CN102686227A

CN102686227A - 一种使用麦麸提取物或由其分离得到的活性成分治疗肥胖症的组合物

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Publication number: CN102686227A
Application number: CN2010800601412A
Authority: CN
Inventors: 李海寿; 徐奥波; 欧若苏; 安恩屈; 李容奥; 洪松苏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: CN102686227B; WO2011081488A2; WO2011081488A3; US20130102554A1

Abstract

本发明关于一种治疗肥胖症的组合物，该组合物使用麦麸提取物或由其分离得到的活性成分：它乔糖甙（tachioside）或者9,12,13-三羟基-10(E)-十八碳烯酸（9,12,13-trihydroxy-10(E)-octadecenoic acid）。麦麸提取物或者活性成分能够抑制主要参与脂肪细胞的分化过程的PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c转录因子的表达，从而抑制在胰岛素的促进下的前体脂肪细胞（adipocyte progenitor cells）向脂肪细胞的分化，进而抑制脂肪的积累。

Description

一种使用麦麸提取物或由其分离得到的活性成分治疗肥胖症的组合物

技术领域

本发明涉及一种改善肥胖症的组合物，其包含可作为活性成分的麦麸提取物或者从麦麸提取物中得到的分离物。

背景技术

近来，随着生活水平的提高，生活节奏的加快导致运动的缺乏以及过量营养的摄入，韩国的肥胖人口快速增加。从1995年到2001年，韩国的女性肥胖人口从11.7%增加到29.4%，男性肥胖人口从18.0%增加到32.6%（韩国卫生和福利部，2007）。

肥胖症是一种由于能量的摄入和消耗之间的不平衡导致的，随着过量能量的积累出现的脂肪组织异常增加的状态(Clinical Endocrinology 28:675-689,1998;Clinical Obesity(eds.Kopelman PG,Stock MJ)248-89(Blackwell Science,Oxford1998)。临床上，肥胖症被定义为男性身体脂肪占身体重量的25%以上，女性身体脂肪占身体重量的30%以上的状态。一个BMI（体重指数）等于或超过30.0的人被认为是肥胖者。

肥胖受环境因素影响，例如高脂肪，高能量的饮食，缺乏运动，内分泌失调以及遗传因素。环境因素占肥胖原因的50到70%，其余的因素归结于遗传易感性。

为了保持体内能量的平衡，当需要能量时，储存于脂肪细胞内的甘油三酯被水解成游离脂肪酸和甘油。反之，过量能量的摄入促进脂肪细胞的成熟，增加体内脂肪积累，导致肥胖。

脂肪细胞是从前脂肪细胞分化而来的。包括PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、C/EBP家族(CCAAT/增强子结合蛋白;C/EBRα,C/EBRβ和C/EBRδ)和ADD1/SREBP1c(脂肪细胞定向和分化因子1)/(固醇调节元件结合蛋白1c)的转录因子在脂肪细胞分化中起重要作用(Genes De 2000,14(11)1293~1307)。在细胞分化过程的不同时间点，这些转录因子的表达被诱导，并且它们之间互相作用，以调节脂肪细胞特异性基因以及逐步诱导脂肪代谢和脂肪细胞分化(PhysiolRev 1998,78(3):783~809;Annu Rev Biochem 2008,77:289~312;Genes Dev 1996,10:1096~1107)。

因此，一种能够调节从前体脂肪细胞到脂肪细胞的分化和/或在脂肪组织内的积累或者抑制PPARγ,C/EBRα和/或ADD1/SREBP1c的表达的活性物质可以被用作抗肥胖剂。例如，韩国专利No.920648公开了银杏内酯A或白果，韩国专利No.847252公开了人参皂甙-RF或者化合物K以及韩国专利No.576157公开了奥替普拉（oltipraz）。

本发明人通过对肥胖症的治疗进行集中和深入的研究，最终在本发明中揭示了通过麦麸提取物或者由此得到的分离物能阻止脂肪细胞分化和脂肪积累以及抑制PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c的表达。

