CN102703444A

CN102703444A - 玉竹微卫星dna分子标记

Info

Publication number: CN102703444A
Application number: CN201210165286XA
Authority: CN
Inventors: 朱国萍; 高鹏; 王晖; 郑基阳; 李雪; 王文才; 唐王刚; 赵晓宇
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: CN102703444B

Abstract

本发明公开了一种玉竹微卫星DNA分子标记，包括玉竹微卫星(CT)n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到55个含有微卫星重复序列的克隆，筛选得到了9个高多态性的微卫星分子标记Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9。本发明可用于研究玉竹的遗传多样性，黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

Description

玉竹微卫星DNA分子标记

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种玉竹微卫星分子遗传标记。

背景技术

微卫星(Microsatellite)又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性（SSLP）。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对（称为核心序列，一般为1～6bps）为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，据此设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成, 微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型(pure),复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如：

单一型：ATATATATATATATATATATATAT

复合型：ATATATCACACACACACACAC

间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA

作为一种分子标记，微卫星DNA具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6 kb长度中就有1个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。

基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。

玉竹又名尾参，玉参，铃铛菜，地管子和甜根草，隶属于百合科(Liliaceae L.)黄精属(Polygonatum Mill.)，为多年生草本植物，喜阴生，广泛分布于欧亚大陆温带地区。

玉竹地下茎可入药，在我国其药用历史已逾两千多年。传统中医学认为玉竹性甘、微寒、归肺、胃经、能养阴润肺，益胃生津用于燥热伤阴，热伤胃阴之症。现代研究证明玉竹含多糖和多种提取物，在延缓衰老，增强免疫力，抑制肿瘤，促进淋巴细胞转化等方面具有一定效果。

由于民间滥挖严重，加之野生药材周期长，玉竹野生资源日益枯竭。实际上，玉竹药源较为复杂，微卫星有助于鉴定玉竹品系，并区分出玉竹伪品。同时，玉竹在栽培驯化过程出现了一系列问题，如繁殖系数低，利用微卫星标记对玉竹分子育种的研究尚且很少。

发明内容

本发明解决的技术问题：分离克隆玉竹的微卫星DNA分子标记，建立玉竹卫星DNA技术体系并用这些分子标记进行玉竹遗传多样性，黄精属属植物遗传关系的研究，以及进行黄精属种质鉴定。

本发明解决技术问题的技术方案：玉竹微卫星DNA分子标记，包括玉竹微卫星（CT）n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到55个含有微卫星重复序列的克隆。得到9个多态性高的微卫星分子标记Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9；Po1为360个核苷酸，Po2为471个核苷酸，Po3为447个核苷酸，Po4为408个核苷酸，Po5为463个核苷酸，Po6为497个核苷酸，Po7为424个核苷酸，Po8为509个核苷酸，Po9为342个核苷酸。

附图说明

图1：Po1位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图2：Po2位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图3：Po3位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图4：Po4位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图5：Po5位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图6：Po6位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图7：Po7位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图8：Po8位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

图9：Po9位点的特异性引物扩增24个玉竹的DNA的银染PAGE图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

玉竹微卫星DNA富集文库的构建

1）基因组的提取与酶切：

用Doyle J介绍的CTAB法（Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB total DNA isolation [A]. In Hewitt GM, Johnston A (eds.), Molecular Techniques in Taxonomy [M].Berlin: Springer, 1991, 283-293）提取基因组。用限制性内切酶Sau 3AI酶切基因组。2%的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外光下切下300-900 bp的DNA片段。用胶回收试剂盒回收。

2）加接头：

将胶回收纯化后的产物加入接头：

oligo A(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)

oligo B (5’-PO₄-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’),

在T4 DNA Ligase作用下于16℃水浴连接过夜。

3）PCR检测接头连接：

以oligo A为引物，以连接产物为模板进行PCR扩增，（50 μl反应体系如下：25 μl GoTaq? Green Master Mix，5 μl引物oligo A，5 μl连接产物，加水补至50 μl。PCR反应程序：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，56℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后72℃充分延伸10分钟。在2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。

