CN102703470B - 调控植物中色素生产的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码能调控植物中花青素生产的新转录因子的多聚核苷酸和被编码的能调控植物中花青素生产的转录因子。本发明也涉及包含所述多聚核苷酸的构建物和载体，和宿主细胞、植物细胞和用所述多聚核苷酸、构建物和载体转化的植物。本发明也涉及生产具有改变的花青素生产的植物的方法和通过该方法获得的植物。

Description

调控植物中色素生产的组合物和方法

本申请是申请号为200680031628.1，申请日为2006年8月30日，发明名称为“调控植物中色素生产的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于植物中色素发育（development）的领域。

背景技术

花青素色素的积累是水果质量的重要决定因素。色素为用户提供了基本的品种区别并涉及到苹果的健康属性（BoyerandLiu,2004）。

花青素色素属于遍在的统称为黄酮类化合物的二级代谢产物的不同组。在植物中，黄酮类化合物涉及到包括防御在内的无数生物学功能，同时，被着色的花青素化合物尤其在植物/动物相互作用中作为引诱剂扮演了重要的生理学角色。

包括花青素在内的全部黄酮类化合物的主要前体是丙二酸单酰辅酶A和对-香豆酰辅酶A。从这些前体查耳酮合成酶（CHS）合成出查耳酮，这是花青素生产和C₁₅骨架建立的第一个关键步骤。查耳酮然后被查耳酮异构酶（CHI）异构化来生产查耳酮柑橘黄素，并且从那里，经由黄烷酮3[β]-羟化酶（F3H）的羟基化步骤转化柑橘黄素到二氢黄酮醇（dihydroflavonon）。二氢黄酮醇被二氢黄酮醇（dihydroflavonon）4-还原酶（DFR）还原，产生白花色苷，然后白花色苷被白花色苷元加双氧酶（LDOX）转化成有色化合物anthocyanindin，同时最终的糖基化步骤被尿嘧啶二磷酸盐（UDP）-葡萄糖：类黄酮3-邻-葡萄糖基转移酶（UFGT）所介导。花青素颜色的差异能归因于包括分子结构和羟基的类型和数目以及连接的糖和酸以及诸如pH值或超微结构的细胞环境在内的大量因素。在许多的花青素色素中，主要负责苹果皮中红色着色的色素是花青苷3-邻-半乳糖苷形式的花青素，并且在苹果的这个生物合成途径中的酶类已经被很好的描述（Kimetal.,2003,PlantScience165,403-413;Hondaetal.,2002,PlantPhysiologyandBiochemistry40,955-962）。长久以来已经观察到，花青素类被升高来响应特定的环境、发育和病原刺激。在苹果中的研究已经证实了花青素积累的环境和发育调控。当水果遭受白光，或更显著地，UV光时，色素生物合成能被诱导，在其它物种中也观察到这个现象。而且，通过将所述水果进行低温储存，花青素水平能被提高。存在在苹果的发育方式中具有明显的花青素酶活性的花青素酶的同等诱导的证据，并且，依赖于品种，相关的着色在不熟的水果中增加并在成熟时再次增加。

研究显示，在花青素途径中，存在通过同启动子元件复合的转录因子（TFs）的特定结合进行的高度特异的基因调控（HoltonandCornish,1995,PlantCell7,1071-1083）。这个调控可能也扩展到诸如花青素运输蛋白的非途径基因。

MYBTFs已经被显示在花青素的转录调控中扮演重要的角色。植物MYBs已经被牵涉到像二级代谢（包括所述花青素途径）、发育、信号传导和疾病抵抗力一样多样的控制途径（JinandMartin,1999,PlantMolBiol,41,577-585）。它们被包含单个或多个缺陷重复的结构保守DNA结合区域赋予特色；那些花青素途径相关的区域趋向于二重复（two-repeat）（R2R3）类别。调控也能在花青素生物合成途径早期或晚期对基因的谨慎的小组（discreetgroups）特异。在紫苏（Perillafruitescens）叶片中，TF驱动的调控已经在从CHS到结果的花青素蛋白运输基因的实际上所有的花青素生物合成的阶段中观察到，同时，在葡萄（Vitisvinifera）中，被MybA进行的特定调控被限定在蛋白生产的终点（UFGT）。

在拟南芥属植物（Arabidopsis）中存在被分成24个亚组的大约140个R2R3MYBTFs（Strackeetal2001,CurrentOpinioninPlantBiology，4,447-556）。花青素色素1（PAP1）MYB的生产（Borevitzetal.,2000,PlantCell,12,2383-2394）属于亚组10（当Strackeetal.,2001的系统发育被使用时）并证明了同其它已知花青素调控子相比高度的氨基酸保守。PAP1在转基因拟南芥中过表达导致了花青素生物合成途径中从PAL到CHS和DFR的大量基因的上调（Borevitzetal.,2000,PlantCell,12,2383-2394;Tohgeetal.,2005,PlantJournal,42,218-235）。

一般地，MYBs同基础的螺旋环螺旋TFs（bHLH）紧密地相互作用，并且这个作用已经被广泛地研究其与黄酮类化合物生产的关系（Moletal.,1996;Winkel-Shirley，2001）。范例包括玉米ZmCMYB和ZmBbHLH和牵牛花AN2MYB和AN1/JAF13bHLHs（Goffetal.,1992GenesDev，6,864-875;Moletal.,1998,TrendsinPlantScience,3,212-217）。明显地，在不同物种中存在这个同等物的保守程度。然而，MYB-bHLH合作不总是必需的。来源于PAP1过表达的结果暗示，相似于玉米PMYB（Grotewoldetal.,2000ProcNatlAcadSciUSA,97,13579-13584）和拟南芥MYB12（Mehrtensetal.,2005PlantPhysiology，138,1083-1096），PAP1不需要过表达的bHLH共同调节因子来驱动花青素生产的大量增加。然而，进一步的研究显示，PAP1确实同bHLHs紧密地相互作用，这在体内实验中导致更强启动子（DFR）激活（Zimmermannetal.,2004PlantJ,40,22-34）。更近期地，PAP1过表达线的整体的转录组学和代谢组学分析证实，PAP1上调bHLHTT8（At4g09820）18倍（Tohgeetal.,2005,PlantJ,42,218-235）。这个对共同调控因子的依赖同高度保守的R2R3结合区域中的少量氨基酸改变相关，如在不依赖bHLH的玉米P和依赖bHLH的玉米C1MYBs间的对比所证明的，并足以定向不同种类的目标基因的激活（Grotewoldetal.,2000,ProcNatlAcadSciUSA,97,13579-13584）。在本研究中，从C1的R2R3区域到P1的相应位置的仅6个氨基酸的替换导致了具有同C1相似的依赖bHLH的行为的突变。更近期地，它被暗示，这可能是目标基因间允许MYBs区别的关键机理（Hernandezetal.,2004,J.Biol.CHem,279,48205-48213）。这些关键的氨基酸在图1中进行了标识。同PAP1相比，FaMYB1在草莓的后期发育过程中抑制了花青素的生物合成。不管这个改变的角色，FaMYB1分享了激活MYBs的同源性并能同诸如牵牛花AN1和JAF13的（激活）bHLH相互作用（Aharonietal.,2001,PlantJ,28,319-332）。不管PAP-样激活子和FaMYB-样抑制子的关键氨基酸残基一样，激活子倾向于属于亚组10而抑制子属于亚组17（根据Strackeetal）。

额外水平的花青素调控涉及含有同MYB和bHLH蛋白形成复合物的WD40区域蛋白的蛋白的单独类别（如在RamsayandGlover,2005,TrendsinPlantScience,10,63-70中回顾的）。范例包括牵牛花中的an11（deVettenetal.,1997GenesDev，11,1422-1434）和拟南芥中的TTG1（Walkeretal.,1999,PlantCell,11,1337-1350）。花青素的转录控制可能被组织特异的调控（Kuboetat,1999,PlantCell,11,1217-1226）和依赖于诸如冷、光和发育线索（cues）的刺激的可能不同的调控层次（Davulurietal.,2005,NatureBiotechnology，23,890-895）进一步并发。

尽管对苹果花青素合成的激活和抑制的研究已经表明，截至目前，发育和环境调控，调控花青素合成的转录因子在这个物种或任何其它每年落叶的水果中是不同的。苹果中的花青素积累的控制是理解和处理水果颜色的关键问题。对施加这个控制的因子的鉴别提供了调节水果组织中起源于花青素的着色的程度和分布的工具。

因此，本发明的目标是提供调控苹果物种中花青素生产的转录因子序列和/或至少提供给公众有用的选择。

发明内容

在第一方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，包括

a）编码具有SEQIDNO:1-4和9-21或其变种的任何一种氨基酸序列的多肽的序列，其中的多肽或其变种是能调控植物中花青素生产的转录因子；

b）具有长度至少为a）的序列的15个核苷酸的片段；

c）a）的序列的互补序列；

d）b）的序列的互补序列；

e）在严格条件下能同a）的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。

在一个实施方案中，分离的多聚核苷酸包含

a）编码具有同SEQIDNO:1-4和9-21的任何一种氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中的多肽是能调控植物中花青素生产的转录因子；

b）具有长度至少为a）的序列的15个核苷酸的片段；

c）a）的序列的互补序列；

d）b）的序列的互补序列；

e）在严格条件下能同a）的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。

在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO：1的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQIDNO：1的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO：2的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQIDNO：2的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO：3的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQIDNO：3的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，所述多肽具有同SEQIDNO：4的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，所述多肽具有SEQIDNO：4的氨基酸序列。

在进一步的实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：5-8、22-47和102的任何一种的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：5-8、22-47和102的任何一种的编码序列至少70%的同一性。

在进一步的实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：5的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：5的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：5的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：5的编码序列。

在进一步的实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：6的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：6的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：6的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：6的编码序列。

在进一步的实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：7的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：7的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：7的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：7的编码序列。

在进一步的实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：8的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：8的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：8的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：8的编码序列。

在进一步的方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含：

a）具有同SEQIDNO：5-8、22-47和102的任何一种核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列编码能调控植物中花青素生产的转录因子；

b）具有长度至少为a）的序列的15个核苷酸的片段；

c）a)的序列的互补序列；

d）b）的序列的互补序列；

e）在严格条件下能同a）的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：5的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：5的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：5的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：5的编码序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：6的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：6的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：6的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：6的编码序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：7的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：7的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：7的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：7的编码序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：8的序列至少70%的同一性。优选地，在a）中的序列具有同SEQIDNO：8的编码序列至少70%的同一性。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：8的序列。更优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：8的编码序列。

在进一步的方面，本发明提供具有同编码含有选自SEQIDNO：1到4和9到21的任何一种的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%序列同一性的分离的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸编码能调控植物中花青素生产的转录因子。

在一个实施方案中，分离的多聚核苷酸具有同编码包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列至少70%的序列同一性。

在进一步的实施方案中，所述核苷酸序列包含SEQIDNO：5的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸序列包含SEQIDNO：5的编码序列。

在进一步的方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含

a）编码具有同SEQIDNO：1-4和9-21的任何一种氨基酸序列至少65%同一性的多肽的序列，其中所述多肽是能调控在花青素生物合成途径中的基因的启动子的转录因子；

b）具有长度至少为a）的序列的15个核苷酸的片段；

c）a)的序列的互补序列；

d）b）的序列的互补序列；

e）在严格条件下能同a）的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。

在进一步的方面，本发明提供了分离的多聚核苷酸，其包含：

a）具有同SEQIDNO：5-8、22-47和102的任何一种核苷酸序列至少70%同一性的序列，其中所述序列编码能调控在花青素生物合成途径中的基因的启动子的转录因子；

b）具有长度至少为a）的序列的15个核苷酸的片段；

c）a)的序列的互补序列；

d）b）的序列的互补序列；

e）在严格条件下能同a）的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。

在一个实施方案中，被调控的基因编码二氢黄酮醇（dihydroflavolon）4-还原酶（DFR）。

在另一个实施方案中，被调控的基因编码查耳酮合成酶（CHS）。

在进一步的方面，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含：

a）编码SEQIDNO：1-4和9-21的任何一种氨基酸序列的多肽变种的序列，其中所述多肽是能调控植物中花青素生产的转录因子，并且其中所述多肽包含SEQIDNO：101的序列；

b）具有长度至少为a）的序列的15个核苷酸的片段；

c）a)的序列的互补序列；

d）b）的序列的互补序列；

e）在严格条件下能同a）的序列杂交的至少长15个核苷酸的序列。

优选地，所述变种多肽衍生自蔷薇科物种。

在进一步的方面，本发明提供分离多肽，其包含：

a）具有同选自SEQIDNO：1-4和9-21任何之一的氨基酸序列至少65%同一性的序列，其中所述多肽是能调控植物中花青素生产的转录因子；或

b）具有长度至少为a）的序列的15个氨基酸的片段。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：1的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：1的序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：2的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：2的序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：3的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：3的序列。

在一个实施方案中，在a）中的序列具有同SEQIDNO：4的氨基酸序列至少65%的同一性。优选地，在a）中的序列具有SEQIDNO：4的序列。

在进一步的方面，本发明提供了编码本发明多肽的多聚核苷酸。

在进一步的方面，本发明提供了抗本发明的多肽的抗体。

在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的任何一种多聚核苷酸的遗传学构建物。

在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的遗传学构建物的宿主细胞。

在进一步的方面，本发明提供了被遗传修饰来表达本发明的任何一种多聚核苷酸的宿主细胞。

在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的遗传学构建物的植物细胞。

在进一步的方面，本发明提供了被遗传修饰来表达本发明的多聚核苷酸的植物细胞。

在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的植物细胞的植物。

在进一步的方面，本发明提供了生产本发明的多肽的方法，所述方法包括培养包含本发明的遗传学构建物的宿主细胞的步骤。

在进一步的方面，本发明提供了具有改变的花青素生产的植物细胞或植物，所述方法包含用遗传学构建物转化植物细胞或植物的步骤，所用的遗传学构建物包括：

a）至少一条编码本发明的多肽的多聚核苷酸；

b）至少一条包含具有长度至少为a）的多聚核苷酸的15个核苷酸的片段的多聚核苷酸；或

c）至少一条包含具有长度至少为a）的多聚核苷酸的15个核苷酸的互补序列的多聚核苷酸。

在进一步的方面，本发明提供了生产具有改变的花青素生产的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用遗传学构建物转化植物细胞或植物的步骤，所用的遗传学构建物包括：

a）至少一条本发明的任何一个的多聚核苷酸。；

b）至少一条包含具有长度至少为a）的多聚核苷酸的15个核苷酸的片段的多聚核苷酸，或

c）至少一条包含具有长度至少为a）的多聚核苷酸的15个核苷酸的互补序列的多聚核苷酸

d）至少一条能在严格条件下同a）或b）的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。

在所述方法的一个实施方案中，所述构建物被设计来表达一对转录因子，并且所述构建物包含：

i）编码具有同SEQIDNO：1、2和9-21的任何一条氨基酸序列至少65%同一性的MYB转录因子的多聚核苷酸序列；和

ii）编码具有同SEQIDNO：1或2的氨基酸序列至少65%同一性的bHLH转录因子的多聚核苷酸序列。

在进一步的实施方案中，在i）中的多聚核苷酸序列具有同SEQIDNO：5、6、22-27和102的任何一条核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii）中的多聚核苷酸序列具有同SEQIDNO：7或8的核苷酸序列至少70%的序列同一性。

