振动12min，然后在转速为14000r/min，温度为5℃的条件下离心40min，收集上清液，用0.5N的HCl溶液调节上清液pH值至3.0~5.0，再次在转速为7000r/min，温度为5℃的条件下离心30min，收集沉淀，装入透析袋中，经48~96h流水透析，即得金黄色葡萄球菌菌体蛋白；
四、无乳链球菌菌苗的制备
制备菌量为1.5~3.0×109的无乳链球菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；
五、大肠杆菌菌苗的制备
制备菌量为1.5~3.0×109的大肠杆菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；
六、奶牛乳房炎疫苗的制备
将步骤二得到的金黄色葡萄球菌类毒素、步骤三得到的金黄色葡萄球菌菌体蛋白、步骤四得到的无乳链球菌菌苗和步骤五得到的大肠杆菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黄色葡萄球菌类毒素的效价为10~30U，金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为200~400μg，无乳链球菌的菌数为1.5~3.0×109，大肠杆菌的菌数为1.5~3.0×109。
本实施方式采用引起奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌作为生产菌株，将提取、精制而成的有效功能成分：金黄色葡萄球菌类毒素及菌体蛋白、无乳链球菌菌苗、大肠杆菌菌苗合理配伍，构建成一种新型奶牛乳房炎疫苗。通过动物实验证实，本发明研制的疫苗具有安全、无毒、较高的免疫力等特点，对金黄色葡萄球菌攻毒组小白鼠的保护率达到了93.3％，对无乳链球菌及大肠杆菌攻毒组小白鼠的保护率也在80%以上，且新型疫苗的免疫力效果均好于单一组分疫苗的免疫力效果（金黄色葡萄球菌类毒素疫苗保护率为73.3%；金黄色葡萄球菌菌体蛋白疫苗保护率为56.7%；无乳链球菌菌苗保护率为66.7%；大肠杆菌菌苗保护率为70%）。这也充分证实了金黄色葡萄球菌类毒素和菌体蛋白配伍，可显著提高机体产生抗金黄色葡萄球菌抗体的水平，而且类毒素和菌体蛋白不仅具有特异性免疫效果（针对金黄色葡萄球菌），还具有非特异性免疫效果（通过增加白细胞的数量，对无乳链球菌和大肠杆菌产生吞噬、清理等作用）。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一至步骤六所进行的操作均在无菌条件下进行。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一至二不同的是：步骤一中所述的金黄色葡萄球菌毒素效价为1024~4096。其它与具体实施方式一至二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述的金黄色葡萄球菌类毒素效价为128~256。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中所述的金黄色葡萄球菌菌体蛋白中蛋白质含量为10~50mg/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中所述的无菌玻璃珠为
其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中所述的产酸培养基组分为：0.3g的MgSO4·7H2O、0.2g的KCl，3.0g的K2HPO4·3H2O、2.0g的葡萄糖、2mL质量浓度为10％的胱氨酸、700mL的牛肉浸液和300mL的牛肉消化液；其中，牛肉消化液制备方法为：将牛肉绞碎，称取1000g，加入蒸馏水1500mL、1.5g的Na2CO3、6g的胰酶和30mL的氯仿，置于37℃培养箱中，用质量浓度为4%的NaOH调节pH至8.0，消化36h，再用2N的HCL调节pH至4.5，加热至90℃，然后用双层棉布过滤，向滤液中加入体积浓度为2%氯仿混匀，即得牛肉消化液。