发明内容

技术问题

因此，本发明的目的是提供改善肥胖症的组合物，其包含可作为活性成分的麦麸提取物或者从麦麸提取物中得到的分离物。

以下的说明书内容将进一步清楚描述其他的技术特征。

技术方案

正如下面将详细解释的是，研究表明麦麸提取物或其得到的分离物-它乔糖甙（tachioside）(甲氧基-对苯二酚-4-β-D-吡喃葡萄糖苷)和9,12,13-三羟基-10(E)-十八碳烯酸（9,12,13-trihydroxy-10(E)-octadecenoic acid），能够调节胰岛素诱导的脂肪细胞从前体脂肪细胞的分化和脂肪积累，并且能够抑制在脂肪细胞分化中起重要作用的转录因子-PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c的表达。

可以从甘蔗糖蜜（sugarcane molasses），勾儿茶（Berchemia racemosa）以及竹材中（bamboo culm）分离出它乔糖甙[J.Agr.Food Chem.31:545-548(1983);Phytochemistry 26:2811-2814(1987);Food Sci.Biotechnol.17(6):1376~1378(2008)]。在甘草（licorice）和野芋（Colocasia antiquorum）中发现有9,12,13-三羟基-10(E)-十八碳烯酸野芋[Izv Akad Nauk SSSRBiol.6:932-6(1988);Phytochemistry 28:2613-2615(1989)]。

在本发明中用作活性成分的化合物分别具有以下的IUPAC命名和化学式：

化学式1

它乔糖甙（tachioside）((2S,3S,4S,5S)-2-(4-羟基-3-甲氧基苯氧基)-6-(羟甲基)-四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇)

化学式2

(E)-9,12,13-三羟基十八碳-10-烯酸((E)-9,12,13-trihydroxyoctadec-10-enoicacid)

本发明的其中一个方面是提供一种改善肥胖症的组合物，其包括作为活性成分的麦麸提取物或者化学式1的化合物或者化学式2的化合物。

本发明中使用的术语“麦麸”是指小麦加工后得到的副产物。副产物可以包含除内胚乳（内胚乳是组成面粉的物质）外的整个小麦，或者当胚和内胚乳一起被分离时可以主要由小麦谷壳组成。取决于加工的程度，麦麸可以包含少量的内胚乳和胚。麦麸可以被进一步研磨成麸皮粉，根据加工的程度，麸皮粉可以被进一步分类。术语“麸皮”也包含将麦麸加工后得到的粉末。

本发明中使用的术语“提取物”不仅包括从麦麸中得到的粗提取物，所述粗提取物，是指用选自水、1到4个碳原子的低分子醇（例如甲醇、乙醇、丁醇等）、乙烯、丙酮、正己烷、醚、氯仿、乙酸乙酯、醋酸丁酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、1,3-丁二醇、丙二醇中的任一种或几种的组合溶剂提取出的提取物，而且也包含用以上各种溶剂抽提的粗提取物其中的各级分。只要能够保证活性成分被抽提和保留，任何提取方法都可以被使用。例如，抽提方法包括：冷沉淀，回流，加热和超声波法。所述级分包括将粗提取物在两种不同极性的溶剂之间进行分配得到的级分，以及用疏水性溶剂、亲水性溶剂或者二者组合的溶剂作为流动相，洗脱装载于硅胶柱中的粗抽提物而得到的洗脱物。此外，本发明的提取物可以是一种浓缩的液相或通过冷冻干燥，真空干燥，热空气干燥或喷雾干燥方法去除抽提溶剂后得到的固相。优选地，本发明的提取物可以是一种利用选自水、乙醇和二者的组合溶剂抽提得到的粗提取物或者是粗提取物中的级分。

本发明使用的术语“肥胖症”是指由遗传因素或者环境因素引起的一种脂肪组织的异常增加，包括由BMI标准定义的肥胖和超重（BMI在30.0以上的属于肥胖，BMI在25~30之间的是超重）。

本发明中使用的术语“活性成分”是指单独能表现出所希望的活性，或者结合一种本身无活性的载体时能表现出所希望的活性。

本发明中使用的与肥胖症相关的术语“改善”，包括对肥胖症的预防或治疗以及体内脂肪的减少和/或体重减轻。

只要能够保证改善肥胖症，任何量（有效量）的活性成分，都可以被用在本发明的组合物中。根据该组合物的用途，配方和目的，典型的有效量范围是占整个组合物总重量的0.001（重量）%到99.990（重量）%。本发明中使用的术语“有效量”是指能够产生所希望效果的活性试剂的剂量，例如改善和治疗肥胖症。可以由本领域普通技术人员的经验确定其有效量。