在进一步的实施方案中，在i）中的多聚核苷酸序列具有同SEQIDNO：5、6、22-27和102的任何一条核苷酸序列至少70%的序列同一性；并且在ii）中的编码序列具有同SEQIDNO：7或8的编码序列至少70%的序列同一性。

在进一步的方面，本发明提供了用本发明的方法生产的植物。

在进一步的方面，本发明提供了选择花青素生产被改变的植物的方法，所述方法包含检测植物中的本发明的多聚核苷酸的改变的表达。

在进一步的方面，本发明提供了选择花青素生产被改变的植物的方法，所述方法包含检测植物中的本发明的多肽的改变的表达。

在进一步的方面，本发明提供了用本发明的方法选择的植物。

在进一步的方面，本发明提供了选择被转化的植物细胞或植物的方法，所述方法包含下述步骤

a）用本发明的能调控植物中花青素生产的多聚核苷酸或多肽转化植物细胞或植物；

b）在所述植物细胞或植物中表达所述多聚核苷酸或多肽；和

c）选择具有相对于其它植物细胞或植物而言增加了的花青素着色的植物细胞或植物，所述增加了的花青素着色表明所述植物细胞或植物已经被转化。

优选地，本发明的能调控植物中花青素生产的转录因子和变种能调控选自但不限于花青素-3-葡糖苷、花青素-3-邻-芸香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin-3-戊糖苷的花青素的生产。

优选地，通过本发明的方法生产或选择的具有改变的花青素生产的植物或植物细胞在选自但不限于cyanadin-3-葡糖苷酶、cyaniding-3-邻-芸香糖苷、cyanadin-3-葡糖苷或cyanadin-3-戊糖苷的花青素的生产中发生改变。

本发明的多聚核苷酸和多聚核苷酸变种能衍生自任何物种或能通过重组或合成方法进行生产。

在一个实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自植物物种。

在进一步的实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自裸子植物物种。

在进一步的实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自被子植物物种。

在进一步的实施方案中，所述多聚核苷酸或变种衍生自双子叶植物物种。

本发明的多肽和多肽变种能衍生自任何物种，或能通过重组或合成方法进行生产。

在一个实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自植物物种。

在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自裸子植物。

在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自被子植物。

在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自双子叶植物。

在进一步的实施方案中，本发明的多肽或变种衍生自单子叶植物。

本发明的植物细胞或植物能衍生自任何物种。

在一个实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自裸子植物物种。

在进一步的实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自被子植物物种。

在进一步的实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自双子叶植物物种。

在进一步的实施方案中，本发明的植物细胞和植物衍生自单子叶植物物种。

优选的植物物种（对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物）包括选自包含但不限定于下述属的水果植物物种：苹果属（Malus）、梨属（Pvrus）、李属（Prunis）、悬钩子属（Rubus）、蔷薇属（Rosa）、草莓属（Fragaria）、猕猴桃属（Actinidia）、榅桲属（Cydonia）、柑橘属（Citrus）和越橘属（Vaccinium）。

特别优选的水果植物物种是：家苹果（Malusdomestica）、美味猕猴桃（Actidiniadeliciosa）、中华猕猴桃（A.chinensis）、毛花猕猴桃（A.eriantha）、软枣猕猴桃（A.arguta）和上述四种猕猴桃物种的杂交品种、桃（Prunispersica）、岭南梨（PyrusL.）、悬钩子属（Rubus）、蔷薇属（Rosa）和草莓属（Fragaria）。

优选的植物（对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物）也包括选自包含但不限定于下述属的蔬菜植物品种：芸苔属（Brassica）、番茄属（Lycopersicon）和茄属（Solanum），

特别优选的蔬菜植物品种为：西红柿（Lycopersiconesculentum）和马铃薯（Solanumtuberosum）

优选的植物（对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物）也包括选自包含但不限定于下述属的农作物植物品种：大豆属（Glycine）、玉米属(Zea）、大麦属（Hordeum）和稻属（Oryza）。

特别优选的农作物植物物种包括大豆（Glycinemax）、玉米（Zeamays）和水稻（Oryzasativa）。

优选的植物（对于本发明的多聚核苷酸和变种、多肽和变种以及植物细胞和植物）也包括那些蔷薇科的物种。

优选的蔷薇科的属包括白鹃梅属（Exochorda）、臭樱属（Maddenia）、Oemleria、Osmaronia、扁核木属（Prinsepia）、李属（Prunus）、苹果亚科（Maloideae）、唐棣属（Amelanchier）、石灰树属（Aria）、腺肋花楸属（Aronia）、木瓜属（Chaenomeles）、Chamaemespilus、榛属（Cormus）、栒子属（Cotoneaster）、山楂属（Crataegus）Osmaronia、扁核木属（Prinsepia）、李属（Prunus）、苹果亚科（Maloideae）、唐棣属（Amelanchier）、Aria、腺肋花楸属（Aronia）、木瓜属（Chaenomeles）、Chamaemespilus、榛属（Cormus）、栒子属（Cotoneaster）、山楂属（Crataegus）、榅桲属（Cydonia）、牛筋条属（Dichotomanthes）、栘属（Docynia）、Docyniopsis、枇杷属（Eriobotrya）、Eriolobus、Heteromeles、Kageneckia、Lindleya、Malacomeles、苹果属（Malus）、欧楂属（Mespilus）、小石积属（Osteomeles）、酸果木属（Peraphyllum）、石楠属（Photinia）、假榅桲属（Pseudocydonia）、火棘属（Pyracantha）、梨属（Pyrus）、石斑木属（Rhaphiolepis）、花楸属（Sorbus）、红果树属（Stranvaesia）、Torminalis、Vauquelinia、蔷薇亚科（Rosoideae）、芒刺果属（Acaena）、羽叶花属（Acomastylis）、龙牙草属（Agrimonia）、羽衣草属（Alchemilla）、Aphanes、Aremonia、Bencomia、Chamaebatia、Cliffortia、无尾果属（Coluria）、Cowania、Dalibarda、Dendriopoterium、仙女木属（Dryas）、蛇莓属（Duchesnea）、Erythrocoma、Fallugia、蚊子虫草属（Filipendula）、草莓属（Fragaria）、路边青属（Geum）、Hagenia、Horkelia、Ivesia、棣棠花属（Kerria）、Leucosidea、Marcetella、Margyricarpus、Novosieversia,Oncostylus、Polylepis、委陵菜属（Potentilla）、蔷薇属（Rosa）、悬钩子属（Rubus）、地榆属（Sanguisorba）、Sarcopoterium、山莓草属（Sibbaldia）、五瓣莲属（Sieversia）、太行花属（Taihangia）、Tetraglochin、林石草属（Waldsteinia）、蔷薇科地位未定（Rosaceaeincertaesedis）、Adenostoma、假升麻属（Aruncus）、紫衫属（Cercocarpus）、Chamaebatiaria、地蔷薇属（Chamaerhodos）、美吐根属（Gillenia）、Holodiscus、Lyonothamnus、绣线梅属（Neillia）、Neviusia、风箱果属（Physocarpus）、Purshia、鸡麻属（Rhodotypos）、珍珠梅属（Sorbaria）、绣线菊属（Spiraea）和小米空木属（Stephanandra）。