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中所述的无乳链球菌菌苗的制备方法如下：：a、取一接种环无乳链球菌，用分区划线接种法接种于血液琼脂平板培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃培养箱中培养18~24h，取无乳链球菌营养肉汤培养物2mL，接种于血液琼脂斜面培养基上，涂布均匀后置于37℃培养箱中培养24~48h，即得无乳链球菌血液琼脂斜面培养物；b、用浓度为0.02~0.2mol/L的无菌磷酸盐生理盐水将步骤a得到的无乳链球菌血液琼脂斜面培养物洗入无菌玻璃瓶中，然后用无菌绢布过滤，加入甲醛溶液至甲醛体积浓度为1.0％~1.2％，置于37℃培养箱中培养1~7d后，加入苯酚至终浓度为5.0g/L，最后置于4℃的冰箱中保存。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中所述的大肠杆菌菌苗的制备方法如下：a、取大肠杆菌一接种环，用分区划线接种法接种于血液琼脂平板，置于37℃培养箱中培养18~24h，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃培养箱中培养18~24h，取一接种环大肠杆菌营养肉汤培养物2mL，接种于血液琼脂斜面培养基上，涂布均匀后置于37℃培养箱中培养24~48h，即得大肠杆菌菌苗；b、浓度为0.02~0.2mol/L的无菌磷酸盐生理盐水将步骤a得到的大肠杆菌菌苗洗入无菌玻璃瓶中，然后用无菌绢布过滤，加入甲醛溶液至甲醛体积浓度为1.0％~1.2％，置于37℃培养箱中1~7d后，加入苯酚至终浓度为5.0g/L，最后置于4℃的冰箱中保存。其它与具体实施方式一至八之一相同。
通过以下试验验证本发明的效果：
本试验的一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法是按照以下步骤进行的：
一、金黄色葡萄球菌毒素制备
a、用接种环挑取金黄色葡萄球菌，接种于营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养24h，得培养液；吸取10μL的培养液于血液琼脂平板培养基涂布均匀，在37℃培养箱中培养24h后，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养琼脂斜面培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h后，得金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物；取一接种环金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于产毒培养基中，在37℃条件下振荡培养24h，即为种子液；b、将步骤a得到的种子液按体积百分含量为1％的接种量接种于产毒培养基内，然后在温度为37℃，转速为200r/min的条件下培养24h后，在3000r/min的条件下离心30min，同时收集上清液与沉淀，收集的上清液即得金黄色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，备用；
二、金黄色葡萄球菌毒素效价的测定
取96孔酶标板，在第一行的每孔中均加入0.1mL无菌生理盐水，再吸取步骤一得到的金黄色葡萄球菌毒素0.1mL加入第1孔，用加样枪反复吸打混合后，吸取0.1mL加入第2孔中，再次吸打混合均匀，以此方法倍比稀释至第12孔，然后分别向每孔中加入用无菌生理盐水洗涤3次的浓度为1％新鲜兔红血球0.1mL，置37℃培养箱中1h，取出观察，完全溶血的最大稀释倍数，即为毒素效价，取效价大于等于1024单位的金黄色葡萄球菌毒，备用；
三、金黄色葡萄球菌类毒素制备
c、取步骤二制得的金黄色葡萄球菌毒素，以1N的NaOH溶液调节pH值至8.0，然后加甲醛至甲醛体积浓度为0.4％，置于37℃培养箱中解毒7d，即得金黄色葡萄球菌类毒素原液；d、将步骤c得到的金黄色葡萄球菌类毒素原液用滤纸过滤，向滤液中加入医用氯化钠至氯化钠质量浓度为15％，然后以2N的HCl溶液调节pH值至3.0，静置过夜；e、将步骤d过夜处理后的金黄色葡萄球菌类毒素原液在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀再用无菌重蒸水离心洗涤沉淀1次，收集洗涤后的沉淀溶于pH为8.0的磷酸缓冲液中，再次在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀并向沉淀中加入质量浓度为1％的硫柳汞溶液至硫柳汞质量浓度为0.01％，即得金黄色葡萄球菌类毒素；其中，磷酸缓冲液与金黄色葡萄球菌类毒素原液体积比为1:20；