本发明的组合物可用于动物和人体，优选的是人体。

本发明的另一个方面是提供一种用于瘦身的组合物，其包括一种作为活性成分的麦麸提取物或者化学式1的化合物或者化学式2的化合物。

本发明中使用的术语“瘦身”是指即使并没有超重或肥胖，但是为了美和健康而希望或需要体重/体内脂肪减少的一种状态。一般来说，为了美和健康，本发明的瘦身组合物可以使用于正常的人。

有关小麦麸皮提取物和其有效量，对改善肥胖症的组合物所给出的说明，也适用于瘦身组合物。

本发明的另一个方面是提供一种改善胰岛素抵抗的组合物，其包含一种作为活性成分的麦麸提取物或者化学式1的化合物或者化学式2的化合物。

肥胖症是胰岛素抵抗的众多原因中的一个。尽管有些严重肥胖的人没有胰岛素抵抗，但是在胰岛素抵抗和肥胖症之间有着紧密的联系。一般来说，肥胖症，尤其是内脏型肥胖症的程度增加，胰岛素抵抗的几率也将增加。

脂肪细胞能释放出在维持代谢平衡的过程中起重要作用的脂肪细胞因子。肥胖症，即过量的脂肪积累导致的脂肪细胞因子的高或低生成，以致使平衡被打破，产生胰岛素抵抗。

脂肪细胞因子可以增加胰岛素敏感性并产生胰岛素抵抗。前者代表性的有脂联素、瘦素和AMPK（AMP依赖的蛋白激酶），后者包括TNF-α,lL-6,和抵抗素。

在脂肪细胞中表达的Fas（脂肪酸合成酶）或者aP2（脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白2）也都与胰岛素抵抗相关。

Fas是在脂肪细胞分化初期表达(J.Biol.Chem.,255:4745~4750(1980))并且具有催化由乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成棕榈酸的功能。Fas在将多余的能量以甘油三酯的形式储存方面起着重要的作用，这将导致肥胖。产生的棕榈酸甘油三酯破坏胰岛β细胞，诱导胰岛素抵抗(Proc.Natl.Acad.Sci.95:2498~2502(1998))。根据在aP2缺乏的小鼠中胰岛素抵抗发生频率较低，而aP2的抑制剂能降低胰岛素抵抗这一有关报道，建议将aP2作为治疗胰岛素抵抗的、所期望的标靶(Nature 447:959-965(2007))。

为了检验能改善肥胖症的活性成分的化学式1和2的化合物，是否也能作为对抗胰岛素抵抗的试剂，将所述化合物加入脂肪细胞中，然后定量分析其中的抵抗素（即一种参与胰岛素抵抗的脂肪细胞因子）和Fas以及aP2。发现它们的表达水平均被大幅抑制。这些实验数据证明化学式1和2的化合物能像改善肥胖症一样有效地改善胰岛素抵抗症。

本文中使用的术语“胰岛素抵抗”是指这样的一种生理症状，就是说，为了维持细胞、器官和身体的正常生理代谢，比正常状态需要更多的胰岛素，即胰岛素功能出现障碍，在这种状态下，胰岛素变得低效了，这种症状被认为是相当于胰岛素非依赖型糖尿病或者2型糖尿病。糖尿病被划分成用胰岛β细胞的损失来表征的胰岛素依赖型糖尿病（1型糖尿病），以及用胰岛素抵抗来表征的胰岛素非依赖型糖尿病（2型糖尿病）。因此，在本领域中，胰岛素抵抗，胰岛素非依赖型糖尿病和2型糖尿病的说法，其意思都是一样的。

关于麦麸提取物和其有效量，对改善肥胖症的组合物所做的说明也适合于改善胰岛素抵抗的组合物。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物可以被用作食品组合物。

本发明的食品组合物可以作为健康辅助食品，营养补充剂或功能性饮料。

食品组合物中除了活性成分外还可以包含添加剂，例如甜味剂、调味剂、生理活性物质、矿物质等。

甜味剂被用来赋予该组合物甜味，其可以是天然的或合成的。优选的是天然甜味剂。天然甜味剂包括玉米糖浆、蜂蜜、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖和其他的糖。