4）磁珠富集：

将纯化后的DNA片段变性形成单链之后与含生物素的微卫星探针杂交，形成“微卫星探针包含微卫星的基因组DNA单链”复合体。将杂交液加入已处理好的磁珠，室温静置30分钟。将离心管放在磁力架上，吸去上清，依次用6×SSC，2×SSC，1×SSC在60℃下洗两次，最后用0.1×SSC室温下洗一次。加入TE缓冲液，在PCR仪上95℃变性15分钟，收集上清。重复两次。

5）PCR富集：

以磁珠富集产物为模板，oligo A为引物进行PCR扩增，25 μl反应体系如下,12.5 μl GoTaq? Green Master Mix，1.5 μl引物oligo A，2.5 μl富集后的DNA，加水补至25 μl。PCR反应程序如下：94℃预变性3分钟，94℃变性35秒，60℃退火性35秒，72℃延伸1分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后72℃充分延伸12分钟。PCR产物在2％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化试剂盒进行纯化。

6）感受态细胞的制备：

挑取平板上E.coli DH-5α单菌落，接种于5 ml的不含Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。取1 ml培养液于50 ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养，2～4 h至对数期。测OD（0.2～0.6）。将培养液分装至EP管中（每管1.5 ml菌液），水浴10～15 min。在4℃离心，4000 rpm，10 min（先降温后再离心）弃上清。弃上清后三管并一管，冰浴30 min（第一管加入0.1 mol/L，1 ml事先冰中预冷的CaCl2，混匀，吸出至第二管，如此将三管并一管）。取出后梯度离心，4℃，4000 rpm，5～8 min。弃上清。加入200 μl预冷甘油(15%)/CaCl₂(0.1 M)混匀,-80℃保存。

7）连接转化：

取PCR富集后的纯化产物连接入TA克隆载体(pMD19-T Simple Vector)，16℃水浴连接2-3小时。取出冻存管，冰上复苏10 min；将10μl的连接产物加入200 μl感受态细胞中,混匀，冰浴30 min；42℃水浴热休克90 s；冰浴2 min，加入600 μl LB培养基，37℃振荡培养1.5 h；取70 μl培养液，滴入LB/Amp/X-gal/IPTG平板上并涂布均匀（X-Gal需避光）；将平板37℃正向放置培养0.5h，然后于37℃烘箱中倒置培养过夜。经过12 h的培养，待平板上的菌落大小适中，取出平板于4℃放置使蓝斑充分显现。用灭过菌的牙签挑取平板上白色单克隆菌落，置于96深孔板中（深孔板事先加入了400 μl的含Amp抗性的LB/Amp培养基）。当白色单菌落挑取结束后，用不干胶将孔板盖好后于37℃，225rpm振荡培养4 h。

8）阳性克隆的筛选：

以连接转化所得的菌液为模板，利用引物oligo A和引物 (CT)₁₂进行PCR扩增。15 μl PCR反应体系包括：rTaq酶0.375 U，10× Buffer 1.5 μl，dNTP 0.2 μM，MgCl₂ 1.5 μM，引物0.4 μM(oligo A，(CT)₁₂)，水，模板。反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性50秒，56℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环30次。最后72℃充分延伸12分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

9）阳性克隆测序及引物设计：

选取扩增片断长度在300-900 bp含阳性克隆的菌液，送生工生物（上海）有限公司测序，共得到51条含有微卫星DNA的序列。利用软件Primer Premier 5.0根据微卫星DNA两端的序列来设计引物。

10）筛选有多态性的引物：

用上述的CTAB法提取玉竹的基因组。用设计好的引物（表1）扩增基因组。反应程序：94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，相应的退火温度30秒，72℃延伸35秒，变性、退火、延伸三个步骤循环35次。最后72℃充分延伸8分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用PAGE电泳进行检测。共得到9个有多态性的微卫星标记。Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9；Po1为360个核苷酸，Po2为471个核苷酸，Po3为447个核苷酸，Po4为408个核苷酸，Po5为463个核苷酸，Po6为497个核苷酸，Po7为424个核苷酸，Po8为509个核苷酸，Po9为342个核苷酸。

11）结果分析：

使用Cervus3.0软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用Genepop3.4软件计算哈代-温伯格以及连锁不平衡的值，以此来描述9个玉竹微卫星DNA多态位点的特征。由附图1-12可看出，本发明的9个微卫星序列的长度在供试的21个玉竹中都出现的多样性，由此可见，本发明的这9个微卫星标记能用于研究玉竹的遗传多样性，黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系，具有很高的重复性，是一种可靠有效的分子标记。