四、金黄色葡萄球菌类毒素效价的测定
⑴抗毒血清制备：选体重2公斤以上的健康家兔3~5只，从耳静脉采血3mL，分离血清，测基础抗体小于1：8的家兔进行以下试验，在家兔后腿肌肉注射步骤三得到的金黄色葡萄球菌类毒素1mL（效价10U），以后每隔3天注射1次，共注射3次，7d后从耳静脉采血3mL，分离血清，备用；
⑵抗毒血清效价测定：取96孔酶标板，向第一行的每孔中均加入0.1mL的无菌生理盐水，在第1孔中加入步骤⑴分离的血清0.1mL，用加样枪反复吸打混合后，吸取0.1mL加入第2孔中，再次吸打混合均匀，以此方法倍比稀释至第12孔，然后向每孔中再加0.1mL金黄色葡萄球菌毒素（2U/mL），轻微震荡混匀，置于37℃培养箱中培养30min，然后向每孔中加用无菌生理盐水洗涤3次的体积浓度为1％新鲜兔红血球0.1mL，置于37℃培养箱中培养60min后观察，完全不溶血的最大稀释倍数即为血清效价，重复测定一次，取效价为1:128以上的免疫家兔颈动脉放血，分离血清，即为抗毒血清，加质量浓度为0.01％的硫柳汞，置于-20℃冰柜中保存备用；
⑶类毒素效价测定：取96孔酶标板，向第一行的每孔中均加入0.1mL无菌生理盐水，再向第1孔中加入步骤三得到的金黄色葡萄球菌类毒素0.1mL，用加样枪反复吸打混合后，吸取0.1mL加入第2孔中，再次吸打混合均匀，以此方法倍比稀释至第12孔，分别向每孔中加入步骤⑵得到的抗毒血清（2U/mL）0.1mL，置于37℃培养箱中培养30min，再向每孔中各加入0.1mL金黄色葡萄球菌毒素（2U/mL），轻微震荡混匀，置于37℃培养箱中培养30min，再向每孔中加入用无菌生理盐水洗涤3次的体积浓度为1％新鲜兔红血球0.1mL，置于37℃培养箱中培养60min后观察，完全溶血的最大稀释倍数即为金黄色葡萄球菌类毒素效价，取效价为128以上的金黄色葡萄球菌类毒素，备用；
五、金黄色葡萄球菌菌体蛋白的制备
取步骤一中收集的沉淀，用4℃无菌生理盐水离心洗涤3次，取上清，收集沉淀，将收集的沉淀和无菌玻璃珠按质量比为1:5的比例放入无菌匀浆杯中混合，再加入4℃无菌生理盐水至杯满，采用匀浆器在温度为5℃，转速为4000r/min的条件下振动12min，然后在转速为14000r/min，温度为5℃的条件下离心40min，收集上清液，用0.5N的HCl溶液调节上清液pH值至4.5，再次在转速为7000r/min，温度为5℃的条件下离心30min，收集沉淀，装入透析袋中，经72h流水透析，即得金黄色葡萄球菌菌体蛋白；
六、金黄色葡萄球菌菌体蛋白含量的测定
用凯氏定氮法对菌体蛋白进行含氮量的测定，取金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为30mg/mL以上的金黄色葡萄球菌菌体蛋白备用；
七、无乳链球菌菌苗的制备
f、取一接种环无乳链球菌，用分区划线接种法接种于血液琼脂平板培养基，然后置于37℃培养箱中培养24h，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃培养箱中培养24h，取无乳链球菌营养肉汤培养物2mL，接种于血液琼脂斜面培养基上，涂布均匀后置于37℃培养箱中培养48h，即得无乳链球菌血液琼脂斜面培养物；g、用浓度为0.02~0.2mol/L的无菌磷酸盐生理盐水将步骤f得到的无乳链球菌血液琼脂斜面培养物洗入无菌玻璃瓶中，然后用无菌绢布过滤，加入甲醛溶液至体积浓度为1.0％，置于37℃培养箱中培养7d后，加入苯酚至浓度为5.0g/L，最后置于4℃的冰箱中保存；
八、大肠杆菌菌苗的制备
h、取大肠杆菌一接种环，用分区划线接种法接种于血液琼脂平板，置于37℃培养箱中培养24h，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃培养箱中培养24h，取一接种环大肠杆菌营养肉汤培养物2mL，接种于血液琼脂斜面培养基上，涂布均匀后置于37℃培养箱中培养48h，即得大肠杆菌菌苗；i、用浓度为0.02~0.2mol/L的无菌磷酸盐生理盐水将步骤h得到的大肠杆菌菌苗洗入无菌玻璃瓶中，然后用无菌绢布过滤，加入甲醛溶液至体积浓度为1.0％，置于37℃培养箱中7d后，加入苯酚至浓度为5.0g/L，最后置于4℃的冰箱中保存；