优选的蔷薇科物种包括红柄白鹃梅（Exochordagiraldii）、Exochordaracemosa、Exochorda、红柄白鹃梅（Exochordagiraldii）、Exochordaracemosa、齿叶白鹃梅（Exochordaserratifolia）、臭樱（Maddeniahypoleuca）、Oemleriacerasiformis、Osmaroniacerasiformis、东北扁核木（Prinsepiasinensis）、齿叶扁核木（Prinsepiauniflora）、阿利根尼李子（Prunusalleghaniensis）、美洲李（Prunusamericana）、Prunusandersonii、奇克索李（Prunusangustifolia）、Prunusapetala、Prunusargentea、山杏(Prunusarmeniaca)、欧洲甜樱桃（Prunusavium）、Prunusbifrons、布里扬松杏（Prunusbrigantina）、Prunusbucharica、橉木樱（Prunusbuergeriana）、山樱花（Prunuscampanulata）、加罗林桂樱（Prunuscaroliniana）、红叶李（Prunuscerasifera）、酸樱桃（Prunuscerasus）、Prunuschoreiana、那不勒斯李（Prunuscocomilia）、Prunuscyclamina、山桃（Prunusdavidiana）、Prunusdebilis、欧洲李（Prunusdomestica）、扁桃（Prunusdulcis）、苦樱桃（Prunusemasginata）、Prunusfasciculata、新疆桃（Prunusferganensis）、Prunusfordiana、Prunusfremontii、灌木樱桃（Prunusfruticosa）、Prunusgeniculata、麦李（Prunusglandulosa）、Prunusgracilis、灰叶稠李（Prunusgrayana）、郝图兰李（Prunushortulana）、圣叶樱桃（Prunusilicifolia）、豆樱（Prunusincisa）、阿富汗樱桃（Prunusjacquemontii）、郁李（Prunusjaponica）、Prunuskuramica、桂樱（Prunuslaurocerasus）、Prunusleveilleana、葡萄牙桂樱（Prunuslusitanica）、斑叶稠李（Prunusmaackii）、圆叶樱桃（Prunusmahaleb）、山杏（Prunusmandshurica）、沙滩李（Prunusmaritima）、黑樱桃（Prunusmaximowiczii）、Prunusmexicana、小樱桃（Prunusmicrocarpa）、光核桃（Prunusmira）、梅（Prunusmume）、雁李（Prunusmunsoniana）、加拿大李（Prunusnigra）、千岛樱（Prunusnipponica）、稠李（Prunuspadus）、欧洲酸樱桃（Prunuspensylvanica）、碧桃（Prunuspersica）、Prunuspetunnikowii、山樱桃（Prunusprostrata）、中国樱桃（Prunuspseudocerasus）、沙樱桃（Prunuspumila）、Prunusrivularis、中国李（Prunussalicina）、大山樱（Prunussargentii）、Prunussellowii、野黑樱（Prunusserotina）、樱花（Prunusserrulata）、西伯利亚杏（Prunussibirica）、红李（Prunussimonii）、刺李（Prunusspinosa）、刺叶稠李（Prunusspinulosa）、奥勒冈州李（Prunussubcordata）、大叶早樱（Prunussubhirtella)、Prunustakesimensis、俄罗斯矮杏（Prunustenella）、Prunustexana、毛樱桃（Prunustomentosa）、Prunustschonoskii、Prunusumbellata、霞樱花（Prunusverecunda）、美国稠李（Prunusvirginiana）、Prunuswebbii、东京樱（Prunusxyedoensis）、大叶樱（Prunuszippeliana）、李属BSP-2004-1（Prunussp.BSP-2004-1）、李属BSP-2004-2（Prunussp.BSP-2004-2）、李属EB-2002（Prunussp.EB-2002）、桤叶唐棣（Amelanchieralnifolia）、Amelanchierarborea、东亚唐棣（Amelanchierasiatica）、巴川姆唐棣（Amelanchierbartramiana）、加拿大唐棣（Amelanchiercanadensis）、Amelanchiercusickii、Amelanchierfernaldii、Amelanchierflorida、Amelanchierhumils、Amelanchierintermedia、平滑唐棣（Amelanchierlaevis）、Amelanchierlucida、Amelanchiernantucketensis、Amelanchierpumila、Amelanchierquinti-martii、Amelanchiersanguinea、Amelanchierstolonifera、Amelanchierutahensis、Amelanchierwiegandii、Amelanchierxneglecta、巴川姆唐棣x唐棣属‘dentata’（AmelanchierbartramianaxAmelanchiersp.′dentata′）、唐棣属‘dentata’（Amelanchiersp.′dentata′）、唐棣属‘erecta’（Amelanchiersp.′erecta′）、唐棣属‘erecta’x光滑唐棣（Amelanchiersp.′erecta′xAmelanchierlaevis）、唐棣属‘serotina’（Amelanchiersp.′serotina′）、Ariaalnifolia、紫果腺肋花楸（Aroniaprunifolia）、毛叶木瓜（Chaenomelscathayensis）、皱皮木瓜（Chaenomelesspeciosa）、Chamaemespilusalpina、家榛（Cormusdomestica）、细尖栒子（Cotoneasterapiculatus）、团花栒子（Cotoneasterlacteus）、毡毛栒子（Cotoneasterpannosus）、Crataegusazarolus、Crataeguscolumbiana、白玉山楂（Crataeguscrus-galli）、Crataeguscurvisepala、彩叶山楂（Crataeguslaevigata）、Crataegusmollis、单子山楂（Crataegusmonogyna）、欧洲黑山楂（Crataegusnigra）、Crataegusrivularis、Crataegussinaica、榅桲（Cydoniaoblonga）、光叶牛筋条（Dichotomanthestristaniicarpa）、云南栘（Docyniadelavayi）、Docyniopsistschonoskii、枇杷（Eriobotryajaponica）、栎叶枇杷（Eriobotryaprinoides）、Eriolobustrilobatus、Heteromelesabutifolia、Kageneckiaangustifolia、Kageneckiaoblonga、Lindleyamespiloides、Malacomelesdenticulata、Malusangustifolia、花红（Malusasiatica）、山荆子（Malusbaccata）、Maluscoronaria、台湾林檎（Malusdoumeri）、Malusflorentina、Malusfloribunda、Malusfusca、垂丝海棠（Malushalliana）、河南海棠（Malushonanensis）、湖北海棠（Malushupehensis）、Malusioensis、光叶陇东海棠（Maluskansuensis）、毛山荆子（Malusmandshurica）、西府海棠（Malusmicromalus）、红肉苹果（Malusniedzwetzkyana）、沧江海棠（Malusombrophiila）、东方苹果（Malusorientalis）、西蜀海棠（Malusprattii）、楸子（Malusprunifolia）、苹果（Maluspumila）、撒氏海棠（Malussargentii）、三叶海棠（Malussieboldii）、新疆野苹果（Malussieversii）、野苹果（Malussylvestris）、变叶海棠（Malustoringoides）、长圆果花叶海棠（Malustransitoria）、三裂叶海棠（MalustrilObata）、Malustschonoskii、Malusxdomestica、MalusxdomesticaxMalussieversii、MalusxdomesticaxPyruscommunis、小金海棠（Malusxiaojinensis）、滇池海棠（Malusyunnanensis）、苹果属、西洋木瓜（Mespilusgermanica）、小石积（Osteomelesanthyllidifolia）、华西小石积（Osteomelesschwerinae）、Peraphyllumramosissimum、红叶石楠（Photiniafraseri）、Photiniapyrifolia、卵叶石楠（Photiniaserrulata）、毛叶石楠（Photiniavillosa）、中华假榅桲（Pseudocydoniasinensis）、欧洲火棘（Pyracanthacoccinea）、火棘（Pyracanthafortuneana）、豆梨（Pyruscalleryana）、Pyruscaucasica、西洋梨（Pyruscommunis）、Pyruselaeagrifolia、杂交梨品种（Pyrushybridcultivar）、沙梨(Pyruspyrifolia)、柳叶梨(Pyrussalicifolia)、秋子梨(Pyrusussuriensis)、白梨(Pyrusxbretschneideri)、石斑木（Rhaphiolepisindica）、美洲花楸（Sorbusamericana）、白花花楸（Sorbusaria）、欧洲花楸（Sorbusaucuparia）、Sorbuscalifornica、克什米尔花楸（Sorbuscommixta）、湖北花楸(Sorbushupehensis)、Sorbusscopulina、西伯利亚花楸(Sorbussibirica)、Sorbustorminalis、红果树(Stranvaesiadavidiana)、Torminalisclusii、Vauqueliniacalifornica、Vauqueliniacorymbosa、Acaenaanserinifolia、Acaenaargentea、灰蓝芒刺果(Acaenacaesiiglauca)、Acaenacylindristachya、Acaenadigitata、Acaenaechinata、Acaenaelongata、Acaenaeupatoria、Acaenafisistipula、无刺芒刺果(Acaenainermis)、Acaenalaevigata、Acaenalatebrosa、Acaenalucida、Acaenamacrocephala、Acaenamagellanica、Acaenamasafuerana、Acaenamontana、Acaenamultifida、新西兰芒刺果(Acaenanovaezelandiae)、Acaenaovalifolia、Acaenapinnatifida、Acaenasplendens、Acaenasubincisa、Acaenaxanserovina、羽叶花(Acomastyliselata)、Acomastylisrossii、Acomastylissikkimensis、欧洲龙牙草(Agrimoniaeupatoria)、日本龙牙草（Agrimonianipponica）、Agrimoniaparviflora、龙牙草（Agrimoniapilosa）、高山羽衣草（Alchemillaalpina）、Alchemillaerythropoda、羽衣草（Alchemillajaponica）、Alchemillamollis、Alchemillavulgaris、Aphanesarvensis、Aremoniaagrimonioides、Bencomiabrachystachya、Bencomiacaudata、Bencomiaexstipulata、Bencomiasphaerocarpa、Chamaebatiafoliolosa、Cliffortiaburmeana、Cliffortiacuneata、Ciffortiadentata、Ciffortiagraminea、Cliffortiaheterophylla、Cliffortianitidula、Ciffortiaodorata、Ciffortiaruscifolia、Cliffortiasericea、Coluriaelegans、Coluriageoides、Cowaniastansburiana、Dalibardarepens、Dendriopoteriummenendezii、Dendriopoteriumpulidoi、德拉蒙德仙女木（Dryasdrummondii）、仙女木（Dryasoctopetala）、皱果蛇莓（Duchesneachrysantha）、蛇莓（Duchesneaindica）、Erythrocomatriflora、Fallugiaparadoxa、多叶蚊子草（Filipendulamultijuga）裤叶蚊子草（Filipendulapurpurea）、旋果蚊子草（Filipendulaulmaria）、六瓣绣线菊（Filipendulavulgaris）、智利草莓（Fragariachiloensis）、裂萼草莓（Fragariadaltoniana）、细梗草莓（Fragariagracilis）、Fragariagrandiflora、Fragariaiinumae、麝香草莓（Fragariamoschata）、黄毛草莓（Fragarianilgerrensis)、Fragarianipponica、西藏草莓（Fragarianubicola）、东方草莓（Fragariaorientalis）、五叶草莓（Fragariapentaphylla）、野草莓（Fragariavesca）、弗州草莓（Fragariavirginiana）、荷兰草莓（Fragariaviridis）、草莓（Fragariaxananassa）、草莓属CFRA538（Fragariasp.CFRA538）、草莓属（Fragariasp.）、Geumandicola、Geumborisi、保加利亚路边青（Geumbulgaricum）、Geumcalthifolium、智利路边青（Geumchiloense）、Geumgeniculatum、Geumheterocarpum、Geummacrophyllum、Geummontanum、Geumreptans、紫萼路边青（Geumrivale）、Geumschofieldii、Geumspeciosum、欧亚路边青（Geumurbanum）、Geumvernum、路边青属‘Chase2507K’（Geumsp.′Chase2507K′）、Hageniaabyssinica、Horkeliacuneata、Horkeliafusca、Ivesiagordoni、重瓣棣棠花（Kerriajaponica）、Leucosideasericea、Marcetellamaderensis、Marcetellamoquiniana、Margyricarpuspinnatus、Margyricarpussetosus、Novosieversiaglacials、Oncostyluscockaynei、Oncostylusliospermus、Potylepisaustralis、Polylepisbesseri、Polylepiscrista-galli、Polylepishieronymi、Polylepisincana、Polylepislanuginosa、Polylepismultijuga、Polylepisneglecta、Polylepispauta、Polylepispepei、Polylepisquadrijuga、Polylepisracemosa、Polylepisreticulata、Polylepisrugulosa、Polylepissericea、Polylepissubsericans、Polylepistarapacana、Polylepistomentella、Polylepisweberbaueri、无毛蕨麻（Potentillaanserina）、Potentillaarguta、二裂委陵菜（Potentillabifurca）、委陵菜（Potentillachinensis）、薄叶皱叶委陵菜（Potentilladickinsii）、Potentillaerecta、莓叶委陵菜（Potentillafragarioides）、白毛金露梅（Potentillafruticosa）、Potentillaindica、Potentillamicrantha、多裂委陵菜（Potentillamultifida）、雪白委陵菜（Potentillanivea）、挪威委陵菜（Potentillanorvegica）、沼生委陵菜（Potentillapalustris）、总梗委陵菜（Potentillapeduncularis）、匍匐委陵菜（Potentillareptans）、Potentillasalesoviana、狭叶委陵菜（Potentillastenophylla）、三齿委陵菜（Potentillatridentata）、Rosaabietina、Rosaabyssinica、刺蔷薇（Rosaacicularis)、草地玫瑰（Rosaagrestis）、白蔷薇（Rosaalba）、白蔷薇x荆刺蔷薇（RosaalbaxRosacorymbifera）、大花密刺蔷薇（Rosaaltaica）、阿州蔷薇（Rosaarkansana）、野地玫瑰（Rosaarvensis）、本香花（Rosabanksiae）、弯刺玫瑰（Rosabeggeriana）、哈德逊湾玫瑰（Rosablanda）、硕苞蔷薇（Rosabracteata）、复伞房蔷薇（Rosabrunonii）、Rosacaesia、加州蔷薇（Rosacalifornica）、犬蔷薇（Rosacanina）、卡罗莱纳蔷薇（RosaCarolna）、月季（Rosachinensis）、Rosacinnamomea、Rosacolumnifera、荆棘蔷薇（Rosacorymbifera）、山木香（Rosacymosa）、山刺玫（Rosadavurica）、马尔密迪玫瑰（Rosadumalis）、Rosaecae、Rosaeglanteria、Rosaelliptica、腺果蔷薇（Rosafedtschenkoana）、异味蔷薇（Rosafoetida）、Rosafoliolosa、法国蔷薇（Rosagallica）、RosagallicaxRosadumetorum、巨花蔷薇（Rosagigantea）、瑞道特玫瑰（Rosaglauca）、卵果蔷薇（Rosahelnae）、软条七蔷薇（Rosahenryi）、黄蔷薇（Rosahugonis）、蔷薇杂交品种（Rosahybridculivar）、Rosainodora、Rosajundzillii、金樱子（Rosalaevigata）、疏花蔷薇（Rosalaxa）、光叶蔷薇（Rosaluciae）、重瓣五月玫瑰（Rosamajalis）、深山蔷薇（Rosamarretii）、伞花蔷薇（Rosamaximowicziana）、Rosamicrantha、毛叶广东蔷薇（Rosamollis）、Rosamontana、射香玫瑰（Rosamoschata）、华西蔷薇（Rosamoyesii）、多苞蔷薇（Rosamultibracteata）、多花玫瑰（Rosamultiflora）、Rosanitida、香水月季（Rosaodorata）、沼泽玫瑰（Rosapalustris）、高山玫瑰(Rosapendulina）、小檗蔷薇（Rosapersica）、Rosaphoenicia、宽刺蔷薇（Rosaplatyacantha）、樱草蔷薇（Rosaprimula）、Rosapseudoscabriuscula、缫丝花（Rosaroxburghii）、甜石南（Rosarubiginosa）、玫瑰（Rosarugosa）、山蔷薇（Rosasambucina）、长青玫瑰（Rosasempervirens）、绢毛蔷薇（Rosasericea）、钝叶蔷薇（Rosasertata）、刚毛玫瑰（Rosasetigera）、Rosasherardii、Rosasicula、密刺蔷薇（Rosaspinosissima）、Rosastellata、平花山地玫瑰（Rosastylosa）、Rosasubcanina、Rosasubcollina、Rosasuffulta、Rosatomentella、被绒毛玫瑰（Rosatomentosa）、Rosatunquinensis、苹果蔷薇（Rosavillosa）、维吉尼亚玫瑰（Rosavirginiana）、光叶蔷薇（Rosawichurana）、小叶蔷薇（Rosawillmottiae）、伍兹氏蔷薇（Rosawoodsii）；Rosaxdamascena、Rosaxfortuniana、Rosaxmacrantha、黄刺玫（Rosaxanthina）、蔷薇属（Rosasp.）、粗叶悬钩子Rubusalceifolius、美国黑莓（Rubusallegheniensis）、Rubusalpinus、周毛悬钩子（Rubusamphidasys）、北悬钩子（Rubusarcticus）、Rubusargutus、西南悬钩子（Rubusassamensis）、Rubusaustralis、Rubusbifrons、欧洲木莓（Rubuscaesius）、欧洲木莓x复盆子（RubuscaesiusxRubusidaeus）、无刺小黑莓（Rubuscanadensis）、Rubuscanescens、Rubuscaucasicus、兴安悬钩子（Rubuschamaemorus）、山莓（Rubuscorchorifolius）、牛叠肚（Rubuscrataegifolius）、沙黑莓（Rubuscuneifolius）、美味悬钩子（Rubusdeliciosus）、Rubusdivaricatus、椭圆悬钩子（Rubusellipticus）、Rubusflagellaris、黑莓（Rubusfruticosus）、Rubusgeoides、Rubusglabratus、Rubusglaucus、Rubusgunnianus、Rubushawaiensis、RubushawaiensisxRubusrosifolius、硬毛黑莓（Rubushispidus）、Rubushochstetterorum、葎草叶悬钩子（Rubushumulifolius）、复盆子（Rubusidaeus）、高粱泡（Rubuslambertianus）、Rubuslasiococcus、白皮糙莓（Rubusleucodermis）、绢毛悬钩子（Rubuslineatus）、Rubusmacraei、Rubusmaximiforrnis、Rubusminusculus、Rubusmoorei、大乌泡（Rubusmultibracteatus）、Rubusneomexicanus、Rubusnepalensis、Rubusnessensis、雪露莓（Rubusnivalis）、红泡刺藤（Rubusniveus）、Rubusnubigenus、黑树莓（Rubusoccidentalis）、香莓（Rubusodoratus）、Rubuspalmatus、茅莓（Rubusparviflorus）、茅莓（Rubusparvifolius）、Rubusparvus、黄泡（Rubuspectinellus）、Rubuspedatus、Rubuspedemontanus、Rubuspensilvanicus、多腺悬钩子（Rubusphoenicolasius）、Rubuspicticaulis、柔毛黑莓（Rubuspubescens）、Rubusrigidus、Rubusrobustus、Rubusroseus、空心泡（Rubusrosifolius）、Rubussanctus、Rubussapidus、石生悬钩子(Rubussaxatilis)、Rubussetosus、美莓（Rubusspectabilis）、Rubussulcatus、灰白毛莓（Rubustephrodes）、三花悬钩子（Rubustrianthus）、三色莓（Rubustricolor）、Rubustrifidus、Rubustrilobus、南露莓（Rubustrivialis）、榆叶黑莓（Rubusulmifolius）、黑草莓（Rubusursinus）、Rubusurticifolius、Rubusvigorosus、悬钩子属JPM-2004（Rubussp.JPM-2004）、Sanguisorbaalbiflora、高山地榆（Sanguisorbaalpina）、Sanguisorbaancistroides、Sanguisorbaannua、美洲地榆（Sanguisorbacanadensis）、矮地榆（Sanguisorbafiliformis）、白山地榆（Sanguisorbahakusanensis）、Sanguisorbajaponensis、小地榆（Sanguisorbaminor）、Sanguisorbaobtusa、地榆（Sanguisorbaofficinalis）、小白花地榆（Sanguisorbaparviflora）、大白花地榆（Sanguisorbastiulata）、细叶地榆（Sanguisorbatenuifolia）、Sarcopoteriumspinosum、山莓草（Sibbaldiaprocumbens）、Sieversiapentapetala、Sieversiapusilla、缘毛太行花（Taihangiarupestris）、Tetraglochincristatum、Waldsteiniafragarioides、欧洲林石草（Waldsteiniageoides）、Adenostomafasciculatum、Adenostomasparsifolium、假升麻（Aruncusdioicus）、Cercocarpusbetuloides、Cercocarpusledifolius、Chamaebatiariamillefolium、直立地蔷薇（Chamaerhodoserecta）、Gilleniastipulata、美吐根（Gilleniatrifoliata）、Holodiscusdiscolor、Holodiscusmicrophyllus、Lyonothamnusfloribundus、川康绣线梅（Neilliaaffinis）、矮生绣线梅（Neilliagracilis）、中华绣线梅（Neilliasinensis）、疏花绣线梅（Neilliasparsiflora）、西康绣线梅（Neilliathibetica）、毛果绣线梅（Neilliathyrsiflora）、东北绣线梅（Neilliauekii）、Neviusiaalabamensis、Physocarpusalternans、Physocarpusarnurensis、太平洋风箱果（Physocarpuscapitatus）、Physocarpusmalvaceus、山风箱果（Physocarpusmonogynus）、美国风箱果（Physocarpusopulifolius）、Purshiatridentata、鸡麻（Rhodotyposscandens）、高丛珍珠梅（Sorbariaarborea）、东北珍珠梅（Sorbariasorbifolia）、Spiraeabetulifolia、麻叶绣线菊（Spiraeacantoniensis）、Spiraeadensiflora、粉花绣线菊（Spiraeajaponica）、Spiraeanipponica、菱叶绣线菊（Spiraeaxvanhouttei）、绣线菊属（Spiraeasp.）、中国小米空木（Stephanandrachinensis）、小米空木（Stephanandraincisa）和日本小米空木（Stephanandratanakae）。