调味剂被用来增强该组合物的味道或风味，其可以是天然的或合成的。优选的是天然调味剂。如果是天然的调味剂，其除了增加味道以外还可以具有营养补充剂的功能。天然的调味剂包括从苹果、柠檬、桔子、葡萄、草莓、桃子、绿茶叶、玉竹、竹叶、肉桂、菊花叶和/或茉莉花中得到的调味剂。其他的天然调味剂包括从参（红参）、竹笋、芦荟和/或银杏果仁中得到的调味剂。天然调味剂可以是一种液体的浓缩液或者一种固体的提取物。也可以使用合成的调味剂，例如酯、醇、醛和萜。

在生理活性物质中有儿茶素类,例如儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素和表没食子儿茶素,和维他命,例如视黄醇、抗坏血酸、生育酚、维生素D2、硫胺素和核黄素。

至于矿物质，包括例如钙、镁、铬、钴、铜、氟化物、锗、碘、铁、锂、镁、锰、钼、磷、硒、硅、钙、钠硫、钒和锌。

根据需要，本发明的食品组合物中除了包含添加剂，例如甜味剂之外，还可以包含防腐剂、乳化剂、酸味剂和增稠剂。

防腐剂、乳化剂等添加剂的加入量在保证达到添加目的的前提下，应该尽可能为最小量。以数据界定的话，它们的加入量占整个组合物的重量百分比的范围是从大约0.0005％到0.5％。

用于本发明的防腐剂包括，例如山梨酸钙、山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钙、苯甲酸钠、苯甲酸钾和EDTA（乙二胺四乙酸）。

用于本发明的乳化剂有阿拉伯胶、羧甲基纤维素、黄原胶和果胶。

代表性的酸化剂有柠檬酸、苹果酸、富马酸、己二酸、磷酸、葡萄糖酸、酒石酸、抗坏血酸和乙酸。为了抑制微生物的繁殖或者增强味道可以加入酸化剂。

本发明中用的增稠剂可以是悬浮剂、絮凝剂、凝胶形成剂和溶胀剂。

本发明的食品组合物可以进一步包含以增强口感或味道的天然添加剂或者包含具有抗肥胖活性或作为肝功能增强剂（改善脂肪肝或治疗宿醉）的试剂。以上的添加剂或试剂例如有：凝结的牛血粉（clotted cow blood powder）或其提取物、豆芽粉（a bean sprout powder）或其提取物、贝壳粉（a shellfish powder）或其提取物、牡蛎粉（an oyster powder）或其提取物、蛇床子粉（a Cnidiummonnieri powder）或其提取物、萝卜汁（a radish juice）或其提取物、黄瓜汁（a cucumber juice）或其提取物、韭菜汁（a Chinese chive juice）或其提取物、菠菜汁（a spinach juice）或其提取物、莲花根汁（a lotus root juice）或其提取物、葛根藤汁（a kuzu vine juice）或其提取物、松针汁（a pine needle juice）或其提取物、人参汁（a ginseng juice）或其提取物、白花蛇舌草粉末（a Hedyotisdiffusa powder）或其提取物、甘草粉（licorice powder）或其提取物、葛根花粉末（a Pueraria lobata flower powder）或其提取物、葛根粉末（a Pueraria lobataroot powder）或其提取物、砂仁黄花粉（a Amomum villosum LOUR powder）或其提取物、葫芦粉（a gourd powder）或其提取物、生姜粉（a ginger powder）或其提取物、枣粉（a jujube powder）或其提取物、茵陈蒿粉末（a Artemisiacapillaris Thunb.powder）或其提取物、枳椇子粉末（a Hovenia dulcis Thunbseed powder）或其提取物、水飞蓟粉末（a Silybum marianum powder）或其提取物、白术粉末（a Atractylodes macrocephala Koidzumi powder）或其提取物、猪苓粉末（a Polyporus umbellatus Fries powder）或其提取物、温州蜜橘皮粉（aCitrus unshiu Markovich peel powder）或其提取物、枸杞粉（a Lycium chinenseMiller powder）或其提取物、绿茶粉（a green tea powder）或其提取物、五味子粉（a Schisandra chinensis powder）或其提取物、东方葡萄树提取物（an orientalraisin tree extract）、紫草提取物（a Lithospermum erythrorhizon S.et Z extract）、芦苇提取物（a Phragmites communis Trinius extract）、肉桂提取物（a cinnamonextract）和紫花前胡醇（decursinol）。关于“提取物”的含义，可以使用对小麦麸皮提取物的说明。各种提取物也可以组合成混合物的形式。