九、奶牛乳房炎疫苗的制备
将步骤二得到的金黄色葡萄球菌类毒素、步骤三得到的金黄色葡萄球菌菌体蛋白、步骤四得到的无乳链球菌菌苗和步骤五得到的大肠杆菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，奶牛乳房炎疫苗每毫升含金黄色葡萄球菌类毒素效价为15U，金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为375μg，无乳链球菌菌数含量为2.7×109，大肠杆菌菌数含量为2.7×109。
本试验从步骤一至步骤九均在无菌条件下进行。
本试验步骤一中所述的产毒培养基组分为：0.3g的MgSO4·7H2O、0.2g的KCl，3.0g的K2HPO4·3H2O、2.0g的葡萄糖、2mL质量百分含量为10％的胱氨酸、700mL的牛肉浸液和300mL的牛肉消化液；其中，牛肉消化液制备方法为：将牛肉绞碎，称取1000g，加入蒸馏水1500mL、1.5g的Na2CO3、6g的胰酶和30mL的氯仿，置于37℃培养箱中，用质量浓度为4%的NaOH调节pH至8.0，消化36h，再用2N的HCL调节pH至4.5，加热至90℃，然后用双层棉布过滤，向滤液中加入体积浓度为2%氯仿混匀，即得牛肉消化液。
产毒培养基制法：将上述成分混合，加热至完全熔化，调节pH值至7.6，煮沸过滤，加活性炭2.0g，混均后分装于250mL锥形瓶中，60mL／瓶，置于高压蒸气灭菌器内，在115℃温度下灭菌20min。
本试验步骤七和步骤八中的无菌玻璃瓶和无菌绢布均是在180℃高温灭菌2h使用的，目的是为了除去热原质。
本试验步骤五中加入4℃无菌生理盐水至杯满是为了使沉淀和无菌玻璃珠充分混匀，对加入的无菌生理盐水量以及杯的体积无要求。
本试验的营养肉汤购买自北京奥博星生物技术有限公司；血液琼脂平板培养基购自郑州博赛生物技术股份有限公司。
本试验的金黄色葡萄球菌购买自中国科学院微生物研究所，保藏编号为：ATCC25923；无乳链球菌购买自中国科学院微生物研究所，保藏编号为：ATCC12386；大肠杆菌购买自中国科学院微生物研究所，保藏编号为：ATCC25922。
本试验的金黄色葡萄球菌毒素共生产8批，8批毒素的效价，最高者达到了4096，最低者2048也远超过1024的标准，充分说明了本项目在制备金黄色葡萄球菌毒素方面的技术是很成熟、稳定的。
本试验的金黄色葡萄球菌类毒素共生产8批，8批类毒素效价经测定均为128或256，充分说明了本项目在制备金黄色葡萄球菌类毒素方面的技术是很成熟、稳定的。
对本试验制得的奶牛乳房炎疫苗进行检定
1）无菌试验
在无菌环境下，分别向3组硫乙醇酸盐培养基内接入奶牛乳房炎疫苗各1mL，在20℃~25℃培养箱中培养3~4d，然后移种至硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂培养基和改良马丁培养基，每种培养基各移种2管，每管0.5mL；取上述移种后的硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂培养基各1管置于30℃~35℃的培养箱中培养，其余各管置于20℃~25℃的培养箱中培养，培养14d，观察有无染菌情况；
其中，硫乙醇酸盐培养基组分为：胰酪蛋白胨15g，酵母浸出粉5g，葡萄糖5g，氯化钠2.5g，L-胱氨酸0.5g，硫乙醇酸钠0.5g，琼脂0.7g，0.2％美蓝溶液1.0mL，蒸馏水1000mL。将上述组分加热溶解，调节pH值至7.1，分装，置于高压蒸气灭菌器内，在115℃条件下灭菌20min后使用；
改良马丁培养基组分为：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，K2HPO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1000mL。制法：将上述组分加热溶解，调节pH值至6.4，分装，置于高压蒸气灭菌器内，在115℃条件下灭菌20min后使用；
血液琼脂培养基购自郑州博赛生物技术股份有限公司。
试验结果表明，硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂培养基、改良马丁培养基中均没有菌生长，由此可知本发明的奶牛乳房炎疫苗无菌试验合格。