特别优选的蔷薇科的属包括：苹果属、梨属、榅桲属、李属、枇杷属和欧楂属。

特别优选的蔷薇科物种包括：家苹果、野苹果、西洋梨、沙梨、白梨、榅桲、中国李、红叶李、碧桃、枇杷、扁桃、欧洲甜樱桃、西洋木瓜和欧洲李。

更特别优选的蔷薇科的属包括苹果属和李属

特别优选的蔷薇科物种包括家苹果和红叶李。

术语“植物”包括整株植物、植物的任何部分、植物的繁殖体和后代。

术语“繁殖体”指能用在有性或无性生殖或繁殖中的植物的任何部分，包括种子和插穗。

附图说明

本发明参照附图将能被更好的理解：

图1：显示了MdMYB10（SEQIDNO：1）和MdMYB9（SEQIDNO：2）同已知的来源于各种物种的花青素MYB调控因子在R2R3结合区域的比较。箭头标明有助于在拟南芥bHLH共同因子相互作用中涉及的基序的特定氨基酸残基（Zimmermannetal.,2000）；这些相同的残基是MdMYB10和MdMYB9中暗示相似的蛋白质-蛋白质相互作用的证据。

图2：显示了显示拟南芥和苹果MYBTFs间关系的系统发育分析。箭头显示了在花青素MYB调控因子亚组10中位于AtPAP1的下一个的MdMYB10的位置。已知的花青素调控因子用灰点表示，图中包括的用黑点表示的其它基因是显示MdMYB10作用是对该MYB进化枝特异和不是对整体MYBs特异的阴性对照。

图3（A）：显示了红地（RedField）苹果和太平洋玫瑰（PacificRose）苹果的皮层、果皮和叶片中的如列在图右手侧的从CHS到UFGT的苹果花青素生物合成基因的qPCR分析数据。X轴数字指如下内容；1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB，5、146DAFB，6、红地苹果OP叶片和7、太平洋玫瑰苹果叶片。

图3（B）：显示了贯通在如图3（A）中显示的发育阶段1到5的苹果果实（红地OP在上列，太平洋玫瑰苹果在下列）的切片。同太平洋玫瑰苹果相比，红地OP苹果的增加的着色明显可见。

图4：显示了MdMYB10、MdbHLH3和MdbHLH33的表达分析。（A）在红地苹果（皮层、果皮和叶片）和太平洋玫瑰苹果（皮层、果皮和叶片）中的MdMYB10的RT-PCR分析和（B）MdMYB10、MdbHLH3和MdbHLH33的相应的qPCR数据。凝胶泳道和X轴数字如下：1、40DAFB，2、67DAFB，3、102DAFB，4、130DAFB，5、146DAFB，6、红地苹果叶片和7、太平洋玫瑰苹果叶片。

图5：显示了双重荧光素酶实验显示了以LUC比REN的比率表示的启动子活性，其中，活性的增加同MYBTFs同/不同bHLHTFs组合的相对于REN的LUC的增加进行平均；（A）拟南芥TT4（CHS）-Luc启动子，（B）拟南芥TT3（DFR）-Luc启动子。0：单独的MYB，1：MYB+AtTT8，2：MYB+MdbHLH3，3：MYB+MdbHLH33。

图6：显示了烟草中短暂实验的数据。（A）显示了以a^*/b^*比率显示的用Minolta比色计测量的颜色测量数据。朝向正值的转变表明了从绿色到红色的颜色变化。（i）MdMYB10+MdbHLH3，（ii）单独的MdMYB10。

（B）显示了显示用20x（左）和40x（右）的MdMyb10+MdbHLH3浸润的烟草叶片组织中花青素（更黑的灰色）积累模式的显微影像。比例尺代表50微米。

图7：显示了显示用MdMYB10+MdbHLH3浸润的（A）烟草花瓣和（B）烟草叶片的HPLC痕量（traces）。1、花青苷-3-葡糖苷，2、矮牵牛素-3-半乳糖苷，3、花青苷-3-邻-芸香糖苷。在对照的烟草叶片中没有观测到峰（数据未显示）。

图8：显示了MdMyb10多肽序列和MdMYB10的多肽变种以及参考的AtPAP1（也称为AtMYB75）的蛋白序列比对。AtMYB75在GenBank数据库中的登入号是CAB09230。所述比对使用ClustalW算法进行创立（Thompsonetal.,1994）。

图9：显示了MdMyb10多肽序列、MdMYB10的多肽变种和参考的AtPAP1间的%序列同一性。所述表格显示了包括在图8中的序列的所有可能的序列组合的%同一性值。

图10：显示了在烟草短暂转化实验中At-DFR基因启动子被同苹果bHLHTFs组合的MdMYB10和PcfMYB10（PcfMYB10的变种）的激活影响了At-DFR基因启动子的活性。双重荧光素酶实验显示了以DFR启动子荧光素酶（LUC）比35S海肾（REN）的比率表达的启动子活性，其中活性的增加同相对于REN的LUC的增加相平均。MYB转录因子（MdMYB10、PcfMYB10和MdMYB8（-ve对照）同bHLH转录因子MdbHLH3和MdbHLH33的组合的效应被显示。显示的误差条是6个重复反应的均值±S.E。

图11：显示，MdMYB10在苹果细胞和/或植物中的过表达提高了花青素生产。（A）（i）显示了着色的愈伤组织细胞。A（ii）显示了用35S-MdMYB10转化的苹果植物（左）和空载体对照植物（右）。与空载体对照相比，用35-MdMYB10（左）转化的植物清楚地显示了强烈的着色。（B）显示了35S-MdMYB10苹果叶片（顶部的线条）和空载体对照（底部的线条）的抽提物的花青素轮廓。在520nm波长处由HPLC痕量鉴定的峰；cy-gal，花青苷-3-半乳糖苷，具有更低痕量的cy-glu，花青苷-3-葡糖苷和cy-pent，花青苷-3-戊糖苷。

具体实施方式

在本说明书中作出的针对专利说明书、其它外部文档或信息的其它来源的参考，其通常的目的是为讨论本发明的特点提供背景知识。除非特别指明，否则对这样的外部文档的参考不被解释为承认，这样的文档或信息的这样的来源，在任何权限内，是已有技术，或形成本领域公知常识的部分。

术语包含和其语法上的同义词是指“至少部分由……组成”。

多聚核苷酸和片段

如本文所用，术语“多聚核苷酸”指任何长度但优选为至少15个核苷酸的单链或双链脱氧核苷酸或核苷酸多聚体，并且包括，作为非限制性的范例，基因的编码和非编码序列、正义和反义序列互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、mRNA前体、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的自然出现的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。

本文提供的多聚核苷酸序列的“片段”是能同目标靶子特异杂交的连续核苷酸的子序列，例如，至少15个核苷酸长的序列。本发明的片段包含本发明的多聚核苷酸的连续核苷酸的15个核苷酸，优选地至少20个核苷酸，更优选地至少30个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸和最优选地至少60个核苷酸。多聚核苷酸的片段能以反义、沉默基因、三螺旋或核酶技术或以包括在微阵中的引物、探针进行使用，或用于本发明的基于多聚核苷酸的选择方法。

术语“引物”指通常具有游离3’OH基的同模板杂交并用于引发同目标互补的多聚核苷酸的聚合的短多聚核苷酸。

术语“探针”指在基于杂交的实验中用来检测同所述探针互补的多聚核苷酸序列的短多聚核苷酸。所述探针可能包含如本文定义的多聚核苷酸的“片段”。

多肽和片段

如本文所用，术语“多肽”包含氨基酸残基被共价肽键连接的包括全长蛋白质的任何长度的但优选地至少5个氨基酸的氨基酸链。本发明的多肽可能是被纯化的天然产物，或可能部分或完全通过使用重组或合成技术进行生产。所述术语可能指多肽、诸如二聚体或其它多聚体的多肽的聚集物、融合肽、多肽片段、多肽变种或其衍生物。

多肽的“片段”是指执行生物活性所需的和/或提供所述多肽三维结构的功能的多肽的子序列。所述术语可能指能执行上述酶活性的多肽、诸如二聚体或其它多聚体的多肽聚集物、融合肽、多肽片段、多肽变种或其衍生物。

如本文公开的，用于所述多聚核苷酸或多肽序列的术语“分离的”是用来指从它们的天然细胞环境中移去的序列。分离的分子可能通过包括生物化学、重组和合成技术在内的任何方法或方法的组合而获得。

术语“重组的”指从在它的天然环境中包围它的序列移去和/或同在它的天然环境中不存在的序列重组的多聚核苷酸序列。

“重组的”多肽序列通过从“重组的”的多聚核苷酸序列的翻译而生产。

关于本发明的衍生自具体属或种的多聚核苷酸或多肽的术语“衍生自”指，所述多聚核苷酸或多肽具有同在所述属或种中天然发现的多聚核苷酸或多肽相同的序列。衍生自具体属或种的所述多聚核苷酸或多肽因此可能被合成地或重组地生产。

变种

如本文中所用，术语“变种”指不同于具体鉴定的序列的多聚核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被删除、取代或加入。变种可能是自然发生的等位变种或非自然发生的变种。变种可能来源于相同的种或来源于其它种并且可能包括同源物、类似物和直系同源物。在某些实施方案中，本发明的多肽变种和多肽具有同本发明的多肽或多肽的生物活性相同或相似的活性。关于多肽和多肽的术语“变种”包括如本文定义的所有形式的多肽和多肽。

多聚核苷酸变种

变种多聚核苷酸序列优选地显示至少50%、更优选地至少51%、更优选地至少52%、更优选地至少53%、更优选地至少54%、更优选地至少55%、更优选地至少56%、更优选地至少57%、更优选地至少58%、更优选地至少59%、更优选地至少60%、更优选地至少61%、更优选地至少62%、更优选地至少63%、更优选地至少64%、更优选地至少65%、更优选地至少66%、更优选地至少67%、更优选地至少68%、更优选地至少69%、更优选地至少70%、更优选地至少71%、更优选地至少72%、更优选地至少73%、更优选地至少74%、更优选地至少75%、更优选地至少76%、更优选地至少77%、更优选地至少78%、更优选地至少79%、更优选地至少80%、更优选地至少81%、更优选地至少82%、更优选地至少83%、更优选地至少84%、更优选地至少85%、更优选地至少86%、更优选地至少87%、更优选地至少88%、更优选地至少89%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%的同本发明的序列的同一性。同一性通过具有至少20个核苷酸位置、优选地至少50个核苷酸位置、更优选地至少100个核苷酸位置和最优选地通过本发明的全长多聚核苷酸的对比窗而发现。

多聚核苷酸序列同一性能以下述方法进行测定。使用bl2seq中的BLASTN（来自BLAST套件程序，版本2.2.5[2002年11月]）将所述目标多聚核苷酸序列同候选多聚核苷酸序列进行比较（TatianaA.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences",FEMSMicrobiolLett.174:247-250），公众可从NCBI（ftp://fp.ncbi.nih.gov/blast/）获得所述程序。除了低复杂度部分过滤（filteringoflowcomplexityparts）应当被关闭外，bl2seq的默认参数被使用。

多聚核苷酸序列的同一性通过使用下述unix命令行参数进行检查：

bl2seq-inucleotideseql-jnucleotideseq2-FF-pblastn参数-FF关闭了低复杂度部分过滤。参数-P选择合适的序列配对算法。所述bl2seq程序在命令行“Identities=”中以相同核苷酸的数目和百分比报告序列同一性。

多聚核苷酸同一性也能通过使用通用序列比对程序测定候选和目标多聚核苷酸序列间的重叠的全部长度而进行计算（例如，Needleman,S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.MoLBiol.48,443-453）。Needleman-Wunsch通用比对算法的完整工具可在EMBOSS程序包中的针（needle）程序中发现（Rice,P.Longden,I.andBleasby，A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,TrendsinGeneticsJune2000,vol16,No6.pp.276-277），所述程序包可从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/）获得。欧洲生物信息学研究所服务器也提供执行两个序列间的EMBOSS-针（needle）通用比对的在线工具，网址为：http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/。

可选地，计算两个序列间的最佳通用比对而没有末端空位罚分的GAP序列能被使用。GAP在下述文章中进行了描述：Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235。

本发明的多聚核苷酸变种也包括那些显示了同一种或更多种明确鉴定的序列的相似性的序列，该序列可能保留那些序列的功能等价物并且，该序列不能被适当地认为已经随机发生。关于多肽的这样的序列相似性可能通过使用公开可得的bl2seq程序进行测定，所述程序可从NCBI的BLAST程序套件（版本2.2.5[2002年11月]）（fp://ftpncbinihgov/blast/）中获得。

多聚核苷酸序列的相似性可能通过使用下述unix命令行参数进行检查：

bl2seq-inucleotideseql-jnucleotideseq2-FF-ptblastx参数-FF关闭了低复杂度部分过滤。参数-P选择合适的序列配对算法。该程序发现序列间具有相似性的区域并为每一个这样的区域报告“E值”，所述“E值”是预期的一个人可以期望在含有随机序列的固定参考大小的数据库中看到的这样的偶然匹配的次数的数目。该数据库的大小在bl2seq程序中通过默认进行设定。对于比一小的多的小的E值，所述E值近似于这样的随机匹配的几率。

当同任何一种具体鉴定的序列比较时，变种多聚核苷酸序列优选地显示小于1×10^-6、更优选地小于1×10^-9、更优选地小于1×10^-12、更优选地小于1×10^-15、更优选地小于1×10^-18、更优选地小于1×10^-21、更优选地小于1×10^-30、更优选地小于1×10^-40、更优选地小于1×10^-50、更优选地小于1×10^-60、更优选地小于1×10^-70、更优选地小于1×10^-80、更优选地小于1×10^-90和最优选地小于1×10^-100的E值。