在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物可以被用作药物组合物。

本发明的药物组合物除了活性成分外还包含药学上可接受的载体或赋形剂，并且可以配制成口服剂型（片剂、混悬剂、颗粒剂、乳剂、胶囊、糖浆等）、肠外剂量形式（无菌注射剂、水性或油性悬浮液等）和局部应用形式（溶液、霜、软膏、凝胶、洗剂、贴片等）。

本发明中使用的术语“药学上可接受的”是指不干预活性成分的生物活性效果的物质，并且毒性低，能够用于接受治疗者。

药学上可接受的载体包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉（例如，玉米淀粉、土豆淀粉等）、纤维素和其衍生物（例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素等）、麦芽、明胶、滑石粉、固体润滑剂（例如，硬脂酸、硬脂酸镁等）、硫酸钙、植物油（例如，花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油）、多元醇（如丙二醇、甘油)、褐藻酸、乳化剂（例如吐温）、润湿剂（十二烷基硫酸钠）、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、水、盐水和磷酸盐缓冲液。按照药物组合物的配方，以上这些载体可以单独或者组合使用。

在发明的药物组合物中也可以使用合适的赋形剂。例如，适合将本发明的药物组合物配制成水悬浮液的赋形剂，该赋形剂可以是悬浮剂或者分散剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠或聚乙烯吡咯烷酮。当此药物组合物被配制成一种注射液时，可以使用林格氏液或等渗氯化钠做赋形剂。

为了施加本发明的药物组合物，可采取口服途径或外用之类的肠外途径给药。

本发明的药用组合物的每日剂量可以是身体重量的0.001~150mg/kg，并且每日可以单一剂量或多次剂量给药。本发明的药用组合物的剂量取决于给药途径，病人的年龄，性别和体重，疾病的严重程度等各种因素，并且因此不应该理解为限制本发明的范围。

有益效果

正如到目前为止所描述的，本发明提供了一种改善肥胖症的组合物，其包含麦麸提取物或者化学式1或2的化合物。本发明也提供了一种能够改善胰岛素抵抗的组合物。按照本发明的说明，治疗肥胖症或胰岛素抵抗的组合物可用作功能性食品组合物或者药物组合物。

附图说明

图1是分离得到化合物1和化合物2的示意图。

图2是化学式1的化合物的COSY谱图。

图3到8显示出小麦麸皮提取物和化学式1和2的化合物对脂肪细胞脂质蓄积的抑制活性呈剂量依赖性。

图9和10显示出小麦麸皮提取物和化学式1和2的化合物对PPARγ转录活性的抑制活性呈剂量依赖性。

图11到16显示出小麦麸皮提取物和化学式1和2的化合物对PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c表达的抑制活性在基因水平上呈剂量依赖性。

图17和18显示出化学式1和2的化合物对PPARγ和C/EBRα表达的抑制活性在蛋白质水平呈剂量依赖性。

图19和24显示出化学式1和2的化合物对抵抗素、aP2和Fas表达的抑制活性在基因水平上呈剂量依赖性。

具体实施例

通过以下的实施例可以进一步更好地理解本发明，但绝不能被解释为限制本发明。

实施例

麦麸提取物和其分离物的制备以及活性成分的鉴定

实施例1：小麦麸皮提取物1的制备

将200g麦麸，即小麦(Triticum aestivum L.)加工后的残余物，在2L水中用热水抽提6小时，然后过滤。滤液装载入用Diaion HP-20树脂填充的柱子，分别用100%乙醇和水做流动相进行洗脱。用100%乙醇洗脱得到的洗脱级分被命名为Red-dog A，用水洗脱得到的洗脱级分被命名为Red-dog B。