2）安全试验
选取体重为18~20g的健康小白鼠5只，在无菌环境下，向每只小鼠皮下注射奶牛乳房炎疫苗0.5mL，逐日观察至第7d，应无由毒性物质而引起的症状或死亡为合格。
试验结果表明，全部试验小白鼠均无由毒性物质而引起的症状，全部健存，由此可知，本发明的奶牛乳房炎疫苗具有安全可靠性。
3）异常毒性试验
选取体重为18~20g小白鼠5只，注射前称取每只小白鼠体重，在无菌环境下，向每只小鼠腹腔注射0.5mL奶牛乳房炎疫苗，观察7d，7d后每只小白鼠体重增加，即为合格的奶牛乳房炎疫苗。
试验结果表明，在观察期内，试验小白鼠全部健存，无异常反应，7d后每只小白鼠体重均增加，增加范围在8~15g之间，由此可知，本发明的奶牛乳房炎疫苗疫苗异常毒性试验合格。
4）热原质试验
选取3只健康无伤、雌性无孕及体重为1.7~2.5kg的家兔，试验所用的注射器、针头及其他与供试液接触的器皿洗净后经180℃高温灭菌2h除去热原质，试验前家兔禁食2h以上，然后将家兔固定，30~60min后开始测量正常体温，连续测量两次，每次间隔60min，两次温差不得大于0.2℃，以这两次体温的平均值为该兔的正常体温；取奶牛乳房炎疫苗，在注射前预热至38℃，测家兔达到正常体温15min内，向家兔耳静脉缓缓注入3mL的奶牛乳房炎疫苗，每隔30min测量体温一次，连测6次。
试验结果表明，热原质试验3只家兔升温均低于0.6℃，并且3只兔升温总和不超过1.4℃，由此可知本发明的奶牛乳房炎疫苗疫苗热原质试验合格。
5）奶牛乳房炎疫苗的免疫力试验
免疫组1：经奶牛乳房炎疫苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
免疫组2：经金黄色葡萄球菌类毒素疫苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
免疫组3：经金黄色葡萄球菌菌体蛋白疫苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
免疫组4：经无乳链球菌菌苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
免疫组5：经大肠杆菌菌苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
免疫组6：经奶牛乳房炎疫苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
免疫组7：经奶牛乳房炎疫苗免疫、体重为14~16g小白鼠30只；
对照组：同批次未经疫苗免疫、体重为14~16g小白鼠9组（每组5只）。
在无菌环境下，用上述疫苗分别免疫对应组小白鼠，每只皮下注射0.5mL，连续注射2次，每次间隔7d，末次免疫10天后进行攻毒试验：向免疫组1、免疫组2、免疫组3小白鼠每只腹腔注射1MLD（MLD为最小致死量，即在一定条件下足以使动物死亡的最小量）的金黄色葡萄球菌（含于0.5mL中）；向免疫组4小白鼠每只腹腔注射1MLD的无乳链球菌（含于0.5mL中）；向免疫组5小白鼠每只腹腔注射1MLD的大肠杆菌（含于0.5mL中）；向免疫组6小白鼠每只腹腔注射1MLD的无乳链球菌（含于0.5mL中）；向免疫组7小白鼠每只腹腔注射1MLD的大肠杆菌（含于0.5mL中）；分别向9组对照组小鼠腹腔分别注射2MLD、1MLD和1/2MLD的毒菌（金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌），观察3d。
表1免疫力试验结果
试验结果如表1所示，由表1可知：
1）对照组小白鼠感染2MLD及1MLD毒菌者全部死亡，感染1/2MLD者有部分死亡，可证实本试验所用的攻毒菌液符合《中国生物制品规程》所规定的要求；
2）免疫组1小白鼠的保护率为93.3％，远大于免疫组2的73.3%和免疫组3的56.7%，证明本发明构建的新型奶牛乳房炎疫苗的免疫力效果要好于单纯使用金黄色葡萄球菌类毒素或菌体蛋白为主要成分的疫苗；
3）免疫组6小白鼠的保护率为83.8%，好于免疫组4的66.7%，证明本发明构建的奶牛乳房炎疫苗免疫效果好于无乳链球菌单独菌苗，说明金黄色葡萄球菌类毒素和菌体蛋白联合使用不仅对金黄色葡萄球菌感染有特异性防治效果，而且还对无乳链球菌有非特异性防治效果，预测其机理可能是类毒素和菌体蛋白联合使用提高了机体白细胞水平，从而对无乳链球菌起到了吞噬、清理的作用；