可选地，本发明的变种多聚核苷酸在严格条件下同特定多聚核苷酸序列或其互补序列杂交。

术语“在严格条件下杂交”和其语法上的同义词指多聚核苷酸在确定的温度和盐浓度条件下同目标多聚核苷酸分子（诸如固定在诸如Southerblot或Northernblot等DNA或RNA印记上的目标多聚核苷酸分子）杂交的能力。在严格条件下杂交的能力能通过在较低严格条件下初始杂交然后增加严格条件到期望的严格条件下的杂交进行测定。

关于长度大于大约100个碱基的多聚核苷酸分子，典型的严格的杂交条件是低于天然双链的解链温度（Tm）不超过25-30℃（例如，10℃）(通常参见，Sambrooketal.,Eds,1987,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress；Ausubeletal.,1987,CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishing,)。超过100个碱基的多聚核苷酸分子的Tm能通过公式Tm=81.5+0.41%（G+C-log（Na+）进行计算（Sambrooketal.,Eds,1987,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress；BoltonandMcCarthy，1962,PNAS84:1390）。对于长度超过大约100个碱基的多聚核苷酸的典型的严格条件将是诸如在6XSSC、0.2%SDS的溶液中预洗；在65℃、6XSSC、0.2%SDS过夜杂交；然后在1XSSC、0.1%SDS的溶液中在65℃下洗涤30分钟，洗涤两次，和在0.2XSSC、0.1%SDS的溶液中在65℃下洗涤30分钟，洗涤两次。

关于具有少于100个碱基的多聚核苷酸分子，范例性的严格的杂交条件是低于Tm5-10℃。平均而言，长度低于100个碱基对的多聚核苷酸分子的Tm被降低大约（500/寡核苷酸长度）℃。

关于称为肽核酸（PNAs）的DNA模拟物（Nielsenetal.,Science.1991Dec6;254(5037):1497-500），其Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA杂交物的Tm值，并能通过使用在Giesenetal.,NucleicAcidsRes.1998Novl;26(21):5004-6中描述的公式进行计算。具有少于100个碱基的DNA-PNA杂交物的范例性的严格的杂交条件是低于Tm值5-10℃。

本发明的变种多聚核苷酸也包括不同于本发明的序列但，作为遗传密码简并性的结果，编码具有同被本发明的多聚核苷酸编码的多肽相似活性的多肽的多聚核苷酸。不改变所述多肽的氨基酸序列的序列改变是“沉默突变”。除了ATG（甲硫氨酸）和TGG（色氨酸）外，相同氨基酸的其它的密码子可能通过人工识别技术进行改变，例如，优化密码子在特定宿主生物中的表达。

导致在被编码的多肽序列中的一个或多个氨基酸保守替换而没有显著改变其生物活性的多聚核苷酸序列改变也包括在本发明中。技术人员将知道制备表型沉默的氨基酸替换的方法（参见例如，Bowieetal.,1990,Science247,1306）。

归因于被编码的多肽序列中的沉默突变和保守替换的变种多聚核苷酸可能通过使用公众可得的bl2seq程序经由如前面所述的tblastx算法进行测定，所述程序来自NCBI的BLAST程序套件（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast）（版本2.2.5[2002年11月]）。

多肽变种

关于多肽的术语“变种”包括天然发生地、重组地和合成地生产的多肽。变种多肽序列优选地显示至少50%、更优选地至少51%、更优选地至少52%、更优选地至少53%、更优选地至少54%、更优选地至少55%、更优选地至少56%、更优选地至少57%、更优选地至少58%、更优选地至少59%、更优选地至少60%、更优选地至少61%、更优选地至少62%、更优选地至少63%、更优选地至少64%、更优选地至少65%、更优选地至少66%、更优选地至少67%、更优选地至少68%、更优选地至少69%、更优选地至少70%、更优选地至少71%、更优选地至少72%、更优选地至少73%、更优选地至少74%、更优选地至少75%、更优选地至少76%、更优选地至少77%、更优选地至少78%、更优选地至少79%、更优选地至少80%、更优选地至少81%、更优选地至少82%、更优选地至少83%、更优选地至少84%、更优选地至少85%、更优选地至少86%、更优选地至少87%、更优选地至少88%、更优选地至少89%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%和最优选地至少99%的同本发明的序列的同一性。同一性通过具有至少20个氨基酸位置、优选地至少50个氨基酸位置、更优选地至少100个氨基酸位置和最优选地通过本发明的全长多肽的对比窗而发现。

多肽序列同一性能以下述方法进行测定。使用bl2seq中的BLASTP（来自BLAST套件程序，版本2.2.5[2002年11月]）将所述目标多肽序列同候选多肽序列进行比较，公众可从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）获得所述程序。除了低复杂度部分过滤（filteringoflowcomplexityparts）应当被关闭外，bl2seq的默认参数被利用。

多肽序列同一性也可能通过使用通用序列比对程序比对候选和目标多肽序列间的重叠的全部长度而计算。如上面所讨论的，EMBOSS-needle（来自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/）和GAP（Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235.）也是计算多肽序列同一性的合适的通用序列比对程序。

优选的计算多肽序列同一性的方法基于通过使用ClustalW比对待比较序列（Thompsonetal1994,NucleicAcidRes11(22)4673-4680）。

本发明的多肽变种也包括那些显示了同一种或更多种明确鉴定的序列的相似性的序列，该序列可能保留那些序列的功能等价物并且，该序列不能被适当地认为已经随机发生。关于多肽的这样的序列相似性可能通过使用公开可得的bl2seq程序进行测定，所述程序可从NCBI的BLAST程序套件（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）（版本2.2.5[2002年11月]）中获得。多肽序列的相似性能通过使用下述unix命令行参数进行测定：

bl2seq-ipeptideseql-jpeptideseq2-FF-pblastp

当同任何一种具体鉴定的序列比较时，变种多肽序列优选地显示小于1×10^-6、更优选地小于1×10^-9、更优选地小于1×10^-12、更优选地小于1×10^-15、更优选地小于1×10^-18、更优选地小于1×10^-21、更优选地小于1×10^-30、更优选地小于1×10^-40、更优选地小于1×10^-50、更优选地小于1×10^-60、更优选地小于1×10^-70、更优选地小于1×10^-80、更优选地小于1×10^-90和最优选地小于1×10^-100的E值。

参数-FF关闭了低复杂度部分过滤。参数-P选择合适的序列配对算法。该程序发现序列间具有相似性的区域并为每一个这样的区域报告“E值”，所述“E值”是预期的一个人可以期望在含有随机序列的固定参考大小的数据库中看到的这样的偶然匹配的次数的数目。对于比一小的多的小的E值，所述E值近似于这样的随机匹配的几率。

没有明显改变其生物活性的所述多肽序列的一个或多个保守替换也被包括在本发明中。技术人员将知晓制备表型沉默氨基酸替换的方法（参见例如，Bowieetal,1990,Science247,1306）。

构建物、载体及其元件

术语“遗传构建物”指通常是双链DNA的多聚核苷酸分子，其可能已经被插入另外的诸如但不限于cDNA分子的多聚核苷酸分子（插入物多聚核苷酸分子）。遗传构建物可能包含支持转录所述插入物多聚核苷酸分子并且可选地翻译所述转录物到多肽的必需元件。所述插入物多聚核苷酸分子可能衍生自宿主细胞，或可能衍生自不同的细胞或生物体和/或可能是重组的多聚核苷酸。一旦处于宿主细胞内，所述遗传构建物可能会整合入宿主染色体DNA。所述遗传构建物可能被连接到载体。

术语“载体”指通常是双链DNA的多聚核苷酸分子，其被用来运输所述遗传构建物到宿主细胞。所述载体可能能在诸如E.coli的至少一种另外的宿主系统中复制。

术语“表达构建物”指包括支持转录所述插入物多聚核苷酸分子并且可选地翻译所述转录物到多肽的必需元件的遗传构建物。表达构建物典型地包含（5’到3’方向）：

a）在所述构建物将被转化入的宿主细胞内起作用的启动子，

b）待表达的多聚核苷酸，和

c）在所述构建物将被转化入的宿主细胞内起作用的终止子。

术语“编码区”或“开放阅读框”（ORF）指能在适当调控序列的控制下生产转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的正义链。所述编码序列被5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在而鉴定。当“编码序列”被插入到遗传构建物中时并且当“编码序列”被可操作地连接到启动子和终止子序列时，“编码序列”能被表达。

“可操作地连接”指，所述待表达的序列（sequenced）被置于包括启动子、组织特异性调控元件、时间调控元件、增强子、抑制子和终止子的调控元件的控制下。

术语“非编码区”指处于翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这些序列也分别以5’UTR和3’UTR指代。这些区域包括转录起始和终止以及调控翻译效率所必需的元件。

终止子是终止转录并在被翻译序列下游的基因的3’非翻译末端发现的序列。终止子是mRNA稳定性的重要决定因素并在某些情况下被发现具有空间调控功能。

术语“启动子”指位于所述编码区上游的调控基因转录的非转录顺式调控元件。启动子包含指定转录起始位点和诸如TATA框的保守框以及被转录因子结合的基序的顺式起始元件。

“转基因”是从一种生物体获取并通过转化被引入到不同生物体的多聚核苷酸。所述转基因可能衍生自相同物种或同所述转基因被引入的生物体所属的物种不同的物种。

“转基因植物”指含有作为遗传操作或转化结果的新遗传物质的植物。所述新遗传物质可能衍生自与产生转基因植物的物种相同或与之不同的植物。

“反向重复”是被重复的、其中所述重复的第二个一半是互补链的序列，例如

(5’)GATCTA……TAGATC(3’)

(5’)CTAGAT……ATCTAG(3’)

只要在所述重复区域间具有3-5碱基对的间隔区，通读转录将产生经历互补碱基配对来形成发卡结构的转录物。

术语“调控花青素生产”要包括增加和减少花青素生产。优选地，该术语指增加花青素生产。可能被调控的花青素包括但不限于cyanindin-3-葡糖苷、cyaniding-3-邻-芸香糖苷、cyanadin-3-半乳糖苷和cyanadin-3-戊糖苷。

术语“改变本发明的多聚核苷酸或多肽的表达”或“改变的本发明的多聚核苷酸或多肽的表达”要包括相应于本发明的多聚核苷酸的基因组DNA被修饰从而导致本发明的多聚核苷酸或多肽的改变的表达的情况。所述基因组DNA的修饰可能是通过遗传转化或其他的本领域已知的诱导突变的方法而进行。所述“改变的表达”能与信使RNA和/或产生的多肽的量的增加或减少有关，并可能由于多聚核苷酸或产生的多肽的序列的改变而产生多肽的改变的活性。

申请人已经鉴定了来源于苹果分别编码多肽（SEQIDNO：1到4）的多聚核苷酸序列(SEQIDNO：5到8)，这些序列是能调控植物中花青素生产的转录因子。申请人还鉴定了编码SEQIDNO：1的多肽变种（SEQIDNO：9到21）的SEQIDNO：5的多聚核苷酸变种（SEQIDNO：22到47）。所述多聚核苷酸和多肽间关系的概要可在表3（序列概要）中发现。

本发明提供了包含所述多聚核苷酸序列的遗传构建物、载体和植物。本发明也提供了包含本发明所述遗传构建物和载体的植物。

本发明提供了相对于合适的对照植物其花青素色素生产发生改变的植物。本发明提供了具有增加的和减少的花青素色素生产的植物。本发明也提供了生产所述植物的方法和选择所述植物的方法。

合适的对照植物可能包括相同物种和变种的未转化植物或用对照构建物转化的相同物种和变种的植物。

本发明组合物的用途包括具有增加的花青素着色水平的水果或其它植物部分的生产，例如，具有红色果皮和或红色果肉的苹果的生产。

本发明也提供通过选择具有增加的花青素色素的植物细胞和植物选择转化的植物细胞和植物的方法，所述增加的花青素色素指明所述植物被转化来表达本发明的多聚核苷酸或多肽。

分离或生产多聚核苷酸的方法

本发明的多聚核苷酸分子能通过使用本领域普通技术人员所知的各种技术进行分离。用例子进行说明，这样的多肽能通过使用在Mullisetal.,Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser中描述的聚合酶链反应（PCR）（将其引入本文作为参考）进行分离。如本文定义的，本发明的多肽能使用衍生自本发明的多聚核苷酸序列的引物进行扩增。

分离本发明的多聚核苷酸的进一步的方法包括具有本文创立的作为杂交探针的序列的多肽的全部或部分的使用。将标记的多聚核苷酸探针同固定在诸如硝酸纤维素滤纸或尼龙膜的固体支持介质上的多聚核苷酸进行杂交的技术能用来筛选基因组或cDNA文库。范例性的杂交和洗涤条件是：在5.0XSSC、0.5%十二烷基磺酸钠、1XDenhardt’s溶液中于65℃杂交20小时；在1.0XSSC、1%（w/v）十二烷基磺酸钠溶液中洗涤（于55℃洗涤三次，每次20分钟），和在0.5XSSC、1%（w/v）十二烷基磺酸钠溶液中于60℃可选地洗涤一次（20分钟）。可选的进一步的洗涤（20分钟）能在0.1XSSC、1%（w/v）十二烷基磺酸钠溶液中于60℃的条件下进行。

本发明的多聚核苷酸片段可能通过诸如限制性内切酶消化、寡核苷酸合成和PCR扩增等本领域著名的技术进行生产。

部分的多聚核苷酸序列可能以本领域著名的方法使用来鉴定相应的全长多聚核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法、5’RACE（FrohmanMA,1993,MethodsEnzymol.218:340-56）和基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。进一步地，用例子进行说明，使用基于已知区域的引物的反向PCR支持获得位于本文公开的多聚核苷酸序列的两端的未知序列（Trigliaetal.,1998,NucleicAcidsRes16,8186，引入本文作为参考）。所述方法使用多个限制性酶来在基因的已知区域中产生合适的片段。所述片段然后通过分子内连接进行环化并用作PCR模板。分歧引物（divergentprimers）从已知区域设计而来。为了完全地组装成全长的克隆，标准的分子生物学方法能被使用（Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987）。

当从特定物种生产转基因植物时，用衍生自该物种的序列转化这样的植物可能是有益地。所述的益处可能是改善公众对在产生转基因生物中的物种间转化的关注。此外，当基因的下调是所期望的结果时，利用同所述植物中的序列相同（或至少是高度相似的）的序列可能是必需的，对该基因而言，降低的表达是所期望的。因为这些以及其它的原因，能鉴定和分离在多个不同植物物种中的特定基因的直系同源物是可期望的。变种（包括直系同源物）可能通过所描述的方法进行鉴定。