表1引物特性表：

表1中F表示上游引物，R表示.下游引物。

Claims

1.一种玉竹微卫星DNA分子标记，其特征在于：所述微卫星标记的标号分别为：Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9；

其核苷酸序列分别为：

Po1：

gatcacatgc cgatagttcc tcggtcacct agcatattta gtgtcagtcttctagctggc 60

gaataaaaac actaagtcga aatgaactaa ggaaagtgct cttctaactgtgagagagag 120

agagagagag agagagagag agagagagag agatgttggt ccatccctcatggtgtactg 180

tggatttcat tttgcgctct ctagctaatt ggattttagt cagatttttctagttagttt 240

agcaccactc ataggtagag ctgtaaaatg aactgagttt tggagtgtttgtgttcgttc 300

aataatttac acgagtttaa atttagctga ttctatatga acccaaacaaatactcaatt 360

Po2：

gatcacagat catgatctgg tcaaccagaa acccccgtgt ctgaccctgaggatacagat 60

accctctgcc tggtcacagg acctgggttg gttggccaga cagtgcccaggtcgaccccg 120

acctattttg ggctgttatt ggttttcttt ggtgttagta ggttttgttggtttcttatt 180

gggtttttga cttatataac tataacctac ttcatctaag gtttagatttgttttgtttt 240

attttggatg gttgagatta gactttaggt gggtgtttcc ctatatataccatctccaaa 300

ccctagaacc cattcctcct cctcctcctc tctctctctc tctctctctctctctctctt 360

gagcaactct ctttaagagc tagggcagag aatttagggg aagatttgggatttttgctg 420

aggttttctt cgtggatttg caagcttcgc atttctaagg caagtattcat 471

Po3：

gatcatgcat atttgtttat agctagcttc ccatcaacgt acgtccgttgcatttgattt 60

gattttcaaa gtattaggac ttgaacgtga agtgagggtg ggaactgggaactaggactc 120

ggatgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagagatatgctgcag 180

gaacttgtgg ataaatagag atatgtgtgg cactctctca ttgattatacttagttcact 240

ctctcgaaac gccacagaga tagacaaagg cttgattgtt agatcagcatacagatggca 300

agaaatggca gcggttatgc ttgctagttt ggtgagtggt gagacattttgtcctctctg 360

gccgtcgtac ttgctataaa gacgacgtgg aaaggcccga ccacgagaatgccgaccgca 420

tcgtttttcg acgataatgt tgttttt447

Po4：

gatcacgaac ttggaagctt cgactttggt gattgttgga gtgagctacaaattgaagag 60

ggtgggtttg cttgagctca tgaataagag gaagggagga gcttggctttctcttgaaaa 120

aggaatgaga atgaaaagag agagaggggg aggaattgtt tttatcaagggggcatggtg 180

cattaaatgc ttggaatgat ggagtgctgg gtattaaatg gaggagggagagagagagag 240

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagtgatgggacttt 300

tctcatccat gaatgagaca aagttaacaa gagggatgtt aacaattcaaactggtaaaa 360

cacatgagtg aaccaaacca gtccacgaat cgcagtaatt cgactgtg408

Po5：

gatcttgtgc caacctcgct attaaactcc ttctttagct cgtaacaacaccattgctct 60

tccactactc aatctacgcc ttcactgtgt ccctactttc tagcctcaccttctctctct 120

ctctctctcc ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcttccgttcgcctc 180