4）免疫组7小白鼠的保护率为86.7%，好于免疫组5的70.0%，证明本发明构建的奶牛乳房炎疫苗免疫效果好于大肠杆菌单独菌苗，说明金黄色葡萄球菌类毒素和菌体蛋白联合使用不仅对金黄色葡萄球菌感染有特异性防治效果，而且还对大肠杆菌有非特异性防治效果，预测其机理可能是类毒素和菌体蛋白联合使用提高了机体白细胞水平，从而对大肠杆菌起到了吞噬、清理的作用。
以上试验结果表明，本发明构建的奶牛乳房炎疫苗具有安全、可靠、免疫力高等特点，其免疫效果要远远好于单纯以其中某一成分为主体的单一疫苗。
Claims (9)
1.一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于奶牛乳房炎疫苗的制备方法是按照以下步骤进行的：
一、金黄色葡萄球菌毒素制备
a、用接种环挑取金黄色葡萄球菌，接种于营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养18~24h，得培养液；吸取10μL的培养液于血液琼脂平板培养基上涂布均匀，在37℃培养箱中培养18~24h后，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养琼脂斜面培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，得金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物；挑取一接种环金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于产毒培养基中，在37℃条件下振荡培养18~24h，即为种子液；b、将步骤a得到的种子液按体积百分含量为1％~3%的接种量接种于产毒培养基内，然后在温度为37℃，转速为180~250r/min的条件下培养18~24h后，在3000r/min的条件下离心30min，同时收集上清液与沉淀，收集的上清液即为金黄色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，备用；
二、金黄色葡萄球菌类毒素制备
c、取步骤一制得的金黄色葡萄球菌毒素，以1N的NaOH溶液调节pH值至6.5~8.5，然后加甲醛至甲醛体积浓度为0.2％~0.5％，置于37℃培养箱中解毒3~7d，即得金黄色葡萄球菌类毒素原液；d、将步骤c得到的金黄色葡萄球菌类毒素原液用滤纸过滤，向滤液中加入医用氯化钠至氯化钠质量浓度为10％~20％，然后以2N的HCl溶液调节pH值至2.0~4.0，静置过夜；e、将步骤d过夜处理后的金黄色葡萄球菌类毒素原液在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀再用无菌重蒸水离心洗涤沉淀1~2次，收集洗涤后的沉淀溶于pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液中，再次在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀并向沉淀中加入质量浓度为1％的硫柳汞溶液至硫柳汞质量浓度为0.01％，即得金黄色葡萄球菌类毒素；其中，磷酸缓冲液与金黄色葡萄球菌类毒素原液体积比为1:15~30；
三、金黄色葡萄球菌菌体蛋白的制备
取步骤一中收集的沉淀，用0~4℃无菌生理盐水离心洗涤3次，取上清，收集沉淀，将收集的沉淀和无菌玻璃珠按质量比为1:3~5的比例放入无菌匀浆杯中混合，再加入0~4℃无菌生理盐水至杯满，采用匀浆器在温度为5℃，转速为4000r/min的条件下振动12min，然后在转速为14000r/min，温度为5℃的条件下离心40min，收集上清液，用0.5N的HCl溶液调节上清液pH值至3.0~5.0，再次在转速为7000r/min，温度为5℃的条件下离心30min，收集沉淀，装入透析袋中，经48~96h流水透析，即得金黄色葡萄球菌菌体蛋白；
四、无乳链球菌菌苗的制备
制备菌量为1.5~3.0×109的无乳链球菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；
五、大肠杆菌菌苗的制备
制备菌量为1.5~3.0×109的大肠杆菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；