实施例2：小麦麸皮提取物2的制备

向小麦(Triticum aestivum L.)精加工后的残余物，即麦麸中加入足量的乙醇，然后通过24小时的三轮冷沉淀进行抽提。抽提液过滤后，滤液在真空下浓缩。浓缩液悬浮在蒸馏水中，用CH₂Cl₂分级，再用丁醇使水层分配，真空蒸发丁醇级分(G36W)后，将其加入Diaion HP-20柱色谱中，使用水-甲醇混合物（水，20、40、60、80、100%甲醇）作为流动相，得到6个亚级分(G36W-18-1~6)。

实施例3：从小麦麸皮提取物中分离得到活性成分

实施例2的亚级分G36W-18-2加入硅胶色谱柱(10x 25)，使用三氯甲烷:甲醇:水(20:4:1,10:3:1,6:3:1,6:4:1)作为流动相，得到11个亚级分(G36W-20-1~11)。从亚级分G36W-20-5中分离得到化合物1。亚级分G36W-18-5在二氯甲烷和水中进行萃取分配，然后将二氯甲烷层重结晶得到化合物2。

活性成分的分离过程显示于图1中。

实施例4：从小麦麸皮中分离得到的活性成分化合物1和2的鉴定

实施例4-1：化合物1的鉴定

分离后的化合物1的理化和谱图分析

无色针状物；ESIMS(positive mode)m/z 325.35[M+Na]⁺,627.35[2M+Na]⁺;(negative mode)m/z 301.79[M-H]-,603.20[2M-H]^-;

¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ6.69(1H,d,J=2.8Hz,H-3),6.66(1H,d,J=8.8Hz,H-6),6.46(1H,dd,J=8.8,2.8Hz,H-5),4.67(1H,d,J=7.6Hz,H-1',3.73(3H,s,3-OCH3),3.71(1H,dd,J=11.6,4.8Hz,H-6'),3.44(1H,dd,J=11.6,6.0Hz,H-6'),93.10-3.45(4H,m,H-2',3',4',5');

¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ151.2(C-4),148.2(C-2),141.7(C-1),115.6(C-6),108.3(C-5),102.8(C-3),102.1(C-1'),77.5(C-3'),77.2(C-5'),73.7(C-2'),70.4(C-4'),61.3(C-6'),55.9(OCH₃).

得到的化合物1呈无色针状形式的结晶，ESI-MS测定其分子量是302amu(m/z 325.35[M+Na]⁺,301.79[M-H]-)。其分子式被鉴定为C₁₃H₁₈O₈，不饱和度为5。在¹H-NMR图谱中(图3),观察到有1,2,4-三取代芳烃质子[δ_H 6.69(1H,d,J=2.8Hz),6.66(1H,d,J=8.8Hz),6.46(1H,dd,J=8.8,2.8Hz)]，并且能鉴定出甲氧基的峰[δ_H 3.73(3H,s)]和在化学位移4.67处有葡萄糖环的一个异头物质子(1H,d,J=7.6Hz)。在¹³C-NMR谱图中能够读出总共13个碳原子的信号峰，包括苯环的6个峰，糖环的6个峰[δ_C 102.1(C-1'),77.5(C-3'),77.2(C-5'),73.7(C-2'),70.4(C-4'),61.3(C-6')]和一个δ_C=55.9的甲氧基信号峰。

从谱图数据和不饱和度可推断化合物1是一个葡萄糖链段连接到甲氧基对苯二酚链段上的化合物。根据参考文献(Food Sci.Biotechnol.,17(6),1376-1378,Tachioside,an antioxidative phenolic glycoside frombamboo Species)以及理化性能可鉴定化合物1是具有化学式1的它乔糖甙(甲氧基-对苯二酚-4-β-D-吡喃葡萄糖苷)。

实施例4-2：化合物2的鉴定

分离后的化合物2的理化和谱图分析

白色固体;ESIMS(positive mode)m/z 353.85[M+Na]⁺,683.42[2M+Na]⁺;(negative mode)m/z 329.72[M-H]^-,659.83[2M-H]^-;