cgggcatttc tttagccacc cggcctccct ttccgccttc cgggctactctttacctccg 240

agctatggtt acttcttaca agctggcttt cgggccctcg tttagcacttttagtgcttt 300

tagccttcag gcttagcttc ggttactttc acgagttgac tctcgggtcctcgtttagca 360

cttttagtgc ttttagcatt cgtacttgct ttccagcctc gcaagagcaaaggaggtgct 420

gccaaatttt ctgctgatac tagactgcag cctaactaca atg463

Po6：

gatcaacatc tccctcacct ttttgcagtg gtttccaagg gcctaaggcccaatctttcg 60

ctggctcagt gaagttaagc ccaagcttgt ctttttgcag tggtttccatatgtgaagtt 120

aagcccaagc ttgtcaacat ctccctaata tatatagccc aatctatgtaggcctgccta 180

gtgggctgaa ttatcctacc acattactcg ctcatattcc accaattccgtatgtggact 240

gattcagcac cacccaaaac ccgacacgcc tccttcgctt ctccaccacatccacctcca 300

cgtgtcggtt tcccccctcc cttctctgtt tcaatattaa ctcctttttctgtccgaaac 360

aaaacccatc tcttttctct ctctctctct ctctgtgtgt gttcagtgttcaaggtctca 420

acaaagagag tagcaatggc gacttcttct tcttcttctt cgactagtccgctgctgaag 480

tacgagctgg atatcgt497

Po7：

gatcatcggc atcgtcgtca agagggatgg agagcgtctc tctcgccttcggacgctgat 60

agcagagaga cccatcgatg gagcaacaaa ggaaaacaac caacaaaatcacaacgaaac 120

gaagattact tgcttcttcc atcatgaatg agtatgaagt ttaatgtggaatactgtgag 180

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagagagagaggaga 240

gataatggag gctgcaggca caatttataa tgtggtattt acaaagaaagaaagaaatta 300

gattttttga gcgtttgatt tgaaaaaaat tgcaacactc tctccttctatctcttccta 360

catttgcatg cccatttagt tttcggtttg ggacacgagg gggccttcataagttgactc 420

gtgt424

Po8：

gatcatccgg aatcctgcta gttggccttg gattggaccg gtgtccgttaccggatccaa 60

tattgatatc tgtacccgtt tctgtgttta atatagtgga ttgttaatttgaactgtgtt 120

aatacagttt cctcttgtct ttgatggcat ggcaagagcc ccaccttcctttgtctaatc 180

aaagccccat ccccttgcat ttaatacttg ttattcactc tctctctctctctctctctc 240

tctctctctc ccatttttta cctcctccct tcccttctct ctttctcttctcatcttcaa 300

agagcaacct aagggaagca agagaacacc accacaccaa gagctcttccaagcctcccc 360

ttgctccggt gaacactccg gtaagctccg gccgagctcc gacgaacttaggcgagtgcc 420

atgctttcct tagcctacgg actgtaaatt gtgagctcac gagttcaagaaatctctctt 480

taaaagagaa gccttaaggg ctattaatt509

Po9：

cccttaagcc ctcattgctg cccctgacca agccctcgtc tcgccggccgaccggtcagc 60

tgagtaatgg ccaacctggt tagtcgaccg acctcctgct cccaatagagcgccgcctct 120

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctcttttcaa atttccccacactccgctta 180

attcttctcc taactccctg tcactcccta actctcccta attcccaccctaactccctc 240

tatctctctc actttctctc ctaactctct cgatctcgcc tctaacctatctgagctccg 300

gacaactggc atctccacca tattctcttt cactcctcca tt342。

2.根据权利要求1所述的一种玉竹微卫星DNA分子标记，其特征在于：

所述的Po1、Po2、Po3、Po4、Po5、Po6、Po7、Po8、Po9九个位点的引物序列为：

Po1-F GAA CTA AGG AAA GTG CTC TTC TAA C

Po1-R CTC TAC CTA TGA GTG GTG CTA AAC

Po2-F TTG AGA TTA GAC TTT AGG TGG GTG

Po2-R TGA ATA CTT GCC TTA GAA ATG CG

Po3-F CTT GAA CGT GAA GTG AGG GTG

Po3-R CTG CCA TTT CTT GCC ATC TGT AT

Po4-F ATG CTT GGA ATG ATG GAG TGC T

Po4-R GAT TCG TGG ACT GGT TTG GTT C

Po5-F CTA CGC CTT CAC TGT GTC CCT

Po5-R CTC GGA GGT AAA GAG TAG CC

Po6-FGCT TCT CCA CCA CAT CCA CCT

Po6-R GTC GCC ATT GCT ACT CTC TTT GT

Po7-FGAG CAA CAA AGG AAA ACA ACC AAC

Po7-R GTG TCC CAA ACC GAA AAC TAA ATG

Po8-F AGT TTC CTC TTG TCT TTG ATG G

Po8-R GCA CTC GCC TAA GTT CGT C

Po9-F GCA CTC GCC TAA GTT CGT C

Po9-R CAG ATA GGT TAG AGG CGA GAT。