六、奶牛乳房炎疫苗的制备
将步骤二得到的金黄色葡萄球菌类毒素、步骤三得到的金黄色葡萄球菌菌体蛋白、步骤四得到的无乳链球菌菌苗和步骤五得到的大肠杆菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黄色葡萄球菌类毒素的效价为10~30U，金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为200~400μg，无乳链球菌的菌数为1.5~3.0×109，大肠杆菌的菌数为1.5~3.0×109。
2.根据权利要求1所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤一至步骤六所进行的操作均在无菌条件下进行。
3.根据权利要求1或2所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中所述的金黄色葡萄球菌毒素效价为1024~4096。
4.根据权利要求3所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤二中所述的金黄色葡萄球菌类毒素效价为128~256。
5.根据权利要求4所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中所述的金黄色葡萄球菌菌体蛋白中蛋白质含量为10~50mg/mL。
6.根据权利要求5所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中所述的无菌玻璃珠为
7.根据权利要求6所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中所述的产酸培养基组分为：0.3g的MgSO4·7H2O、0.2g的KCl，3.0g的K2HPO4·3H2O、2.0g的葡萄糖、2mL质量浓度为10％的胱氨酸、700mL的牛肉浸液和300mL的牛肉消化液；其中，牛肉消化液制备方法为：将牛肉绞碎，称取1000g，加入蒸馏水1500mL、1.5g的Na2CO3、6g的胰酶和30mL的氯仿，置于37℃培养箱中，用质量浓度为4%的NaOH调节pH至8.0，消化36h，再用2N的HCL调节pH至4.5，加热至90℃，然后用双层棉布过滤，向滤液中加入体积浓度为2%氯仿混匀，即得牛肉消化液。
8.根据权利要求7所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤四中所述的无乳链球菌菌苗的制备方法如下：a、取一接种环无乳链球菌，用分区划线接种法接种于血液琼脂平板培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃培养箱中培养18~24h，取无乳链球菌营养肉汤培养物2mL，接种于血液琼脂斜面培养基上，涂布均匀后置于37℃培养箱中培养24~48h，即得无乳链球菌血液琼脂斜面培养物；b、用浓度为0.02~0.2mol/L的无菌磷酸盐生理盐水将步骤a得到的无乳链球菌血液琼脂斜面培养物洗入无菌玻璃瓶中，然后用无菌绢布过滤，加入甲醛溶液至甲醛体积浓度为1.0％~1.2％，置于37℃培养箱中培养1~7d后，加入苯酚至终浓度为5.0g/L，最后置于4℃的冰箱中保存。
9.根据权利要求8所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤五中所述的大肠杆菌菌苗的制备方法如下：a、取大肠杆菌一接种环，用分区划线接种法接种于血液琼脂平板，置于37℃培养箱中培养18~24h，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃培养箱中培养18~24h，取一接种环大肠杆菌营养肉汤培养物2mL，接种于血液琼脂斜面培养基上，涂布均匀后置于37℃培养箱中培养24~48h，即得大肠杆菌菌苗；b、浓度为0.02~0.2mol/L的无菌磷酸盐生理盐水将步骤a得到的大肠杆菌菌苗洗入无菌玻璃瓶中，然后用无菌绢布过滤，加入甲醛溶液至甲醛体积浓度为1.0％~1.2％，置于37℃培养箱中1~7d后，加入苯酚至终浓度为5.0g/L，最后置于4℃的冰箱中保存。
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