¹H-NMR(CDCl₃/CD₃OD,400MHz)δ5.73(1H,dd,J=15.6,6.0Hz,H-10),5.65(1H,dd,J=15.6,6.4Hz,H-11),4.06(1H,dd,J=12.4,6.5Hz,H-9),3.89(1H,t,J=6.4Hz,H-12),3.41(1H,m,H-13),2.28(2H,t,J=7.6Hz,H-2),1.61(2H,m,H-3),1.52(2H,m,H-8a,14a),1.32(16H,m,H-4,5,6,7,8b,14b,15,16,17),0.89(3H,t,J=7.0Hz,H-18);

¹H-NMR(pyridine-d5,400MHz)δ6.42(1H,dd,J=15.6,5.6Hz),6.35(1H,dd,J=15.6,5.2Hz),4.53(2H,m),3.96(1H,m),2.51(2H,t,J=7.4Hz),1.81(7H,m),1.58(3H,m),1.33(10H,m),0.83(3H,t,J=6.8Hz);

¹³C-NMR(pyridine-d5,100MHz)δ177.0,137.6,131.8,77.2,76.2,72.8,39.4,35.8,34.5,33.3,30.9,30.7,30.5,27.2,27.0,26.6,23.9,15.2.

得到的化合物2呈白色固体，ESI-MS测定其分子量是330amu(m/z 353.85[M+Na]⁺,329.72[M-H]-)。鉴定其分子式是C₁₈H₃₄O₅，不饱和度是2。在¹H-和¹³C-NMR中,检测到三个氧化次甲基质子峰分别在δ_H＝4.06(1H,dd,J=12.4,6.5Hz,H-9),3.89(1H,t,J=6.4Hz,H-12),和3.41(1H,m,H-13)出现以及出现一个反式双键的信号峰[δ_H 5.73(1H,dd,J=15.6,6.0Hz;δC 131.8),5.65(1H,dd,J=15.6,6.4Hz;δC 137.6)]。在δ_C为177.0处检测出一个羧基的碳原子信号峰。因此，可推断化合物2是一种含有18个碳原子的单不饱和长链脂肪酸结构，并且有三个羟基和一个反式双键。此外，COSY（见图2）揭示出一部分结构是CH₂-CH(OH)-CH(OH)-CH=CH-CH(OH)-CH₂-。在以上获得的数据以及参考文献(J.Nat.Prod.,200669(9),1366-1369,Phytochemicalconstituentsfrom Salsola tetranda)的基础上，鉴定出化合物2是具有化学式2的9,12,13-三羟基-10(E)-十八碳烯酸。

实验实施例

小麦麸皮提取物及其分离物对肥胖症和胰岛素抵抗的抑制活性测试

实验实施例1：对肥胖症改善的活性测试

将小鼠前体脂肪细胞3T3-L1在37°C，5%CO₂条件下，用含有10%BCS的DMEM培养基培养。

前体脂肪细胞3T3-L1以5x10⁴个/孔的密度接种于34孔板中。当细胞长到100%融合状态时，再将其孵育两天。然后，在MDI(0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),1μM地塞米松,1μg/ml胰岛素)的存在下，在10%FBS的DMEM培养液中诱导该前体脂肪细胞分化成脂肪细胞。在此培养基中孵育48小时后，在包含1μg/ml胰岛素的10%FBS DMEM培养基中培养细胞2天。随后，10%FBS DMEM培养基中培养细胞4天，每2天更换新鲜的培养基。在脂肪细胞分化阶段，使用预定浓度的样品溶液处理细胞。在第8天分化完成，观察细胞的分化。关于这一点，是在光学显微镜下用油红O染色并且在510nm下测定吸光度，定量分析脂肪组织分化。

结果显示于图3到8中。图3到8显示用实施例1的提取物(Red-dog A&Red-dogB)和实施例2的提取物(G36W,G36W-18-2&G36W-18-5)以及实施例3的化合物(化合物1&2)处理后的细胞中油红O染色的情况以及脂质含量。