鉴定变种的方法

物理方法

变种多肽可能通过使用基于PCR的方法进行鉴定（Mullisetal.,Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser）。典型地，用来通过PCR扩增本发明的多聚核苷酸分子变种的引物的多聚核苷酸序列可能基于编码相应的氨基酸序列的保守区域的序列。

可选地，本领域技术人员所熟知的库筛选方法可能被使用（Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987）。当鉴定所述探针序列的变种时，相对于当精确无误的序列匹配被寻找时所需的条件，其杂交和/或洗涤的严格条件将典型地被降低。

多肽变种也可能通过物理方法进行鉴定，例如，通过使用抗本发明的多肽的抗体筛选表达文库（Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987）或在这样的抗体的帮助下将多肽从天然来源中鉴定出。

基于计算机的方法

包括多聚核苷酸和多肽变种的本发明的变种序列也可能通过本领域技术人员所熟知的基于计算机的方法通过使用公众域序列比对算法和序列相似性搜索工具来搜索序列数据库（公众域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它）而进行鉴定。参见例如，NucleicAcidsRes.29:1-10and11-16,2001中在线资源的例子。相似性搜索检索和比对针对同待分析序列相比较的序列（即查询序列）。序列比较算法使用打分矩阵来为每一条比对序列赋予总体的分数。

用于鉴定序列数据库中变种的范例性的程序族是包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX的BLAST程序套件（版本2.2.5[2002年11月]），公众可从（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）或从美国马里兰州贝塞斯达市38A栋8N805房间的国家医学图书馆国家生物技术信息中心（NCBI）获取。NCBI服务器也提供使用所述程序来筛选大量公众可得的序列数据库的工具。BLASTN比较核苷酸查询序列和核苷酸序列数据库。BLASTP比较氨基酸查询序列和蛋白序列数据库。BLASTX比较在所有阅读框中被翻译的核苷酸查询序列和蛋白序列数据库。tBLASTN比较蛋白查询序列和在所有阅读框中动态翻译的核苷酸序列数据库。tBLASTX比较核苷酸查询序列的六读码框翻译和核苷酸序列数据库的六读码框翻译。所述BLAST程序可能以默认参数使用或所述参数可能按改进筛选所需而改变。

包括BLASTN、BLASTP和BLASTX的BLAST算法族的使用在出版物Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997中进行了描述。

被BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法产生的被被查询序列产生的对一个或多个数据库序列的“击中序列数”（hits）比对和鉴定了序列的相似部分。击中序列数以相似性的程度和序列重叠的长度的顺序排列。对数据库序列的击中序列数通常代表了仅是被查询序列的序列长度的部分的重叠。

BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX算法也为比对产生“期望”（Expect）值。期望值（E）表明当搜索含有随机连续序列的相同大小的数据库时人们能“期望”随机看到的击中的数目。期望值用作决定所述对数据库的击中是否表明真的相似性的显著性阈值。例如，指定到多聚核苷酸击中数的0.1的E值被解释为意味着，在被筛选的数据库大小的数据库中，人们可能期望看到具有简单随机地相似分值的序列的被比对部分的0.1匹配。对于被比对和匹配部分具有0.01或更低的E值的序列，通过使用所述BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在那个数据库中发现随机匹配的可能性是1%或更低。

一组相关序列的多序列比对能用CLUSTALW(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.andGibson,T.J.(1994)CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsResearch,22:4673-4680,http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html）或T-COFFEE（CedricNotredame,DesmondG.Higgins,JaapHeringa,T-Coffee:Anovelmethodforfastandaccuratemultiplesequencealignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217））或PILEUP进行，这些算法使用渐进（progressive）配对比对。（FengandDoolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351）。

模式识别软件应用可用于发现基序或标记序列。例如，MEME（用于基序引出的多重Em，MultipleEmforMotifElicitation）在一组序列中发现基序标记序列，和MAST（基序比对和搜索工具，MotifAlignmentandSearchTool）使用这些基序来鉴定查询序列中的相似或相同基序。MAST结果以具有适当统计数据和发现的基序的可视概观的系列比对的形式提供。MEME和MAST在圣地亚哥的加利福尼亚大学开发。

PROSITE（BairochandBucher,1994,NucleicAcidsRes.22,3583;Hofmannetal.,1999,NucleicAcidsRes.27,215）是鉴定从基因组或cDNA翻译而来的未鉴定蛋白的功能的方法。PROSITE数据库（www.expasy.org/prosite）含有生物学上重要的模式和轮廓并被设计以便它能同适当的计算机工具共同使用来指定新的序列到已知的蛋白家族或来测定已知的结构域在所述序列中存在（Falquetetal.,2002,NucleicAcidsRes.30,235）。Prosearch是能用给定序列模式或标记搜索SWISS-PROT和EMBL数据库的工具。

因为编码能调控植物中色素生产的转录因子的本发明的变种多聚核苷酸的功能，转录因子能被检测调控已知花青素生物合成基因的表达（例如实施例4）的这个能力或能被检测它们的调控色素生产的能力（例如实施例5和6）。

分离多肽的方法

包括变种多肽的本发明的多肽可能通过使用本领域著名的肽合成方法进行制备，例如使用固相合成技术的定向肽合成（例如Stewartetal.,1969,inSolid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,加利福尼亚圣弗朗西斯科）或自动化合成，例如使用应用生物系统431A肽合成仪(加利福尼亚，福斯特市)。所述多肽的突变形式也可能在这样的合成过程中生产。

本发明的多肽和变种多肽也可能通过使用本领域著名的各种技术从天然来源中纯化而来（例如，Deutscher,1990,Ed,MethodsinEnzymology，Vol.182,GuidetoProteinPurification,）。

可选地，本发明的多肽和变种多肽可能在合适的宿主细胞中重组表达并按下面讨论的方法从所述细胞中分离而来。

生产构建物和载体的方法

本发明的遗传构建物包含一条或多条本发明的多聚核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多聚核苷酸，并可能是对转化有用的，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。本发明的遗传构建物要包括如本文定义的表达构建物。

生产和使用遗传构建物和载体的方法在本领域中是公知的并通常在Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishing,1987）中进行了描述。

生产包含多聚核苷酸、构建物或载体的宿主细胞的方法

本发明提供了包含本发明的遗传构建物或载体的宿主细胞。宿主细胞可能衍生自，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。

包含本发明的诸如表达构建物的遗传构建物的宿主细胞在本领域著名的方法中对重组生产本发明的多肽的是有用的（例如，Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishing,1987）。这样的方法可能涉及在适当的培养基中在适于或有助于本发明的多肽的表达的条件下培养宿主细胞。可能会可选地分泌到培养物中的表达的重组多肽可能然后被从培养基、宿主细胞或培养物培养基中用本领域著名的方法分离（例如，Deutscher,Ed,1990,MethodsinEnzymology，Vol182,GuidetoProteinPurification）。

生产包含构建物和载体的植物细胞和植物的方法

本发明进一步提供包含本发明的遗传构建物的植物细胞和被修饰来改变本发明的多聚核苷酸或多肽的表达的植物细胞。包含这样的细胞的植物也形成了本发明的一个方面。

在色素生产上发生改变的植物的生产可能通过本发明的方法而获得。这样的方法可能涉及用被设计来改变能调控在这样的植物细胞和植物中的色素生产的的多聚核苷酸或多肽的表达的本发明的构建物来转化植物细胞和植物。这样的方法也包括用本发明的构建物和一个或多个其它的设计来改变一个或更多个多肽或能调控在这样的植物细胞和植物中的色素生产的多肽的表达的构建物的组合来转化植物细胞和植物。

用多肽转化植物细胞、植物和其部分的方法在下述文献中进行了描述：Draperetal.,1988,PlantGeneticTransformationandGeneExpression.ALaboratoryManualBlackwellSci.Pub.Oxford,p.365;PotrykusandSpangenburg,1995,GeneTransfertoPlants.Springer-Verlag,Berlin.;和Gelvinetal.,1993,PlantMolecularBiol.Manual.KluwerAcad.Pub.Dordrecht。包括转化技术的转基因植物的综述在GalunandBreiman,1997,TransgenicPlants.ImperialCollegePress,London中提供。

植物遗传操作的方法

大量植物转化策略是可获得的（例如，Birch,1997,AnnRevPlantPhysPlantMolBiol,48,297）。例如，在多聚核苷酸/多肽被正常表达时，策略可能被设计来增加多聚核苷酸/多肽在植物细胞、器官中和/或在特定发育阶段的表达，或在多聚核苷酸/多肽不能正常被表达时，策略被设计来在细胞、组织、器官中和/或特定发育阶段异常表达多聚核苷酸/多肽。表达的多聚核苷酸/多肽可能衍生自将被转化的植物物种或可能衍生自不同的植物物种。

转化策略可能被设计来降低多聚核苷酸/多肽在被正常表达时在植物细胞、组织、器官或在特定发育阶段的表达。这样的策略称为基因沉默策略。

在转基因植物中用于基因表达的遗传构建物典型地包括驱动一条或更多条克隆的多聚核苷酸表达的启动子、终止子和检测（detest）遗传构建物在被转化植物中存在的选择性标记序列。

适用于本发明构建物的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中是有作用的并包括细胞-、组织-和器官-特异的启动子、细胞周期特异的启动子、时间启动子、诱导型启动子、在大多数植物组织中有活性的组成型启动子和重组启动子。启动子的选择将依赖于所期望的克隆的多聚核苷酸在时间和空间上的表达。所述启动子可能是那些同目标转基因正常相关的启动子，或衍生自其它植物、病毒和植物病原性细菌和真菌的基因的启动子。在没有不恰当的实验下，本领域的技术人员将能通过使用包含本发明的多聚核苷酸序列的遗传构建物选择适用于修饰和调控植物特性的启动子。组成型植物启动子的例子包括CaMV35S启动子、胆脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子和来自于玉米的Ubi1启动子。在特定组织中有效并应对内部发育信号或外部无生命或有生命的应激的植物启动子在科学文献中进行了描述。范例性的启动子被进行了描述，例如在WO02/00894中，将其引入本文作为参考。

在植物转化遗传构建物中普遍使用的范例性的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒（CaMV）35S终止子、根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）胭脂碱合成酶或章鱼肉碱合成酶终止子、玉米（Zeamays）醇溶蛋白基因终止子、水稻（Oryzasativa）ADP葡糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯（Solanumtuberosum）PI-II终止子。

在植物转化中普遍使用的选择性标记包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（phophotransferase）II基因（NPTII）、赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite（AgrEvo）和Basta（Hoechst）抗性的phosphinothricin乙酰基转移酶（bar基因）和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）。

包含可能用于植物和植物组织中启动子表达分析的报告基因（表达对于宿主而言是外来的、通常是酶活性和/或可视信号（例如荧光素酶、GUS、GFP）的活性的编码序列）的遗传构建物的使用也是被考虑的。报告基因的文献在Herrera-Estrellaetal.,1993,Nature303,209，和Schrott,1995,In:GeneTransfertoPlants(Potrykus,T.,Spangenberg.Eds)SpringerVerlag.Berline,pp.325-336中进行了综述。

基因沉默策略可能会聚焦于所述基因本身或影响被编码的多肽的表达的调控元件。“调控元件”在本文中以其最广泛可能的意思使用并包括同目标基因相互作用的其它基因。

设计来降低或沉默本发明的多聚核苷酸/多肽的表达的遗传构建物可能包括本发明多聚核苷酸的反义拷贝。在这样的构建物中，所述多聚核苷酸被以与启动子和终止子相关的反义方向进行放置。

“反义”多聚核苷酸通过逆变所述多聚核苷酸的多聚核苷酸或片段以使产生的转录物将对所述基因的mRNA转录物互补而获得，例如，

5′GATCTA3′(编码链)3′CTAGAT5′(反义链)

3′CUAGAU5′mRNA5′GAUCUCG3′反义RNA

为基因沉默设计的遗传构建物可能也包括反向重复序列。‘反向重复序列’是所述重复序列的第二个一半是在互补链内重复的序列，例如，

5′-GATCTA……TAGATC-3′

3′-CTAGAT……ATCTAG-5′

形成的转录物可能经历互补碱基配对来形成发卡结构。通常在所述重复区域间的至少3-5碱基对的间隔区是允许发卡形成所必需的。

另一种沉默方法涉及靶向miRNA的转录等价物的小反义RNA的使用（Llaveetal.,2002,Science297,2053）。这样的相应于本发明的多聚核苷酸的小反义RNA的使用是特别考虑的。

如本文中所用，术语遗传构建物也包括小反义RNA和其它影响基因沉默的这样的多肽。

如本文定义的，用表达构建物进行的转化可能也通过名为正义抑制的过程产生基因沉默（例如，Napolietal.,1990,PlantCell2,279;deCarvalhoNiebeletal.,1995,PlantCell,7,347）。在某些情况下，正义抑制可能涉及全部或部分编码序列的过表达但也可能涉及所述基因的诸如内含子或5’或3’非翻译区（UTR）的非编码区的表达。嵌合的部分正义构建物能用来协调沉默多个基因（Abbottetal.,2002,PlantPhysiol.128(3):844-53;Jonesetal.,1998,Planta204:499-505）。这样的用来沉默本发明的多聚核苷酸的表达的正义抑制的使用也是被考虑的。

遗传构建物中为基因沉默设计的多聚核苷酸插入物可能对应于诸如启动子和/或内含子和/或5’或3’UTR序列或相应基因的编码序列和/或非编码序列。

其它的基因沉默策略包括显性负向途径和核酶构建物的使用（McIntyre,1996,TransgenicRes,5,257）。

转录前沉默可能通过所述基因本身或它的调控元件的突变而带来。这样的突变可能包括点突变、移码、插入、删除和替换。

下述文献是披露能用来遗传转化下述植物物种的遗传转化方案的代表性出版物：水稻(Alametal.,1999,PlantCellRep.18,572)、苹果(Yaoetal.,1995,PlantCellReports14,407-412)、玉米(美国专利序列号Nos.5,177,010和5,981,840)、小麦(Ortizetal.,1996,PlantCellRep.15,1996,877)、番茄(美国专利序列号No.5,159,135)、马铃薯(Kumaretal.,1996PlantJ.9,:821)、木薯(Lietal.,1996Nat.Biotechnology14,736)、莴苣(Michelmoreetal.,1987,PlantCellRep.6,439)、烟草(Horschetal.,1985,Science227,1229)、棉花(美国专利序列号Nos.5,846,797和5,004,863)、草(美国专利Nos.5,187,073和6,020,539)、薄荷(Niuetal.,1998,PlantCellRep.17,165)、柑橘植物(Penaetal.,1995,PlantSci.104,183);葛缕子(Krensetal.,1997,PlantCellRep,17,39)、香蕉(美国专利序列号No.5,792,935)、大豆(美国专利Nos.5,416,011、5,569,834、5,824,877、5,563,04455和5,968,830)、菠萝(美国专利序列号No.5,952,543)、白杨(美国专利No.4,795,855)、普通单子叶植物(美国专利Nos.5,591,616和6,037,522)、芸苔(美国专利Nos.5,188,958、5,463,174和5,750,871)、谷物(美国专利No.6,074,877)、梨(Matsudaetal.,2005)、李子(Rameshetal.,2006、SongandSink2005、GonzalezPadillaetal.,2003)、草莓(Oosumietal.,2006、Foltaetal.,2006)、玫瑰(Lietal.,2003)和悬钩子(Grahametal.,1995)。其它物种的转化也被本发明所考虑。合适的方法和方案在科学文献中可以获得。

本领域已知的多个进一步的方法可能被用来改变本发明的核苷酸和/或多聚核苷酸的表达。这样的方法包括但不限于Tilling（Tilletal.,2003,MethodsMolBiol,2%,205）、所谓的“Deletagene”技术（Lietal.,2001,PlantJournal27(3),235）和诸如合成的锌指转录因子的人工转录因子的使用（例如，Jouvenotetal.,2003,GeneTherapy10,513）。此外，靶向特定多肽的抗体或其片段也可能在植物中表达来调控该多肽的活性（Joblingetal.,2003,Nat.Biotechnol,21(1),35）。转座子标签途径也可能被应用。此外，同本发明的多肽相互作用的多肽可能通过诸如相位展示的技术（DyaxCorporation）进行鉴定。这样的相互作用的多肽可能在植物中表达或应用到植物来影响本发明的多肽的活性。上述改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达的每一种方法的使用都是被特别考虑的。

选择植物的方法

也提供了选择具有改变的色素生产的植物的方法。这样的方法涉及检测植物中的本发明的多聚核苷酸或多肽的改变的表达。为了提高花青素含量，这样的方法可能在改变的色素生产可能不必是可视的幼龄或早期发育阶段来应用来加快培育程序。

诸如信使RNA的多聚核苷酸的表达被经常用作相应多肽表达的指示物。测定多聚核苷酸的表达的范例性的方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和斑点印记分析(Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。因此，如本文定义的，本发明的多聚核苷酸或其部分在鉴定具有改变水平的花青素的植物的方法中是有用的探针或引物。本发明的多肽可能在设计来鉴定这样的植物的杂交实验中用作探针或在基于PCR的实验中用作引物。

可选地，抗体可能被产生来抵抗本发明的多肽。产生和使用抗体的方法在本领域是标准的方法（参见例如：Antibodies,ALaboratoryManual,HarlowALane,Eds,ColdSpringHarbourLaboratory，1998）。这样的抗体可能被用在检测调控植物花朵大小的多肽的改变的表达的方法中。这样的方法可能包括ELISA（Kemeny，1991,APracticalGuidetoELISA,NYPergamonPress）和Western分析（Towbin&Gordon,1994,JImmunolMethods,72,313）。

这些分析多聚核苷酸或多肽表达和选择具有改变的表达的植物的方法在设计来生产具有改变的色素生产的变种的传统的培育程序中是有用的。

植物

本发明的植物可能被栽培并且被自交或同不同的植物植株进行杂交并且产生的具有期望的表型特征的杂交体可能被鉴定。二或更多代植物可能被栽培来确保目标表型特征是稳定保持和遗传的。从这样的标准培育方法产生的植物也形成本发明的一个方面。

现在，本发明将参考下述非限制性实施例进行解释。

实施例1：用于编码调控色素生产的转录因子的多聚核苷酸的分离的恰当苹果组织和发育阶段的鉴定

材料和方法

实时(qPCR）表达分析

苹果在2003-2004年从春季（十月）经过夏季到（三月）的苹果季的6个时间点从HortResearch果园的苹果树上（新西兰纳尔逊）进行收集：十月（盛花期后7天，DAFB）、十一月（40DAFB）、十二月（67DAFB）、一月（102DAFB）、二月（130DAFB）和三月（146DAFB）。RNA被从所述果实（分别从相同的果树而来的6个果实、皮和皮层）和2个基因型的叶片分离而来（改自Changetal.,1993的方法）；白色果肉的商品化的家苹果品种变种Sciros（太平洋玫瑰（PacificRose）^TM，衍生自噶拉和华丽苹果间的杂交）和红色果肉的家苹果品种变种红地，品种‘红地’的自花授粉幼苗（‘狼河’（WolfRiver）和家苹果变种Niedzwetzkyana的杂交）（BrooksandOlmo,1972）。对于第一个发育水果时间点，十月（7DAFB），从皮层成功地切除果皮是不可能的并且来源于这个样品的数据已经被排除。在第一链cDNA合成（每一个样品重复三次然后三次的结果被混合）前用DNase处理，然后按照厂商说明书使用寡dT进行合成（Transcriptor,RocheAppliedScience）。编码苹果花青素路径酶和调控因子的基因通过在HortResearchEST数据库的同源性鉴定，并且，在可能的异型体的情况下，选择按照表达轮廓和文库组织进行制备。相应于这些基因的基因特定引物使用VectorNTI版本9.0.0（www.invitrogen.com）按照一套严格的标准进行设计，从而使通用反应条件的应用成为可能。为了检查反应的特异性，RT-PCR被按照厂商说明书进行使用（PlatinumTaq,Invitrogen）。每一对引物的序列和相关的登入号在下面的表1中补充显示。

表1

DNA扩增和分析使用LightCycler系统（RocheLightCycler1.5）进行。所有的

反应均按照厂商方法用LightCyclerFastStartSYBRGreenMasterMix（RocheAppliedScience）进行。反应通过使用2μl5xMasterMix、0.5μM的每种引物、1μl稀释的cDNA和无核酶的水（RocheAppliedScience）并使终体积为10μl进行，同时进行三份反应。在每一个反应中均包括阴性水对照。下述热循环被用于所有的qPCR反应：95℃预孵育5分钟，然后95℃（5秒）、60℃（5秒）和72℃（10秒）进行40个循环。在每一个退火步骤的末期测量荧光。扩增后，用在65℃到95℃熔解时获取的连续荧光数据进行熔解曲线分析。用LightCycler软件版本4分析原始数据并且表达用具有标称值1的作为校准的太平洋玫瑰苹果叶片样品来标准化到家苹果肌动蛋白（MdActin，登入号CN938023）。对于每一个基因，标准曲线用cDNA系列稀释产生并且产生的PCR效率计算结果（位于1.839到1.945间）被输入到相对表达数据分析中。

结果

生物合成酶的qPCR表达分析

为了鉴定水果发育中花青素合成的转录调控是最大的阶段，主要的生物合成基因的表达分析被进行。在太平洋玫瑰苹果和红地苹果间的编码花青素生物合成基因的转录物水平的比较显示了惊人的不同。在实验的代表所述路径中大多数酶步骤的所有基因中，与在太平洋玫瑰苹果中发现的转录水平相比，红地苹果的转录水平在水果发育的所有阶段均显示了显著的提高（图3）。

具有指明最高的转录物水平是在一月的时间点的一般模式的红地苹果生物合成基因的转录物丰度在果皮和皮层的整个水果发育阶段均被增强。这个格局模拟了在组织取样时被观测到的在发育早期（40DAFB）及然后再一次在仲夏（102DAFB）被观测到的具有最强烈着色的的着色程度，该水平然后被保持到夏末水果成熟时（图3b）。在水果发育过程中通常具有下降的表达的太平洋玫瑰苹果皮层组织中，所有花青素生物合成基因的均具有相对低的转录物水平。中等的活性在果皮中观察到，具有同水果成熟过程中的增强的着色水平并发的在发育中途的在102DAFB处的表达峰。在两种变种的叶片中的表达水平是明显的但相对的低且红地苹果和太平洋玫瑰苹果间的区别不明显。

花青素生物合成酶转录物水平的qPCR分析结果被分析来测定相关的MYB转录因子分离的最适组织/时间点。我们选择显示了最高的花青素生物合成基因表达水平的来源于红地苹果皮层的组织。

实施例2：编码潜在调控苹果中色素生产的转录因子的多聚核苷酸的分离

PCR通过使用来源于红地（一月时间点）皮层样品的cDNA和在基于各种物种的花青素调控因子的序列的R2R3结合区域设计的简并引物（具有32倍的简并性）进行。各种编码R2R3MYB区域的cDNAs被获得。来源于测序数据的结果揭示，通过使用5’RACE（GeneRacer，Invitrogen）具有同花青素调控因子和全长序列的高度同一性的一种cDNA被获得。MdMYB10cDNA的完整序列由重叠片段编译而来。为了比较来源于红地苹果的转录物，全长的cDNAs随后被从家苹果变种太平洋玫瑰苹果和史密斯祖母（GrannySmith）苹果分离而来。MdMYB11（亚组11MYB）（DQ074463）（根据Strackeetal.2001）也用相同的过程进行分离和测序。其它的候选转录因子从HortResearchEST标本分离而来：拟南芥TT2的苹果同族体MdMYB9（Nesietal.,2001,AJ299452）和具有同已知花青素调控因子很少序列同源性的苹果MYBMdMYB8。

先前在其它物种中的研究已经表明，亚组10MYB可能是着色的关键决定因素。在公众可得的苹果EST数据库中（在2005年8月时具有185,000种核苷酸序列），经过序列同源性比较，没有显示出同拟南芥PAP1和来源于其它物种的亚组10MYB高度同源性的MYBTF被发现。

在PCR后克隆的cDNAs的重叠序列比对显示，最好的候选者MdMYB10同其它MYBTFs在R2R3区域并且具体地，同来源于其它物种的花青素调控因子分享了高度的同源性（图1）。MdMYB10同拟南芥亚组10MYB、PAP1紧密相关，它们在R2R3结合区域具有77%的氨基酸同一性并整体具有58%的氨基酸同一性。对于拟南芥PAP2，这些氨基酸同一性百分比分别为75%和57%，同时对于其它物种，整体的同一性数字如下：牵牛花AN260%，番茄ANT157%，玉米C158%和玉米P26%。

所有这些MYBTFs均具有同bHLHs特定相互作用的氨基酸残基（Grotewoldetal.,2000）。因此，这些共同因子的候选者均选自HortResearchEST数据库。在具有组成型bHLH型TF的巨大系统发育家族中，似乎被涉及到类黄酮生物合成调控中的命名为IIIf的更小的进化枝（Heimetal，2003）是存在的。在这个进化枝内，两个来源于HortResearchEST数据库的苹果TFs集成簇（数据未显示）。这些均被全长测序并给予识别符MdbHLH3（CN934367）（拟南芥TT8基因的假定同源物）和MdbHLH33（Delila的假定同源物）（来源于金鱼草，Goodrichetal.,1992）。

种系发生

苹果EST序列用载体、接口和低质量序列区域修饰并被上传到VectorNTI版本9.0.0（www.invitrogen.com）。EST聚簇相（ESTclusteringphase）通过使用VectorNTIAlignX程序进行。比对然后以MSF格式文档被输出到GeneDoc版本2.6.002（http://www.psc.edu/biomed/genedoc/）中。通过在CLUSTALX（v1.81）中使用默认设置重新排列输出的文档，进化树被产生（Thompsonetal，1997）。使用PHYLIP软件包进行种系发生分析（Felsenstein,1993）。TreeView（v.1.6.5）被用来展示产生的进化树（Page，1996）或通过使用MEGA版本2.1产生环状进化树（circulartrees）（Kumaretal，2001）。

实施例3：MdMyb10变种的鉴定

从全部为蔷薇科物种的家苹果、野苹果（Ms，欧洲山楂果）、西洋梨（Pc，梨）、沙梨（Ppy梨，Nashi）、白梨（Pb，梨，鸭梨）、榅桲（Co，榅桲）、中国李（Ps，日本李，洋李）、红叶李（Pcf，樱桃李）、碧桃（Ppr，桃）、枇杷（Ei，枇杷）、扁桃（Pd，杏）、欧洲甜樱桃（Pav，甜樱桃）、西洋木瓜（Mg，欧楂）、欧洲李（Pdm，普通李）、复盆子（Ri，红树莓）、山杏（par，杏）和乌荆子李（Pi，西洋李子）中收集组织。

使用DNeasyPlantMini试剂盒（QIAGEN，目录号69104）按照厂商指导从每一种物种的叶片抽提基因组DNA（gDNA），砂梨（Ppy梨，Nashi）和白梨（Pb，梨，鸭梨）除外，它们的基因组DNA从水果果皮中分离。

使用在下面的表2中显示的引物的组合进行对来源于上述物种的gDNA的PCR（通过标准技术）。

表2

通过标准程序进行基因组PCR产物的测序。

从经测序的基因组DNA，内含子和外显子可通过用MdMYB10EST数据、已知的内含子/外显子边界和开放阅读框的比较的已知方法进行预测。从这些推论的cDNAs，翻译的蛋白质被产生。经鉴定的变种gDNA、预测的cDNA和预测的多肽序列的概要被包括在表X中。MdMyb10的多肽变种以SEQIDNO：9-21列在序列表中。MdMyb10的多聚核苷酸变种以SEQIDNO：22-47列在序列表中。SEQIDNO：102是MdMyb10基因组序列。

变种多肽序列（以及MdMyb10和用作参考的AtPAP1）通过使用ClustalW算法的VectorNTI版本9.0进行比对（Thompsonetal.,1994）。结果在图8中显示。

比对的多肽序列间的序列同一性百分比也通过使用VectorNTI版本9.0进行计算（2003年9月2日(c)1994-2003InforMax，现在已经许可给Invitrogen）。结果在图9中显示。

这些数据显示，申请人已经从蔷薇科物种中鉴定了不同组的MdMyb10变种。蔷薇科序列分享了显著程度的序列保守性，并且，每一种蔷薇科序列与其它蔷薇科序列的相似性比它与AtPAP1的相似性更高。

实施例4：在植物中通过本发明的转录因子多聚核苷酸的表达激活色素启动子

双重荧光素酶实验

启动子序列被插入到pGreen0800-LUC（Hellensetal，2005）的克隆位点并被修饰来在所述序列的3’端引入NcoI位点，这将使所述启动子以同萤火虫荧光素酶基因（LUC）转录融合的形式被克隆。这样，结合所述启动子并增加转录速率的TFs能通过发光活性的增加进行鉴定。拟南芥CHS（TT4）（AT5g13930）和拟南芥DFR（TT3）（AT5g42800）被从基因组DNA中分离。在同一构建物中，来源于海肾（REN）且处于35S启动子控制下的荧光素酶基因提供了短暂表达程度的估计。活性以LUC比REN活性比率的形式表达，因此，在TF（+/-bHLH）和所述启动子间的相互作用发生时，相对于REN的LUC活性的显著增加将被观测到。