正如在图3到8中看到的那样，所有的小麦麸皮提取物和从提取物中分离得到的化合物1和2均能抑制前脂肪细胞分化成脂肪细胞，且呈剂量依赖性。

实验实施例1-2：对转录因子PPARγ抑制活性的测试

用携带PPRE(PPARγ应答元件)基因和PPARγ基因的重组pGL3-basic荧光素酶表达载体(Promega)和携带Renilla荧光素酶cDNA的pRL-SV-40质粒（作为报告基因）(Promega)共转染HEK 293T细胞。在转染1天后，用预定浓度的样品(Red-dog A,Red-dog B以及化合物1&2)单独或者与10μM曲格列酮（troglitazone，PPARγ的配体）联合使用处理细胞。通过测量萤光素酶的表达水平可以测定样品对转录因子PPARγ的抑制活性。

结果显示于图9和图10中。图9和图10显示出样品，即实施例1的提取物(Red-dog A&Red-dog B)和实施例3的化合物(化合物1&2)对PPARγ的转录活性的影响效果。正如图9和图10中看到的那样，所有的样品都能抑制PPARγ的转录活性，且呈剂量依赖性。

实验实施例1-3：对负责脂肪细胞分化的转录因子的抑制活性

实验实施例1-3-1：在基因水平上的抑制活性测试

在脂肪细胞分化的过程中，PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c的表达水平增加。

用与实验实施例1-2相同的方式，以预定浓度的样品(Red-dog A,Red-dog B以及化合物1&2)处理细胞后，细胞被诱导分化8天后成为脂肪细胞。用实时定量PCR分析PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c的表达水平。在8天的分化后，用PBS冲洗3T3-L1细胞2次，用RNA提取试剂盒(Qiagen)提取细胞RNA。使用下表1中的引物，以1μg分离后的RNA为模板进行实时定量PCR反应合成cDNA，然后用SYBR Green荧光染料（Takara）染色。用GAPDH作为对照基因。1μg的RNA按1/50的比例稀释后取出5μL，然后和各0.5μL的10pmole引物，10μL的2×SYBR green染料和4μL的蒸馏水混合,得到总体积是20μL的PCR混合物用于合成cDNA。实时定量PCR是从95°C变性30s开始，然后是95°C变性5s，60°C退火15s，72℃延伸10s的，共40个热循环。熔融曲线由80个热循环组成，从55°C到95°C，每个循环增加0.5°C。检测得到所希望的荧光信号（用Bio-Rad MyiQ软件分析数据）。

表1

引物

正如在图11到16中看到的那样，在基因水平上，实施例1的提取物(Red-dog A&Red-dog B)和实施例3的化合物(化合物1&2)对PPARγ,C/EBRα和ADD1/SREBP1c的表达有抑制作用，且呈剂量依赖性。

实验实施例1-3-2：在蛋白质水平的抑制活性测试

每隔2天，以和脂肪细胞分化法同样的方式，用样品(Red-dog A&Red-dogB,化合物1&2)处理3T3-L1细胞后，用PBS冲洗细胞两次，在RIPA缓冲溶液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM氯化钠,1%NP-40,0.5%去氧胆酸钠,0.1%十二烷基硫酸钠,蛋白酶抑制剂)中裂解细胞。在13,000rpm下离心分离30min后得到蛋白质，用8%SDS-PAGE凝胶对其分离后，将其转移到膜上。该膜用含5%脱脂奶的TBST进行封闭后与一抗(PPARγ,C/EBPα)(Santa Cruz)反应，再与二抗(Santa Cruz)反应，然后用ECL试剂(Thermo scientific)显色比较PPARγ和C/EBPα的表达水平与β-肌动蛋白的表达水平的差异。

结果显示于图17和18中。

与图11到16的数据类似，实施例1的提取物(Red-dog A&Red-dog B)和实施例3的化合物（化合物1&2）抑制PPARγ和C/EBRα的表达，且呈剂量依赖性。

实验实施例2：对抗胰岛素抵抗活性的测试

为了检验样品(Red-dog A&Red-dog B,化合物1&2)作为抗-胰岛素抵抗试剂是否有效，用下面的表2中的引物分析如实验实施例1那样进行了8天分化的细胞中的抵抗素、aP2和Fas的表达水平。

表2

引物

结果显示于图19到24中。结果发现实施例1的所有提取物(Red-dog A&Red-dog B)和实施例3的化合物(化合物1&2)都能够抑制抵抗素、aP2和Fas的表达，且在基因水平上呈剂量依赖性。