烟草在温室条件下使用日光长度为16小时的自然光进行培育，直到至少6片叶片（长度为2-3cm）可用于用农杆菌进行的浸润。在实验的过程中，所述植物均维持在温室中。农杆菌菌株GV3101(MP90)在补充了选择抗生素的Lennox琼脂（Invitrogen）上培养并在28℃孵育。10μl环（loop）的汇合细菌重悬于10ml浸润培养基（10mMMgCl₂、0.5μM乙酰丁香酮）中并使OD₆₀₀为0.2，并于浸润前在没有摇动的情况下在室温下孵育2小时。浸润按照Voinnetetal（2003）的方法进行。大约150μl的这种农杆菌混合物在六个点浸润入烟草的幼叶并且在接种后3天进行短暂表达的实验。

在pGreenII0800-LUC中的启动子-LUC融合物(CHS和DFR)被用在短暂转化中，通过将100μl用报道基因表达框转化的农杆菌同两种其它的用包含在pART27（Gleave，1992）或pGreenII62-SK（Hellensetal.，2000）二元载体中的融合到35S启动子的MYBTF基因和bHLHTF基因的表达框转化的农杆菌菌株（每种450μl）混合可实现上述步骤。

萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶使用双重荧光素酶实验试剂（Promega，美国麦迪逊）进行实验。接种后三天，2cm叶片盘（来源于每种植物的6个技术重复）被移除并在500μl被动裂解缓冲液（PLB）中磨碎。10μl该粗提物的1/100稀释物在40μl的荧光素酶实验缓冲液中进行实验，并且化学发光被测量。40μl终止（Stop）和发光^TM（Glow^TM）缓冲液然后被加入并且第二化学发光测量被进行。绝对的相对发光单位（RLU）在Turner20/20发光计上用5s延迟和15s测量进行测量。

双重荧光素酶实验

所述双重荧光素酶系统已经被证明能提供短暂基因表达分析的快速方法（Hellensetal.，2005）。它不需要选择性标记并且结果能用简单的酶学实验进行定量。在本研究中，当用假定结合所述启动子的TFs攻击时，所述系统被用来定量花青素生物合成基因的启动子的活性。我们在所述双重荧光素酶短暂实验中使用烟草来检测我们的候选TFs同已知被拟南芥PAP1和PAP2MYBTFs调控的两个拟南芥花青素生物合成基因启动子AtCHS（TT4，AT5g13930）和AtDFR（TT3，AT5g42800）间的相互作用（Tohgeetal.,2005,Zimmermannetal.,2004）。多个苹果MYBTFs被选来探测MdMYB10的特异性：MdMYB9、MdMYB11、MdMYB8和来源于拟南芥的AtPAP1。这些MYBs属于分别代表亚型10、9、11和7的进化枝（图2）。为了详细研究MYB和bHLHTFs间的相互作用，共转化用来源于苹果的bHLH类假定的调控因子；MdbHLH3和MdbHLH33和来源于拟南芥的bHLH，TT8（AtbHLH042；At4g09820）进行。

来源于基于CHS启动子的短暂分析的结果显示，拟南芥PAP1MYB的活性在用苹果bHLH进行的共转化中最大，但未料到的是，它不被用拟南芥TT8bHLH进行的共转化所影响。在对照中，MdMYB10的结果表明，可能独立于bHLH的仅具有MYB的活性具有最大的观察到的活性(图5)。MdMYB10同拟南芥bHLH的共转化似乎抑制活性。当同序列相似性同TT2-样基因相符的苹果bHLH合用时，MdMYB9也显示增强的活性。剩余MYBs的显著活性未被观察到并且这个活性程度被推测代表了基底水平的活性。

当MdMYB10（和AtPAP1）被同苹果bHLH共转化时，来源于DFR启动子实验的结果显示了标明显著活性增加的不同模式。在MdMYB10的情况下，当用MdbHLH3浸润时，最高的活性被观察到。与之相比较，AtPAP1当用苹果Delila同源物、MdbHLH33浸润时其活性是最高的。这些结果反映了在短暂原生质体转染系统中的先前的结果，其中在拟南芥DFR启动子：Gus中融合仅在存在bHLH时被PAP1激活（Zimmermannetal.,2004），尽管应该注意，当AtPAP1被用AtTT8浸润时我们没有看到这样的巨大的活性增加。MdMYB9以相似但简化的方式进行，同时MbMYB11和MdMYB8的LUC比REN比率低于所有的条件。

当基因组樱桃梅MYB10（PcfMYB10）被克隆入pGREEN质粒载体并按上述方法进行实验时，DFR启动子的激活产生。当PcfMYB10被用MdbLHL3和MdbHLH33进行浸润时，最高的活性被显示（图10）。这个数据显示，来源于桃亚科或李亚科的MYB10序列也以同MdMYB10（蔷薇科的苹果亚科的）相似的机理在驱动花青素基因活性上起作用。

实施例5：植物中色素生物合成被本发明转录因子表达的激活

颜色实验

烟草变种Samsun在温室中于22℃使用日光长度为16小时的自然光进行培育，直至至少3片叶片（长度为10-15cm）能用于农杆菌的浸润。植物在实验的过程中均处于温室中。农杆菌培养物按双重荧光素酶实验的方法进行孵育并且含有在pART27二元载体中的MYBTF基因和融合到35S启动子的bHLHTF基因的分离菌株被混合（每种500μl）并按照用烟草进行实验的方法浸润到下部叶片表面。六个分离浸润被进行到烟草叶片中（每组处理两株植物）并且颜色变化使用MinoltaCR-300比色计（校正到D65光）和L^*a^*b系统（CIE，1986）每日测量。包含MdMYB10和苹果bHLH的浸润在四天后产生可见的着色。着色水平在整个实验过程中均增加；数码照片和显微图像在浸润后八天获取。当烟草用在平行实验中时，花青素着色没有发展（数据未显示）。

HPLC

烟草叶片盘沿浸润位点切下、冷冻干燥并在5ml甲醇和0.1%HCL中重悬前粗糙磨碎、在室温下抽提2小时并在3500rpm下离心。1ml等份在LabconcoCentrivap浓缩器中干燥到彻底。样品重悬在20%甲醇中（250μl）。花青素在250x4.6mm、Synergi、4m粒度、Polar-RP、孔径、醚联苯柱（Phenomenex，新西兰奥克兰）上通过HPLC进行鉴定。这同具有柱加热炉、自动上样器、真空溶剂脱气器和二极管阵列检测器的Shimadzu分析型HPLC相符。溶剂是（A）乙腈+0.1%甲酸和（B）比例为5∶92∶3的乙腈/水/甲酸。流速是1.5ml/min并柱温为45℃。溶剂A的含量在0时是0%并在第17分钟线性增加到17%、在第20分钟增加到20%、在第26分钟增加到30%、在第28.5分钟增加到50%、在第32-35分钟间增加到95%并在第36-42分钟间变回到0%。反应产物的定量是，在520nm对花青素定量，在280nm对其他酚类化合物定量。波谱在从240到600nm的范围内以4nm的间隔记录。样品注射体积为40μl。

颜色实验

我们已经建立了经由农杆菌浸润来揭示烟草中花青素色素积累的简单方法。在被浸润的烟草叶片中的着色积累被可视检查。当用苹果bHLH共浸润时，对于MdMYB10而言，着色在浸润点在早至浸润后4天的时间即是明显的（图6A）。着色程度随实验周期而增加（长达十天）。在包含AtPAP1和苹果bHLH（MdbHLH3或MdbHLH33）、AtPAP1和AtTT8的浸润的处理中，着色也能被观察到但水平降低，并且，当单用MdMYB10浸润时，着色程度更低。在其他组合中没有着色是可见的。结果证明本实验的效率能作为研究着色过程的调控的有用的报告系统。

通过用Minolta比色计和使用L^*a^*b系统来定量颜色并确认从绿到红的视觉变化。数据以a^*/b^*的比率显示（图6A），其中从负值朝向正值的变化标明从绿色到红色的变化。在给定处理组的重复间存在像以误差条深度表示的明显可变性一样的着色程度的可变性（图6A）。

为了证实花青素化合物的细胞积累，显微图像从浸润后1周的表皮获取（图6B）。这例证了用候选基因进行的单个细胞的转化和液泡内花青素色素的积累的激活。

HPLC数据的分析

为了确认在选择的MYBs的烟草短暂表达过程中合成的花青素的鉴定，样品被抽提并且可溶的花青素被用HPLC分析。结果表明，当MdMYB10和MdbHLH3在烟草叶片中被共同过表达时，代表花青苷-3-葡糖苷和花青苷-3-邻-芸香苷的两个主要峰被观察到（图7）。这些化合物鉴定通过LC-MS确认（数据未显示）。在用空载体对照转化的烟草叶片的抽提物中没有可观察到的花青素的峰被发现（数据未显示）。为了比较这个化合物和在苹果和烟草中自然发生的化合物，来源于烟草花瓣和苹果果皮（太平洋玫瑰苹果，成熟果实）的花青素也被抽提，但如前面描述的，结果确证花青苷-3-半乳糖苷在苹果果皮中占优（数据未显示）（Tsouetal.2003）。花青苷-3-葡糖苷和矮牵牛素-3-半乳糖苷在烟草花瓣中观察到（图7）。矮牵牛素-3-半乳糖苷在烟草叶片中被MdMYB10和MdbHLH3的作用产生的轮廓中未被看到（图7）。

转录因子的qPCR表达分析

关于生物合成基因转录物的丰度、积累模式的知识提供了关于执行分离假定的转录调控因子的简并PCR的最恰当组织的信息。在这个相同的发育系列中的TFs的qPCR揭示了同太平洋玫瑰苹果相比，在红地苹果的果实组织中MdMYB10相对转录水平的增加。在皮层组织中，转录水平在太平洋玫瑰苹果中几乎检测不到，同时在太平洋玫瑰苹果果皮中，转录物是明显的且MYB转录物的水平在一月时间点同生物合成酶具体相关并涉及UFGT。在红地苹果中，MdMYB10的表达水平似乎大部分依照实验的所述酶的转录模式，具有遍及水果组织的高度升高的水平，特别是在十一月时间点，然后再在一月、二月和三月时间点(图4B)。同太平洋玫瑰苹果相比，在红地苹果叶片中的转录物水平被相似地升高。结果同RT-PCR的结果相似（图4A）并进一步证实了特异性，qPCR扩增物被测序、分析并被发现编码MdMYB10。

MdbHLH3和MdbHLH33的转录物水平似乎不依照在遍及发育系列和变种中的为生物合成基因或为MdBYB10展示的具有更一致表达水平的模式（图4B）。MdMYB8、MdMYB9和MdMYB11基因的转录物水平也被实验但并未显示同花青素酶转录物水平的相关模式（数据未显示）。

实施例6：MdMyb10在转基因苹果植物中的过表达产生升高的花青素生产

苹果的转化

用标准技术生产的包含被花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的MdMYB10cDNA的二元载体pSAK277-MdMYB10被通过本领域技术人员熟知的冻融法传递入根癌农杆菌菌株GV3101。转基因家苹果‘皇家噶拉’植物被通过农杆菌介导的叶片碎片的转化并通过使用先前报道的方法（Yaoetal.,1995）产生。用相等的空载体转化的对照植物也以相同方式生产。

结果被显示在图11中。

高度着色的愈伤组织细胞在A（i）中显示。A（ii）显示了高度着色的35-5Mym10植物（左侧）和用作对照的空载体对照植物（右侧）。

图的B部分显示了来源于35S-MdMyB10和对照植物的抽提物的花青素轮廓（按实施例5中描述的方法产生）。结果显示，花青素色素的水平在35S-MdMYB10植物中明显可检测但在对照植物中检测不到。苹果组织在酸化甲醇中抽提并且峰在520nm从HPLC痕量中鉴定；cy-gal（cyaniding-3-半乳糖苷）、具有更痕量的cy-glu（cyaniding-3-葡糖苷）和cy-pent（cyaniding-3-戊糖苷）。

上述提及的实施例不是为了限制本发明的范围。如被本领域技术人员所理解的，在没有离开本发明的范围的许多变化是可能的。

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表X：序列概要

Claims (18)

1.一种分离的多聚核苷酸，其选自

a)编码由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列所组成的多肽的序列；和

b)a)的序列的互补序列。

2.根据权利要求1所述的分离的多聚核苷酸，其中在a)中的序列由SEQIDNO：5所示的核酸序列所组成。

3.一种分离的多聚核苷酸，其由选自以下的序列所组成：

a)SEQIDNO:5所示的序列；以及

b)如a)中序列的互补序列。

4.一种分离的多肽，其由SEQIDNO:1的氨基酸序列所组成。

5.一种编码权利要求4的多肽的分离的多聚核苷酸。

6.一种抗权利要求4的多肽的抗体。

7.一种包含权利要求1至3和5的任一项的多聚核苷酸的遗传构建物。

8.一种包含权利要求7的遗传构建物的载体。

9.一种包含权利要求7的遗传构建物的宿主细胞。

10.一种被遗传修饰来表达权利要求1至3和5的任一项的多聚核苷酸的宿主细胞。

11.一种包含权利要求7的遗传构建物的植物细胞。

12.一种被遗传修饰来表达权利要求1至3和5任一项的多聚核苷酸的植物细胞。

13.一种生产权利要求4的多肽的方法，所述方法包含培养包含权利要求7的遗传构建物的宿主细胞。

14.一种生产具有改变的花青素生产的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用遗传构建物转化植物细胞或植物的步骤，所述遗传构建物包括至少一种编码权利要求4的多肽的多聚核苷酸。

15.一种生产具有改变的花青素生产的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用遗传构建物转化植物细胞或植物的步骤，所述遗传构建物包括至少一种权利要求1至3和5的任一项的多聚核苷酸。

16.一种选择花青素生产发生改变的植物的方法，所述方法包含检测植物的如权利要求1至3和5的任一项的多聚核苷酸的改变的表达。

17.一种选择花青素生产发生改变的植物的方法，所述方法包含检测植物的如权利要求4的多肽的改变的表达。

18.一种选择已经被转化的植物细胞或植物的方法，所述方法包含步骤

a)用权利要求1至3和5的任一项的编码能调控植物中花青素生产的多肽的多聚核苷酸转化植物细胞或植物；

b)在植物细胞或植物中表达所述多肽；和

c)选择相对于其他植物细胞或植物而言具有增加的花青素着色的植物细胞或植物，其中所述增加的花青素着色表明所述植物细胞或植物已经被转化。